CN113786390A - 负载siRNA的仿生化ZIF-8纳米传递系统，及其制备方法和应用 - Google Patents

负载siRNA的仿生化ZIF-8纳米传递系统，及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种负载siRNA的仿生化ZIF‑8纳米传递系统，所述纳米传递系统包括由细胞膜包裹的ZIF‑8和siRNA。本发明所述纳米传递系统具有较高的转染效果，对于肿瘤抑制具有较好的治疗效果，可以规模化制备。

Description

负载siRNA的仿生化ZIF-8纳米传递系统，及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种负载siRNA的仿生化ZIF-8纳米传递系统，及其制备方法和应用。
背景技术
Polo样激酶I(polo-like kinase，PLK1)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞周期中发挥重要的作用。PLK1在细胞的分裂及分化过程中起着关键的作用,在多数癌细胞当中PLK-1都过表达,与肿瘤的发生及预后密切相关,因此被认为是重要的抗肿瘤药物靶标。临床发现，由于缺乏特异性，宫颈癌、卵巢癌和乳腺癌对化学疗法具有高度抗性，同时研究表明，PLK1在宫颈癌中的表达明显高于正常细胞，抑制PLK1的表达能显著抑制肿瘤的生长，而对正常细胞没有明显的抑制作用，因此PLK1是一个治疗恶性肿瘤的新靶点。
基因治疗法将小干扰RNA输送到细胞胞浆中下调功能蛋白质，为癌症、炎症和溶酶体疾病等各种疾病的药物开发提供了一种有前途的方法。然而，核酸大多是膜不透性的，在细胞中，特别是在溶酶体中容易被降解。纳米MOFs作为载体可以有效保护寡核苷酸免受体内核酸酶降解，增强其细胞摄取达到基因治疗的目的。纳米级别的有机金属框架(Metalorganic-Framework,MOF)是通过中心金属离子或中心金属团簇与有机配体通过自组装相互连接，形成具有周期性的多孔结构,由于Zn是生物体内第二丰富的过渡金属，咪唑基团是体内组氨酸不可分割的一部分，因而ZIF-8具有优异的生物相容性。此外，ZIF-8易于修饰的特性可以让材料表面或者孔道中连接上各种功能的生物分子以实现多功能，例如可以在表面修饰靶向分子来特异性地识别肿瘤分子，通过同源细胞膜表面修饰，使得纳米MOFs负载的siPlk1能够有效聚集在肿瘤组织抑制其生长。经过同源靶向修饰的ZIF-8纳米药物输送系统在肿瘤治疗领域潜力巨大。然而现有技术制备规模较小，化学药具有高度抗性与非特异性分布，很难对大分子(如核酸)进行递送，很难维持较长时间的血药浓度，对癌症的治疗效果有限制。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种负载siRNA的仿生化ZIF-8纳米传递系统，及其制备方法和应用。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“siRNA”是指：Small interfering RNA，小干扰RNA。
术语“ZIF-8”是指：沸石咪唑酯骨架结构材料。
术语“MOF”是指：Metal organic-Framework，有机金属框架。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种负载siRNA的仿生化ZIF-8纳米传递系统，所述纳米传递系统包括由细胞膜包裹的ZIF-8和siRNA。
根据本发明第一方面的米传递系统，其中，所述细胞膜选自以下一种或多种：Hela细胞膜、Hepa1-6细胞膜、RAW264.7细胞膜；最优选为Hela细胞膜。
根据本发明第一方面的米传递系统，其中，所述siRNA选自以下一种或多种：siPlk1、sic-erbB2、siPokemon；最优选为siPlk1。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的纳米传递系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)用无核酶水溶解siPlk1干粉制备siPlk1溶液；
(2)将二甲基咪唑与步骤(1)得到的siPlk1溶液混合，室温下搅拌孵育；
(3)将六水合硝酸锌在搅拌下加入到步骤(2)所得溶液中孵育；
(4)将步骤(3)所得混合液离心，去掉上清，洗涤，得到的沉淀重悬；
(5)提取细胞膜，将步骤(4)所得混合液与细胞膜混合超声，得到所述纳米传递系统。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述2-甲基咪唑、六水合硝酸锌、siPlk1、细胞膜的质量比为100～1000：10～100：1～10：1000～5000，优选为200～500：10～50：5～10：2000～3000，最优选为475：25：5：2500。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(1)中，所述siPlk1溶液浓度为1～100μM，优选为1～50μM，最优选为20μM。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(2)中所述孵育时间为1～60min，优选为1～30min，最优选为10min；和/或
步骤(3)中所述孵育时间为1～60min，优选为1～30min，最优选为10min。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(5)中，
所述超声频率为42kHz；所述超声功率为功率100W；和/或
所述超声时间为5分钟。
本发明的第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的纳米传递系统和/或按照第二方面的制备方法而制得的纳米递送系统；和药学上可接受的载体。
本发明的第四方面提供了第一方面所述的纳米传递系统和/或按照第二方面的制备方法而制得的纳米递送系统在制备用于治疗癌症的药物和/或医疗产品中的应用；优选地，所述癌症为宫颈癌。
本发明旨在寻找一种基于Hela细胞膜修饰的装载siPlk1的ZIF-8纳米囊进行靶向高效转染，敲低PLK1蛋白水平，从而达到高效长久治疗恶性肿瘤的治疗效果。
为达到目的，本发明采用以下技术方案：
为了避免毒性，本发明在制备MOFs时一般仔细选择一些无毒或低毒的金属离子，由于Zn是生物体内第二丰富的过渡金属，咪唑基团与组氨酸是不可分割的一部分，因而ZIF-8具有优异的生物相容性。它是将咪唑或者其类似物与Zn(II)或CO(II)连接得到的一种具有类沸石结构的多孔类骨架材料。
由于上面带正电荷的Zn 2+在ZIF-8的表面，推测核酸骨架上的磷酸残基之间以及ZIF-8表面的锌空位可通过静电相互作用使ZIF-8可以与核酸结合。另外带正电的Zn2+也能容易将纳米颗粒吸附在带负电的细胞膜上，促进ZIF-8的高效细胞摄取。故本发明采用同源的Hela膜包裹纳米囊，在不需要任何其他转染试剂的情况下，高效的将siPlk1纳米囊系统输送到细胞内。通过细胞膜修饰的纳米ZIF-8，可改善在生理环境下的分散性，减少非特异性血浆蛋白的结合，避免被单核吞噬系统吞噬，同时进行表面改性，使其具有靶向治疗的目的，具有重要的应用价值。
本发明提供了一种可以使PLK1蛋白沉默的基因：
siRNAs against Plk1(siPlk1,
有义链:5′-UGAAGAAGAUCACCCUCCUUAdTdT-3′，
无义链:5′-UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCAdTdT-3′。
本发明中Hela细胞膜，2-甲基咪唑，六水合硝酸锌，siPlk1的比例固定。
本发明中纳米囊芯成分为2-甲基咪唑，六水合硝酸锌,且其比例固定。具体比例为：2-甲基咪唑：六水合硝酸锌：siPlk1：Hela细胞膜为475：25:5：2500。
本发明的纳米传递系统可以具有但不限于以下有益效果：
本发明所述纳米传递系统具有较高的转染效果，对于肿瘤抑制具有较好的治疗效果，可以规模化制备。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了实施例1所得到的纳米颗粒的性质结果；其中，图1A为合成的ZIF-8装载的siPlk1纳米粒子(MOFP)的TEM图，图1B为提取的Hela细胞膜包裹MOFP后的粒子(HM@MOFP)的TEM图，图1C为不同siRNA与ZIF-8比例下的负载效率，图1D为MOFP和HM@MOFP的粒径结果，图1E为MOFP和HM@MOFP的动态光散射(DLS)结果。
图2示出了试验例1中肿瘤抑制体内实验结果；其中，图2A为给药治疗后通过Western Blot检测肿瘤内PLK1的表达水平；图2B为给药治疗后剥离的肿瘤。
图3示出了试验例2中癌细胞的体外转染实验结果。
图4示出了试验例3中蛋白免疫杂交印迹结果；其中，图4A为体外PLK1水平的Western印迹分析；图4B为PLK1水平灰度分析。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
siPlk1干粉、无核酶水，购自广州市锐博生物科技有限公司；二甲基咪唑、六水合硝酸锌、PBS、Hela细胞、膜蛋白抽提试剂、PMSF、BCA试剂，购自广州擎科生物技术有限公司；
雌性BALB/c裸鼠，购自广州晴乐生命科学有限公司。
仪器：
透射电子显微镜(TEM)，购自日本JEOL公司，型号：JEM-1400；
纳米粒度电位仪，购自英国马尔文公司，型号：Nano ZS 90；
激光共聚焦显微镜，购自德国Zeiss公司，型号：Zeiss LSM 880；
蛋白免疫印迹杂交系统，购自美国Bio-Rad公司,型号：164-5050。
实施例1
本实施例用于说明构建利用纳米材料和提取出的Hela细胞膜制备生物膜包裹纳米粒子的方法。
1)用无核酶水溶解siPlk1干粉,可得20μMsiPlk1溶液；
2)取二甲基咪唑(MIM,231.43μM))与上述溶解的siPlk1溶液室温下搅拌孵育10min；
3)取3.36μM六水合硝酸锌(Zn(NO3)2·6H2O)(质量比Zn(NO3)2·6H2O:MIM＝1/19)搅拌下加入到上述溶液中，室温孵育10min；
4)以不同的重量比(MOF:siRNA)如50、100、200、400、800、1600和3200)进行配制得到MOFP；
5)将上述混合液，4℃，12000rpm离心15分钟，去掉上清，再反复洗涤2次，得到的沉淀用无菌双蒸水重悬；
6)将上述混合液与Hela细胞膜混合，用MOFP与细胞膜按重量比(w/w＝0、1、2、3、5、10和20)分别包裹不同上述MOFP得HM@MOFP。将混合物在带盖玻璃小瓶中使用FisherScientific FS30D水浴超声，频率为42kHz，功率100W，超声处理5分钟包裹含siPlk1的纳米囊，即本发明负载siRNA的仿生化ZIF-8纳米传递系统。
其中Hela细胞膜的提取过程为：
1)收集细胞：培养约2000-5000万Hela细胞，用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞。
2)洗涤细胞：
用适量冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞4℃，600g离心5分钟沉淀细胞。弃上清，随后4℃，600g离心1分钟，以沉淀离心管管壁上的残留液体并进一步沉淀细胞，尽最大努力吸尽残留液体。
3)细胞预处理：
把1毫升临用前添加了浓度为100×PMSF(使其终浓度为1×)的膜蛋白抽提试剂A加入至2000-5000万细胞中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置10-15分钟。
4)把细胞悬液转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中，匀浆约30-50下。
5)去除细胞核和未破碎的细胞：
4℃，700g离心10分钟，小心收集上清液至一新的离心管中。吸取上清时切勿接触沉淀。可以有约30-50微升上清液残留不予吸取，以保证吸取的上清液有较高的纯度。
6)沉淀细胞膜碎片：
4℃，14000g离心30分钟，以沉淀细胞膜碎片。
7)采用Bicinchoninic Acid(BCA)试剂测细胞膜上蛋白总含量。
图1为实施例1所得到的纳米颗粒的性质结果。图1AMOFP的比例为MIM与Zn(NO3)2·6H2O的固定质量比例为19:1；图1B中MIM与Zn(NO3)2·6H2O与siPLK1与Hela细胞膜的质量比为475：25：5：2500图1A为合成的ZIF-8装载的siPlk1纳米粒子(MOFP)，图1B图为提取的Hela细胞膜包裹MOFP后的粒子(HM@MOFP)。分析表明，MOFP的核心约为121nm(图1D)，包裹上癌细胞膜后，尺寸增加到约137纳米(图1E)。动态光散射(DLS)结果也与之相符，MOFP为120.7±6.8nm，电位值为-24.2±1.5mV而癌细胞膜包被后的粒径增为152.1±4.1nm，电位为-35.4±2.7mV。固定材料的组成(MIM与Zn(NO3)2·6H2O的固定比例为19:1)，将siRNA与ZIF-8的比例从1:3200,1:1600，1:800,1:400,1:200，1:100到1:50(图1C)，可以看到当材料与siRNA的比例达到1:100时，载药率仍然达到82％。
实施例2
本实施例用于说明本发明所述方法可以规模化制备。
将siRNA与ZIF-8的比例从1:3200,1:1600，1:800,1:400,1:200，1:100到1:50(图1C)，可以看到当材料与siRNA的比例达到1:200时，载药率仍然达到94％。
1)用无核酶水溶解50mg siPLK1干粉,可得20μM的siPLK1溶液；
2)取153.01μM二甲基咪唑(MIM)与20μM上述溶解的siLuciferase溶液室温下搅拌孵育10min；
3)取2.18μM六水合硝酸锌(Zn(NO3)2·6H2O)搅拌下加入到上述溶液中，室温孵育10min；
4)将上述混合液，4℃，12000rpm离心15分钟，去掉上清，再反复洗涤2次，得到的沉淀用无菌双蒸水重悬；
5)将上述混合液与Hela细胞膜混合，超声使用Fisher Scientific FS30Dbathsonicator，频率42kHz，功率100W，在带盖玻璃小瓶中超声处理5分钟包裹含siPlk1的纳米囊)。
通过两步合成法制备siRNA包封ZIF-8，包括siRNA和二甲基咪唑的孵育，然后进一步与Zn(NO3)2·6H2O孵育。我们通过测量MOF与siRNA在3200/1至50/1的连续重量比下孵育后的无结合siPlk1(siPlk1)来评估靶向Plk1的siPlk1对MOF的负载效率。电泳分析显示，在siPlk1比例增加至1:200之前，无负载siPlk1的量可以忽略不计siRNA分别以1:100和1:50的比例减少到82％和68％(图1A)。结果表明，ZIF-8具有较高的siRNA负载效率。更重要的是，我们发现基于MOF的核酸复合物可以在50mg的siRNA重量下形成，这足以给成人服用一次。
试验例1：肿瘤抑制体内实验
如实施例1方法合成纳米传递系统，MIM与Zn(NO3)2·6H2O与siPLK1与Hela细胞膜的质量比为475：25：5：2500，用于宫颈癌治疗。
图2是与其它治疗方法对比的结果，其中，HM@MOFP是实验组，MOFP是未用Hela细胞膜包被的对照组，而HM@MOFL的制备方法如下：
1)用无核酶水溶解siLuciferase干粉,可得20μM的siLuciferase溶液；
2)取231.43μM二甲基咪唑(MIM)与20μM上述溶解的siLuciferase溶液室温下搅拌孵育10min；
3)取3.36μM六水合硝酸锌(Zn(NO3)2·6H2O)搅拌下加入到上述溶液中，室温孵育10min；
4)将上述混合液，4℃，12000rpm离心15分钟，去掉上清，再反复洗涤2次，得到的沉淀用无菌双蒸水重悬；
5)将上述混合液与Hela细胞膜混合，超声使用Fisher Scientific FS30Dbathsonicator，频率42kHz，功率100W，在带盖玻璃小瓶中超声处理5分钟包裹含siPlk1的纳米囊)是用于检测siPlk1特异性沉默作用的对照组，siPlk1是未加修饰的药物对照组，HM@MOF是不含药物的空载对照组，Saline是完全空白对照组。A图为PLK1在小鼠体内的表达水平变化，B图为BALB/c裸鼠治疗后剥离的肿瘤。
取30只雌性BALB/c裸鼠(6-8周龄，体重在16g左右)，随机均分成以上所述六组，给药两周后，含siPLK1 20μg，分离小鼠肝脏，提取蛋白，通过蛋白免疫杂交印迹(WesternBlot)检测小鼠体内PLK1的水平(如图2所示)。
试验例2：癌细胞的体外转染实验
如实施例1方法合成纳米传递系统，MIM与Zn(NO3)2·6H2O与siPLK1与Hela细胞膜的质量比为475：25：5：2500对人来源的宫颈癌细胞(Hela)进行体外转染。
激光共聚焦显微镜(CLSM)观察细胞摄入。
1)取对数生长期Hela细胞用胰酶消化，洗涤，离心后将其制备成细胞悬液；
2)取1mL上述悬液接种于共聚焦小皿，每皿1.0*10^5个细胞，37℃培养过夜，显微镜下细胞贴壁生长密度达到80％以上后，加入cy5标记的siPlk1纳米药物含cy-siPLK1分别为25nM，50nM，100nM，200nM继续培养；
3)达到培养时间后，吸去原培养液，用预热的PBS洗涤，加入4％多聚甲醛室温固定10分钟，然后弃去用PBS洗涤2次；
4)弃去上述溶液而后用Hoechst室温染色15分钟，洗涤，于CLSM下拍摄(图3)。随着所合成的纳米颗粒HM@MOFP浓度的增加，Hela细胞对其摄入量也逐渐提高(红色cy5-siPLK1荧光增强)，在浓度为100nM时显示细胞对其摄入达到最大，再增大浓度也与在100nM时的摄入量基本相当。
试验例3蛋白免疫杂交印迹(Western Blot)检测细胞PLK1的水平
1)按实例1所述方法合成纳米传递系统，MIM与Zn(NO3)2·6H2O与siPLK1与Hela细胞膜的质量比为475：25：5：2500；
2)按上述方法制成细胞悬液，每孔取2mL于六孔板中培养，每孔细胞含3.0*10^5个，当细胞贴壁生长且密度达到80％后，给药进行转染；
3)培养24小时后，弃去上述原培养基，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，WB检测PLK1条带变化情况，如图4所示。WB分析证实HM@MOFP显著抑制PLK1的表达(图4A)，与未被膜包覆的MOFP颗粒相比相比，HM@MOFP还显示出显著的的基因沉默效果(18％对63％，图4B)。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种负载siRNA的仿生化ZIF-8纳米传递系统，其特征在于，所述纳米传递系统包括由细胞膜包裹的ZIF-8和siRNA。
2.根据权利要求1所述的纳米传递系统，其特征在于，所述细胞膜选自以下一种或多种：Hela细胞膜、Hepa1-6细胞膜、RAW264.7细胞膜；最优选为Hela细胞膜。
3.根据权利要求1或2所述的纳米传递系统，其特征在于，所述siRNA选自以下一种或多种：siPlk1、sic-erbB2、siPokemon；最优选为siPlk1。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米传递系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)用无核酶水溶解siPlk1干粉制备siPlk1溶液；
(2)将二甲基咪唑与步骤(1)得到的siPlk1溶液混合，室温下搅拌孵育；
(3)将六水合硝酸锌在搅拌下加入到步骤(2)所得溶液中孵育；
(4)将步骤(3)所得混合液离心，去掉上清，洗涤，得到的沉淀重悬；
(5)提取细胞膜，将步骤(4)所得混合液与细胞膜混合超声，得到所述纳米传递系统。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述2-甲基咪唑、六水合硝酸锌、siPlk1、细胞膜的质量比为100～1000：10～100：1～10：1000～5000，优选为为200～500：10～50：5～10：2000～3000，最优选为475：25：5：2500。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述siPlk1溶液浓度为1～100μM，优选为1～50μM，最优选为20μM。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述孵育时间为1～60min，优选为1～30min，最优选为10min；和/或
步骤(3)中所述孵育时间为1～60min，优选为1～30min，最优选为10min。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其特征在于，
所述超声频率为42kHz；所述超声功率为功率100W；和/或
所述超声时间为5分钟。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1至3中任一项所述的纳米传递系统和/或按照权利要求4至8中任一项的制备方法而制得的纳米递送系统；和药学上可接受的载体。
10.权利要求1至3中任一项所述的纳米传递系统和/或按照权利要求4至8中任一项的制备方法而制得的纳米递送系统在制备用于治疗癌症的药物和/或医疗产品中的应用；优选地，所述癌症为宫颈癌。
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