CN114259477A

CN114259477A - 一种促渗透、缓解肿瘤缺氧并能靶向肿瘤细胞的纳米递送体系及其制备方法和应用

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Publication number: CN114259477A
Application number: CN202210104890.5A
Authority: CN
Inventors: 高申; 李鹃鹃; 宫春爱; 韩治敏; 台宗光; 丁楠; 陈昕璐; 郭欢欢; 杨婷
Original assignee: First Affiliated Hospital of Naval Military Medical University of PLA
Current assignee: First Affiliated Hospital of Naval Military Medical University of PLA
Priority date: 2022-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2042-01-28
Also published as: CN114259477B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是一种促渗透、缓解肿瘤缺氧并能靶向肿瘤细胞的纳米递送体系及其制备方法和应用。本发明提供的纳米递送体系以介孔二氧化锰为基础，既作为载体可负载疏水性治疗药物，同时二氧化锰本身特有的催化性质可以促使肿瘤部位的过氧化氢产生氧气以缓解肿瘤部位的缺氧状态，其次，载体表面可嫁接胶原酶分解肿瘤细胞外基质促进渗透，最后在其表面包被由pH敏感脂质体与巨噬细胞膜融合的膜以达到靶向并且响应肿瘤微环境的目的。本发明为药物输送提供了一种新的纳米递送体系，可以靶向肿瘤细胞并响应肿瘤微环境，智能型的保护及暴露胶原酶发挥促渗透的作用，是一种高效、低毒、精准的纳米级递送系统。

Description

一种促渗透、缓解肿瘤缺氧并能靶向肿瘤细胞的纳米递送体系及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种促渗透、缓解肿瘤缺氧并能靶向肿瘤细胞的纳米递送体系及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤是目前人类最常见的发病和死亡原因之一，目前肿瘤的治疗方法主要包括化学治疗、放射疗法等。缺氧是实体肿瘤的一个突出特征。缺氧微环境加剧了肿瘤的恶性程度，降低了肿瘤对各种治疗方法的敏感性，如化疗、放疗、光动力治疗等，导致患者预后不良。一方面肿瘤的中心区域因混乱的血管结构导致一些区域无法通过血液循环供给氧气，另一方面肿瘤细胞旺盛的代谢加剧了缺氧的程度，导致缺氧状态的形成。因此，肿瘤供氧干预增强肿瘤治疗引起了广泛关注。

近年来，二氧化锰(MnO₂)纳米结构作为一种独特的肿瘤微环境(tumormicroenvironment，TME)响应治疗剂引起了广泛关注。研究表明二氧化锰(MnO₂)纳米颗粒在酸性TME条件下对H₂O₂具有较高的特异性和反应性，可生成O₂和H₂O。此外，Mn²⁺离子是MnO₂的产物，是一种重要的微量元素，可在体内有效代谢，还可作为磁共振成像(MRI)造影剂，为癌症的诊断和治疗提供指导。MnO₂纳米输送系统没有长期毒性可以安全地进行体内肿瘤治疗。特别是介孔二氧化锰(H-MnO₂)纳米结构，它有很大的比表面积和高孔隙体积,可以对抗肿瘤治疗药物进行有效装载和高效递送。

对于实体肿瘤，除肿瘤细胞外，还存在肿瘤相关成纤维细胞和胶原含量较高的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)等生理和物理屏障，极大地阻碍了纳米载体的扩散，导致其在肿瘤深部不易积聚。各种研究表明，胶原酶可以嫁接到纳米载体表面，消化胶原蛋白，促进纳米载体的扩散。然而，酶是一种不稳定的实体，可以在血液中迅速灭活。目前，寻找合适的载体来传递这种酶充满了挑战。

细胞膜仿生纳米药物递送系统将纳米载体的可改造性与细胞膜的天然功能结合起来，使该系统既拥有物理化学性质可随用途而调整的纳米粒，又继承了细胞膜复杂的功能，利用仿生膜包被可以保护胶原酶在血液循环中不被降解，又可以发挥仿生膜的靶向优势，这种纳米递送体系尚未被研究，期望可以为肿瘤治疗提供一种新型、高效、低毒的纳米药物递送系统。

发明内容

传统的治疗方式取得了很大的成果，但是在治疗过程中，仍存在重重困扰，化学治疗等治疗方式的耐药现象、传统的给药方式的脱靶效应、在体内不能有效地传递的原因等会带来一系列的副作用等，所以本发明考虑引入纳米体系递送相关药物实现化学治疗增敏。介孔二氧化锰因其特有的介孔结构作为纳米载体可以有效的封装药物，且由于其本身的催化化学功能可利用肿瘤微环境富余的过氧化氢产生氧气，从而缓解缺氧导致的耐药现象。

研究表明，巨噬细胞或巨噬细胞膜与纳米载药系统相结合，利用细胞膜表面的α4整合素与乳腺癌细胞血管粘附分子(VMAM-1)间的相互作用，增强纳米载药系统对于肿瘤部位与转移病灶的靶向性。为了保护和条件响应暴露胶原酶，本发明引入了pH敏感脂质体，脂质体与细胞膜均是磷脂层双分子结构，较为容易融合，同时给融合膜赋予了新的功能。

本发明构建的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的纳米材料装载了抗肿瘤药物阿霉素，期望是一个靶向肿瘤部位增加有效递送增强治疗效果的纳米递送系统。

为了克服现有技术存在的问题与不足，本发明的目的之一是提供pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的纳米材料，该材料可以靶向肿瘤细胞并能在肿瘤微环境响应，所述的纳米体系具有酸敏感特性，并且保留了巨噬细胞膜的炎症靶向性，同时还兼具胶原酶发挥促渗透功能、二氧化锰催化肿瘤微环境的过氧化氢产生氧气、又可递送抗肿瘤药物阿霉素从而发挥治疗肿瘤的效果。

本发明的目的之二是提供一种pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的纳米材料的制备方法，通过在介孔纳米颗粒表面修饰胶原酶并且包覆pH敏感融合膜，同时介孔纳米颗粒负载阿霉素。制备过程简单，操作方便，节约原材料，实验原材料来源丰富。

本发明的目的之三是提供pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的纳米材料的用途，通过负载的阿霉素实现对肿瘤化学治疗的增敏。

为实现上述目的，采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体(MP@H-MnO₂-Col)，由介孔二氧化锰、胶原酶、pH敏感融合膜组成，其中介孔二氧化锰表面嫁接胶原酶修饰，并包覆pH敏感融合膜；所述的pH敏感融合膜是由pH敏感脂质体和RAW264.7巨噬细胞膜进行融合而成的杂化膜。

进一步的，所述的多功能纳米载体的制备方法：是将胶原酶修饰的介孔二氧化锰与pH敏感融合膜融合混合，两者质量比为1：1，采用Avanti微型挤出机，在200纳米聚碳酸酯多孔膜上进行多次挤压，然后用离心机去除多余的pH敏感融合膜，新制备的多功能纳米载体在4℃PBS中过夜。

介孔二氧化锰进行氨基化后可以与羧基化的胶原酶结合，从而将胶原酶修饰在介孔二氧化锰表面，pH敏感融合膜最终包覆在胶原酶修饰的介孔二氧化锰表面形成所述的多功能纳米载体。

进一步的，所述的介孔二氧化锰参照中国专利文献CN107349211A(申请号201710618202.6)公开的介孔二氧化锰制备方法制备得到。

进一步的，所述的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的制备方法：介孔二氧化锰分散到水溶液中，加入APTES，在机械搅拌下加热到60～70℃并反应12～24h后，停止反应，冷却到室温，经分离、洗涤得到氨基功能化改性的介孔二氧化锰纳米粒子，同时在5mg胶原酶溶液中加入EDC 100mg和65mg NHS活化胶原酶的羧基30min，然后将获得的氨基化介孔二氧化锰加入上述溶液中在4℃下搅拌24h。

进一步的，所述的pH敏感融合膜的制备方法：将3.1毫克卵磷脂、0.8毫克胆固醇和2.2毫克DSPE-PEOz溶解在6毫升二氯甲烷中，然后将混合物旋蒸成薄膜；用2.8mL PBS和200μL巨噬细胞膜溶液水化薄膜制备pH敏感融合膜。

更进一步的，所述的巨噬细胞膜溶液的制备方法：将RAW264.7细胞在培养瓶中孵化，细胞数量大约为1×10⁸个，然后用细胞刮刀分离，在1500g离心处理5分钟；收集的细胞在预冻的pH为7.4的PBS缓冲溶液重悬，在1500g离心5分钟；获得的细胞颗粒悬浮在低渗溶液中(该低渗溶液包含膜蛋白抽提试剂A和苯甲基磺酰氟，根据说明书的介绍，1ml上述混合低渗透溶液可以重悬2000-5000万细胞)，然后在冰浴中孵化10-15分钟，将溶液反复冻融，在4℃，700g离心10min，上清液14000g离心30min，收集细胞膜碎片，利用Avanti挤出机，在400纳米的聚碳酸酯多孔膜，反复挤压细胞膜即得巨噬细胞膜溶液。

本发明的第二方面，提供一种如上所述的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体(MP@H-MnO₂-Col)的制备方法，是将胶原酶修饰的介孔二氧化锰与pH敏感融合膜融合混合，两者质量比为1：1，采用Avanti微型挤出机，在200纳米聚碳酸酯多孔膜上进行多次挤压，然后用离心机去除多余的pH敏感融合膜，新制备的多功能纳米载体在4℃PBS中过夜。

进一步的，所述的制备方法包括如下步骤：

(A)介孔二氧化锰的纳米颗粒制备：参考中国专利文献CN107349211A(申请号201710618202.6)公开的介孔二氧化锰制备方法制备介孔二氧化锰；

(B)胶原酶修饰的介孔二氧化锰制备：介孔二氧化锰分散到水溶液中，加入APTES，在机械搅拌下加热到60～70℃并反应12～24h后，停止反应，冷却到室温，经分离、洗涤得到氨基功能化改性的介孔二氧化锰纳米粒子，同时在5mg胶原酶溶液中加入EDC 100mg和65mgNHS活化胶原酶的羧基30min，然后将获得的氨基化介孔二氧化锰加入上述溶液中在4℃下搅拌24h；

(C)pH敏感融合膜的制备：将RAW264.7细胞在培养瓶中孵化，细胞数量大约为1×10⁸个，然后用细胞刮刀分离，在1500g离心处理5分钟；收集的细胞在预冻的pH为7.4的PBS缓冲溶液重悬，在1500g离心5分钟；获得的细胞颗粒悬浮在低渗溶液中，该低渗溶液包含膜蛋白抽提试剂A和苯甲基磺酰氟，根据说明书的介绍，1ml上述混合低渗透溶液可以重悬2000-5000万细胞，然后在冰浴中孵化10-15分钟，将溶液反复冻融，在4℃，700g离心10min，上清液14000g离心30min，收集细胞膜碎片，利用Avanti挤出机，在400纳米的聚碳酸酯多孔膜，反复挤压细胞膜即得巨噬细胞膜溶液；

此外，将3.1毫克卵磷脂、0.8毫克胆固醇和2.2毫克DSPE-PEOz溶解6毫升二氯甲烷中置于圆形底烧瓶里，然后将混合物旋蒸成薄膜。用2.8mL PBS和200μL巨噬细胞膜溶液水化薄膜制备pH敏感融合膜；

(D)MP@H-MnO₂-Col的制备：上述所得胶原酶修饰的介孔二氧化锰与制备pH敏感融合膜融合混合，两者质量比为1：1，采用Avanti微型挤出机，在200纳米聚碳酸酯多孔膜上进行多次挤压，然后用离心机去除多余的步骤(C)制得的pH敏感融合膜，新制备的MP@H-MnO₂-Col在4℃PBS中过夜。

本发明的第三方面，提供一种如上所述的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体(MP@H-MnO₂-Col)在制备药物递送系统中的应用。

本发明的第四方面，提供一种如上所述的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体(MP@H-MnO₂-Col)在制备肿瘤治疗药物的应用。

MP@H-MnO₂-Col是一种可以靶向肿瘤细胞并能在肿瘤微环境可以响应的酶敏感纳米体系，所述的纳米体系具有酸敏感特性，并且保留了巨噬细胞膜的炎症靶向性在抗肿瘤治疗中的应用。

进一步的，所述的肿瘤治疗药物是通过如上所述的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体(MP@H-MnO₂-Col)包载阿霉素。

进一步的，所述的MP@H-MnO₂-Col包载阿霉素的方法：先用介孔二氧化锰(H-MnO₂)包载化疗药阿霉素(Dox)，并在其表面修饰胶原酶(Col)，进一步将pH敏感脂质体(P)与巨噬细胞膜(M)的融合膜(MP)包裹在胶原酶修饰的载阿霉素的介孔二氧化锰表面构建得到MP@H-MnO₂-Dox-Col。

更进一步的，所述的介孔二氧化锰(H-MnO₂)包载化疗药阿霉素(Dox)的方法：取2mg H-MnO₂，加入1mg·mL^-1DOX溶液6mL，混匀后于避光搅拌孵育一整夜，高速离心(11000rpm,30min)除去未负载成功的药物，并用去离子水洗涤、离心2遍，即得H-MnO₂-Dox。

更进一步的，所述的肿瘤为乳腺癌。

本发明的第五方面，提供一种如上所述的多功能纳米载体(MP@H-MnO₂-Col)包载阿霉素在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的第六方面，提供一种乳腺癌治疗药物，所述的乳腺癌治疗药物是由如上所述的多功能纳米载体(MP@H-MnO₂-Col)包载阿霉素。

本发明的原理如图1所示：

介孔二氧化锰(H-MnO₂)包载化疗药阿霉素(Dox)，并在其表面修饰胶原酶(Col)，为了避免胶原酶在体内运过程中酶活性失活，以及希望实现纳米递送系统在肿瘤部位暴露胶原酶发挥降解细胞外基质的作用，我们进一步将pH敏感脂质体(P)与巨噬细胞膜(M)的融合膜(MP)包裹在胶原酶修饰的载阿霉素的介孔二氧化锰表面构建MP@H-MnO₂-Dox-Col，赋予纳米递送系统肿瘤酸性微环境敏感的特性以及炎症靶向的功能，最终构建免疫原性低、靶向性强以及肿瘤酸性微环境响应的载药仿生纳米粒，为进一步实现改善肿瘤微环境缺氧和有效的化学治疗作用提供条件，为探索改善乳腺癌化疗耐药提供了可能性。

本发明优点在于：

1、由于pH敏感融合膜赋予纳米颗粒表面功能化，MP@H-MnO₂-Col可以逃脱免疫清除，具有炎症靶向以及酸敏感靶向功能，从而显著增强其肿瘤部位的富集能力。

2、MP@H-MnO₂-Col可以在肿瘤微环境响应暴露胶原酶，分解肿瘤部位密集的细胞外基质，同时二氧化锰发挥催化肿瘤部位过氧化氢产生氧气的作用缓解肿瘤部位缺氧，结合递送治疗药物，具有更优更强大的治疗效果。

3、本发明提供的促渗透、缓解缺氧、靶向肿瘤细胞的纳米递送体系，以介孔二氧化锰为基础，既作为载体可负载疏水性治疗药物，同时二氧化锰本身特有的催化性质可以促使肿瘤部位的过氧化氢产生氧气以缓解肿瘤部位的缺氧状态，其次，载体表面可嫁接胶原酶分解肿瘤细胞外基质促进渗透，最后在其表面包被由pH敏感脂质体与巨噬细胞膜融合的膜以达到靶向并且响应肿瘤微环境的目的。所述的介孔二氧化锰载体具有较小的孔径以及较大的比表面积，表现出良好的载药能力，表面连接胶原酶增加其向肿瘤深部渗透的功能，pH敏感融合膜的包被既保护了胶原酶在体内的活性，同时发挥肿瘤微环境响应释放药物的作用。

4、本发明为药物输送提供了一种新的纳米递送体系，可以靶向肿瘤细胞并响应肿瘤微环境，智能型的保护及暴露胶原酶发挥促渗透的作用，一方面发生化学反应释放氧气，另一方面将化疗药物递送至细胞内，发挥深部的抗肿瘤作用，可以靶向肿瘤细胞递送化学治疗药物，缓解缺氧促渗透，从而促进乳腺癌细胞的凋亡，是乳腺癌化学治疗的一种高效、增敏、低毒、精准的纳米级递送系统。

附图说明

图1.本发明纳米颗粒构建图；

图2.MP@H-MnO₂-Dox-Col纳米颗粒的粒径；

图3.MP@H-MnO₂-Dox-Col纳米颗粒的电位；

图4.MP@H-MnO₂-Dox-Col纳米颗粒的透射电镜图；

图5.MP@H-MnO₂-Dox-Col纳米颗粒的稳定性考察；

图6.不同条件下Dox的释放考察；

图7.不同条件下产氧能力考察；

图8.不同纳米颗粒胶原酶活性考察；

图9.4T1细胞对MP@H-MnO₂-Dox-Col中Dox摄取的共聚焦结果；

图10.不同条件下细胞缺氧逆转考察；

图11.不同浓度载体对细胞的细胞毒性考察；

图12.MP@H-MnO₂-Dox-Col在4T1肿瘤球的渗透考察；

图13MP@H-MnO₂-Dox-Col对4T1肿瘤球的细胞毒性考察。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：MP@H-MnO₂-Dox-Col纳米颗粒的合成

参考中国发明专利CN201710618202.6的方法合成介孔二氧化锰，随之进行胶原酶修饰和pH敏感融合膜的包覆和阿霉素载药，平均粒径结果及电位见图2、图3)，电镜图见图4，粒径结果与透射电镜图相一致，MP@H-MnO₂-Dox-Col纳米颗粒粒径约为220nm。

实施例2：MP@H-MnO₂-Dox-Col纳米颗粒的稳定性考察

将H-MnO₂-Dox NPs和MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs重悬于PBS中，15天内用DLS测定样品的粒径，考察NPs的稳定性。结果见图5，MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs和H-MnO₂-Dox NPs在2周的研究期间都保持了较好的稳定性。

实施例3：不同条件下Dox的释放考察

采用透析袋法评价MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs分别在有或无100μM过氧化氢在pH＝7.4或pH＝6.5条件下阿霉素的释放度。将2毫升MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs置于透析袋(MWCO＝3500Da)中，分别沉浸在50毫升不同的外液中，37.0℃，100rpm搅拌。分别于0.5，1，2，3，4，5，10，15，20，25h取1ml溶液，用紫外-可见分光光度法测定吸光度，并用等体积的释放液代替。绘制体外释放曲线。

如图6所示，在H₂O₂和pH 6.5的作用下，MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs在15h内释放Dox的量逐渐达到>70％(p<0.01)，显著高于其他组。表明所制备的MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs可以根据肿瘤部位H⁺和H₂O₂的特性“按需”释药。

实施例4：体外产氧能力考察

RDPP探针的荧光可被O₂强烈猝灭，我们选用RDPP探针来检测O₂的产生情况。步骤：将1mL Dox+Col、H-MnO₂-Dox和MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs(50μg mL^-1)均匀悬浮于pH＝6.5的PBS溶液中。加入50μL RDPP乙醇溶液(0.01M)搅拌5min，再加入250μL H₂O₂(100mM)。记录各个时间点各组样品在发射波长615nm处RDPP的荧光强度情况。

结果见图7所示，其结果表明含有H-MnO₂的溶液可以产生氧气，并在短时间内迅速将探针荧光猝灭，使其荧光强度迅速衰减，结果可以证实H-MnO₂具有较强的产氧能力。

实施例5：不同纳米颗粒胶原酶活性考察

采用胶原酶试剂盒对仿生纳米体系中的胶原酶活性进行检测分析。步骤：于96孔板上分别加入60μL胶原酶检测缓冲液、40μL的胶原酶底物和100μL样品。用酶标仪测量所有样品孔在345nm处的吸光度。

结果见图8所示，结果表明修饰在介孔二氧化锰表面上的胶原酶依旧保留酶的活性，包膜后的纳米递送体系的酶活性测定结果降低，结果表明pH敏感融合膜可以保护胶原酶活性。

实施例6：4T1细胞对MP@H-MnO₂-Dox-Col中Dox摄取的共聚焦结果

采用激光共聚焦显微镜(CLSM)技术研究纳米粒在4T1细胞内的分布情况。步骤：将无菌圆形盖玻片提前放入24孔板中，然后将4T1细胞以5000个细胞/孔的细胞量接种到24孔板，培养24h后，移去旧的培养基，将游离Dox、H-MnO₂-Dox NPs、MP@H-MnO₂-Dox NPs(pH＝7.4或6.5)、MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs(pH＝7.4或6.5)(Dox浓度：1μg/mL)加入培养板中，补充不含血清培养基至每孔体积500μL，而后在37℃，5％CO₂环境中培养4小时后，吸去旧的培养基，用PBS洗涤1次，用4℃预冷的4％多聚甲醛固定30min，弃去4％多聚甲醛，用PBS洗涤3次。用移液枪吸取8μL含有DAPI液的封片液滴于载玻片上，将圆形盖玻片取出，将含有细胞的一面慢慢贴于含有DAPI液的载玻片上，小心操作避免气泡产生。利用CLSM观察纳米粒在4T1细胞内的分布情况，并拍照记录。

结果如图9所示，结果表明包膜组的细胞内荧光分布高于不包膜组，pH6.5条件下的纳米粒子胞内分布高于pH7.4，表明了pH敏感融合膜的包覆可以促进纳米粒进入细胞。

实施例7：不同条件下细胞缺氧逆转考察

使用[Ru(dpp)₃]Cl₂探针观察MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs对细胞缺氧情况的逆转效果。将4T1细胞(10⁵个细胞/孔)置于常氧和低氧环境共聚焦培养皿中培养24h。为探讨细胞内缺氧情况的改善，将MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs加入细胞缺氧6h后，用[Ru(dpp)₃]Cl₂探针孵育6h。PBS冲洗细胞，使用CLSM观察。

结果如图10所示，加入MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs的细胞内荧光较缺氧组显著减弱，较常氧组有类似的荧光强度，表明MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs可以有效产氧并改善细胞缺氧环境。

实施例8：载体的细胞毒性研究

通过CCK8法考察空白递送载体H-MnO₂ NPs和MP@H-MnO₂-Col NPs的细胞毒性，以评价载体的安全性。分离出的4T1细胞以5000个/孔的密度铺96孔板，细胞在含有10％胎牛血清的RMPI-1640培养基中生长24小时。在每孔中加入不同浓度H-MnO₂ NPs和MP@H-MnO₂-ColNPs进行处理，24h后，培养板移去旧的培养基，重新加入90μL培养基和10μL CCK8试剂，然后放入孵育箱中放置2h。取出需要检测的培养板，放于酶标仪震荡30s，然后测定在450nm波长处的各个孔的OD值。空白组为未接种细胞组的OD值，对照组为未加入药物的OD值，每个孔重复测量6次。细胞存活率依照如下方法进行：

存活率＝(实验组-空白组)/(对照组-空白组)*100％

如图11所示，结果表明在载体浓度达到167μg/mL时细胞的相对活力仍在80％以上，说明载体本身对细胞的毒性较低，具有较好的安全性。也可以排除后续试验中因为载体毒性而引起的细胞活力的下降。

实施例9：纳米颗粒在肿瘤球的渗透考察

三维(3D)肿瘤球根据液体覆盖法进行培养构建。96孔板涂上无菌的50μL1％琼脂糖。每孔接种2×10³个4T1细胞。在37℃，5％CO₂的条件下培养约5天。在显微镜下观察球体的生长。当三维肿瘤椭球体直径达到约250μm时，进行后续的三维肿瘤球体实验。

将直径为250μm的肿瘤球转移到共聚焦皿中，加入MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs(pH7.4或pH6.5)、游离Dox处理4h。利用CLSM对3D肿瘤球体进行z叠扫描，间隔5μm，从上到下扫描。通过对多个肿瘤球体同时成像观察Dox的渗透情况。

结果如图12所示，结果显示：在游离Dox处理组，仅在球体边缘观察到微弱的荧光。MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs(pH＝7.4)孵育的肿瘤球形体在50μm深度的外环处有较强的红色荧光，而在较深区域则没有，说明药物不能进入肿瘤深部发挥治疗作用。相反，在扫描深度为65μm时，MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs(pH＝6.5)组的红色荧光几乎完全分布在肿瘤球内部，说明在pH＝6.5时，MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs的渗透性高于MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs pH＝7.4以及游离Dox。

实施例10：纳米颗粒在肿瘤球的细胞毒性考察

按照上述肿瘤球培养方法培养肿瘤球，选取直径在250μm的肿瘤球进行实验。分别将Dox、H-MnO₂-Dox NPs、MP@H-MnO₂-Dox NPs(pH＝7.4或6.5)、MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs(pH＝7.4或6.5)(Dox浓度：5μg/mL)加入到上述肿瘤球所在的96孔板中，孵育72h。使用CytoTox

Non-Radioactive cytotoxic Assay Kit检测细胞毒性。

结果如图13所示，结果显示：MP@H-MnO₂-Dox-Col NPs(pH6.5)处理组显示出明显的细胞死亡，细胞死亡接近于70％，这可能是由于杂化膜MP酸敏感崩解，暴露Col降解基质，促进了NPs的渗透，从而增强了Dox的抗肿瘤作用。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体，由介孔二氧化锰、胶原酶、pH敏感融合膜组成，其中介孔二氧化锰表面嫁接胶原酶修饰，并包覆pH敏感融合膜；所述的pH敏感融合膜是由pH敏感脂质体和RAW264.7巨噬细胞膜进行融合而成的杂化膜。

2.根据权利要求1所述的多功能纳米载体，其特征在于，所述的多功能纳米载体的制备方法：是将胶原酶修饰的介孔二氧化锰与pH敏感融合膜融合混合，两者质量比为1：1，采用Avanti微型挤出机，在200纳米聚碳酸酯多孔膜上进行多次挤压，然后用离心机去除多余的pH敏感融合膜，新制备的多功能纳米载体在4℃PBS中过夜。

3.根据权利要求1所述的多功能纳米载体，其特征在于，所述的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的制备方法：介孔二氧化锰分散到水溶液中，加入APTES，在机械搅拌下加热到60～70℃并反应12～24h后，停止反应，冷却到室温，经分离、洗涤得到氨基功能化改性的介孔二氧化锰纳米粒子，同时在5mg胶原酶溶液中加入EDC 100mg和65mg NHS活化胶原酶的羧基30min，然后将获得的氨基化介孔二氧化锰加入上述溶液中在4℃下搅拌24h。

4.根据权利要求1所述的多功能纳米载体，其特征在于，所述的pH敏感融合膜的制备方法：将3.1毫克卵磷脂、0.8毫克胆固醇和2.2毫克DSPE-PEOz溶解在6毫升二氯甲烷中，然后将混合物旋蒸成薄膜；用2.8mL PBS和200μL巨噬细胞膜溶液水化薄膜制备pH敏感融合膜。

5.一种如权利要求1所述的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体的制备方法，其特征在于，是将胶原酶修饰的介孔二氧化锰与pH敏感融合膜融合混合，两者质量比为1：1，采用Avanti微型挤出机，在200纳米聚碳酸酯多孔膜上进行多次挤压，然后用离心机去除多余的pH敏感融合膜，新制备的多功能纳米载体在4℃PBS中过夜。

6.一种如权利要求1所述的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体在制备药物递送系统中的应用。

7.一种如权利要求1所述的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体在制备肿瘤治疗药物的应用。

8.根据权利要求7所述的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体在制备肿瘤治疗药物的应用，其特征在于，所述的肿瘤治疗药物是通过所述的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体包载阿霉素。

9.一种如权利要求1所述的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体包载阿霉素在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.一种乳腺癌治疗药物，所述的乳腺癌治疗药物是由如权利要求1所述的pH敏感融合膜包覆的胶原酶修饰的介孔二氧化锰的多功能纳米载体包载阿霉素。