CN114940512A - 一种中空二氧化锰纳米粒及其制备方法、用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物制剂技术领域,涉及一种中空二氧化锰纳米粒及其制备方法、用途。该中空二氧化锰纳米粒的制备包括以下步骤:将MnO2/SiO2纳米颗粒在碱性条件下进行蚀刻,分离所得沉淀溶解后加入3‑氨丙基三乙氧基硅烷及二甲基甲酰胺进行反应,即得。本发明提供的方法制备得到的中空二氧化锰纳米粒能显著提高对水溶性金属盐类药物的载药量,并可将粒径保持在100nm左右,经巨噬细胞来源微囊泡伪装后其粒径依然可以维持在100nm左右,经巨噬细胞来源微囊泡伪装后得到的载药纳米粒具有清除炎症部位过度蓄积的活性氧物种、提供抗炎效果的作用,且安全有效、无毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域,涉及一种中空二氧化锰纳米粒及其制备方法、用途,尤其涉及一种巨噬细胞来源微囊泡伪装的改良型载药二氧化锰纳米粒及其制备方法、用途。
背景技术
大约1%的世界人口患有类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)。RA是一种广泛且无法治愈的自身免疫性慢性炎症疾病,其以关节肿胀、疼痛、僵硬、滑膜破坏为特征,严重影响患者的生理功能,并且一些RA患者可能出现其他器官的疾病表现,如间质性肺病、心包炎、胸腔积液或支气管扩张。随着病情不断恶化,可能引起患者残疾、全身性并发症,甚至造成死亡。RA的炎症反应可迅速招募多种免疫细胞聚集在关节部位,如巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞等,并将其部分转化为促进RA发展的炎症性细胞表型。除此之外,在RA中,浸润关节滑膜的免疫细胞氧气供应不足,诱导活性氧物种(Reactive oxygen species,ROS)的产生。ROS的过表达被认为是软骨细胞凋亡的炎症介质,导致组织损伤,加剧滑膜炎症。ROS的过度积累更是进一步恶化了RA的病理过程。
中空二氧化锰纳米粒除了具有药物负载能力,同时在肿瘤研究中已被证明是一种有效的活性氧物种之一——过氧化氢(H2O2)去除剂。中空二氧化锰纳米粒在酸性条件下表现出过氧化氢酶样活性,促进H2O2分解并产生O2,具有改善肿瘤乏氧环境的效果,同时反应的MnO2可进一步转化为二价锰离子(Mn2+),具有磁共振成像的功能。此外,无毒的Mn2+离子可被肾脏迅速消除,因此长期毒性无需担心。
炎症作为癌症肿瘤疾病发展的前期基础,具有与肿瘤类似的疾病环境条件。现有技术CN113244409A公开一种具有清除活性氧及抗炎作用协同增强效果的纳米粒子及其应用,其公开的制备方法制得的中空二氧化锰纳米粒呈花生粒或椭状,然而粒径却在500-600nm,并且对药物的负载能力低下(载药量<20%),这无论是对于炎症或是肿瘤疾病应用而言都有待提高。
发明内容
为了实现上述发明目的,本发明采用以下技术方案:
本发明提供一种中空二氧化锰纳米粒的制备方法,包括以下步骤:将MnO2/SiO2纳米颗粒在碱性条件下进行蚀刻,分离所得沉淀溶解后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷及二甲基甲酰胺,在55℃~65℃下反应6~10h,即得所述中空二氧化锰纳米粒。
优选地,所述沉淀的干燥品与所述3-氨丙基三乙氧基硅烷、所述二甲基甲酰胺的混合比为30~40g∶0.4~0.5L∶0.4~0.5L。
优选地,所述MnO2/SiO2纳米颗粒是按照以下方法制备得到:
将硅源加入至无水乙醇、水及氨水的混合溶液中,在50℃~60℃下反应110min,并在反应过程中补入1~2次氨水,反应物离心,收集沉淀,得到单分散SiO2纳米粒;
将所述单分散SiO2纳米粒溶解后与高锰酸钾混合,反应6-7h,得到所述MnO2/SiO2纳米颗粒;
其中,所述补入1~2次氨水是在反应10min后或距前次加入间隔10min后再次加入氨水,且所述无水乙醇与每次补入氨水的体积比为50∶2.5~3.5。
优选地,所述氨水的质量浓度为25%,所述混合溶液中无水乙醇、水及氨水的体积比为25∶1∶3;
所述硅源与所述无水乙醇的体积比为3~7:50;
所述单分散SiO2纳米粒与所述高锰酸钾的质量比为6.5~8.5∶1。
本发明还提供一种根据上述方法制备得到的中空二氧化锰纳米粒。
本发明还提供一种微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒的制备方法,是将所述中空二氧化锰纳米粒负载抗类风湿性关节炎类药物后,与巨噬细胞来源微囊泡自组装后得到。
优选地,所述中空二氧化锰纳米与所述抗类风湿性关节炎类药物的质量比为1∶0.5~3;
所述中空二氧化锰纳米负载抗类风湿性关节炎类药物后所得产物与所述巨噬细胞来源微囊泡的质量比为1∶1.5~2.5;
所述巨噬细胞来源微囊泡是将处于对数生长期的M0型、M1型或M2型的RAW264.7巨噬细胞有血有抗的DMEM培养基更换为无血无抗的DMEM培养基继续培养,收集培养基,离心后所得;
所述抗类风湿性关节炎类药物为水溶性金属盐类药物。
本发明还提供了根据上述方法制备得到的微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒。
本发明还提供了所述微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒在制备抗类风湿性关节炎药物中的用途。
本发明还提供一种用于抗类风湿性关节炎的药物,其包括所述微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒,以及药学上可接受的辅料或载体。
对比现有技术,本发明的有益效果为:
1、本发明采用单分散二氧化硅纳米粒作为模板并通过碱性蚀刻制备得到中空二氧化锰纳米粒,通过控制二氧化硅纳米粒水动力学粒径在100-200nm之间,制备出实际粒径100nm左右的中空二氧化锰纳米粒。
2、本发明选择3-氨丙基三乙氧基硅烷与二甲基甲酰胺逆转中空二氧化锰纳米粒的表面电荷,使水溶性金属盐药物可通过静电作用及中空二氧化锰纳米粒的空腔吸附负载在纳米粒上,增强了中空二氧化锰纳米粒的载药能力,使制备得到的中空二氧化锰纳米粒对水溶性金属盐类药物载药量高达48.3%左右,并且包封率保持在90%以上。此外,该中空二氧化锰纳米粒呈球形,且粒径在100nm左右,有利于微囊泡包被的均匀性,该中空二氧化锰纳米粒可以作为一种优异的药物递送纳米载体。
3、本发明采用超滤浓缩法和超高速离心法从巨噬细胞中分离出巨噬细胞来源微囊泡,将该巨噬细胞来源微囊泡通过静电相互作用紧密包裹在中空二氧化锰载药纳米粒的表面,制得微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒,该微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒的粒径依然可以维持在100nm左右,可通过同源粘附和被动靶向被炎症部位富集的巨噬细胞摄取,具有清除炎症部位过度蓄积的活性氧物种和通过抗类风湿性关节炎药物来改善疾病的双重作用。
4、本发明将巨噬细胞来源微囊泡和经改良后的中空二氧化锰纳米粒作为载体材料,制备出高载药量、高生物相容性、低毒性以及低免疫原性的靶向类抗风湿性关节炎的纳米药物。体外试验结果显示,该纳米药物能够有效清除活性氧物种——H2O2;在类风湿性关节炎大鼠模型中,药代动力学研究显示出:该纳米药物能同时达到靶向疾病部位,延长药物半衰期;体内试验显示:该纳米药物对疾病大鼠表现出优异的疗效;体内安全性评价显示:该纳米药物未造成任何肝肾毒性,也未发生任何溶血情况,具备良好的安全性。
附图说明
图1为本发明实施例提供的微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒的制备流程图;
图2为实施例9制备得到的单分散SiO2纳米粒的水动力学粒径;
图3为实施例10制备得到的单分散SiO2纳米粒的水动力学粒径;
图4为实施例1、实施例13及实施例14制备得到的H-MnO2的粒径分布图;
图5为经本发明改良的与未经改良的H-MnO2纳米粒Zeta电位对比图;
图6为H-MnO2纳米粒的包封率及载药量;A、H-MnO2纳米粒载药量及包封率筛选图;B、在投料质量比为1:1的条件下,经本发明改良的(记为H-MnO2 +)与对比例1提供的H-MnO2纳米粒的载药量及包封率对比图;****P<0.0001;
图7为本发明实施例15提供的M1MV-MnO2@DSP纳米粒合成过程中的粒径变化;
图8为实施例15提供的H-MnO2纳米粒(A)与M1MV-MnO2@DSP纳米粒(B)的TEM图;
图9为M1MV-MnO2@DSP纳米粒体外抗氧化评价;A、经50μg/ml的M1MV-MnO2@DSP纳米粒处理后的H2O2溶液在不同时间的吸光度;B、经不同浓度的M1MV-MnO2@DSP纳米粒处理H2O2溶液20min时的吸光度;
图10为M1MV-MnO2@DSP纳米粒体内药效学评价;A、经M1MV-MnO2@DSP组和对照组治疗前后CIA大鼠关节肿胀程度变化;B、经M1MV-MnO2@DSP组和对照组治疗后CIA大鼠关节Micro-CT的相关指标,B1、BV/TV,B2、Tb-Th;C、经M1MV-MnO2@DSP组和对照组治疗后的CIA大鼠血清中HIF-α和IL-10,C1、HIF-1α,C2、IL-10;各组与Saline组相比,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001;
图11为M1MV-MnO2@DSP组和对照组治疗过程中CIA大鼠足体积、体重、踝关节直径和关节评分变化;A、足体积;B、体重;C、踝关节直径;D、关节评分;各组与Saline组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001;
图12为M1MV-MnO2@DSP组和对照组在不同时间点体内各组织及脏器的分布量以及血药浓度-药时曲线;A、1h分布量;B、4h分布量;C、8h分布量;D、血药浓度-药时曲线;各组与DSP组相比,**P<0.01,***P<0.001;
图13为M1MV-MnO2@DSP体内安全性评价;A、经M1MV-MnO2@DSP组和对照组治疗后大鼠的肝脏H&E染色;B、经M1MV-MnO2@DSP组和对照组治疗后大鼠的肾脏H&E染色;C、M1MV-MnO2@DSP组和对照组的ALT、AST检测结果;D、M1MV-MnO2@DSP组和对照组的溶血实验:D1、不同药物浓度下M1MV-MnO2@DSP组和对照组的溶血情况的定量,D2、2000μg/ml浓度下不同处理组的溶血情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
在本发明中的实施例中,选用M1型的RAW264.7巨噬细胞提取微囊泡(M1MV),选用地塞米松磷酸钠(DSP)作为抗类风湿性关节炎类药物,以SD大鼠的类风湿性关节炎模型作为主要动物模型评估纳米粒治疗效果。此外,微囊泡可以来源于其他不同表型的RAW264.7巨噬细胞,抗类风湿性关节炎类药物还可以采用甲氨蝶呤二钠盐及其他金属盐类药物。
图1为本发明提供的微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒的制备流程图。
实施例1
中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒制备和表征
中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备包括以下步骤:
步骤1:合成单分散SiO2纳米粒,具体地,①50ml无水乙醇、2ml超纯水和6ml 25%的氨水混合,封口,超声15min,记为A液;A液在55℃下水浴加热10min;②取3ml TEOs和25ml无水乙醇混合,超声25min,记为B液;③A液伴随搅拌缓慢倒入B液,封口,放入55℃水浴锅中反应(10min后,加3ml质量浓度25%氨水,此步骤完成2次,第二次是在第1次加入后间隔10min再次加入),继续反应90min。④离心(9000r、25℃)15min收集沉淀,纯水洗涤数次,随后40℃真空干燥;
步骤2:合成MnO2/SiO2纳米粒,具体地,①称取200mg步骤1制得优选的SiO2白色粉末,超纯水超声分散至混悬液;②称取1500mg KMnO4固体并制备成KMnO4溶液;③在超声作用下,将高锰酸钾溶液全部滴加到SiO2悬浮液中,再超声10min后取出;④静置反应6h后,离心(12950r/min,25℃)20min收集合沉淀,纯水洗涤数次;
步骤3:合成H-MnO2纳米粒,具体地,①将步骤2制得的产物溶于60℃100ml2mol/LNa2CO3溶液中放置过夜;②吸出多余的上清液,将剩余固液混合物离心(9000r、25℃)10min,并用纯水洗涤数次,干燥待用;③称取上述干燥产物(80mg)、丙三醇(6400mg)以及超纯水(800mg),超声混合20min;加入1mlAPTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)和1ml DMF(二甲基甲酰胺),60℃水浴加热搅拌反应8h;随后离心(9000r,25℃)15min收集沉淀,纯水洗涤数次并冷冻干燥保存。
实施例2
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于步骤3中反应温度为55℃,反应时间为10h。
实施例3
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于步骤3中反应温度为65℃,反应时间为6h。
实施例4
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于步骤3中加入0.8mlAPTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)和1ml DMF(二甲基甲酰胺)。
实施例5
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于步骤3中加入0.8mlAPTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)和0.8ml DMF(二甲基甲酰胺)。
实施例6
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于步骤3中称取上述干燥产物(60mg)、丙三醇(6400mg)以及超纯水(800mg),超声混合20min;加入1mlAPTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)和1ml DMF(二甲基甲酰胺)。
实施例7
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于步骤1中TEOs的加入量为5mL。
实施例8
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于步骤1中TEOs的加入量为7mL。
实施例9
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于步骤1在反应过程中未补入氨水。
实施例10
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于步骤1在反应过程中补入3mL氨水1次。
实施例11
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于步骤1在反应过程中补入2.5mL氨水1次。
实施例12
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于步骤1在反应过程中补入3.5mL氨水1次。
图2~3分别为实施例9及实施例10(实施例10~12制备的中空二氧化锰纳米粒的粒径基本相近,故此处仅以实施例10为例进行说明)制备得到的单分散SiO2纳米粒的水动力学粒径。
实施例13
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于:高锰酸钾的加入量为1300mg。
实施例14
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,与实施例1的不同在于:高锰酸钾的加入量为1700mg。
图4显示,实施例1(由于实施例1~8制备得到的中空二氧化锰纳米粒的粒径基本相同,故此处仅以实施例1为例对粒径进行说明)、实施例13及实施例14制备得到的中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)的平均粒径分别为182.70±19.79nm、176.05±5.01nm和155.27±2.91nm,均小于200nm。
对比例1
一种中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒的制备方法,包括以下步骤:
步骤1:合成单分散SiO2纳米粒,具体地,①50ml无水乙醇、2ml超纯水和6ml 25%的氨水混合,封口,超声15min,记为A液;A液在55℃下水浴加热10min;②取3ml TEOs和25ml无水乙醇混合,超声25min,记为B液;③A液伴随搅拌缓慢倒入B液,封口,放入55℃水浴锅中反应(10min后,加3ml质量浓度25%氨水,此步骤完成2次,第二次是在第1次加入后间隔10min再次加入),继续反应90min。④离心(9000r、25℃)15min收集沉淀,纯水洗涤数次,随后40℃真空干燥;
步骤2:合成MnO2/SiO2纳米粒,具体地,①称取200mg步骤1制得优选的SiO2白色粉末,超纯水超声分散至混悬液;②称取1500mg KMnO4固体并制备成KMnO4溶液;③在超声作用下,将高锰酸钾溶液全部滴加到SiO2悬浮液中,再超声10min后取出;④静置反应6h后,离心(12950r/min,25℃)20min收集合沉淀,纯水洗涤数次;
步骤3:合成H-MnO2纳米粒,具体地,①将步骤2制得的产物溶于60℃100ml2mol/LNa2CO3溶液中放置过夜;②吸出多余的上清液,将剩余固液混合物离心(9000r、25℃)10min,并用纯水洗涤数次,干燥待用。
图5显示,未经本发明改良(对比例1)和经过本发明改良的H-MnO2纳米粒(实施例1)Zeta电位分别为-28.40±1.25mV和21.47±0.55mV。
由图6B可以看出,经本发明改良后H-MnO2纳米粒(实施例1)的载药能力和包封效率相较于未经改良的H-MnO2纳米粒(对比例1)都有显著性提升,且当H-MnO2纳米粒与药物的用量比为1∶1时包封率及载药率最优(图6A)。
实施例15
M1MV-MnO2@DSP纳米粒制备和表征
所采用的中空二氧化锰纳米粒(H-MnO2)纳米粒通过以下步骤制备得到:
步骤1:合成单分散SiO2纳米粒,具体地,①50ml无水乙醇、2ml超纯水和6ml 25%的氨水混合,封口,超声15min,记为A液;A液在55℃下水浴加热10min;②取3ml TEOs和25ml无水乙醇混合,超声25min,记为B液;③A液伴随搅拌缓慢倒入B液,封口,放入55℃水浴锅中反应(10min后,加3ml质量浓度25%氨水,此步骤完成2次,第二次是在第1次加入后间隔10min再次加入),继续反应90min。④离心(9000r、25℃)15min收集沉淀,纯水洗涤数次,随后40℃真空干燥;
步骤2:合成MnO2/SiO2纳米粒,具体地,①称取200mg步骤1制得优选的SiO2白色粉末,超纯水超声分散至混悬液;②称取1500mg KMnO4固体并制备成KMnO4溶液;③在超声作用下,将高锰酸钾溶液全部滴加到SiO2悬浮液中,再超声10min后取出;④静置反应6h后,离心(12950r/min,25℃)20min收集合沉淀,纯水洗涤数次;
步骤3:合成H-MnO2纳米粒,具体地,①将步骤2制得的产物溶于60℃100ml2mol/LNa2CO3溶液中放置过夜;②吸出多余的上清液,将剩余固液混合物离心(9000r、25℃)10min,并用纯水洗涤数次,干燥待用;③称取上述干燥产物(80mg)、丙三醇(6400mg)以及超纯水(800mg),超声混合20min;加入1mlAPTES和1ml DMF,60℃水浴加热搅拌反应8h;随后离心(9000r,25℃)15min收集沉淀,纯水洗涤数次并冷冻干燥保存。
所采用的M1型巨噬细胞来源微囊泡(M1MV)通过以下步骤制备得到:
步骤4:①将经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激后处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞有血有抗的DMEM培养基更换为无血无抗的DMEM培养基继续培养24h后收集培养皿中培养基,随后加入无血无抗的DMEM培养基,培养24h后再收集一次,共收集两次。②将收集的培养基离心(2000×g,4℃)20min以清除细胞和碎片,然后用超滤管(MWCO=10000)将上清液离心(2400×g,4℃)8min浓缩至原始体积的30%左右。③转移上清液,离心(15500×g,4℃)60min,完毕后,用1ml的PBS重悬离心管底部的M1MV沉淀,存放于4℃下待用。
所采用的M1MV-MnO2@DSP纳米粒通过以下步骤制备得到:
步骤5:MnO2@DSP载药纳米粒合成,具体地,称取10mg步骤3制得的产物和10mg地塞米松磷酸钠(DSP)并分别用超纯水分散,随后混合在一起,在常温条件下搅拌24h,离心(9000r,25℃)15min,纯水洗涤数次,收集沉淀即得;
步骤6:M1MV-MnO2@DSP纳米粒合成,具体地,步骤4所制得的产物和步骤5所制得的产物按质量比1∶1.5混合后超声90min完成自组装。
实施例16
M1MV-MnO2@DSP纳米粒制备,与实施例15的不同在于地塞米松磷酸钠(DSP)的加入量为5mg。
实施例17
M1MV-MnO2@DSP纳米粒制备,与实施例15的不同在于地塞米松磷酸钠(DSP)的加入量为30mg。
实施例18
M1MV-MnO2@DSP纳米粒制备,与实施例15的不同在于步骤4所制得的产物和步骤5所制得的产物按质量比1∶2.5混合。
由于实施例15~18制备得到的M1MV-MnO2@DSP纳米粒的性质基本相同,故仅以实施例15为例,对其提供的M1MV-MnO2@DSP纳米粒的粒径进行了检测。结果如图7~8所示。
图7为M1MV-MnO2@DSP纳米粒合成过程中的粒径变化。其中,步骤1所制得的SiO2纳米粒平均粒径为159.37±2.42nm;步骤2所制得的MnO2/SiO2纳米粒平均粒径为185.73±21.74nm;步骤3所制得的H-MnO2纳米粒平均粒径为182.70±19.79nm;步骤6所制得的M1MV-MnO2@DSP平均粒径为206.73±27.26nm。
图8A、B可以看出,H-MnO2纳米粒和M1MV-MnO2@DSP纳米粒均为实际粒径在100nm左右的球形粒子。
实验例1
M1MV-MnO2@DSP纳米粒(以实施例15为例)体外抗氧化评价
①相同H2O2溶液浓度和反应时间,0、50、100、150μg/ml不同浓度的纳米粒分别对H2O2的分解作用,通过紫外分光光度仪检测反应后溶液中H2O2浓度,并绘制趋势图;
②50μg/ml溶液浓度的纳米粒在0、10、20、30min时对同一溶液浓度H2O2的分解作用,通过紫外分光光度仪检测反应后溶液中H2O2浓度,并绘制趋势图;
图9说明该M1MV-MnO2@DSP纳米粒能有效清除活性氧物种——H2O2,并与反应时间和底物浓度具有相关性。
实验例2
M1MV-MnO2@DSP纳米粒(以实施例15为例)体内药效学评价
1、建模
SD大鼠适应饲养一周后于第0天,在大鼠尾根部皮下注射等体积的牛二型胶原蛋白与完全弗式佐剂(Complete Freund's adjuvant,CFA)充分乳化后的乳剂,每只大鼠注射100μL。初次免疫后第7天,每只大鼠第二次注射等体积的牛二型胶原蛋白与不完全弗式佐剂(Incomplete Freund's adjuvant,IFA)充分乳化后的乳剂100μL,建立SD大鼠胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型。
2、给药
初次免疫15天后开始给药,M1MV-MnO2@DSP组(给予实施例14制备得到的M1MV-MnO2@DSP)、MnO2@DSP组(给予实施例14中步骤5制备得到的MnO2@DSP载药纳米粒)、DSP组(给予地塞米松磷酸钠)及盐水对照组(给予等量生理盐水,记为Saline组)通过尾静脉注射的方式给药,给药剂量按DSP计为1.2mg/kg,每3天给药一次,共4次,并与正常饲养组作对照(记为Normal组)。每次给药前拍照并记录大鼠体重、关节指数、足体积、足厚度和踝关节直径以评价大鼠关节肿胀程度。
3、检测
给药完成后处死大鼠,取关节完成Micro-CT;取血清完成HIF-α和IL-10相关因子检测。
4、结果
图10和图11结果证明,M1MV-MnO2@DSP在CIA大鼠模型体内具有最优异的疗效,特别是能够下调HIF-α的表达。
实验例3
M1MV-MnO2@DSP纳米粒(以实施例15为例)体内组织分布及药代动力学评价
①药代动力学:给药剂量按DSP计为1.2mg/kg,将M1MV-MnO2@DSP、MnO2@DSP及DSP的生理盐水溶液分别通过尾静脉注射到对应分组的CIA模型SD大鼠体内,给药后于0.5h、1h、2h、4h、6h、8h进行心脏取血,随后进行血清样本准备,通过HPLC检测血清中的药物浓度,绘制药代动力学曲线图并计算药代动力学参数。
②给药剂量按DSP计为1.2mg/kg,将M1MV-MnO2@DSP、MnO2@DSP及DSP的生理盐水溶液分别通过尾静脉注射到对应分组的CIA模型SD大鼠体内,给药后于0.5h、1h、2h、4h、6h、8h取心肝脾肺肾及关节组织,随后进行脏器组织样本处理,通过HPLC检测各脏器组织在不同时间点的药物浓度,绘制出组织分布图。
图12血液中的药时曲线表明,M1MV-MnO2@DSP显著提高了DSP在血液中的循环滞留时间,延长了半衰期;组织分布结果表明:即便是在8h后,相较于另外两组,M1MV-MnO2@DSP在关节部位仍然具有较高的蓄积量,并且整体清除速度最慢。
实验例4
M1MV-MnO2@DSP纳米粒(以实施例15为例)体内安全性评价
用药完毕后,取各组大鼠的血清和肝肾分别完成ALT/AST检测和H&E染色。此外,使用正常SD大鼠进一步完成各组在药物浓度分别为2、20、200、2000μg/ml的溶血实验,并对各组在药物浓度为2000μg/ml浓度下的溶血情况进行拍照。
图13A和图13B H&E染色结果显示,各组均未见任何明显肝肾损伤。
图13CALT/AST检测结果显示,除MnO2和MnO2@DSP两组,其余各组均未显示任何异常。
图13D溶血实验结果表明,即便在2000μg/ml如此高浓度情况下,M1MV-MnO2@DSP仍然未见溶血情况的发生。上述结果均说明M1MV伪装后能够降低无机纳米粒在体内的毒性,证明M1MV-MnO2@DSP是一种安全有效的纳米粒药物。
以上公开的仅为本发明的具体实施例,但是,本发明实施例并非局限于此,任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种中空二氧化锰纳米粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将MnO2/SiO2纳米颗粒在碱性条件下进行蚀刻,分离所得沉淀溶解后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷及二甲基甲酰胺,在55℃~65℃下反应6~10h,即得所述中空二氧化锰纳米粒。
2.根据权利要求1所述的中空二氧化锰纳米粒的制备方法,其特征在于,所述沉淀的干燥品与所述3-氨丙基三乙氧基硅烷、所述二甲基甲酰胺的混合比为30~40g∶0.4~0.5L∶0.4~0.5L。
3.根据权利要求1所述的中空二氧化锰纳米粒的制备方法,其特征在于,所述MnO2/SiO2纳米颗粒是按照以下方法制备得到:
将硅源加入至无水乙醇、水及氨水的混合溶液中,在50℃~60℃下反应110min,并在反应过程中补入1~2次氨水,反应物离心,收集沉淀,得到单分散SiO2纳米粒;
将所述单分散SiO2纳米粒溶解后与高锰酸钾混合,反应6-7h,得到所述MnO2/SiO2纳米颗粒;
其中,所述补入1~2次氨水是在反应10min后或距前次加入间隔10min后再次加入氨水,且所述无水乙醇与每次补入氨水的体积比为50∶2.5~3.5。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,
所述氨水的质量浓度为25%,所述混合溶液中无水乙醇、水及氨水的体积比为25∶1∶3;
所述硅源与所述无水乙醇的体积比为3~7:50;
所述单分散SiO2纳米粒与所述高锰酸钾的质量比为6.5~8.5∶1。
5.一种根据权利要求1~4任一项所述的方法制备得到的中空二氧化锰纳米粒。
6.一种微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒的制备方法,其特征在于,是将权利要求5所述中空二氧化锰纳米粒负载抗类风湿性关节炎类药物后,与巨噬细胞来源微囊泡自组装后得到。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,
所述中空二氧化锰纳米粒与所述抗类风湿性关节炎类药物的质量比为1∶0.5~3;
所述中空二氧化锰纳米负载抗类风湿性关节炎类药物后所得产物与所述巨噬细胞来源微囊泡的质量比为1∶1.5~2.5;
所述巨噬细胞来源微囊泡是将处于对数生长期的M0型、M1型或M2型的RAW264.7巨噬细胞有血有抗的DMEM培养基更换为无血无抗的DMEM培养基继续培养,收集培养基,离心后所得;
所述抗类风湿性关节炎类药物为水溶性金属盐类药物。
8.一种根据权利要求6所述的方法制备得到的微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒。
9.一种权利要求8所述微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒在制备抗类风湿性关节炎药物中的用途。
10.一种用于抗类风湿性关节炎的药物,其特征在于,其包括权利要求8所述微囊泡型中空二氧化锰载药纳米粒,以及药学上可接受的辅料或载体。
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