CN113577316A - 一种巨噬细胞膜包覆的负载二氧化锰MnO2和顺铂Pt的仿生纳米水凝胶及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种巨噬细胞膜包覆的负载二氧化锰MnO2和顺铂Pt的仿生纳米水凝胶及其制备和应用,所述材料为巨噬细胞膜包覆纳米水凝胶;其中纳米水凝胶为负载二氧化锰(MnO2)和化疗药物顺铂的聚N‑乙烯基己内酰胺(PVCL)纳米水凝胶。本发明制备的巨噬细胞膜包覆的仿生载药纳米水凝胶一方面通过联合化疗和增强的化学动力学治疗(CDT),显著降低了其半数抑制浓度(IC50),提高药物安全指数(Safety index)和肿瘤细胞凋亡率;而且巨噬细胞膜表面的整合素α4、β1可以有效提高其穿越血脑屏障(BBB)靶向脑胶质瘤的比例,将在肿瘤原位瘤诊疗方面具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于功能性仿生材料及其制备和应用领域,特别涉及一种巨噬细胞膜包覆的负载二氧化锰MnO2和顺铂Pt的仿生纳米水凝胶及其制备和应用。
背景技术
脑胶质瘤是最具侵袭性和致死性的中枢神经系统原发性脑肿瘤,预后差,易复发,五年生存率低于5%(Kui Wang,et al.Adv.Funct.Mater.2020,2007166)。目前治疗脑胶质瘤的主要手段是手术、放疗和化疗,近年来尽管在脑胶质瘤的治疗方面已经做出了许多努力,但是由于血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的存在使进入颅内肿瘤部位的药物十分有限,极大的限制了脑胶质瘤的诊疗效果。BBB主要由大脑内皮细胞、高度特异性的基底膜、包埋在基底膜内的周细胞和星型胶质细胞等组成,相邻内皮细胞间的紧密连接复合物进一步加强了血脑屏障功能的完整性(C.X.Wang,et al.Adv.Funct.Mater.2020,30,1909369)。BBB可以严格控制各种物质的进出,保护中枢神经系统(CNS)免受血液中废物的干扰,维持CNS微环境的稳定(J.Z.Lai,Biomaterials,2019,211,48-56)。这就致使大部分的大分子药物会被BBB阻挡难以进入颅腔内部。虽然BBB的紧密连接在脑肿瘤晚期会受到一定程度的破坏,从而允许一部分药物进入脑部,但是进入肿瘤部位的药物浓度仍不足以达到治疗水平。早期脑肿瘤的诊疗则由于存在较完整的血脑屏障而更具挑战性。因此,开发新型高效的药物递送体系将治疗剂或造影剂输送至大脑内部进行脑肿瘤的诊断和治疗显得十分迫切和重要。
随着纳米医学技术的发展,纳米材料在药物和基因传递领域引起了极大地关注。纳米材料具有延长的血液循环时间、较高的药物上载率、可控的药物释放能力、良好的稳定性、生物相容性、表面易于功能化修饰以及优异的被动或主动靶向能力等优势,这使其在穿越血脑屏障,将负载的诊断或治疗试剂运送到脑部以进行CNS疾病的诊疗方面显示出了巨大的潜力 (J.B.Xie,et al,Biomaterials,2019,224,119491)。近年来,为了进一步提高载药纳米材料向脑部的递送效率,人们开发了许多基于纳米材料的BBB穿越策略,例如(1)通过机械或超声波暂时性破坏BBB,如Foley等人即利用甘露糖产生的渗透压变化使血管内皮细胞脱水,从而引起紧密连接的收缩和破坏,暂时打开血脑屏障(C.P.Foley,et al,J.Controlled Release, 2014,196,71-78),但是血脑屏障的通透性增加也会使一些有害分子进入中枢神经系统,可能会引起CNS的不可逆损伤;(2)细胞穿膜肽介导的BBB穿越,如Li等人利用细胞穿膜肽 (dNP2)和叶酸(FA)修饰的载药脂质体进行原位脑胶质瘤的治疗,穿膜肽dNP2可以促进其跨越血脑屏障,FA则可以进一步使载药脂质体靶向到脑胶质瘤内(M.Li,et al,Eur.J.Pharm. Sci.2018,124,240-248),但是细胞穿膜肽缺乏选择性,亲和力不佳,穿越BBB的效率不高;(3)受体介导的BBB穿越:大脑内皮细胞表面通常会高表达转铁蛋白受体(Transferrin receptor)、乳铁蛋白受体(Lactoferrin receptor)、葡萄糖受体(Glucose receptor)等,Anraku 等人将适量的葡萄糖修饰在超分子纳米载体上,利用其与大脑毛细血管内皮细胞中高表达的葡萄糖受体(GLUT1)介导的胞吞作用,显著提高了材料跨越BBB在脑部聚积的能力(Y. Anraku et al,Nat.Commun.,2017,8,1001),然而由于配体的上载率有限,加之与血液中内源性配体的竞争,使其与受体的结合能力较弱;(4)细胞介导的BBB穿越,利用一些细胞对炎症因子的响应性,像中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等可以携带纳米材料穿越BBB进行脑胶质瘤的诊断和治疗,目前细胞介导的递送策略仍然存在药物负载率较低、负载药物提前释放等问题。
为了克服这些局限性,开发具有较高载药量、增强的脑靶向性以及更多不同类型的诊疗试剂,细胞膜包覆法作为一种仿生策略开始被用来制备智能型的药物递送体系。细胞膜可以为载药纳米材料提供隐身能力,以避免网状内皮系统的拦截,延长载药纳米颗粒的血液循环时间;此外细胞膜上的一些特异性蛋白可以与癌细胞表面的特定受体结合,赋予纳米材料主动靶向的潜力。据报道,巨噬细胞表面高表达的整合素α4、β1等,可以与肿瘤部位的血管内皮粘附分子-1(VCAM-1)发生相互作用,促进巨噬细胞向乳腺癌肺转移瘤的迁移(H.Q.Cao, et al,ACS Nano,2016,10,7738-7748)。另外,巨噬细胞膜上的整合素α4、β1或巨噬细胞-1抗原(Mac-1)等在穿越BBB特异性靶向脑胶质瘤中起到至关重要的作用(J.Z.Lai,et al, Biomaterials,2019,211,48-56),但是上述体系不仅治疗方式单一,而且前者只研究了乳腺癌的抗肺转移情况,未考察原位瘤的治疗效果;后者应用的近红外I区激光则穿透深度极为有限,难以深入脑胶质瘤原位瘤内部。因此,利用巨噬细胞膜包覆纳米材料的仿生策略,有望协助负载不同诊疗试剂的载药纳米材料有效跨越BBB,进行原位脑胶质瘤的诊疗。
检索国内外相关文献和专利结果表明:巨噬细胞膜包覆的负载二氧化锰(MnO2)和顺铂 (Pt)的聚N-乙烯基己内酰胺(PVCL)仿生纳米水凝胶在原位脑胶质瘤诊疗中的应用,尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种巨噬细胞膜包覆的负载二氧化锰MnO2和顺铂Pt 的仿生纳米水凝胶及其制备和应用,克服现有的BBB穿越策略中效率不高、载药量有限、药物提前释放及诊疗试剂单一等缺点的缺陷。
本发明的一种仿生纳米水凝胶材料,所述材料为巨噬细胞膜包覆纳米水凝胶;其中纳米水凝胶为负载二氧化锰MnO2和化疗药物的聚N-乙烯基己内酰胺PVCL纳米水凝胶。
所述化疗药物为顺铂。
本发明的一种仿生纳米水凝胶材料的制备方法,包括:
(1)采用物理包覆法将化疗药物(顺铂)负载在M@P NGs中:将负载二氧化锰的聚N-乙烯基己内酰胺纳米水凝胶MnO2/PVCL NGs(M@P NGs)和化疗药物混合,室温下避光搅拌反应,离心,得到载药纳米水凝胶(Pt/MnO2@PVCL NGs(记作PM@P NGs));
(2)将细胞膜溶液和步骤(1)所得载药纳米水凝胶混合,利用细胞膜挤出器进行共挤出,得到仿生纳米水凝胶MPM@P NGs(也即巨噬细胞膜包覆的载药纳米凝胶 MM-Pt/MnO2@PVCL NGs)。
上述制备方法的优选方式如下:
所述步骤(1)中负载二氧化锰的聚N-乙烯基己内酰胺纳米水凝胶MnO2/PVCL NGs(M@P NGs)具体为:通过沉淀聚合法合成的还原响应型聚N-乙烯基己内酰胺纳米水凝胶PVCL-COOH NGs经乙二胺修饰后,形成氨基末端的PVCL-NH2NGs,然后通过注射泵逐滴加入高锰酸钾KMnO4溶液,利用PVCL-NH2与KMnO4之间的氧化还原反应在PVCL NGs内部原位负载MnO2NPs,透析纯化后得到棕色的MnO2@PVCL NGs(M@P NGs)溶液。
所述PVCL-NH2NGs与KMnO4的质量比为1:0.25,其中PVCL-NH2NGs溶液的浓度为 4~7mg/mL,KMnO4溶液的浓度为4~6mg/mL,通过注射泵加入KMnO4溶液的速度为0.01~0.1 mL/min。
所述步骤(1)中化疗药物为顺铂;所述MnO2/PVCL NGs(M@P NGs)与顺铂的质量比为1:0.2~1:0.5。
所述步骤(1)中反应时间为16-24h。
所述步骤(2)中细胞膜具体为:收集小鼠巨噬细胞,加入低渗细胞裂解液,在冰下孵育 15~30min进行细胞裂解,并采用冻融法冻融,离心,得到的细胞膜沉淀,细胞膜沉淀重悬于 PBS并置于4℃备用。
所述细胞膜制备具体为:每管巨噬细胞的细胞数量为1~5×107,加入配制好的细胞裂解液2~4mL,其中每1mL细胞裂解液中加入10μL蛋白酶抑制剂PMSF,在液氮和37℃水浴锅中反复冻融次数为3~5次,先在750~850g/min的低速离心速度下除去细胞器沉淀,然后在15000~18000g/min的高速离心速度下获得细胞膜沉淀。
所述步骤(2)中细胞膜与载药纳米凝胶(PM@P NGs)的质量比为0.8:1~1.5:1。
所述步骤(2)中共挤出次数为10~20次,所用聚碳酸酯滤膜孔径为800nm(细胞膜挤出器里面要加一片特定孔径的聚碳酸酯滤膜)。
所述步骤(2)制备的仿生纳米水凝胶:也即巨噬细胞膜包覆的载药纳米凝胶MPM@PNGs 可以为纳米颗粒提供伪装,躲避网状内皮系统的拦截,并协助其跨越血脑屏障(BBB)靶向原位脑胶质瘤,进行脑胶质瘤的MR成像与治疗。
本发明提供一种所述仿生纳米水凝胶材料在制备跨越BBB进行原位脑胶质瘤的MR成像和化学动力学-化疗联合治疗药物中的应用。
本发明中仿生纳米水凝胶:巨噬细胞膜包覆的负载MnO2和顺铂的PVCL仿生纳米水凝胶,MnO2在癌细胞中较高浓度的谷胱甘肽(GSH)还原下形成Mn2+,Mn2+不仅可以实现 MR成像,还可以与肿瘤微环境中的双氧水(H2O2)发生类芬顿反应,生成高毒性的羟基自由基(·OH)。同时由于MnO2清除了部分GSH,可以减少细胞内高水平的GSH对·OH的消耗,达到增强化学动力学治疗的效果。
本发明首先以N-乙烯基己内酰胺(VCL)、丙烯酸(AAc)为单体,N,N'-双丙烯酰胱胺(BAC)为交联剂,采用沉淀聚合法制备得到PVCL-COOH NGs,经乙二胺修饰以后得到 PVCL-NH2NGs。然后通过PVCL-NH2NGs和KMnO4之间的氧化还原反应在PVCL-NH2NGs 内原位合成MnO2NPs,并负载化疗药物顺铂Pt,最后通过共挤出法包覆巨噬细胞膜,得到 MM-Pt/MnO2@PVCL NGs(MPM@P NGs)。
其中VCL:AAc=8-10:1(摩尔比),交联剂BAC占VCL的2-6%(质量百分比),引发剂占VCL的3-4%(质量百分比)。
纳米凝胶(NGs)作为具有溶胀特性的三维网状结构纳米颗粒,拥有良好的柔软性和流动性,对一些外源(如光、温度)或内源刺激(如ROS、pH、氧化还原)具有响应性,表面的功能基团易于修饰等特点,是一种富有潜力的载药纳米平台。本发明以还原响应的PVCLNGs作为载体负载MnO2和Pt,选用巨噬细胞膜来包覆该载药纳米凝胶,用于跨越BBB进行原位脑胶质瘤的化疗/化学动力学治疗,其中产生的效果包裹:(1)BAC交联的PVCL纳米凝胶对癌细胞中较高浓度的GSH(10mM)具有还原响应性,GSH可以使二硫键断裂,纳米凝胶瓦解,从而控制化疗药物顺铂在肿瘤位置的释放;(2)MnO2可以被GSH还原为具有更高弛豫率的Mn2+,Mn2+不仅具有优异的MR成像效果,还可以与肿瘤微环境中的双氧水(H2O2) 发生类芬顿反应,生成高毒性的羟基自由基(·OH)。但是癌细胞内高水平的GSH往往会将产生的·OH清除,降低其对肿瘤的杀伤效果,在此,PVCL NGs和MnO2对GSH的消耗,可以有效减少GSH对·OH的清除,增强化学动力学治疗效果;(3)巨噬细胞膜对载药纳米凝胶的包覆可以延长血液循环时间,减少网状内皮系统的拦截,通过膜上的多种靶向蛋白赋予其穿越BBB靶向脑胶质瘤的功能,起到更好的原位脑胶质瘤诊疗效果。
本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、X射线光电子能谱分析(XPS)、透射电子显微镜(TEM)等手段表征制备的载药纳米凝胶材料(PM@P NGs和MPM@P NGs)。利用紫外可见吸收光谱(UV-Vis)考察了PM@P NGs产生·OH的能力,通过激光共聚焦显微镜(Confocal)和流式细胞术(FACS)定性和定量分析材料在大鼠脑胶质瘤细胞(C6)内产生活性氧(ROS)的情况。并根据细胞毒性分析(CCK-8)和流式细胞术FACS分别评价了材料对C6细胞的细胞活力影响和细胞凋亡情况。然后通过Transwell装置构建了体外血脑屏障模型(BBB model),首先利用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)检测载药纳米凝胶在包膜前后和膜表面抗体阻断后穿越BBB的比例,进而通过流式细胞术检测原位末端转移酶(TUNEL)试剂盒标记的下室癌细胞的细胞凋亡情况,并利用蛋白印迹法(Western blot)分析各组载药纳米凝胶穿越BBB以后是否会引起下室癌细胞凋亡相关蛋白表达水平的改变。随后构建小鼠原位脑胶质瘤模型,通过体内MR成像观测PM@P NGs和MPM@P NGs在荷瘤小鼠体内穿越BBB进行原位脑胶质瘤成像的情况,并利用MR成像技术监测小鼠肿瘤体积变化,考察MPM@P NGs对原位脑胶质瘤的化学动力学-化疗联合治疗效果,说明书附图1为本发明制备的巨噬细胞膜包覆的负载二氧化锰和顺铂的仿生载药纳米凝胶的制备及应用示意图。具体测试结果如下:
(1)Zeta电势及水动力学直径测试结果
参见说明书附图2a-2b,分别为PVCL-COOH NGs、PVCL-NH2NGs、MnO2@PVCL NGs (M@PNGs)、Pt/MnO2@PVCL NGs(PM@P NGs)、MM-Pt/MnO2@PVCL NGs(MPM@P NGs) 的水动力学粒径和zeta电势变化情况。PVCL-COOH NGs经乙二胺修饰以后,水动力学粒径从298.9±15.3nm减小为278.9±3.9nm,电势从-13.7mV变为17.5mV,证明成功制备得到了PVCL-NH2NGs。负载了MnO2和Pt以后,其水动力学粒径出现了增加,变为301.5± 3.1nm,电势则从正电荷又变为负电荷(-10.2mV)。利用微型挤出器包覆巨噬细胞膜以后,水动力学粒径明显减小为270±3.7nm,电势略有增加(-6.1mV),说明了巨噬细胞膜的成功包覆。
(2)XPS光电子能谱分析结果
参见说明书附图2c-e,为M@P NGs和PM@P NGs的X射线光电子能谱图。从附图2c 和2d中看到在642.4eV和654.2eV处出现的两个峰分别对应MnO2的Mn 2p3/2和Mn 2p1/2自旋轨道的特征峰,说明了MnO2的成功制备。附图2c和2e中出现在72.9eV和75.9eV的峰则对应顺铂的Pt 4f5/2和Pt 4f7/2自旋轨道峰,表明顺铂成功负载到了NGs上,从而说明成功制备了负载MnO2和Pt的PM@P NGs。
(3)UV-vis吸收光谱测试结果
参见说明书附图2f-h,为通过UV-vis光谱监测MB的特征吸收峰(665nm)来评价PM@P NGs在模拟肿瘤微环境条件下产生·OH的能力以及GSH对·OH的消耗情况,由于产生的·OH 会使亚甲基蓝(MB)发生降解而褪色,因此MB被用作·OH的指示剂。首先从图2f中看到,在HCO3 -的存在下,当MB与MnSO4(0.5mM)和H2O2(10mM)的混合液共孵育30min 后,MB的特征吸收峰显著降低,MB溶液从蓝色变为无色,说明产生了大量的·OH使MB 发生了降解。而当MB与MnSO4、H2O2和10mM的GSH混合液共孵育时,MB的特征吸收峰只出现了微弱的下降,溶液颜色也未见明显变化,这说明过量GSH的存在会消耗产生的·OH。然后根据说明书附图2g,同样地,在HCO3 -的存在下,将MB与一定浓度的PM@P NGs (0.5mM)和H2O2(10mM)混合,同时加入不同浓度的GSH(0、1、2、5、10mM),从图中看到随着GSH的增加,棕色的MnO2与GSH发生反应,逐渐被还原为无色的Mn2+,生成的Mn2+进而与H2O2反应产生·OH,从而使MB发生降解。当[GSH]=0~10mM时,MB溶液的颜色先由蓝色变浅,然后又由无色逐渐变为蓝色,相对应的,其紫外吸收值先显著降低,然后又逐渐增加,这归因于过量的GSH消耗了一部分产生的·OH。值得注意的是,对比附图 2f和2g,经计算得知,当置于同等浓度的GSH(10mM)条件下时,Mn2+仅使20.3%的MB 发生了降解,而MnO2可以使68.7%的MB产生降解,显著高于Mn2+对MB的降解率(如图 2h所示),这说明MnO2通过与GSH反应降低了体系中GSH的浓度,从而可以有效降低其对毒性·OH的消耗,有助于产生更好的化学动力学治疗效果。
参见说明书附图2i为利用UV-vis光谱测得的PM@P NGs在包膜前后对非特异性蛋白的吸附情况。将PM@P NGs和MPM@P NGs分别与牛血清白蛋白(BSA)混合配成含一系列浓度NGs的混合液,并置于37℃恒温水浴锅中共孵育1~2h,然后离心收集上清,通过UV-vis 分光光度计测试孵育前后的BSA溶液在278nm处的吸收值。利用吸收值差异(ΔAbsorbance)评估包膜前(PM@P NGs)和包膜后(MPM@P NGs)的抗非特异性蛋白吸附能力。从图中看出,包膜前的PM@P NGs比包膜后的MPM@P NGs具有更高的蛋白吸附能力(p<0.01),说明细胞膜包覆可以显著降低纳米材料对非特异性蛋白的吸附。
(4)TEM及元素能谱图测试结果
参见说明书附图3a-b,为PM@P NGs在包膜前和包膜后的TEM照片及对应的元素能量分散谱图。从图中看到包膜前的PM@P NGs相对松散,P元素含量比较低;而包膜以后的MPM@P NGs由于受到挤膜器的多次挤压,变的相对紧实,各元素分布比较集中。而且代表磷脂双分子层的P元素含量显著增高,经测量外侧均匀包覆了一层约25nm厚度的细胞膜层,充分证明细胞膜已成功包覆在了PM@P NGs表面。
(5)载药纳米凝胶的药物释放及Mn2+释放测试结果
参见说明书附图4a和4b,为包膜前PM@P NGs和包膜后的MPM@P NGs中负载的Pt 和Mn2+在不同条件下随时间变化的累积释放结果。在pH=7.4,未添加GSH时,PM@P NGs 和MPM@P NGs中的顺铂Pt在96h内的累积释放量分别为42.8%和37.9%,Mn2+的释放量仅有13.4%和7.8%;在pH=5.5,未添加GSH时,PM@P NGs和MPM@P NGs中Pt的累积释放量分别增加为58%和56.9%,Mn2+的累积释放量明显增加至79%和73.2%,说明细胞内的弱酸性环境有利于顺铂的释放,并使MnO2转化为Mn2+;进一步地,在pH=5.5,并添加 10mM GSH条件下,在监测时间内(96h)从PM@P NGs和MPM@P NGs中释放的Pt(84.1%和78.6%)和Mn2+(97.7%和94%)均显著增加,这是由于GSH不但使NGs内部的二硫键断裂发生解体,而且还会使更多的MnO2还原为Mn2+,从而促进了Pt和Mn2+的释放,为MR 成像和增强的化学动力学治疗奠定了基础。
(6)巨噬细胞膜包覆的仿生载药纳米凝胶的弛豫率测试结果
说明书附图4c为巨噬细胞膜包覆的载药纳米凝胶MPM@P NGs在GSH存在(GSH(+))或不存在(GSH(-))条件下,其弛豫时间的倒数(1/T1)随Mn浓度变化的情况。如图所示,在未添加GSH时,MPM@P NGs的弛豫率仅有0.57mM-1s-1,而在含有10mM GSH的MPM@P NGs溶液中,其弛豫率显著提高到9.69mM-1s-1,这是由于GSH将MnO2还原成为了具有更高弛豫率的Mn2+。
(7)巨噬细胞膜包覆的仿生载药纳米凝胶对不同细胞的细胞活力测试结果
参见说明书附图4d-f,为各材料在不同浓度下(0、2、5、10、20、50μg/mL)对小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3,附图4c)和大鼠脑胶质瘤细胞(C6,附图4d)的CCK-8细胞活力测试结果。从图中看到与bEnd.3细胞相比,各组材料对C6细胞产生了更高的杀伤效果,这可能归因于癌细胞内具有较高水平的GSH,从而可以促进Pt和Mn2+的释放。经计算各组材料对bEnd.3和C6细胞的IC50结果如表1所示,负载了Pt和MnO2的PM@P NGs比单独的顺铂和M@PNGs具有更低的IC50值,包覆细胞膜以后MPM@P NGs组的IC50值进一步降低为13.1μg/mL和1.9μg/mL,其安全系数也最高(6.9),表明包覆巨噬细胞膜和联合化疗- 化学动力学治疗有利于提高材料的肿瘤杀伤效果,减小对正常组织的毒副作用。
(8)体外活性氧(ROS)测试结果
说明书附图5a和5b为利用流式细胞术测试各组材料在癌细胞内产生ROS的情况。负载了MnO2的M@P NGs产生的活性氧水平显著高于Mn2+(p<0.01),这是因为MnO2可以清除掉一部分GSH,从而减少过量GSH对·OH的消耗。同时,负载了Pt和MnO2的PM@P NGs 产生的ROS明显高于M@P NGs(p<0.01),这可能是由于顺铂可以介导烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的活化,触发氧分子(O2)转化为超氧自由基(O2 ·—)和下游的 H2O2,然后Mn2+通过类芬顿反应催化产生H2O2,从而生成更多的·OH。将PM@P NGs包覆细胞膜以后得到了MPM@P NGs,从图中看到MPM@P NGs产生的ROS进一步提高(p< 0.05),这应该归因于细胞膜仿生的载药纳米凝胶更易于进入癌细胞,使细胞的吞噬量增加,从而相应地提高了胞内ROS的产生水平。
(9)细胞凋亡测试结果
参见说明书附图5c为不同材料([Pt]=5μg/mL,[Mn]=2.6μg/mL)与脑胶质瘤细胞C6 共孵育12h后的细胞凋亡测试结果。如图所示,M@P NGs处理过的细胞,其凋亡率大于Mn2+处理过的细胞,这与上述ROS的测试结果一致,证实MnO2可以通过对GSH的清除作用减少·OH的消耗,提高化学动力学治疗效果。而且,负载了Pt和MnO2的联合治疗组PM@P NGs 处理过的细胞凋亡率为17.31%(早凋+晚凋),明显高于单独的化疗组(顺铂:10.5%)和单独的化学动力学治疗组(M@P NGs:7.03%),说明联合化学动力学治疗和化疗可以有效提高抗肿瘤治疗效果。另外,细胞膜仿生的载药纳米凝胶组MPM@P NGs引起的细胞凋亡率是最高的(22.7%),这是由于细胞膜包覆有利于癌细胞对载药纳米凝胶的特异性吞噬,进一步增强了对癌细胞的杀伤效果。
(10)体外穿越BBB的测试结果
参见说明书附图6a-b,为通过transwell构建的体外BBB模型和利用ICP-OES测得的各组材料穿越BBB到达下室的百分数情况,其中跨越BBB到达下室的材料包含了下室培养基和被C6细胞吞噬的材料含量之和。主要分为4组:PBS、包膜组MPM@P、阻断组Blocked MPM@P和未包膜组PM@P。可以看出,MPM@P NGs穿越到下室的比例显著高于阻断组和未包膜组(p<0.001),这是由于巨噬细胞膜的包覆为载药纳米凝胶提供了伪装,而且膜表面的α4、β1等整合素可以与癌细胞上高表达的血管内皮粘附分子VCAM-1特异性结合,促进 MPM@P NGs穿越bEnd.3单细胞层进入到下室中。用anti-α4和anti-β1阻断MPM@P NGs (Blocked)以后,其迁移百分数明显降低,证实了整合素α4、β1在跨越BBB的过程中起了重要作用。
说明书附图6c-d为跨越BBB到下室的各组材料与C6细胞继续孵育24h以后,利用流式细胞术检测得到的癌细胞凋亡情况。结果发现,由于包覆巨噬细胞膜的MPM@P NGs迁移到下室的百分数最高,从而引起了最高的细胞凋亡。而用anti-α4和anti-β1处理过的blockedMPM@P NGs组和未包膜的PM@P NGs组由于迁移到下室的比例降低,引起的细胞凋亡数相应地出现了明显降低。如附图6e-g所示,接下来我们利用Western blot进一步考察了穿越BBB到达下室的各组材料与下室中C6细胞孵育24h后的凋亡相关蛋白表达情况,Bax、Bcl-2、P53和PTEN的表达及定量分析见图6e和6f,与对照组相比,我们看到MPM@P NGs组的 Bcl-2显著下调,P53则明显上调,而且Bax/Bcl-2的比值明显升高,证明了癌细胞的显著凋亡(Y.Fan,et al,Nano Today,2020,33,100899),该结果与附图6c-d的癌细胞凋亡结果一致。(11)在体内原位脑胶质瘤中的MR成像效果
参见说明书附图6h和6i,分别为包膜前后的PM@P NGs和MPM@P NGs在原位脑胶质瘤中的MR成像结果和对应的信噪比。从图中看到,MR信号强度先逐渐增加,在4h时达到峰值,随后逐渐降低。值得注意的是,相同时间点时,包膜组MPM@P的信噪比明显高于未包膜组(p<0.05),表明包覆了巨噬细胞膜的MPM@P NGs跨越BBB进入原位脑胶质瘤中的量高于未包膜的PM@P NGs,这与体外BBB跨膜实验结果相一致。
(12)体内治疗效果评价
参见说明书附图7a为体内原位脑胶质瘤的治疗过程示意图,附图7b-d为脑胶质瘤的MRI 成像、对应的相对肿瘤体积变化和小鼠体重变化情况。在ICR小白鼠体内构建C6原位脑胶质瘤模型,待5-7天后,通过MR成像确认是否建模成功,挑选建模成功的老鼠平均分为6组:PBS组、M@P NGs组、顺铂(Cisplatin)组、PM@P NGs组、MPM@P NGs组和Blocked MPM@PNGs组。治疗过程中,每只小鼠经尾静脉注射200μL材料,每3天给药治疗一次,一个疗程共治疗3次(第0、3、6天)。同时分别在第0天、第3天、第6天和第10天用MR 成像监测和记录肿瘤体积变化,每隔两天记录小鼠的体重变化情况。从附图7b和7c看到,与PBS组相比,其它治疗组均使肿瘤生长受到了不同程度的抑制。其中,与单独的化学动力学治疗组(M@P)相比,化学动力学联合化疗治疗组(PM@P)表现出了提高的抑制肿瘤生长效果(p<0.01)。更重要的是,与未包膜的PM@P组相比,包覆了巨噬细胞膜的联合化学动力学-化疗组(MPM@P)进一步显著抑制了原位脑胶质瘤的生长(p<0.01)。为了考察巨噬细胞膜在跨越BBB靶向脑肿瘤过程中的作用机制,我们用anti-α4和anti-β1对MPM@P NGs 进行膜表面抗体阻断。从结果中看到,抗体阻断组(Blocked MPM@P)的肿瘤抑制能力显著下降,验证了巨噬细胞膜上的整合素α4和β1在穿越BBB进入脑实质中发挥了重要作用。另外,从附图7d中也可以看到,PBS组的小鼠体重下降最明显,其他各对照组的小鼠体重也出现了一定程度的下降,而MPM@P NGs组的小鼠体重下降最少。
有益效果
(1)本发明反应条件易于实现,合成步骤容易操作,产率高,重复性好,且成本较低,具有良好的发展前景。
(2)本发明的合成反应完全在水相中完成,制备过程环保,材料对细胞内高水平的GSH具有良好的响应性,可以控制Pt和Mn2+在到达肿瘤部位后进行充分释放,减少对正常组织器官的毒副作用,提高抗肿瘤效果。
(3)本发明制备的巨噬细胞膜包覆的负载MnO2和顺铂的PVCL仿生纳米水凝胶具有较高的 MnO2负载率和药物装载率,良好的生物相容性和水溶性,负载的MnO2和Pt均有利于产生更多的·OH,实现增强的化学动力学和化疗联合治疗效果。
(4)本发明利用巨噬细胞膜包覆的仿生载药纳米凝胶跨越BBB进行原位脑胶质瘤的靶向递送,巨噬细胞膜的包覆一方面可以提高材料的抗蛋白吸附能力,延长血液循环时间,另一方面为纳米材料提供伪装,促进材料穿越血脑屏障进行原位脑胶质瘤的MR成像和化学动力学- 化疗联合治疗,为细胞膜介导的跨越BBB治疗原位脑胶质瘤的纳米药物拓宽了思路。
附图说明
图1为本发明制备的负载MnO2和Pt的巨噬细胞膜仿生PVCL纳米水凝胶(MPM@PNGs)的合成和应用示意图;
图2为本发明制备的各纳米凝胶的水动力学粒径(a)和表面电势(b)变化;M@P NGs和 PM@P NGs的XPS全谱(c)、PM@P NGs的Mn2p(d)和Pt4f(e)光电子能谱图;MB在不同条件下的UV-vis吸收光谱图和对应的MB溶液颜色变化照片([Mn]=0.5mM,[H2O2]=10 mM,[NaHCO3]=25mM):在不存在或存在GSH时,Mn2+介导的类芬顿反应引起的MB降解情况(f),PM@P NGs在不同GSH浓度下引起的MB降解情况(g);在10mM GSH和10mM H2O2条件下,Mn2+和PM@P NGs引起的MB降解百分数柱状图(h);PM@P NGs和MPM@P NGs的抗蛋白吸附能力评价(i);
图3为本发明制备的PM@P NGs(a)和MPM@P NGs(b)的TEM图及元素能量分散谱图;
图4为Pt(a)和Mn2+(b)在一定条件下从PM@P NGs和MPM@P NGs中的累积释放情况;PM@P NGs在添加或不添加GSH(10mM)时的弛豫率(c);利用CCK-8法测得的bEnd.3 (d)或C6(e)细胞经不同材料处理24h后的细胞活力,以及两种细胞经MPM@P NGs处理后的细胞活力比较(f);
图5为C6细胞与不同材料共孵育6h后,利用流式细胞分析测得的ROS的产生(a)和对应的平均荧光强度柱状图(b);C6细胞经不同材料处理12h后的细胞凋亡分析(c);
图6为通过Transwell构建的体外BBB模型(a)和各组材料(PBS组、包膜组MPM@P、阻断组Blocked MPM@P和未包膜组PM@P)跨越BBB到达下室的迁移百分数(b);跨越到下室的各组材料与C6细胞孵育24h后,利用流式细胞术测得的细胞凋亡结果(c-d),以及通过western blot定量分析的凋亡相关蛋白的表达情况(e-f)和Bax/Bcl-2的比例(g);本发明制备的PM@P NGs和MPM@P NGs在小鼠体内原位脑胶质瘤中的MR成像(h)及对应的信噪比(i);
图7为体内治疗过程示意图(a),利用MR成像监测原位脑胶质瘤的生长(b),测得的相对肿瘤体积变化(c)和小鼠体重变化(d)。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
首先通过沉淀聚合法合成PVCL-COOH NGs:称取469.5mg N-乙烯基己内酰胺(VCL,购自Sigma-Aldrich),24.6mg N,N’-双丙烯酰胱胺(BAC,购自阿法埃莎(中国)化学有限公司)和7.9mg十二烷基磺酸钠(SDS,购自Sigma-Aldrich)溶于30mL去离子水中,在N2氛围、70℃条件下搅拌30min,随后利用注射器向上述混合液缓慢滴加1.25mL自由基引发剂ACMA(17.5mg,日本和光纯药工业株式会社),反应5min后,再逐滴加入27mg丙烯酸单体(AAc,购自阿拉丁),然后在70℃和N2氛围持续搅拌反应4h。反应结束后透析3 天去除未反应的单体和表面活性剂。得到的该PVCL-COOH NGs(210mg)经EDC/NHS(287.55 mg/172.635mg)活化2h以后,加入200.4μL乙二胺(EDA)于室温反应3天,即得到氨基化的PVCL-NH2NGs。
然后利用氨基与KMnO4之间的氧化还原反应在PVCL-NH2NGs内部原位合成MnO2NPs:取20mL PVCL-NH2NGs(4.56mg/mL),PVCL NGs与KMnO4的质量比为1:0.25,在搅拌条件下,通过注射泵将4.56mL KMnO4(购自百灵威科技有限公司)溶液(5mg/mL) 以0.05mL/min的注射速度逐滴滴加到上述PVCL NGs中,混合溶液持续搅拌过夜。第二天用分子量为1000的透析袋透析3天。取一部分纯化的液体冷冻干燥,得到棕色的M@P NGs 固体并称重,经王水消化并用ICP-OES测量得知MnO2的负载量为6.6%,其余液体置于4℃冰箱备用。
取上述纯化的M@P NGs(5.4mg/mL)10mL,通过物理包覆法负载抗癌药物顺铂Pt(购自百灵威科技有限公司),称取顺铂13.5mg(M@P NGs:Cisplatin=1:0.25,质量比)溶于6.75mL水,将顺铂溶液加入到M@P NGs中,磁力搅拌24h,然后13000rpm离心30min,去掉上清,将沉淀回溶于PBS溶液中,即得到负载顺铂的纳米凝胶PM@P NGs。取一部分 PM@P NGs冷冻干燥后定重,并用王水消化,然后通过ICP-OES测定并计算得出Pt的上载率(LC%)和包封率(EE%)分别为8.7%和53.21%,其余溶液置于4℃冰箱备用。
取呈对数生长期的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)5×107个(RAW264.7来自中国科学院细胞库),1000rpm离心5min得到细胞沉淀,向细胞沉淀中加入3mL低渗细胞裂解液(含体积分数为10%的PMSF),在冰下孵育15min,然后采用冻融法(于液氮中快速冷冻,37℃快速融化)反复冻融3次。随后,先在4℃、850g离心力下离心15min去掉沉淀,取上清液在18000g、4℃再次离心60min,保留沉淀,将其重悬于PBS溶液中即得到巨噬细胞膜悬液。
将200μg的PM@P NGs溶液与上述含0.2mg巨噬细胞膜的细胞膜悬液混合,使用微型挤出器(Avanti)将溶液反复挤出11次,所用聚碳酸酯滤膜孔径为800nm,然后在13500rpm下离心30min,去掉上清中多余的细胞膜,制备得到包覆了巨噬细胞膜的MPM@P NGs。
实施例2
对实施例1制备的PVCL-COOH NGs、PVCL-NH2NGs、M@P NGs、PM@P NGs和 MPM@P NGs进行表征。其水动力学粒径分布和电势变化情况分别如图2a和2b所示, PVCL-COOH NGs经乙二胺修饰以后,水动力学粒径从298.9±15.3nm减小为278.9±3.9 nm,电势从-13.7mV变为17.5mV,证明表面羧基成功转变为带正电荷的氨基(-NH2)。负载了MnO2和Pt以后,其水动力学粒径出现了增加,变为301.5±3.1nm,电势则从正电荷又变为负电荷(-10.2mV),说明MnO2和Pt的成功负载。利用Avanti微型挤出器包覆巨噬细胞膜以后,水动力学粒径明显减小为270±3.7nm,电势略有增加(-6.1mV),说明巨噬细胞膜成功包覆。
M@P NGs和PM@P NGs的XPS全谱结果如图2c所示,图2d和2e分别为PM@P NGs 的Mn2p(d)和Pt4f(e)光电子能谱图。从附图2c和2d中看到在642.4eV和654.2eV处出现的两个峰分别对应MnO2的Mn 2p3/2和Mn 2p1/2自旋轨道的特征峰,说明了MnO2的成功制备。附图2c和2e中出现在72.9eV和75.9eV的峰则对应顺铂的Pt 4f5/2和Pt 4f7/2自旋轨道峰,表明顺铂成功负载到了NGs上,从而进一步验证了MnO2和Pt的负载。其中在M@P NGs 全谱中只观察到了Mn2p的峰,而在PM@P NGs全谱中同时出现了Mn2p和Pt4f的峰,说明成功制备了M@P NGs和PM@P NGs。
Mn2+和PM@P NGs产生·OH的测试结果如图2f-h,由于产生的·OH会使亚甲基蓝(MB) 发生降解而褪色,因此MB被用作·OH的指示剂。利用UV-vis吸收光谱监测MB(10μg/mL) 的特征吸收峰(665nm),用来评价PM@P NGs在模拟肿瘤微环境条件下产生·OH的能力以及过量的GSH对·OH的消耗情况。首先从图2f中看到,在HCO3 -(25mM)的存在下,当MB与MnSO4(0.5mM)和H2O2(10mM)的混合液共孵育30min后,MB的特征吸收峰显著降低,MB溶液从蓝色变为无色,说明产生了大量的·OH使MB发生了降解。而当 MB与MnSO4(0.5mM)、H2O2(10mM)和10mM的GSH混合液共孵育30min后,MB 的特征吸收峰只出现了微弱的下降,溶液颜色变化也不明显,这证明GSH的存在会消耗产生的·OH。如图2g,同样地,在HCO3 -(25mM)的存在下,将MB与一定浓度的PM@P NGs (0.5mM)和H2O2(10mM)混合,同时加入不同浓度的GSH(0、1、2、5、10mM),从图中看到随着GSH的增加,棕色的MnO2与GSH发生反应,逐渐被还原为无色的Mn2+,生成的Mn2+进而与H2O2反应产生·OH,从而使MB发生降解。当[GSH]=0~10mM时,MB溶液的颜色先由蓝色变浅,然后又由无色逐渐变为蓝色,相对应的,其紫外吸收值先显著降低,然后又逐渐增加,这归因于过量的GSH消耗了一部分产生的·OH。值得注意的是,对比附图2f和2g经计算得知,当置于同等浓度的GSH(10mM)条件下时,Mn2+仅使20.3%的MB发生了降解,而MnO2可以使68.7%的MB产生降解,显著高于Mn2+对MB的降解率 (如图2h所示),这说明MnO2通过与GSH反应降低了体系中GSH的浓度,从而可以有效减少过量的GSH对毒性·OH的消耗,有望产生更好的化学动力学治疗效果。
包覆巨噬细胞膜以后,MPM@P NGs的抗非特异性蛋白吸附结果如图2i所示,未包覆细胞膜的PM@P NGs作为对照。将PM@P NGs和MPM@P NGs分别与BSA混合,配成BSA 浓度为1mg/mL、含有一系列浓度NGs([Pt]=2,5,10,20,50μg/mL)的混合液,将其置于 37℃恒温水浴锅中共孵育2h,然后在13500rpm离心30min后收集上清液。随后通过UV-vis 吸收光谱测试孵育前后的BSA溶液在278nm处的吸收值,利用吸收值差异(ΔAbsorbance) 评估包膜前(PM@P NGs)和包膜后(MPM@P NGs)的抗非特异性蛋白吸附能力。从图中看出,包膜前的PM@PNGs比包膜后的MPM@P NGs具有更高的蛋白吸附能力(p<0.01),说明细胞膜包覆可以显著降低纳米材料对非特异性蛋白的吸附。
实施例3
通过TEM及元素能量分散谱分析研究纳米凝胶的形貌和组成。如图3a-b,为包覆巨噬细胞膜前后的PM@P NGs和MPM@P NGs的TEM照片及对应的元素能谱图。从图中看到包膜前的PM@P NGs相对松散,P元素含量比较低;而包膜以后的MPM@P NGs由于受到挤膜器的多次挤压,变的相对紧实,各元素分布比较集中。其中代表磷脂双分子层的P元素含量显著增高,经测量外侧均匀包覆了一层约25nm厚度的巨噬细胞膜,充分证明了细胞膜已成功包覆在了PM@P NGs表面。
实施例4
对实施例1制备的纳米凝胶样品通过ICP-OES测定其Mn2+和Pt的累积释放情况,结果如图4a和4b所示,展示了包膜前PM@P NGs和包膜后的MPM@P NGs中负载的Pt和Mn2+在不同条件下随时间变化的累积释放结果。在pH=7.4,未添加GSH时,PM@P NGs和 MPM@P NGs中的顺铂Pt在96h内的累积释放量分别为42.8%和37.9%,Mn2+的释放量仅有 13.4%和7.8%;在pH=5.5,未添加GSH时,PM@P NGs和MPM@P NGs中顺铂Pt的累积释放量分别增加为58%和56.9%,Mn2+的累积释放量明显增加至79%和73.2%,说明细胞内的弱酸性环境有利于顺铂的释放,并使部分MnO2转化为Mn2+;进一步地,在pH=5.5,并添加10mM GSH条件下,在监测时间内(96h)从PM@P NGs和MPM@P NGs中释放的Pt (84.1%和78.6%)和Mn2+(97.7%和94%)均显著增加,这一方面是由于GSH使NGs内部的二硫键断裂发生解体,另一方面还将更多的MnO2还原为Mn2+,从而促进了Pt和Mn2+的释放,为MR成像和增强的化学动力学治疗奠定了基础。
MPM@P NGs在GSH存在(GSH(+))或不存在(GSH(-))条件下,其弛豫时间的倒数 (1/T1)随Mn浓度变化的情况如图4c所示。在未添加GSH时,MPM@P NGs的弛豫率仅有0.57mM-1s-1,而在含有10mM GSH的MPM@P NGs溶液中,其弛豫率显著提高到9.69 mM-1s-1,这归因于GSH将MnO2还原成为了具有更高弛豫率的Mn2+。
各材料在不同浓度下(0、2、5、10、20、50μg/mL)对小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3,附图4c)和大鼠脑胶质瘤细胞(C6,附图4d)的CCK-8细胞活力测试结果参见说明书附图 4d-f(bEnd.3和C6来自中国科学院细胞库)。在细胞活力实验中,以10000/孔的密度将bEnd.3或C6细胞种于96孔板中,加入含有1%双抗和10%FBS的DMEM培养液,于37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜。然后去掉旧培养基,换成含有不同浓度材料的培养基,并控制Pt的终浓度分别为0μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL,置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h,随后加入含10%的CCK-8(10μL)的DMEM培养基,继续培养2h。最后用酶标仪测试450nm处每孔的吸光度,其中以PBS处理的细胞作为空白对照,细胞活力记为100%,从图中看到与bEnd.3细胞相比,各组材料对C6细胞产生了更高的杀伤效果,这可能归因于癌细胞内具有较高水平的GSH,从而可以促进Pt和Mn2+的释放。经计算各组材料对bEnd.3和C6细胞的IC50结果如表1所示,负载了Pt和MnO2的PM@P NGs比单独的顺铂和M@P NGs具有更低的IC50值,包覆细胞膜以后MPM@P NGs组的IC50值进一步降低为13.1μg/mL和1.9μg/mL,其安全系数也最高(6.9),表明包覆巨噬细胞膜和联合化疗- 化学动力学治疗有利于提高材料的肿瘤杀伤效果,减小对正常组织的毒副作用。
表1、各纳米凝胶材料处理bEnd.3细胞和C6细胞针对Pt浓度的细胞半数致死浓度(IC50)。
顺铂为阳性对照
表1
实施例5
通过流式细胞术分析了各组材料在癌细胞内产生ROS的情况,结果如图5a和5b所示, 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)用作检测ROS的探针。在12孔板内以1×105细胞/孔的密度接种C6细胞,于37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜。第二天,去掉旧培养基,加入含有不同材料的DMEM培养基,控制Mn的浓度均为10μg/mL,继续孵育6h后,去掉培养基并用PBS冲洗2次,然后加入10μM DCFH-DA孵育30min,消化、离心、收集细胞,利用流式细胞术分析各组材料处理过的细胞中产生荧光的情况。从附图5a-b中看到,负载了 MnO2的M@P NGs产生的ROS水平显著高于Mn2+(p<0.01),这是因为MnO2清除了一部分GSH,从而减少了GSH对·OH的消耗。同时,负载了Pt和MnO2的PM@P NGs产生的 ROS明显高于M@P NGs(p<0.01),这可能是由于顺铂可以介导烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的活化,触发氧分子(O2)转化为超氧自由基(O2 ·—)和下游的H2O2 (P.A.Ma,et al,Nano Lett.,2017,17,928-937),然后Mn2+通过类芬顿反应催化产生的H2O2,从而生成更多的·OH。包覆了巨噬细胞膜的MPM@P NGs产生的ROS进一步提高(p<0.05),这应该是由于细胞膜仿生的载药纳米凝胶更易于进入癌细胞,使细胞的吞噬量增加,从而相应地提高了ROS的产生。
接下来利用细胞凋亡实验进一步考察了不同材料([Pt]=5μg/mL,[Mn]=2.6μg/mL)与脑胶质瘤细胞C6共孵育12h后的细胞凋亡情况,参见说明书附图5c所示。从图中看到,M@P NGs处理过的细胞,其凋亡率高于Mn2+处理过的细胞,这与上述ROS的测试结果一致,证实了MnO2可以通过清除GSH减少对·OH的消耗,提高化学动力学治疗效果。而且,负载了Pt和MnO2的联合治疗组PM@P NGs处理过的细胞凋亡率为17.31%(早凋+晚凋),明显高于单独的化疗组(顺铂:10.5%)和单独的化学动力学治疗组(M@P NGs:7.03%),说明联合增强的化学动力学治疗和化疗可以有效提高抗肿瘤治疗效果。此外,细胞膜仿生的载药纳米凝胶组MPM@P NGs引起的细胞凋亡率是最高的(22.7%),这应该归因于细胞膜的包覆有利于癌细胞对载药纳米凝胶的吞噬,进一步增强了对癌细胞的杀伤效果。
实施例6
通过transwell实验设计验证各组材料体外跨越BBB的能力及其进一步杀死癌细胞的效果。通过transwell构建的体外BBB模型示意图和利用ICP-OES测得的各组材料跨越BBB到达下室的百分数情况如图6a-b所示,其中跨越BBB到达下室的材料包含了下室培养基和被 C6细胞吞噬的材料含量之和。首先在transwell(12孔板,滤膜孔径0.4μm,康宁)上室中接种2.5×104/孔的bEnd.3细胞,在37℃,5%CO2培养箱中培养5-7天,直至其跨内皮电阻TEER>150Ω.cm2,形成类似于BBB紧密连接的单细胞层。然后在下室中接种5×104细胞/孔的C6细胞,待其贴壁后,再在上室中加入含有不同材料(PBS、MPM@P、Blocked MPM@P、 PM@P,[Pt]=5μg/mL,[Mn]=2.6μg/mL)的新培养基,将上室与下室合并培养6h,然后收集下室中的C6细胞和培养基,用王水消化后通过ICP-OES测量穿越bEnd.3单细胞层到达下室的材料含量。可以看出,MPM@P NGs穿越到下室的比例显著高于阻断组和未包膜组(p< 0.001),这是由于巨噬细胞膜的包覆为载药纳米凝胶提供了伪装,而且膜表面的α4、β1等整合素可以与癌细胞上高表达的血管内皮粘附分子VCAM-1特异性结合,促进MPM@P NGs 穿越bEnd.3单细胞层进入到下室中。用anti-α4和anti-β1阻断MPM@P NGs(Blocked)以后,其迁移百分数明显降低,证实了整合素α4、β1在跨越BBB的过程中起了重要作用。
随后,考察了上述各组材料(PBS、MPM@P、Blocked MPM@P、PM@P,[Pt]=5μg/mL,[Mn]=2.6μg/mL)跨越BBB到达下室以后对下室癌细胞的杀伤效果,结果如图6c-d所示。跨越BBB到下室的各组材料与C6细胞继续孵育24h,利用TUNEL试剂盒标记下室癌细胞,然后通过流式细胞术分析下室的C6细胞的凋亡情况。结果发现,MPM@P NGs引起了最高的细胞凋亡,这是由于包覆了巨噬细胞膜的MPM@P NGs组迁移到下室的百分数最高;而用 anti-α4(Proteintech)和anti-β1(Beyotime)处理过的blocked MPM@P NGs组和未包膜的PM@P NGs组由于迁移到下室的百分比降低,从而相应地使C6细胞凋亡数出现了明显降低(p<0.001)。另外,如图6e-g所示,接下来我们利用Western blot进一步研究了跨越BBB到达下室的各组材料引起C6细胞凋亡的机理,Bax、Bcl-2、P53和PTEN等凋亡相关蛋白的表达及其定量分析见图6e和6f,与对照组相比,我们看到MPM@P NGs组的Bcl-2显著下调,P53 则明显上调,而且Bax/Bcl-2(附图6g)的比值明显升高,这验证了癌细胞的凋亡(Y.Fan,et al,Nano Today,2020,33,100899),该结果与附图6c-d的流式细胞测试的细胞凋亡结果一致。
实施例7
体内原位脑胶质瘤MR成像实验:利用小鼠脑立体定位仪在6-8周ICR小白鼠体内构建 C6原位脑胶质瘤模型,分别尾静脉注射PM@P NGs和MPM@P NGs(200μL,MnO2:2 mg/kg)。MR成像结果参见说明书附图6h和6i,分别为包膜前后的PM@P NGs和MPM@P NGs 在原位脑胶质瘤中的MR成像图片和对应的信噪比(SNR)。从图中看到,注射NGs以后肿瘤部位随时间逐渐变亮,SNR信号值增加,在4h时MR信号强度达到最高,随后减弱。值得注意的是,包膜组(MPM@P)的SNR值显著高于未包膜组(PM@P)(p<0.05),表明包覆了巨噬细胞膜的MPM@P NGs跨越BBB进入原位脑胶质瘤中的量高于未包膜的PM@P NGs,这与体外BBB跨膜结果相一致。
实施例8
所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。实验用的6-8周的ICR小白鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国,上海)。小鼠麻醉后用立体脑定位仪将头部固定,在设定的手术区域备皮、消毒,用刀片轻划开皮肤后在其颅骨上钻孔,然后经注射孔注射1×105个C6 细胞/鼠的细胞悬液。待注射癌细胞5~7天后,通过MR成像确认建模成功的小鼠,将荷瘤小鼠随机分为6组(PBS、M@P、Cisplatin、PM@P、MPM@P和Blocked MPM@P组),每组裸鼠数量为4只,此时记作实验开始的第0天,分别尾静脉注射200μL PBS、200μL溶于 PBS的M@P、Cisplatin、PM@P、MPM@P和Blocked MPM@P,其中Blocked MPM@P NGs 组用anti-α4和anti-β1单克隆抗体进行阻断,每只实验组小鼠的注射药物(Cisplatin:3.8mg/kg) 和MnO2(2mg/kg)保持一致。治疗过程中,每3天给药治疗一次,一个疗程共治疗3次(第 0、3、6天),治疗过程如图7a所示。同时分别在第0天、第3天、第6天和第10天用MR 成像监测和记录肿瘤体积变化,每隔两天记录小鼠的体重变化情况。肿瘤体积以及相对肿瘤体积用下面的公式(1)和(2)分别计算。
肿瘤体积(V)=a×b2/2(1)
a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
相对肿瘤体积=V/V0(2)
V和V0分别代表给药后第n天的肿瘤体积和给药前的肿瘤体积。
从附图7b和7c看到,与PBS组相比,其他治疗组均使肿瘤生长受到了不同程度的抑制。其中,与单独的化学动力学治疗组(M@P)相比,化学动力学联合化疗治疗组(PM@P)表现出了提高的抑制肿瘤生长效果(p<0.01)。更重要的是,与未包膜的PM@P组相比,包覆了巨噬细胞膜的联合化学动力学-化疗组(MPM@P)进一步显著抑制了脑胶质瘤原位瘤的生长 (p<0.01)。为了考察巨噬细胞膜在跨越BBB靶向脑肿瘤过程中的作用机制,我们用anti-α4 和anti-β1对MPM@P NGs进行膜表面抗体阻断。从结果中看到,抗体阻断组(Blocked MPM@P)的肿瘤抑制能力出现显著下降,验证了巨噬细胞膜上的整合素α4和β1在穿越BBB 进入脑实质中发挥了重要作用。另外,从附图7d中也可以看到,PBS组的小鼠体重下降最明显,其他各对照组的小鼠体重也出现了一定程度的下降,而MPM@P NGs组的小鼠体重下降最少。可见本发明制备的巨噬细胞膜包覆的负载MnO2和Pt的PVCL仿生纳米水凝胶通过介导其跨越BBB,联合增强的化学动力学治疗和化疗,可以有效抑制脑胶质瘤原位瘤的生长。
Claims (10)
1.一种仿生纳米水凝胶材料,其特征在于,所述材料为巨噬细胞膜包覆纳米水凝胶;其中纳米水凝胶为负载二氧化锰MnO2和化疗药物的聚N-乙烯基己内酰胺PVCL纳米水凝胶。
2.根据权利要求1所述仿生纳米水凝胶材料,其特征在于,所述化疗药物为顺铂。
3.一种仿生纳米水凝胶材料的制备方法,包括:
(1)将负载二氧化锰的聚N-乙烯基己内酰胺纳米水凝胶MnO2/PVCL NGs和化疗药物混合,室温下避光搅拌反应,离心,得到载药纳米水凝胶;
(2)将细胞膜溶液和步骤(1)所得载药纳米水凝胶混合,进行共挤出,得到仿生纳米水凝胶。
4.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中化疗药物为顺铂;所述MnO2/PVCL NGs与顺铂的质量比为1:0.2~1:0.5。
5.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中反应时间为16-24h。
6.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中细胞膜具体为:收集小鼠巨噬细胞,加入细胞裂解液,在冰下孵育15~30min进行细胞裂解,并采用冻融法冻融,离心,得到的细胞膜沉淀。
7.根据权利要求6所述制备方法,其特征在于,所述细胞膜制备具体为:每管巨噬细胞的细胞数量为1~5×107,加入配制好的细胞裂解液2~4mL,其中每1mL细胞裂解液中加入10μL蛋白酶抑制剂PMSF,在液氮和37℃水浴锅中反复冻融次数为3~5次,先在750~850g/min的低速离心速度下除去细胞器沉淀,然后在15000~18000g/min的高速离心速度下获得细胞膜沉淀。
8.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中细胞膜与载药纳米凝胶的质量比为0.8:1~1.5:1。
9.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中共挤出次数为10~20次。
10.一种权利要求1所述仿生纳米水凝胶材料在制备跨越BBB进行原位脑胶质瘤的MR成像和化学动力学-化疗联合治疗药物中的应用。
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