CN113116854B - 一种壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属药物制剂领域，公开了一种壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，包括脂蛋白纳米粒、具有鼻粘膜吸收促进作用的壳聚糖或/和壳聚糖衍生物。本发明还公开了壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物的制备方法，包括：将壳聚糖或/和壳聚糖衍生物与脂蛋白纳米粒通过动态作用力自组装成为透膜性良好的鼻腔制剂。本发明壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物制备条件温和，工艺简单，易于工业化生产。体系安全无毒，生物降解性良好，可提高脂蛋白类药物的鼻粘膜吸收，保证高效脑靶向性。该剂型给药方式为滴鼻、喷雾等，操作简单，便于长期服药的患者用药，在中枢神经系统疾病的治疗方面具有良好的临床应用前景。

Description

一种壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属药物制剂领域，尤其涉及一种壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，关于中枢神经系统(Central nervous system，CNS)疾病如阿尔兹海默症、帕金森症、脑卒中、脑胶质瘤的研究和发展十分迅速。但由于脑组织的天然生理屏障-血脑屏障(Bloodbrain barrier，BBB)的存在，使98％以上具有中枢治疗活性的药物因无法跨越BBB而失去疗效。虽然缩氨酸和蛋白类小分子可以通过系统给药跨过BBB到达大脑，但因治疗剂量高而导致一系列的不良反应。通过直接向脑室或大脑薄壁组织注射给药，虽然可以将药物直接递送至脑内，但这种侵入性给药方式具有明显的侵害性。因此，在临床应用中为了克服BBB的阻碍，改变药物的传递策略十分必要。
鼻腔给药是以非侵入性的给药方式提高药物的脑内递释，因其安全、有效、便捷，已经成为脑内靶向给药研究的热点之一。鼻腔与脑组织间存在着解剖学上的直接联系：鼻腔的嗅粘膜上皮含双极嗅细胞，由其形成的嗅神经穿过筛板进入中枢神经系统的嗅球，因此，鼻腔给药后部分药物可经嗅粘膜吸收进入嗅球或脑脊液，从而绕过BBB直接转运入脑，发挥中枢治疗作用。
脂蛋白(lipoprotein)是哺乳动物体内存在的由多种脂质和载脂蛋白组成的大分子复合物，在机体内承担着重要脂质代谢功能。研究表明，脂蛋白类药物可以参与β-淀粉样蛋白(β-amyloid plaques，Aβ)的代谢，促进其脑内降解和清除，同时还具有潜在的抗炎抗氧化以及促内皮细胞生成、抑制内皮细胞凋亡的作用，为中枢神经系统疾病的治疗提供了广阔的开发前景。临床前已有对澳大利亚CSL公司前体脂蛋白模拟物CSL-111用于阿尔兹海默症治疗的研究，入脑后可有效促进阿尔兹海默病患者脑内β-淀粉样蛋白被代谢清除。但此类药物属机体内源性物质，静注给药后易与血浆蛋白结合发生性质转变，且因肝脏高表达脂蛋白特异性受体，经血液循环后其大量转移到肝脏，脑靶向效率极低。近年来，已有一些脂蛋白类药物通过鼻腔入脑治疗中枢神经系统疾病的文献和专利报道，专利CN106466298A公开一种单唾液酸四己糖神经节苷脂修饰重组脂蛋白用于鼻腔给药治疗阿尔兹海默症，将合适含量的单唾液酸四己糖神经节苷脂用于修饰重组脂蛋白以显著提高重组脂蛋白对β淀粉样蛋白的亲和力，并促进β淀粉样蛋白的清除。但该蛋白类药物透粘膜吸收能力差而且鼻腔稳定性不佳，易受鼻腔内酶降解又易被鼻纤毛清除，入脑量较低，无法达到有效的临床剂量。因此，提高脂蛋白类的鼻腔稳定性，增加其透膜吸收已经成为该类药物经鼻腔入脑的一个关键问题。
专利CN 107890570A公开了一种靶向胶质瘤的复合纳米制剂，采用包载材料壳聚糖聚合物包覆肝癌衍生生长因子shRNA后组装成鼻用纳米复合物，具有良好的脑部胶质瘤靶向性。但该类纳米复合物涉及壳聚糖入脑后的分解代谢，为机体带来不必要的负担。因此，有必要开发一种既可利用壳聚糖粘膜黏附性及吸收促进性，又可智能断裂壳聚糖-药物连接键的纳米传递系统，使得壳聚糖停留在鼻腔外，只将治疗药物经鼻递送至脑内。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物及其制备方法和其在中枢神经系统疾病治疗中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，包括脂蛋白纳米粒、具有鼻粘膜吸收促进作用的壳聚糖或/和壳聚糖衍生物；按处方总质量算，壳聚糖或/和其衍生物占处方总质量的10％～90％，脂蛋白纳米粒占处方总质量的10％～90％；壳聚糖衍生物的接枝率为5％～50％。
所述壳聚糖或壳聚糖衍生物的脱乙酰度为≤98％，分子量为≤1000KDa。
所述壳聚糖选自非衍生化壳聚糖、羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、三甲基壳聚糖、硫醇化壳聚糖的一种或多种。
所述壳聚糖衍生物选自壳聚糖硼衍生物、壳聚糖酸酐聚合物、氨基酸接枝壳聚糖的一种或多种。
所述壳聚糖衍生物是由壳聚糖接枝功能性小分子制成，所述功能性小分子选自4-羟基苯硼酸、4-溴甲基苯硼酸、马来酸酐、L-精氨酸。
所述脂蛋白纳米粒是从血浆中直接提取或经基因工程表达的天然脂蛋白纳米粒或经脂质与载脂蛋白体外重组方法获得的脂蛋白纳米粒，通过合理的工艺参数配伍，其粒径为7～200nm。
所述脂质选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、神经酰胺、鞘磷脂、甘油酯或其衍生物中的一种或多种。
所述载脂蛋白选自apoA-I或其模拟肽、apoA-Ⅱ或其模拟肽、apoA-IV或其模拟肽、apoE或其模拟肽中的一种或多种。
作为优选，所述脂蛋白体的外重组方法为薄膜分散-后插入法，具体包括以下步骤：
步骤(1)、称取处方量的脂质溶解于适量成膜溶剂中，于25～75℃旋蒸或真空干燥12～24h去除溶剂，形成均匀的脂质膜；
步骤(2)、称取处方量的载脂蛋白溶解于超纯水，配制成浓度为5～30mg/mL的载脂蛋白溶液；
步骤(3)、脂质膜用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液水化，搅拌混合均匀，得到浓度为10～90mg/mL的脂质水化溶液；
步骤(4)、水化结束后，于水浴超声中分散2～20min，得到脂质纳米粒溶液；
步骤(5)、将载脂蛋白溶液加入到脂质纳米粒溶液中，室温磁力搅拌孵育8～24h，冷冻干燥，即得脂蛋白纳米粒。
所述脂质和成膜溶剂的用量比为7～20:1g/mL；所述脂质和载脂蛋白的质量比为3～1:1；所述的成膜溶剂为甲醇或氯仿或甲醇氯仿(1:1，v:v)混合溶剂；所述水浴的温度是30～45℃。
所述壳聚糖或壳聚糖衍生物与所述脂蛋白是经动态作用力自组装而成，所述动态作用力包括配位键、氢键、π键、范德华力、静电力、极性键、非极性键和离子键中的一种或多种。单一的壳聚糖通过静电力、氢键与脂蛋白自组装，壳聚糖衍生物与脂蛋白间的动态作用力范围得以扩大，引入包括配位键、π键、范德华力、极性键与非极性键等，使得壳聚糖脂蛋白纳米复合物间动态结合与解离的效率提高，促脂蛋白鼻粘膜吸收效果增强。
本发明的另一个目的是提供所述壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物的制备方法，所述制备方法为动态作用自组装法，具体包括以下步骤：
步骤(1)、将处方量的壳聚糖或/和壳聚糖衍生物溶解于pH＝8～10的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到壳聚糖或/和壳聚糖衍生物溶液；
步骤(2)、将处方量的冻干脂蛋白纳米粒溶解于pH＝8～10的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到脂蛋白溶液；
步骤(3)、将壳聚糖或/和壳聚糖衍生物溶液和脂蛋白溶液混合，室温磁力搅拌自组装24～48h，即得壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物。
本发明所述壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物具有高鼻腔黏附性、高鼻粘膜透过性及高效脑靶向性，可以治疗疾病领域包括阿尔兹海默症、帕金森症、脑卒中、脑胶质瘤等中枢神经系统疾病。因此，本发明的另一个目的是提供壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用，优选在制备治疗阿尔兹海默症、帕金森症、脑卒中、脑胶质瘤药物中的应用。该剂型给药方式为滴鼻、喷雾等，操作简单，便于长期服药的患者用药，在中枢神经系统疾病的治疗方面具有良好的临床应用前景。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1)、采用动态作用力连接壳聚糖或壳聚糖衍生物与脂蛋白。动态作用力可在鼻腔生理环境中特定的pH值、粘膜细胞层负电性、黏液层唾液酸的触发下智能断裂。
2)、通过合理的脂蛋白制备工艺参数配伍及动态作用自组装比例的调配，控制壳聚糖脂蛋白鼻腔纳米复合物的粒径为20～70nm，属于高效脑靶向纳米制剂的粒径范围。壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物基本趋于均一的球形、外观光滑圆整且分散性良好，给药后可均匀分散在鼻粘膜上皮细胞上，利于鼻粘膜吸收。
3)、本发明壳聚糖脂蛋白纳米复合物克服了现有壳聚糖纳米粒包封中枢治疗活性药物经鼻给药的弊端，经鼻腔给药后，通过壳聚糖的生物黏附作用，延长了纳米制剂在鼻腔内的滞留时间；通过鼻腔生理环境的特定触发，智能断裂壳聚糖及其衍生物与脂蛋白纳米粒间的动态作用力；通过壳聚糖打开鼻粘膜上皮细胞紧密连接的作用，“卸货”式递药，高效促进脂蛋白纳米粒经细胞旁路靶向入脑，而壳聚糖或壳聚糖衍生物本身在鼻腔外被清除，不涉及脑内代谢负担。该纳米复合物兼具高鼻腔黏附性、高鼻粘膜透过性及高效脑靶向性，无鼻粘膜毒性，生物降解性良好。
4)、脂蛋白纳米粒是从血浆中直接提取或经基因工程表达的天然脂蛋白纳米粒或经脂质与载脂蛋白体外重组方法获得的脂蛋白纳米粒，材料来源广泛，特异性强、安全性高，易于大规模生产，具有极大的临床应用潜力。
5)、本发明壳聚糖脂蛋白纳米复合物制备工艺简单，采用不同规格的壳聚糖或壳聚糖衍生物均可与脂蛋白纳米粒通过动态作用力自组装成透膜吸收良好的鼻腔制剂，适用范围广且普适性强。
6)、单一的壳聚糖只通过静电力、氢键与脂蛋白自组装，壳聚糖衍生物与脂蛋白间的动态作用力范围得以扩大，引入包括配位键、π键、范德华力、极性键与非极性键等，使得壳聚糖脂蛋白纳米复合物间动态结合与解离的效率提高。对比壳聚糖及同规格壳聚糖衍生物制备的纳米复合物，壳聚糖衍生物制备的纳米复合物给药后以更高效的解离使鼻粘膜上皮细胞紧密连接快速打开，脂蛋白细胞旁路转运效率增强，脑组织分布量提高。
附图说明
图1：壳聚糖-硼衍生物接枝聚合物的核磁共振氢谱；
图2：薄膜分散-后插入法体外重组脂蛋白纳米粒的透射电镜图；
图3：壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物的透射电镜图；
图4：鼻粘膜上皮细胞的体外细胞模型的跨膜电阻变化；
图5：壳聚糖脂蛋白纳米复合物的跨膜转运效率；
图6：壳聚糖脂蛋白纳米复合物的鼻腔给药脑组织分布。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进一步详细的说明。应当理解，此处所述的具体实施例用以说明本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例1
称取0.5g壳聚糖(分子量为150KDa，脱乙酰度为98％)溶于60mL 0.5％醋酸溶液中。另称取0.45倍壳聚糖单元摩尔量的4-羧基苯硼酸(PBA)和206.6mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于30mL甲醇，室温下搅拌30min。称取342.57mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC·HCl)加入到PBA/NHS混合液中，搅拌均匀溶解。然后将PBA/NHS/EDC·HCl混合溶液加入到壳聚糖的醋酸溶液中(反应体系中甲醇和水的体积比为1:2)，室温下搅拌24h，将反应液转移到截留分子量为14×103的透析袋中，在去离子水中透析72h，每4h更换1次水。将透析后的样品冷冻干燥，得到淡黄色粉末状的壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物。将壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物分散于重水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，使用Bruker Advance400MHz核磁共振鉴定其结构，结果如图1所示，在8ppm附近显示强的-C6H4-峰，证实苯硼酸已经连接在壳聚糖上，采用核磁共振峰面积计算该接枝聚合物的接枝率为15％。
实施例2
参照实施例1的工艺条件，将壳聚糖(分子量为150KDa，脱乙酰度为98％)调整为壳聚糖(分子量为150KDa，脱乙酰度为60％)，制得壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物，采用核磁共振峰面积计算方法得到接枝率为9％。
实施例3
参照实施例1的工艺条件，将壳聚糖(分子量为150KDa，脱乙酰度为98％)调整为壳聚糖(分子量为150KDa，脱乙酰度为80％)，制得壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物，采用核磁共振峰面积计算方法得到接枝率为12％。
实施例4
称取0.5g三甲基壳聚糖(分子量为50KDa，脱乙酰度为95％)溶于60mL 0.5％醋酸溶液中。另称取0.3倍壳聚糖单元摩尔量的4-羧基苯硼酸(PBA)和195.7mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于30mL甲醇，室温下搅拌30min。称取301.83mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC·HCl)加入到PBA/NHS混合液中，搅拌均匀溶解。然后将PBA/NHS/EDC·HCl混合溶液加入到三甲基壳聚糖的醋酸溶液中(反应体系中甲醇和水的体积比为1:2)，室温下搅拌24h，将反应液转移到截留分子量为14×103的透析袋中，在去离子水中透析72h，每4h更换1次水。将透析后的样品冷冻干燥，得到淡黄色粉末状的三甲基壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物。将三甲基壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物分散于重水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，使用Bruker Advance 400MHz核磁共振仪做核磁共振氢谱，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率均为28％。
实施例5
参照实施例4的工艺条件，将三甲基壳聚糖(分子量为50KDa，脱乙酰度为95％)调整为三甲基壳聚糖(分子量为150KDa，脱乙酰度为95％)，制得三甲基壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物，采用核磁共振峰面积计算方法得到接枝率为28％。
实施例6
参照实施例4的工艺条件，将三甲基壳聚糖(分子量为50KDa，脱乙酰度为95％)调整为三甲基壳聚糖(分子量为800KDa，脱乙酰度为95％)，制得三甲基壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物，采用核磁共振峰面积计算方法得到接枝率为28％。
实施例7
在100mL烧瓶中，将0.2g硫醇化壳聚糖(分子量为100KDa，脱乙酰度为80％)溶解在15mL浓度为0.2mol/L的NaOH溶液中，然后将0.8倍壳聚糖单元摩尔量的4-溴甲基苯硼酸溶解在15mL邻二氯苯中，将硫醇化壳聚糖溶液与4-溴甲基苯硼酸溶液混合，向混合体系中加入0.1倍壳聚糖单元摩尔量的相转移催化剂十六烷基三甲基溴化铵，120℃回流24小时，用反应液三倍体积的乙酸乙酯萃取3次，将反应液转移到截留分子量为14×103的透析袋中，在去离子水中透析72h，每4h更换1次水。将透析后的样品冷冻干燥，得到淡黄色粉末状的硫醇化壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物。将硫醇化壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物分散于重水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，使用Bruker Advance 400MHz核磁共振仪做核磁共振氢谱，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为37％。
实施例8
参照实施例7的工艺条件，将硫醇化壳聚糖(分子量为100KDa，脱乙酰度为80％)调整为硫醇化壳聚糖(分子量为500KDa，脱乙酰度为80％)，制得硫醇化壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物，采用核磁共振峰面积计算方法得到接枝率为37％。
实施例9
参照实施例7的工艺条件，将硫醇化壳聚糖(分子量为100KDa，脱乙酰度为80％)调整为硫醇化壳聚糖(分子量为1000KDa，脱乙酰度为80％)，制得硫醇化壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物，采用核磁共振峰面积计算方法得到接枝率为37％。
实施例10
在100mL烧瓶中，将0.2g三甲基壳聚糖(分子量为100KDa，脱乙酰度为65％)溶解在15mL浓度为0.2mol/L的NaOH溶液中，然后将1倍壳聚糖单元摩尔量的4-溴甲基苯硼酸溶解在15mL邻二氯苯中，将三甲基壳聚糖溶液与4-溴甲基苯硼酸溶液混合，然后加入0.1倍壳聚糖单元摩尔量的相转移催化剂十六烷基三甲基溴化铵，120℃回流24小时，用反应液三倍体积的乙酸乙酯萃取3次，将反应液转移到截留分子量为14×103的透析袋中，在去离子水中透析72h，每4h更换1次水。将透析后的样品冷冻干燥，得到淡黄色粉末状的三甲基壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物。将三甲基壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物分散于重水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，使用Bruker Advance 400MHz核磁共振仪做核磁共振氢谱，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为29％。
实施例11
参照实施例10的工艺条件，将三甲基壳聚糖(分子量为100KDa，脱乙酰度为65％)调整为三甲基壳聚糖(分子量为100KDa，脱乙酰度为85％)，制得三甲基壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为38％。
实施例12
参照实施例10的工艺条件，将三甲基壳聚糖(分子量为100KDa，脱乙酰度为65％)调整为三甲基壳聚糖(分子量为100KDa，脱乙酰度为95％)，制得三甲基壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为43％。
实施例13
称取2g壳聚糖(分子量为20KDa，脱乙酰度为50％)，用100mL蒸馏水分散，并转移至250mL烧瓶中，加入0.5倍壳聚糖单元摩尔量的L-精氨酸，随后加入1倍壳聚糖单元摩尔量缩合剂EDC与0.8倍壳聚糖单元摩尔量的偶联剂NHS，用0.1mol/L盐酸调节pH值为5，使包括壳聚糖在内的各反应物充分溶解，形成均一的反应体系，随后于30℃下反应12h。反应结束后，用0.5mol/L的NaOH溶液调节体系pH值至8，待产物充分析出后，装入截留分子量为14×103的透析袋中，于蒸馏水中透析72h，期间每隔6h更换一次蒸馏水，以充分去除未反应的氨基酸、缩合剂、偶联剂以及副产物异脲。随后在浓缩剂PEG20000上浓缩24h，取出产物冷冻干燥，得到最终白色粉末状的精氨酸接枝壳聚糖。将精氨酸接枝壳聚糖分散于重水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，使用Bruker Advance 400MHz核磁共振仪做核磁共振氢谱，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为15％。
实施例14
参照实施例13的工艺条件，将壳聚糖(分子量为20KDa，脱乙酰度为50％)调整为壳聚糖(分子量为20KDa，脱乙酰度为70％)，制得精氨酸接枝壳聚糖，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为20％。
实施例15
参照实施例13的工艺条件，将壳聚糖(分子量为20KDa，脱乙酰度为50％)调整为壳聚糖(分子量为20KDa，脱乙酰度为90％)，制得精氨酸接枝壳聚糖，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为27％。
实施例16
称取1.8g硫醇化壳聚糖(分子量为10KDa，脱乙酰度为80％)，用100mL蒸馏水分散，并转移至250mL烧瓶中，加入0.5倍壳聚糖单元摩尔量的L-精氨酸，随后加入1倍壳聚糖单元摩尔量缩合剂EDC与0.8倍壳聚糖单元摩尔量的偶联剂NHS，用0.1mol/L的盐酸调节pH值为5，使包括硫醇化壳聚糖在内的各反应物充分溶解，形成均一的反应体系，随后于30℃下反应12h。反应结束后，用0.5mol/L的NaOH溶液调节体系pH值至8，待产物充分析出后，装入截留分子量为14×103的透析袋中，于蒸馏水中透析72h，期间每隔6h更换一次蒸馏水，以充分去除未反应的氨基酸、缩合剂、偶联剂以及副产物异脲。随后在浓缩剂PEG20000上浓缩24h，取出产物冷冻干燥，得到最终白色粉末状的精氨酸接枝硫醇化壳聚糖。将精氨酸接枝硫醇化壳聚糖分散于重水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，使用Bruker Advance 400MHz核磁共振仪做核磁共振氢谱，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为13％。
实施例17
参照实施例16的工艺条件，将硫醇化壳聚糖(分子量为10KDa，脱乙酰度为80％)调整为硫醇化壳聚糖(分子量为50KDa，脱乙酰度为80％)，制得精氨酸接枝硫醇化壳聚糖，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为13％。
实施例18
参照实施例16的工艺条件，将硫醇化壳聚糖(分子量为10KDa，脱乙酰度为80％)调整为硫醇化壳聚糖(分子量为150KDa，脱乙酰度为80％)，制得精氨酸接枝硫醇化壳聚糖，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为13％。
实施例19
将一定量的氯化(1-丁基-3-甲基咪唑)加入三口烧瓶中，加去离子水配成4％的水溶液，然后按质量分数1％加入壳聚糖(分子量为120KDa，脱乙酰度为50％)，60℃下加热直到完全溶解，加入0.5倍壳聚糖单元摩尔量的马来酸酐，升温至80℃反应6h，向反应液中加入等量甲醇析出白色沉淀，抽滤，产物以甲醇为溶剂用索式提取器抽提10h，得到马来酰化壳聚糖。将马来酰化壳聚糖分散于重水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，使用BrukerAdvance400MHz核磁共振仪做核磁共振氢谱，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为27％。
实施例20
参照实施例19的工艺条件，将壳聚糖(分子量为120KDa，脱乙酰度为50％)调整为壳聚糖(分子量为120KDa，脱乙酰度为80％)，制得马来酰化壳聚糖，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为43％。
实施例21
将一定量的氯化(1-丁基-3-甲基咪唑)加入三口烧瓶中，加去离子水配成4％的水溶液，然后按质量分数1％加入三甲基壳聚糖(分子量为80KDa，脱乙酰度为80％)，60℃下加热直到完全溶解，加入0.8倍壳聚糖单元摩尔量的马来酸酐，升温至80℃反应6h，向反应液中加入等量甲醇析出白色沉淀，抽滤，产物以甲醇为溶剂用索式提取器抽提10h，得到马来酰化壳聚糖。将马来酰化壳聚糖分散于重水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，使用BrukerAdvance 400MHz核磁共振仪做核磁共振氢谱，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为19％。
实施例22
参照实施例21的工艺条件，将三甲基壳聚糖(分子量为80KDa，脱乙酰度为80％)调整为三甲基壳聚糖(分子量为150KDa，脱乙酰度为80％)，制得马来酰化壳聚糖，采用核磁共振峰面积计算接枝聚合物的接枝率为19％。
实施例23
薄膜分散-后插入法体外重组脂蛋白纳米粒，具体步骤为：
步骤(1)、称取20mg蛋黄卵磷脂溶解于1mL甲醇中，于37℃旋蒸去除有机溶剂，蛋黄卵磷脂形成均匀的脂质膜。
步骤(2)、称取20mg apoA-I溶解于2mL超纯水，得到浓度为10mg/mL的载脂蛋白溶液。
步骤(3)、向步骤(1)的脂质膜中加入2mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液水化，搅拌混合均匀,得到浓度为10mg/mL的脂质水化溶液。
步骤(4)、水化结束后，于水浴(30～37℃)超声中分散8min，得到脂质纳米粒溶液。
步骤(5)、将载脂蛋白溶液加入到脂质纳米粒溶液中，室温磁力搅拌孵育12h，孵育结束后冷冻干燥即得脂蛋白纳米粒。
实施例24
薄膜分散-后插入法体外重组脂蛋白纳米粒，具体步骤为：
步骤(1)、称取10mg磷脂酰丝氨酸和0.2mg鞘磷脂共同溶解于1mL甲醇中，于40℃旋蒸去除有机溶剂，磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂形成均匀的脂质膜。
步骤(2)、称取2.5mg apoE和2.5mg apoA-IV溶解于250μL超纯水，得到浓度为20mg/mL的载脂蛋白溶液。
步骤(3)、向步骤(1)的脂质膜中加入250μL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液水化，搅拌混合均匀，得到质量浓度为40mg/mL的脂质水化溶液。
步骤(4)、水化结束后，于水浴(35～40℃)超声中分散15min，得到脂质纳米粒溶液。
步骤(5)、将载脂蛋白溶液加入到脂质纳米粒溶液中，室温磁力搅拌孵育24h，孵育结束后冷冻干燥即得脂蛋白纳米粒。
实施例25
薄膜分散-后插入法体外重组脂蛋白纳米粒，具体步骤为：
步骤(1)、称取6mg大豆卵磷脂和1mg磷脂酸溶解于1mL甲醇中，于40℃旋蒸去除有机溶剂，大豆卵磷脂和磷脂酸形成均匀的脂质膜。
步骤(2)、称取1mg apoA-I模拟肽和1mg apoE共同溶解于200μL超纯水，得到浓度为10mg/mL载脂蛋白溶液。
步骤(3)、向步骤(1)的脂质膜中加入200μL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液水化，搅拌混合均匀，得到浓度为30mg/mL的脂质水化溶液。
步骤(4)、水化结束后，于水浴(40～45℃)超声中分散20min，得到脂质纳米粒溶液。
步骤(5)、将载脂蛋白溶液加入到脂质纳米粒溶液中，室温磁力搅拌孵育12h，孵育结束后冷冻干燥即得脂蛋白纳米粒。
实施例26
壳聚糖与脂蛋白纳米粒的动态作用自组装，具体步骤为：
步骤(1)、取壳聚糖(分子量为150KDa，脱乙酰度为98％)100mg溶解于20mLpH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液。
步骤(2)、取实施例23得到的冻干脂蛋白纳米粒400mg溶解于20mL pH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为20mg/mL的脂蛋白溶液。
步骤(3)、将壳聚糖溶液和脂蛋白溶液混合，室温磁力搅拌自组装24h，即得壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，连接的动态作用力主要为氢键及静电力。
实施例27
三甲基壳聚糖与脂蛋白纳米粒的动态作用自组装，具体步骤为：
步骤(1)、取三甲基壳聚糖(分子量为50KDa，脱乙酰度为95％)625mg溶解于25mLpH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为25mg/mL的三甲基壳聚糖溶液。
步骤(2)、取实施例24得到的冻干脂蛋白纳米粒625mg溶解于25mL pH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为25mg/mL的脂蛋白溶液。
步骤(3)、将壳聚糖溶液和脂蛋白溶液混合，室温磁力搅拌自组装24h，即得壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，连接的动态作用力主要为氢键、范德华力及静电力。
实施例28
硫醇化壳聚糖与脂蛋白纳米粒的动态作用自组装，具体步骤为：
步骤(1)、取硫醇化壳聚糖(分子量为900KDa，脱乙酰度为75％)600mg溶解于20mLpH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为30mg/mL的硫醇化壳聚糖溶液。
步骤(2)、取实施例24得到的冻干脂蛋白纳米粒400mg溶解于20mL pH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为20mg/mL的脂蛋白溶液。
步骤(3)、将壳聚糖溶液和脂蛋白溶液混合，室温磁力搅拌自组装24h，即得壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，连接的动态作用力主要为氢键、范德华力及静电力。
实施例29
壳聚糖硼衍生物与脂蛋白纳米粒的动态作用自组装，具体步骤为：
步骤(1)、取实施例1壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物140mg溶解于20mL pH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为7mg/mL的壳聚糖-硼衍生物溶液。
步骤(2)、取实施例23得到的冻干脂蛋白纳米粒60mg溶解于20mL pH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为3mg/mL的脂蛋白溶液。
步骤(3)、将壳聚糖硼衍生物溶液和脂蛋白溶液混合，室温磁力搅拌自组装36h，即得壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，连接的动态作用力主要为氢键、静电力及非极性键。
实施例30
三甲基壳聚糖硼衍生物与脂蛋白纳米粒的动态作用自组装，具体步骤为：
步骤(1)、取实施例4三甲基壳聚糖-苯硼酸接枝聚合物625mg溶解于25mL pH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为25mg/mL的三甲基壳聚糖-硼衍生物溶液。
步骤(2)、取实施例24得到的冻干脂蛋白纳米粒625mg溶解于25mL pH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为25mg/mL的脂蛋白溶液。
步骤(3)、将三甲基壳聚糖硼衍生物溶液和脂蛋白溶液混合，室温磁力搅拌自组装24h，即得壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，连接的动态作用力主要为氢键、静电力、范德华力及非极性键。
实施例31
精氨酸接枝壳聚糖与脂蛋白纳米粒的动态作用自组装，具体步骤为：
步骤(1)、取实施例13精氨酸接枝壳聚糖140mg溶解于20mL pH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为7mg/mL的精氨酸接枝壳聚糖溶液。
步骤(2)、取实施例25得到的冻干脂蛋白纳米粒60mg溶解于20mL pH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为3mg/mL的脂蛋白溶液。
步骤(3)、将精氨酸接枝壳聚糖溶液和脂蛋白溶液混合，室温磁力搅拌自组装36h，即得壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，连接的动态作用力主要为氢键、静电力、范德华力及非极性键。
实施例32
精氨酸接枝硫醇化壳聚糖与脂蛋白纳米粒的动态作用自组装，具体步骤为：
步骤(1)、取实施例18精氨酸接枝硫醇化壳聚糖600mg溶解于20mL pH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到质量浓度为30mg/mL的精氨酸接枝硫醇化壳聚糖溶液
步骤(2)、取实施例25得到的冻干脂蛋白纳米粒400mg溶解于20mL pH＝8.5的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到浓度为20mg/mL的脂蛋白溶液。
步骤(3)、将精氨酸接枝壳聚糖溶液和脂蛋白溶液混合，室温磁力搅拌自组装36h，即得壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，连接的动态作用力主要为氢键、静电力、范德华力及非极性键。
实施例33
体外重组脂蛋白纳米粒的粒径及形态学表征
精密移取200μL实施例23制得的脂蛋白纳米粒，用超纯水稀释至1mL，使用马尔文粒度仪测定其粒径为(14.4±0.05)nm，多分散系数为(0.260±0.01)。另精密移取1μL实施例23制得的脂蛋白纳米粒，用超纯水稀释至4mL，滴于覆盖碳膜的铜网上，用滤纸吸去多余液体，2％磷钨酸溶液负染后自然烘干，置透射电镜下观察，结果如图2所示，其形态呈圆盘堆叠状，外观完整。
精密移取200μL实施例24制得的脂蛋白纳米粒，用超纯水稀释至1mL，使用马尔文粒度仪测定其粒径为(25.2±0.07)nm，多分散系数为(0.213±0.04)。另精密移取1μL实施例24制得的脂蛋白纳米粒，用超纯水稀释至4mL，滴于覆盖碳膜的铜网上，用滤纸吸去多余液体，2％磷钨酸溶液负染后自然烘干，置透射电镜下观察其形态呈圆盘堆叠状，外观完整。
精密移取200μL实施例25制得的脂蛋白纳米粒，用超纯水稀释至1mL，使用马尔文粒度仪测定其粒径为(40.0±0.01)nm，多分散系数为(0.225±0.07)。另精密移取1μL实施例25制得的脂蛋白纳米粒，用超纯水稀释至4mL，滴于覆盖碳膜的铜网上，用滤纸吸去多余液体，2％磷钨酸溶液负染后自然烘干，置透射电镜下观察其形态呈圆盘堆叠状，外观完整。
实施例34
壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米制剂的粒径及形态学表征
精密移取200μL实施例26制得的壳聚糖脂蛋白纳米复合物，用超纯水稀释至1mL，使用马尔文粒度仪测定其粒径为(30.5±0.02)nm，多分散系数为(0.215±0.03)。另精密移取1μL实施例26制得的纳米制剂，用超纯水稀释至4mL，滴于覆盖碳膜的铜网上，用滤纸吸去多余液体，2％磷钨酸溶液负染后自然烘干，置透射电镜下观察，结果如图3所示，其形态基本趋于均一的球形，外观光滑圆整且分散性良好。
精密移取200μL实施例27制得的壳聚糖脂蛋白纳米复合物，用超纯水稀释至1mL，使用马尔文粒度仪测定其粒径为(41.3±0.05)nm，多分散系数为(0.227±0.05)。另精密移取1μL实施例27制得的纳米制剂，用超纯水稀释至4mL，滴于覆盖碳膜的铜网上，用滤纸吸去多余液体，2％磷钨酸溶液负染后自然烘干，置透射电镜下观察，其形态基本趋于均一的球形，外观光滑圆整且分散性良好。
精密移取200μL实施例29制得的壳聚糖脂蛋白纳米复合物，用超纯水稀释至1mL，使用马尔文粒度仪测定其粒径为(59.6±0.08)nm，多分散系数为(0.207±0.01)。另精密移取1μL实施例29制得的纳米制剂，用超纯水稀释至4mL，滴于覆盖碳膜的铜网上，用滤纸吸去多余液体，2％磷钨酸溶液负染后自然烘干，置透射电镜下观察，其形态基本趋于均一的球形，外观光滑圆整且分散性良好。
精密移取200μL实施例32制得的壳聚糖脂蛋白纳米复合物，用超纯水稀释至1mL，使用马尔文粒度仪测定其粒径为(69.5±0.01)nm，多分散系数为(0.174±0.09)。另精密移取1μL实施例32制得的纳米制剂，用超纯水稀释至4mL，滴于覆盖碳膜的铜网上，用滤纸吸去多余液体，2％磷钨酸溶液负染后自然烘干，置透射电镜下观察，其形态基本趋于均一的球形，外观光滑圆整且分散性良好。
实施例35
壳聚糖脂蛋白纳米复合物打开鼻粘膜上皮细胞间紧密连接的效果考察
采用人结肠癌上皮细胞(Caco-2)作为模拟鼻粘膜上皮细胞的体外细胞模型。在75cm2培养瓶中，Caco-2细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，置入37℃培养箱，通入5％CO2(相对湿度90％)。取对数生长期细胞接种于24孔Transwell板上，接种密度为每孔1×105个/cm2，第1周隔天换液，第2周开始每天换液，培养约17～21d后，细胞完全汇合并分化，跨上皮细胞电阻大于300Ω/cm2表示建模成功。在建模成功的Transwell上室中分别加入经400μL鼻腔模拟液(磷酸二氢钾13.6g,加去离水1L溶解，用0.1mol/L(4g/L)氢氧化钠溶液调至pH＝6.5)预处理的壳聚糖脂蛋白纳米复合物(实施例26，0.05％，w/v)和脂蛋白纳米制剂(实施例23，0.05％，w/v)，下室加600μL DMEM培养基。每隔15min测一次电阻值，电阻达到最低后移去纳米制剂，每隔4h测一次电阻值，持续测量48h。结果如图4所示，壳聚糖脂蛋白纳米复合物给药后75min，细胞跨膜电阻达到最低值，且移去后电阻值逐渐恢复至初始，脂蛋白纳米制剂给药后细胞跨膜电阻值几乎无变化，证明壳聚糖具有打开鼻粘膜上皮细胞紧密连接的作用且效果可逆，促吸收效果良好且安全无毒。
实施例36
参照实施例35，考察实施例27制备的壳聚糖脂蛋白纳米复合物(0.05％，w/v)和实施例24制备的脂蛋白纳米制剂(0.05％，w/v)打开鼻粘膜上皮细胞间紧密连接的效果。实施例27制备的壳聚糖脂蛋白纳米复合物给药后70min，细胞跨膜电阻达到最低值，且移去后电阻值逐渐恢复至初始，实施例24制备的脂蛋白纳米制剂给药后细胞跨膜电阻值几乎无变化，证明壳聚糖具有打开鼻粘膜上皮细胞紧密连接的作用且效果可逆，促吸收效果良好且安全无毒。
实施例37
参照实施例35，考察实施例30制备的壳聚糖脂蛋白纳米复合物(0.05％，w/v)和实施例24制备的脂蛋白纳米制剂(0.05％，w/v)打开鼻粘膜上皮细胞间紧密连接的效果。实施例30制备的壳聚糖脂蛋白纳米复合物给药后60min，细胞跨膜电阻达到最低值，且移去后电阻值逐渐恢复至初始，实施例24制备的脂蛋白纳米制剂给药后细胞跨膜电阻值几乎无变化，证明壳聚糖具有打开鼻粘膜上皮细胞紧密连接的作用且效果可逆，促吸收效果良好且安全无毒。
实施例38
参照实施例35，考察实施例32制备的壳聚糖脂蛋白纳米复合物(0.05％，w/v)和实施例25制备的脂蛋白纳米制剂(0.05％，w/v)打开鼻粘膜上皮细胞间紧密连接的效果。实施例32制备的壳聚糖脂蛋白纳米复合物给药后65min，细胞跨膜电阻达到最低值，且移去后电阻值逐渐恢复至初始，实施例25制备的脂蛋白纳米制剂给药后细胞跨膜电阻值几乎无变化，证明壳聚糖具有打开鼻粘膜上皮细胞紧密连接的作用且效果可逆，促吸收效果良好且安全无毒。
实施例39
壳聚糖脂蛋白纳米复合物的跨膜转运效率考察
用荧光染料香豆素6(C6)分别标记实施例23制备的脂蛋白纳米粒、实施例26制备的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，构建得到脂蛋白-C6纳米粒、壳聚糖脂蛋白-C6纳米复合物。
在按照实施例35建模成功的Transwell上室中分别加入经400μL鼻腔模拟液(磷酸二氢钾13.6g,加去离水1L溶解，用0.1mol/L(4g/L)氢氧化钠溶液调至pH＝6.5)预处理的壳聚糖脂蛋白-C6纳米复合物(0.05％，w/v)和脂蛋白-C6纳米粒(0.05％，w/v)，下室加600μLDMEM培养基，给药75min后收集下室培养基，用多功能酶标仪测上室给与的纳米制剂以及下室培养基中C6的荧光强度，换算上下室的C6的质量后计算纳米制剂的跨膜转运效率，跨膜转运效率＝(下室收集的C6的质量/上室给与C6的质量)×100％。
结果如图5所示，壳聚糖脂蛋白纳米复合物的跨膜转运效率是脂蛋白纳米粒的7.92倍，证明壳聚糖促吸收效果良好。
实施例40
用荧光染料香豆素6(C6)分别标记实施例24制备的脂蛋白纳米粒、实施例27制备的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，构建得到脂蛋白-C6纳米粒、壳聚糖脂蛋白-C6纳米复合物。
参照实施例39，考察壳聚糖脂蛋白纳米复合物的跨膜转运效率。壳聚糖脂蛋白纳米复合物的跨膜转运效率是脂蛋白纳米粒的8.02倍，证明壳聚糖促吸收效果良好。
实施例41
用荧光染料香豆素6(C6)分别标记实施例24制备的脂蛋白纳米粒、实施例30制备的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，构建得到脂蛋白-C6纳米粒、壳聚糖脂蛋白-C6纳米复合物。
参照实施例39，考察壳聚糖脂蛋白纳米复合物的跨膜转运效率。壳聚糖脂蛋白纳米复合物的跨膜转运效率是脂蛋白纳米粒的8.38倍，证明壳聚糖促吸收效果良好。
实施例42
用荧光染料香豆素6(C6)分别标记实施例25制备的脂蛋白纳米粒、实施例32制备的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，构建得到脂蛋白-C6纳米粒、壳聚糖脂蛋白-C6纳米复合物。
参照实施例39，考察壳聚糖脂蛋白纳米复合物的跨膜转运效率
参照实施例39的工艺条件，将按实施例26构建壳聚糖脂蛋白-C6纳米复合物和按实施例23制备脂蛋白-C6纳米粒调整为按实施例32构建壳聚糖脂蛋白-C6纳米复合物和按实施例25制备脂蛋白-C6纳米粒，壳聚糖脂蛋白纳米复合物的跨膜转运效率是脂蛋白纳米粒的8.35倍，证明壳聚糖促吸收效果良好。
实施例43
壳聚糖脂蛋白纳米复合物的鼻腔给药脑组织分布考察
ICR小鼠随机分为2组，每组28只，第一组鼻腔给予实施例26制备的壳聚糖脂蛋白纳米复合物(40mg/kg)，第二组鼻腔给予相同剂量的实施例23制备的脂蛋白纳米制剂，给药体积10μL(每只鼻孔给5μL)。小鼠给药后，分别于15min、1h、2h，4h、8h、12h、48h处死，取出大脑，生理盐水洗净，-80℃保存。切割一半大脑，称取重量。加入500μLpH＝7.4的预冷PBS，用组织匀浆机将脑组织匀浆充分。10000rpm离心20min，收集上清液200μL，采用酶联免疫吸附法测定脑组织中脂蛋白的含量。结果如图6所示，给药4h后壳聚糖脂蛋白纳米复合物脑内含量是脂蛋白纳米粒的1.64倍，证明壳聚糖的存在延长了脂蛋白纳米粒在鼻腔内的滞留时间，同时促进了脂蛋白纳米粒的鼻腔吸收，具有更高的脑靶向性。
实施例44
参照实施例43，考察实施例27制备的壳聚糖脂蛋白纳米复合物和实施例24制备的脂蛋白纳米制剂的鼻腔给药脑组织分布。给药4h后壳聚糖脂蛋白纳米复合物脑内含量是脂蛋白纳米粒的1.67倍，证明壳聚糖的存在延长了脂蛋白纳米粒在鼻腔内的滞留时间，同时促进了脂蛋白纳米粒的鼻腔吸收，具有更高的脑靶向性。
实施例45
参照实施例43，考察实施例30制备的壳聚糖脂蛋白纳米复合物和实施例24制备的脂蛋白纳米制剂的鼻腔给药脑组织分布。给药4h后壳聚糖脂蛋白纳米复合物脑内含量是脂蛋白纳米粒的1.93倍，证明壳聚糖的存在延长了脂蛋白纳米粒在鼻腔内的滞留时间，同时促进了脂蛋白纳米粒的鼻腔吸收，具有更高的脑靶向性。
实施例46
参照实施例43，考察实施例32制备的壳聚糖脂蛋白纳米复合物和实施例25制备的脂蛋白纳米制剂的鼻腔给药脑组织分布。给药4h后壳聚糖脂蛋白纳米复合物脑内含量是脂蛋白纳米粒的1.87倍，证明壳聚糖的存在延长了脂蛋白纳米粒在鼻腔内的滞留时间，同时促进了脂蛋白纳米粒的鼻腔吸收，具有更高的脑靶向性。

Claims (10)

1.一种壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，其特征在于包括脂蛋白纳米粒、具有鼻粘膜吸收促进作用的壳聚糖或/和壳聚糖衍生物；所述壳聚糖或壳聚糖衍生物与所述脂蛋白经动态作用力自组装相连；所述动态作用力为氢键、范德华力、静电力、非极性键中的一种或多种；壳聚糖或/和其衍生物占处方总质量的10%～90%，脂蛋白纳米粒占处方总质量的10%～90%；所述壳聚糖衍生物是由壳聚糖接枝功能性小分子制成，所述功能性小分子选自4-羟基苯硼酸、4-溴甲基苯硼酸、马来酸酐、L-精氨酸；壳聚糖衍生物的接枝率为5%～50%；所述壳聚糖或壳聚糖衍生物的脱乙酰度为≤98%；
所述的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物通过以下方法制备得到：
步骤(1)、将处方量的壳聚糖或/和壳聚糖衍生物溶解于pH=8～10的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到壳聚糖或/和壳聚糖衍生物溶液；
步骤(2)、将处方量的脂蛋白纳米粒溶解于pH=8～10的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到脂蛋白溶液；
步骤(3)、将壳聚糖或/和壳聚糖衍生物溶液和脂蛋白溶液混合，室温磁力搅拌自组装24～48 h，即得壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，其特征在于所述壳聚糖或壳聚糖衍生物的分子量为≤1000 KDa。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，其特征在于所述壳聚糖衍生物是选自羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、三甲基壳聚糖、硫醇化壳聚糖中的一种或多种接枝功能性小分子制成的；或所述壳聚糖衍生物是选自羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、三甲基壳聚糖、硫醇化壳聚糖中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，其特征在于所述脂蛋白纳米粒采用从血浆中直接提取或经基因工程表达的天然脂蛋白纳米粒或经脂质与载脂蛋白体外重组方法获得的脂蛋白纳米粒；脂蛋白纳米粒粒径为7～200 nm。
5.根据权利要求4所述的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，其特征在于所述脂质选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、神经酰胺、鞘磷脂、甘油酯中的一种或多种；
所述载脂蛋白选自apoA-I或其模拟肽、apoA-Ⅱ或其模拟肽、apoA-IV或其模拟肽、apoE或其模拟肽中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，其特征在于所述脂蛋白纳米粒采用薄膜分散-后插入法制备，包括以下步骤：
步骤(1)、脂质溶解于成膜溶剂中，去除溶剂，形成均匀的脂质膜；
步骤(2)、载脂蛋白溶解于超纯水，配制成浓度为5～30 mg/mL的载脂蛋白溶液；
步骤(3)、脂质膜用pH=7.4的磷酸盐缓冲液水化，搅拌混合均匀，得到浓度为10～90mg/mL的脂质水化溶液；
步骤(4)、水化结束后，于水浴超声中分散2～20 min，得到脂质纳米粒溶液；
步骤(5)、将载脂蛋白溶液加入到脂质纳米粒溶液中，室温磁力搅拌孵育8～24 h，冷冻干燥，即得脂蛋白纳米粒。
7.根据权利要求6所述的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物，其特征在于所述脂质和成膜溶剂的用量比为7～20:1 g/mL；所述脂质和载脂蛋白的质量比为3～1:1；所述成膜溶剂为甲醇或氯仿或甲醇氯仿体积比1:1的混合溶剂；所述水浴的温度是30～45℃。
8.权利要求1所述的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤(1)、将处方量的壳聚糖或/和壳聚糖衍生物溶解于pH=8～10的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到壳聚糖或/和壳聚糖衍生物溶液；
步骤(2)、将处方量的脂蛋白纳米粒溶解于pH=8～10的碳酸氢钠缓冲溶液中，得到脂蛋白溶液；
步骤(3)、将壳聚糖或/和壳聚糖衍生物溶液和脂蛋白溶液混合，室温磁力搅拌自组装24～48 h，即得壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物。
9.权利要求5所述的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用。
10.权利要求5所述的壳聚糖脂蛋白鼻腔给药纳米复合物在制备治疗阿尔兹海默症、帕金森症、脑卒中、脑胶质瘤药物中的应用。
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