CN115154422B - Cd44靶向和ros响应的纳米胶束药物组合物及制备方法与应用 - Google Patents

Cd44靶向和ros响应的纳米胶束药物组合物及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物，纳米胶束药物组合物包括雷公藤红素和糖胺聚糖衍生物载体。本发明还公开了一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物的制备方法。本发明还公开了一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物的应用，将其应用于制备治疗CD44高表达和ROS响应疾病的药物。本发明的纳米胶束药物组合物通过多糖骨架与脂肪组织M1样巨噬细胞表面高表达的CD44受体的高度亲和力以及脂肪组织的高ROS响应性，将雷公藤红素主动靶向至特定的脂肪组织中，作用于治疗靶点，可显著提高脂肪组织的药物浓度，提高其治疗肥胖的效果。

Description

CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物及制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及到一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物及制备方法与应用。
背景技术
肥胖是代谢综合征发生的主要诱因，会引起肥胖组织活性氧(ROS)水平和炎症因子表达上升，进而引起胰岛素抵抗，最终发展为糖尿病。在过去的50年里，全球肥胖症和糖尿病的患病率持续上升。研究显示，通过控制饮食或手术治疗可以减缓甚至逆转脂肪堆积，但是对肥胖患者进行节食及运动干预，非常困难。因此，药物治疗是首选的治疗方式。目前，临床上常用的抗肥胖药物(AOM)有：奥利司他、纳曲酮-安非他酮、利拉鲁肽、索马鲁肽和芬特明-托吡酯，但上述AOMs存在药效较低和安全性问题，因此本发明利用制剂技术设计一种可行的药物递送系统，能够增加药物的脂肪组织和相关巨噬细胞靶向性，达到提高药效、降低全身毒性反应的目的。
肥胖小鼠的白色脂肪组织(WAT)的慢性炎症微环境会引起肥胖相关的全身胰岛素抵抗，且肥胖小鼠WAT中脂肪细胞成脂相关基因显著上调，如瘦素(leptin)、CFC3、MCP-1等，这些均与巨噬细胞的聚集和炎症的产生有关。因此，为了缓解肥胖症状，需要改善小鼠的体内炎症微环境。已有研究证明肥胖C57BL/6小鼠脂肪中氧化应激的增加是肥胖相关代谢综合征的重要致病机制。总的来说，肥胖病理环境下，组织炎症和脂质堆积相互促进，导致疾病的不断恶化，进而引起其他代谢相关疾病的发生。肥胖患者中ROS产生增加会进一步募集更多的M1样巨噬细胞到达脂肪组织，加剧炎症微环境的形成，脂肪组织的M1样巨噬细胞高表达CD44受体。
雷公藤红素(celastrol，CLT)，其结构式如图1所示，是一种从植物中提取出来的萜类化合物，作为NF-κB抑制剂在多种炎症相关疾病的治疗中发挥了重要作用，并且已有研究证明CLT可以提高瘦素敏感性，因而说明雷公藤红素有治疗肥胖的潜力，但雷公藤红素的毒副作用较明显。
基于上述背景，申请人设计了一个同时具有CD44靶向性和ROS响应的纳米胶束递释系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物及制备方法与应用，用于解决现有技术中抗肥胖药物存在药效较低和安全性不足的技术问题。
为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物，纳米胶束药物组合物包括雷公藤红素和糖胺聚糖衍生物载体。
本发明优选的方案之一，糖胺聚糖衍生物载体和雷公藤红素的质量比为3～30:1。
本发明优选的方案之一，糖胺聚糖衍生物载体是将多糖骨架与具有ROS响应的脂溶性小分子通过酰胺键共价连接。
本发明优选的方案之一，糖胺聚糖衍生物载体的糖胺聚糖材料选自透明质酸、硫酸软骨素以及低分子量肝素中的任意一种或两种，糖胺聚糖材料的分子量为1kDa～500kDa；具有ROS响应的脂溶性小分子的修饰度为5％～50％。
本发明优选的方案之一，，具有ROS响应的脂溶性小分子为4-氨基苯硼酸、3-氨基苯硼酸、4-氨基苯硼酸频哪醇酯、4-氨甲基苯硼酸频哪醇酯中的至少一种。
本发明优选的方案之一，糖胺聚糖衍生物载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)将糖胺聚糖溶于水中，向其中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，活化10分钟，作为溶液A；
步骤(2)称取具有ROS响应性的脂溶性小分子溶于有机溶剂中，作为溶液B；
步骤(3)将溶液A和溶液B搅拌混合均匀，37℃反应24小时，透析，冻干，得到具有CD44靶向和ROS响应的糖胺聚糖衍生物载体。
步骤(2)中有机溶剂为二甲基亚砜、无水乙醇以及丙酮中的至少一种。
基于本发明公开的CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物，本发明还公开了一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将雷公藤红素溶于有机溶剂中；
步骤(2)：将糖胺聚糖衍生物载体溶于水中，得到糖胺聚糖载体水溶液；
步骤(3)：向步骤(2)中的水溶液中搅拌加入步骤(1)中含有雷公藤红素的有机溶剂，搅拌4小时后，探头超声，透析得到纳米胶束药物组合物。
本发明优选的方案之一，步骤(1)中有机溶剂选自二甲基亚砜或无水乙醇；步骤(2)中水溶液与步骤(1)中有机溶剂的质量比为16～40：1；步骤(3)中的透析具体为：采用2500Da-8000Da的透析袋在超纯水中透析1-2天。
本发明优选的方案之一，步骤(3)中制备得到的纳米胶束药物组合物通过口服、静脉注射或滴注方式给药。
本发明还公开了一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物的应用，将其应用于制备治疗CD44高表达和ROS响应疾病的药物。
综上所述，本发明的有益效果为：
1、本发明的纳米胶束药物组合物通过多糖骨架与脂肪组织M1样巨噬细胞表面高表达的CD44受体的高度亲和力以及脂肪组织的高ROS响应性，将雷公藤红素主动靶向至特定的脂肪组织中，作用于治疗靶点，可显著提高脂肪组织的药物浓度，提高其治疗肥胖的效果。
2、本发明在糖胺聚糖的多糖骨架上通过共价偶联具有ROS响应的脂溶性小分子从而形成两亲性的具有CD44靶向和ROS响应的糖胺聚糖衍生物载体，再通过“超声-透析”法负载雷公藤红素制备纳米胶束。制备得到的纳米胶束药物组合物具有以下特征：①通过糖胺聚糖衍生物载体的两亲性成功包封雷公藤红素，显著提高药物溶解度、稳定性和体内循环时间。②糖胺聚糖衍生物载体具有CD44靶向性和ROS响应性释药特点，将药物主动靶向至CD44高表达和ROS含量高的病灶部位，提高病灶部位的药物浓度，降低游离药物的毒性，提高药物疗效。
3、本发明的糖胺聚糖衍生物载体可以有效负载雷公藤红素，提高药物溶解度，并且由于载体是天然多糖，因为可降低毒副作用，提高生物相容性。
4、本发明的纳米胶束药物组合物具有生物相容性好、载药量高、安全性好、稳定性强、制备工艺简单的优势。
附图说明
图1为本发明一个实施例中雷公藤红素的结构式；
图2为本发明一个实施例中CS-PBE的结构和核磁氢谱图；
图3为本发明一个实施例中CS-PBE的紫外扫描谱图；
图4为本发明一个实施例中CS-PBE的红外谱图；
图5为本发明一个实施例中CS-PBE的ROS响应示意图；
图6为本发明一个实施例中不同H2O2浓度下CS-PBE的核磁氢谱图；
图7为本发明一个实施例中CS-PBE的TEM图；
图8为本发明一个实施例中CS-PBE在37℃的7d稳定性图；
图9为本发明一个实施例中CLT/CS-PBE的体外释放图；
图10为本发明一个实施例中CS-PBE的细胞相容性图；
图11为本发明一个实施例中CS-PBE的血液生物相容性外观图；
图12为本发明一个实施例中CS-PBE的血液生物相容性定量图；
图13为本发明一个实施例中CLT/CS-PBE的细胞毒性图；
图14为本发明一个实施例中CS-PBE胶束在未极化RAW264.7和M1样RAW264.7细胞上的摄取图；
图15为本发明一个实施例中CS-PBE胶束在刺激和不刺激RAW264.7细胞、3T3L1细胞上的共聚焦摄取图(20×)；
图16为本发明一个实施例中CS-PBE胶束在刺激和不刺激RAW264.7细胞、3T3L1细胞上的共聚焦摄取图(63×)；
图17为本发明一个实施例中CLT/CS-PBE的ROS清除图；
图18为本发明一个实施例中CS-PBE/CLT治疗3T3-L1脂肪细胞炎症模型药效图；
图19为本发明一个实施例中CS-PBE/CLT治疗3T3-L1脂肪细胞炎症模型药效半定量图；
图20为本发明一个实施例中不同时间点DiD和CS-PBE/DiD的体内脂肪分布活体成像图；
图21为本发明一个实施例中不同时间点DiD和CS-PBE/DiD的体内脂肪分布半定量图；
图22为本发明一个实施例中静脉注射给药肥胖小鼠体内药效体重变化图；
图23为本发明一个实施例中静脉注射给药肥胖小鼠体内药效eWAT质量图；
图24为本发明一个实施例中静脉注射给药肥胖小鼠体内药效iWAT质量图；
图25为本发明一个实施例中静脉注射给药肥胖小鼠体内药效肝脏质量图；
图26为本发明一个实施例中口服给药肥胖小鼠体内药效体重变化图；
图27为本发明一个实施例中口服给药肥胖小鼠体内药效eWAT图；
图28为本发明一个实施例中口服给药肥胖小鼠体内药效iWAT质量图；
图29为本发明一个实施例中口服给药肥胖小鼠体内药效肝脏质量图。
具体实施方式
本发明提供了一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物，纳米胶束药物组合物包括雷公藤红素和糖胺聚糖衍生物载体。其中，糖胺聚糖衍生物载体和雷公藤红素的质量比为3～30:1。
糖胺聚糖衍生物载体是将多糖骨架与具有ROS响应的脂溶性小分子通过酰胺键共价连接。糖胺聚糖衍生物载体的糖胺聚糖材料选自透明质酸、硫酸软骨素(CS)以及低分子量肝素中的任意一种或两种，糖胺聚糖材料的分子量为1kDa～500kDa。
具有ROS响应的脂溶性小分子的修饰度为5％～50％，优选的，具有ROS响应的脂溶性小分子为4-氨基苯硼酸、3-氨基苯硼酸、4-氨基苯硼酸频哪醇酯(PBE)、4-氨甲基苯硼酸频哪醇酯中的至少一种。
糖胺聚糖衍生物载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)将糖胺聚糖溶于水中，向其中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC·HCL)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化10min溶液A；
步骤(2)称取0.5摩尔当量～2摩尔当量具有ROS响应性的脂溶性小分子溶于有机溶剂中，作为溶液B；
步骤(3)将溶液A和溶液B搅拌混合均匀，37℃反应24h，透析，冻干，得到具有CD44靶向和ROS响应的糖胺聚糖衍生物载体。
其中，步骤(2)中有机溶剂为二甲基亚砜、无水乙醇以及丙酮中的至少一种，优选的，有机溶剂为二甲基亚砜。
本发明还公开了一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将雷公藤红素分散溶于有机溶剂中；
步骤(2)：将糖胺聚糖衍生物载体溶于水中，得到糖胺聚糖载体水溶液；
步骤(3)：向步骤(2)中的水溶液中搅拌加入步骤(1)中含有雷公藤红素的有机溶剂，搅拌4h后，探头超声，透析得到纳米胶束药物组合物。
其中，步骤(1)中有机溶剂选自二甲基亚砜或无水乙醇；糖胺聚糖衍生物载体、有机溶剂与水的比例为(10mg-20mg)：(0.1mL-0.5mL)：(4mL-8mL)；
步骤(3)中的透析具体为：采用2500Da-8000Da的透析袋在超纯水中透析1-2天。
步骤(3)中制备得到的纳米胶束药物组合物通过口服、静脉注射或滴注方式给药。
本发明还公开了一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物的应用，将其应用于制备治疗CD44高表达和ROS响应疾病的药物。
实施例1：硫酸软骨素苯硼酸酯衍生物载体(CS-PBE)的合成与表征
准确称取502.7mg硫酸软骨素(CS)(后文硫酸软骨素均简称CS)溶于20mL超纯水中，向溶液中加入1.0068g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC·HCL)(后文1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺均简称EDC·HCL)，603.2mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(后文N-羟基琥珀酰亚胺均简称NHS)，10min后，向体系中加入10mLDMSO，作为溶液A；准确称取230.2mg 4-氨基苯硼酸频哪醇酯(PBE)(后文4-氨基苯硼酸频哪醇酯均简称PBE)，溶于30mLDMSO中，作为溶液B；将溶液A和溶液B在搅拌条件下混合均匀，37℃下反应24h。反应完成后，将反应体系移入3500Da的透析袋中，超纯水透析2d，每天更换透析液2次，透析结束后收集透析袋内反应液，冷冻干燥后得到产物CS-PBE。通过核磁氢谱、紫外扫描光谱和红外光谱确证CS-PBE的结构。图2为CS-PBE的核磁氢谱，δ＝1.91ppm为CS骨架上-NHCOCH3-的特征峰。在δ＝7.41～7.76ppm出现了PBE上苯环的特征峰，说明PBE成功修饰在CS上。图3为CS-PBE的紫外扫描光谱，对PBE的混合溶液进行光谱扫描，得到PBE的最大紫外吸收波长为266nm。在264-266nm处CS-PBE和PBE具有最大吸收。通过计算，确定了CS-PBE上PBE的取代度为9.35％。图4为CS-PBE的红外光谱，CS的图谱上特征峰2871cm-1归属于νC-H，特征峰1226cm-1归属于νS-O。CS-PBE的图谱上特征峰1620cm-1归属于δN-H弯曲振动，特征峰1740cm-1归属于酰胺νC＝O。CS-PBE上出现了CS上未出现的酰胺峰，说明CS-PBE合成成功。
实施例2：CS-PBE的ROS响应性
将CS-PBE溶解在不同H2O2浓度的重水溶液中，在7d后观察CS-PBE的核磁谱图。图5为ROS响应的示意图，图6为不同H2O2浓度下CS-PBE的核磁氢谱。随着H2O2浓度的升高，PBE部分逐渐从CS主链上解聚，形成CS和4-羟基苯硼酸的峰谱图，提示我们CS的两亲性减弱，这样就会使得CS-PBE中包载的药物能够在指定部位顺利释放，为之后的药效实验提供了释药基础。
实施例3：纳米胶束药物组合物(CS-PBE/CLT)的制备与表征
(1)纳米胶束药物组合物的制备：取15.3mgCS-PBE溶于6mL超纯水中，在搅拌状态下向其中缓慢加入含有2.5mgCLT的DMSO溶液300μL，搅拌4h后，在冰浴状态下探头超声10min(功率为150W)，收集超声后胶束溶液，在超纯水中透析12h除去DMSO，0.45μm滤头过滤后得到CS-PBE的载药或者空白胶束。
(2)粒径和电位：采用激光粒度仪(DLS)测定纳米胶束在水中的粒径(Size)、多分散系数(PDI)及Zeta电位，见表1。
表1：CS-PBE的粒径、PDI和电位
样品 粒径(nm) PDI 电位(mV)
CS-PBE 225.6±1.4 0.125±0.028 -29.7±1.2
(3)透射电镜(TEM)：CS-PBE的TEM图见图7，其中图1雷公藤红素结构式、图3纳米胶束紫外扫描图谱以及图7纳米胶束TEM图共同体现了纳米胶束药物组合物这个概念。
(4)稳定性实验：制备载药CS-PBE胶束溶液，放置在37℃进行储存，分别于第0、1、2、3、4、5、6、7天进行DLS检测，观察CS-PBE在模拟体内温度下的稳定性。结果见图8，CS-PBE在测定期间稳定性良好，可以用于后续实验。
(5)体外释放实验：制备载药CS-PBE胶束3mL，游离CLT的DMSO溶液3mL，转移到3500Da的透析袋中(1mL/份)，采用20mL含有0.2％Tween-80的PBS(pH7.4)作为释放介质，温度设为37℃，振荡速度为100rpm。在15min，30min，1h，2h，4h，6h，12h，24h，48h，72h，96h，120h分别取2mL释放介质进行检测，同时补加2mL新鲜介质，其释放曲线见图9。发现CS-PBE的包载可以延缓CLT的体外释放，达到缓释控释的目的，在24h后达到释放平衡，延长了药物在体内的作用时间。
实施例4：CS-PBE的体外细胞研究
(1)CS-PBE的细胞相容性：为了证明空白载体良好的细胞相容性，考察了不同浓度的CS-PBE空白胶束对正常RAW264.7细胞的影响。首先按照1×104个/孔的细胞密度在96孔板上接种RAW264.7细胞，每孔100μL细胞悬液，分别设置10个组别(其中一组不加细胞悬液，每组设置5个复孔)，待细胞贴壁并生长至适宜密度时，吸走培养基，然后在每一组加入不同浓度的空白CS-PBE胶束培养基100μL，并设置阴性对照组(无细胞、无胶束溶液)和空白对照组(有细胞、无胶束溶液)，分别于空白载体溶液作用1d和2d后，吸走溶液，然后在每一孔中加入CCK-8工作液110μL，继续孵育2h后，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔吸光度值(OD)。细胞相容性结果见图10，CS-PBE在后续实验浓度下对RAW264.7细胞有良好的细胞相容性。
(2)CS-PBE的血液生物相容性：为了证明空白载体良好的血液相容性，考察了不同浓度的CS-PBE空白胶束对正常红细胞的影响。设置组别，CS-PBE：0.156，0.313，0.625，1.250，2.500，5.000，10.000，20.000μM37℃孵育3h后，2000rpm离心15min，测定上清液的紫外吸收率(设定波长545nm)，计算材料的血液相容性，实验结果见图11，阳性对照Triton X-100为红色溶液，而阴性对照生理盐水组和胶束共孵育组均澄清透明。对孵育后溶液进行紫外吸光度检测，并分别计算不同组别吸光度占Triton X-100阳性对照组吸光度的比值，得到图12，结果显示不同浓度的CS-PBE与生理盐水组相比均具有更低的血红素吸收，说明CS-PBE胶束具有良好的血液相容性，可以用于后续的尾静脉给药。
实施例5：纳米胶束药物组合物的体外细胞研究
(1)纳米胶束药物组合物的毒性考察：考察了不同浓度的游离CLT和CLT/CS-PBE对正常RAW264.7细胞的影响。首先按照1×104个/孔的细胞密度在96孔板上接种RAW264.7细胞，每孔100μL细胞悬液，分别设置10个组别(其中一组不加细胞悬液，每组设置5个复孔)，待细胞贴壁并生长至适宜密度时，吸走培养基，然后在每一组加入不同浓度游离CLT和CLT/CS-PBE培养基溶液100μL，并设置阴性对照组(无细胞、无胶束溶液)和空白对照组(有细胞、无胶束溶液)，分别于空白载体溶液作用1d后，吸走溶液，使用CCK-8试剂盒对细胞毒性进行检测，实验结果见图13。从图中可知，游离CLT药物浓度高于1μM即具有明显细胞毒性，通过使用CS-PBE作为载体包载CLT实现药物递送目的可以有效减弱CLT对细胞的毒性，游离CLT的IC50为1.861μM，CS-PBE/CLT的IC50为2.848μM。
(2)CS-PBE胶束在未极化RAW264.7和M1样RAW264.7细胞上的摄取：制备CS-PBE/DiD胶束，考察未极化RAW264.7和M1样RAW264.7细胞的摄取情况。用1μg/mLLPS和20ng/mLIFN-γ完全培养基中诱导M1样RAW264.7炎症细胞模型形成，在适宜密度时进行细胞摄取实验，使用流式细胞术对摄取情况进行分析，如图14所示，不同极化状态的RAW264.7摄取CS-PBE/DiD效率均呈现时间依赖性增加；在不同的时间点，M1样RAW264.7均具有更高的CS-PBE/DiD摄取效率。这说明M1样RAW264.7炎症细胞模型的建立(即炎症微环境的形成)，可能对RAW264.7细胞的胶束摄取具有促进作用，所以CS-PBE/CLT可能更容易被M1样RAW264.7摄取，有利于抗炎药物CLT药效的高效发挥。
(3)CD44在不同细胞上的表达：为了探讨CD44受体的表达是否影响两种递送载体的细胞摄取，将RAW264.7细胞和3T3-L1细胞按5×104个/皿接种于共聚焦小皿中，待生长到适宜密度后，小心吸出培养基，用PBS润洗3次(每次5min)，室温下，在4％多聚甲醛中孵育细胞10min进行固定操作，PBS洗去固定液，用1％BSA的PBS4℃过夜孵育，加入CD44一抗稀释液(1：4000，1％BSA稀释)进行一抗孵育，4℃过夜后，PBS洗去一抗稀释液后，加入Alexa
Figure BDA0003771083020000111
647二抗稀释液(1：500，1％BSA稀释)进行二抗孵育，室温1h后PBS润洗；加入DAPI对细胞核进行染色，室温孵育10min后，PBS洗净。之后使用共聚焦显微镜观察两种细胞中CD44蛋白表达，结果如图15和图16所示，可知LPS和IFN-γ刺激RAW264.7细胞可以提高其表面CD44蛋白的表达，3T3-L1细胞为CD44低表达细胞，推测可能是由于不同细胞的CD44表达情况不同，细胞对CS-PBE胶束体系的摄取情况存在差异，CD44的高表达有利于促进RAW264.7细胞对CS-PBE胶束的摄取。
(4)抑制ROS产生实验：将RAW264.7细胞以5×105个/孔的密度接种在12孔板上，待生长到适宜密度后，除去原培养基，对细胞预孵育含CS-PBE/CLT载药胶束或游离CLT培养基30min，除去含药培养基，对细胞进行LPS和IFN-γ刺激30min，之后进行DCFH荧光强度的测定。实验结果如图17所示。由图17可知，CLT和CS-PBE/CLT可以显著降低胞内ROS水平(P<0.05)，随着给药浓度的增加，CS-PBE/CLT组的治疗效果增强，相比于游离CLT组，CS-PBE/CLT具有更好的降低胞内ROS水平的效果，这可能是因为CS-PBE/CLT增强了CLT的入胞效果，有利于药效更好地发挥。
(5)CS-PBE/CLT治疗3T3-L1脂肪细胞炎症模型药效：建立M1样RAW264.7炎症细胞模型后，更换含有不同浓度的CS-PBE/CLT的新鲜培养基，继续培养24h后取上清液收集备用。3T3-L1细胞按6×105个/孔接种于6孔板中，待贴壁生长至完全长满后小心吸出原培养基，添加新鲜前脂肪细胞培养基(PM)继续培养72h即细胞接触抑制阶段，然后小心吸出培养基，贴壁缓慢加入分化培养基I(DM I)进行诱导分化，48h后小心吸出培养基，并贴壁缓慢加入分化培养基II(DM II)，48h后更换脂肪细胞维持培养基(AM)继续培养，隔天换液，直至诱导周期(共14d)结束，建立3T3-L1脂肪细胞模型，进行油红O染色观察细胞内部脂质积累情况(图18)。
Figure BDA0003771083020000131
使用Image J对脂滴堆积情况进行半定量测定(图19)，虽然图18中治疗组并未显示出药物治疗减少红色脂滴面积的特点，但可以看到随着治疗浓度增加脂滴面积减少的浓度依赖的微弱趋势，从放大部分中可以看到使用M1样RAW264.7的分泌因子共培养会引起分化细胞中堆积更多、更大的脂滴，治疗组可以降低脂滴的大小，并且随着给药浓度的增加，对脂滴大小抑制效果逐渐增强，并显著降低了分化细胞中脂质积累(P<0.01)。
实施例6：纳米胶束药物组合物的体内研究
(1)肥胖小鼠体内组织分布实验：为了探讨将药物包载入衍生化CS胶束后能否改善药物的分布，我们用包载了荧光素DiD的制剂进行了组织分布研究。将db/db小鼠随机分为4组，每组3只。按照75μg/kg DiD的剂量分别尾静脉注射DiD溶液、CS-PBE/DiD溶液。然后分别于给药后6h、12h，解剖小鼠，取三种脂肪组织，生理盐水洗净，用小动物活体成像仪进行检测(Ex＝420-760nm，Em＝520-845nm)，扫描参数为Ex＝644nm，Em＝665nm，曝光时间为5s，并使用离线工作站对图片进行半定量。结果如图20、图21所示。图20即不同时间点DiD和CS-PBE/DiD的体内脂肪分布，从中发现CS-PBE可以提高药物的脂肪积聚并显著延长脂肪组织滞留时间，其半定量数据图21也同样证明了CS-PBE增强组织滞留的作用。
(2)肥胖小鼠的体内药效实验(静脉注射)：在高脂饮食喂养小鼠10周得到HFD小鼠后，以正常饮食喂养小鼠(CD)为阴性对照(n＝3)，选择生理盐水组作为空白对照(n＝3)，分别尾静脉注射CLT溶液组(n＝3)、CS-PBE/CLT组(n＝3)进行治疗。以3天为一周期进行给药，共给药5次，于每次给药之前测定体重的变化(图22)，并在实验结束后取附睾白色脂肪组织(eWAT，(图23)，腹股沟白色脂肪组织(iWAT，(图24)，肝脏(图25)测定重量。从体重变化、eWAT质量、iWAT、肝脏质量上看，游离CLT给药组总体来看治疗效果低于CS-PBE/CLT组，这说明CS-PBE/CLT组可以提高药物治疗效果，具有明显的减肥作用。
(3)肥胖小鼠的体内药效实验(口服给药)：高脂饮食喂养小鼠10周，建立HFD小鼠后，以正常饮食喂养小鼠(CD)为阴性对照(n＝3)，选择生理盐水组作为空白对照(n＝3)，分别口服给药CLT溶液组(n＝3)、CS-PBE/CLT组(n＝3)进行治疗。在第1、4、7、10、13每三天给药一次，共给药5次，给药剂量为8mg/kg。于每次给药之前测定体重的变化(图26)，并在实验结束后取eWAT(图27)，iWAT(图28)，肝脏(图29)测定重量。比较体重变化、eWAT质量和iWAT肝脏质量可见，游离CLT给药组总体来看治疗效果低于CS-PBE/CLT组，这说明CS-PBE/CLT组可以提高药物治疗效果，具有明显的减肥作用。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (6)

1.一种CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物，其特征在于：纳米胶束药物组合物包括雷公藤红素和糖胺聚糖衍生物载体；
所述糖胺聚糖衍生物载体和雷公藤红素的质量比为3~30:1；
所述糖胺聚糖衍生物载体是将多糖骨架与具有ROS响应的脂溶性小分子通过酰胺键共价连接；
所述糖胺聚糖衍生物载体的糖胺聚糖材料选自透明质酸、硫酸软骨素以及低分子量肝素中的任意一种或两种，所述糖胺聚糖材料的分子量为1kDa~500kDa；所述具有ROS响应的脂溶性小分子的修饰度为5%~50%；
所述具有ROS响应的脂溶性小分子为4-氨基苯硼酸、3-氨基苯硼酸、4-氨基苯硼酸频哪醇酯、4-氨甲基苯硼酸频哪醇酯中的至少一种。
2.如权利要求1所述的CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物，其特征在于：所述糖胺聚糖衍生物载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤（1）将糖胺聚糖溶于水中，向其中加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，活化10分钟，作为溶液A；
步骤（2）称取具有ROS响应性的脂溶性小分子溶于有机溶剂中，作为溶液B；
步骤（3）将溶液A和溶液B搅拌混合均匀，37℃反应24小时，透析，冻干，得到具有CD44靶向和ROS响应的糖胺聚糖衍生物载体；
所述步骤（2）中有机溶剂为二甲基亚砜、无水乙醇以及丙酮中的至少一种。
3.一种权利要求1-2中任一项所述的CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：将雷公藤红素溶于有机溶剂中；
步骤（2）：将糖胺聚糖衍生物载体溶于水中，得到糖胺聚糖载体水溶液；
步骤（3）：向步骤（2）中的水溶液中搅拌加入步骤（1）中含有雷公藤红素的有机溶剂，搅拌4小时后，探头超声，透析得到纳米胶束药物组合物。
4.如权利要求3所述的CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中有机溶剂选自二甲基亚砜或无水乙醇；所述步骤（2）中水溶液与步骤（1）中有机溶剂的质量比为16~40：1；所述步骤（3）中的透析具体为：采用2500Da-8000Da的透析袋在超纯水中透析1-2天。
5.如权利要求3所述的CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中制备得到的纳米胶束药物组合物通过口服、静脉注射或滴注方式给药。
6.一种权利要求1-2中任一项所述的CD44靶向和ROS响应的纳米胶束药物组合物的应用，其特征在于：将其应用于制备治疗CD44高表达和ROS响应疾病的药物。
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