CN113546046B - 一种乳铁蛋白修饰的广藿香醇脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种乳铁蛋白修饰的广藿香醇脂质体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种乳铁蛋白修饰的脂质体，所述脂质体包括以下原料：乳铁蛋白、蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑N‑羟基丁二酰亚胺‑聚乙二醇2000和广藿香醇；其中，蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑N‑羟基丁二酰亚胺‑聚乙二醇2000的比例为(29～32):(5～7):(5～7):(0.5～1.5)(w/w)；其中，所述广藿香醇包裹在脂质体中；其中，所述乳铁蛋白所含的氨基通过与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑N‑羟基丁二酰亚胺‑聚乙二醇2000中的N‑羟基丁二酰亚胺反应，从而连接在脂质体表面。

Description

一种乳铁蛋白修饰的广藿香醇脂质体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种乳铁蛋白修饰的广藿香醇脂质体及其制备方法和在炎症性肠病中的应用。
背景技术
炎症性肠病是一种慢性复发的特发性胃肠道炎症，可导致胃肠结构和功能的长期、甚至是不可逆的损害，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎两种表现形式。克罗恩病常见于小肠末端和结肠起始段，可能以不同的类型累及消化道的任何部位；溃疡性结肠炎起始于直肠，可向上延伸至整个结肠。炎症性肠病的病因及发病机制尚不清楚，可能与基因易感、肠道微生物稳态失衡、肠黏膜屏障功能受损、肠道固有性和获得性免疫调节紊乱及外界环境因素刺激等有关。炎症性肠病治疗一线用药为氨基水杨酸、糖皮质激素及免疫抑制剂，远期治疗效果差、长期服用副作用大，临床亟需安全有效、适合长期或终身服用的炎症性肠病治疗新药。
广藿香醇(又名“百秋李醇”)是中药广藿香含有的一种三环倍半萜化合物，具有祛湿、消暑、止吐等功效。广藿香醇的其他医用价值包括神经保护性、抗流感病毒以及抑制微生物特性。更重要的是，广藿香醇具有治疗炎症的作用，能够有效抑制炎症因子，在各种炎症动物模型中均具有良好的效果。
对于肠道炎症疾病，药物需要到达炎症部位才能更好的发挥药效，而药物向炎症部位的递送面临着一系列难题。首先，大多数难溶性药物在体内的药物吸收差，生物利用度低，因此难以发挥疗效。其次，药物在生物体内会受到不同屏障和环境因素的影响，例如，在口服给药时，需要克服肠粘膜屏障，胃(pH值1.3-1.8)到结肠(pH值6-8)中pH的变化，以及各种酶、消化的食物和微生物的影响。因此寻找一种较好的给药方式和药物载体以解决炎症部位递药的问题。
脂质体作为一种纳米级别的递药系统，能够显著增强药物的溶解度，并极大地延长药物在体内的循环时间，减缓药物的释放速率，使药物长期维持在有效的治疗剂量。纳米载体体积小，可通过渗透滞留增强效应在发炎和受损的组织上积累，从而更有效地靶向病变组织。当结肠发生炎症时，炎症部位大量聚集的免疫细胞也会增加对纳米颗粒的摄取，提高受损组织的药物浓度。除了被动靶向炎症组织外，还可以在脂质体表面修饰特异性配体，通过表面功能化使其具有主动靶向特定生物分子的潜力。由于巨噬细胞在炎症中具有重要作用，因此可以作为一个治疗的靶点，将修饰后的脂质体直接靶向巨噬细胞，以进一步治疗结肠炎。
乳铁蛋白可以与M1型巨噬细胞表面高表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白1的特异性结合，辅助脂质体靶向M1型巨噬细胞，调控巨噬细胞内的炎症信号通路。
因此，主动靶向结肠炎症部位巨噬细胞在结肠炎的治疗中具有极为广阔的应用前景。
发明内容
为了增强药物的结肠炎靶向性，本发明创新性地将乳铁蛋白作为靶向配体修饰到载广藿香醇脂质体表面，借助M1型巨噬细胞表面高表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白1与乳铁蛋白的特异性结合作用，进一步提高药物对结肠炎的治疗作用。
本发明的一个目的是提供一种乳铁蛋白修饰的脂质体。
本发明的另一个目的是提供一种乳铁蛋白修饰的脂质体的制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述乳铁蛋白修饰的脂质体的用途。
根据一个方面，本发明提供了一种乳铁蛋白修饰的脂质体，所述脂质体包括以下原料：
乳铁蛋白、蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000和广藿香醇；
其中，蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000的比例为(29～32):(5～7):(5～7):(0.5～1.5)(w/w)，例如为30:6:6:1(w/w)；
其中，所述广藿香醇包裹在脂质体中；
其中，所述乳铁蛋白所含的氨基通过与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000中的N-羟基丁二酰亚胺反应，从而连接在脂质体表面。
优选地，所述乳铁蛋白修饰的脂质体粒径为120～150nm，更优选为140nm，多分散指数为0.1～0.3，更优选为0.2，Zeta电位为-8～-12mV，更优选为-10mV。
本发明的乳铁蛋白修饰的脂质体中，优选地，基于1重量份乳铁蛋白修饰的脂质体，所述广藿香醇为0.036～0.040重量份，更优选为0.038重量份，和/或所述乳铁蛋白为0.112～0.115重量份，更优选为0.113重量份，例如，如果所述乳铁蛋白修饰的脂质体为1mg，则所述广藿香醇的含量为0.036～0.040mg，更优选为0.038mg，和/或所述乳铁蛋白的含量为0.112～0.115mg，更优选为0.113mg。
根据另一个方面，本发明提供了所述的乳铁蛋白修饰的脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1)将蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000和广藿香醇以有机溶剂溶解得到溶液；
2)将所述溶液减压蒸发除去有机溶剂得到一层薄膜，并将薄膜用磷酸盐缓冲溶液水化，得到脂质水分散体；
3)将所述脂质水分散体进行超声破碎，之后使用过膜挤出仪反复挤压至脂质体通过微孔滤膜(优选地，粒径为200nm的膜)，得到脂质体；
4)将所述脂质体(优选地，利用葡聚糖凝胶柱(G-50))除去游离的广藿香醇，得到纯化的脂质体；
5)将所述纯化的脂质体与乳铁蛋白溶液混合并孵育12～16h，得到乳铁蛋白修饰的脂质体；
6)将所述乳铁蛋白修饰的脂质体(优选地，用超滤离心)除去游离的乳铁蛋白，得到纯化的乳铁蛋白修饰的脂质体。
本发明的制备方法中，优选地，步骤1)中蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000比例为(29～32):(5～7):(5～7):(0.5～1.5)(w/w)，更优选为30:6:6:1(w/w)。
本发明的制备方法中，优选地，步骤1)中所述有机溶剂可为二氯甲烷或三氯甲烷，更优选为三氯甲烷。
本发明的制备方法中，优选地，步骤2)中所述减压蒸发的温度可为35～40℃，更优选为37℃。
本发明的制备方法中，优选地，步骤3)中所述超声破碎的功率可为5％～10％，更优选为5％；所述超声破碎的时间可为4～7min，更优选为5min。
特别地，步骤6)中得到的乳铁蛋白修饰的脂质体中，基于1重量份乳铁蛋白修饰的脂质体，所述广藿香醇为0.036～0.040重量份，更优选为0.038重量份，和/或所述乳铁蛋白为0.112～0.115重量份，更优选为0.113重量份，例如，如果所述乳铁蛋白修饰的脂质体为1mg计，所述广藿香醇的含量为0.036～0.040mg，更优选为0.038mg，和/或所述乳铁蛋白的含量为0.112～0.115mg，更优选为0.113mg。
优选地，步骤5)中所述孵育温度为4℃，特别地，孵育时间为12～16h。
优选地，步骤6)中所述超滤离心的超滤管分子截留量为100KD，所述超滤离心的速度为2500～3500rpm，更优选为3000rpm；所述超滤离心的时间为35～45min，更优选为40min。
根据再一个方面，本发明提供了所述乳铁蛋白修饰的脂质体在制备炎症性肠病靶向递药系统中的应用。
所述炎症性肠病的实例包括但不限于溃疡性结肠炎、克罗恩病。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的乳铁蛋白修饰的脂质体体外稳定性较好，且相比于游离药物具有缓释作用。
2)本发明的乳铁蛋白修饰的脂质体可以更好地被M1型巨噬细胞摄取，有效抑制M1型巨噬细胞的促炎能力，实现促炎M1型巨噬细胞向抗炎M2型巨噬细胞的极化，降低M1型巨噬细胞中的活性氧，并且在细胞水平上有良好的安全性。
3)本发明的乳铁蛋白修饰的脂质体抑制了MAPK和NF-κB通路的激活，并减少NLRP3炎症小体的产生，从而抑制肠道炎症。
4)本发明的乳铁蛋白修饰的脂质体可以更好地靶向小鼠结肠组织，对结肠炎模型小鼠起到治疗作用，显著降低了疾病活动指数和体重下降率，并有效抑制结肠缩短，降低肠道通透性，减少结肠组织中的炎症细胞因子。
5)本发明的乳铁蛋白修饰的脂质体增加了小鼠结肠组织Tregs的数量，而减少DCs的数量，有良好的炎症治疗效果，并显示出了良好的安全性。
因此，本发明的乳铁蛋白修饰的脂质体可用于主动靶向结肠部位，在炎症性肠病(特别是溃疡性结肠炎)治疗领域有着良好的开发应用前景。
附图说明
图1为显示实施例2中乳铁蛋白与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000反应的MALDI-TOF表征结果的图。
图2为显示实施例2中脂质体偶联乳铁蛋白的定量结果的照片。
图3A和图3B分别为实施例2中脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体的粒径分布和Zeta电位图。
图4A和图4B分别为实施例2中脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体的透射电镜图。
图5A和图5B分别为实施例2中脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体的体外稳定性和体外释放实验图。
图6为显示实施例3中广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体的细胞安全性试验结果的图。
图7为实施例4脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体的细胞摄取结果。其中，A为低密度脂蛋白受体相关蛋白1在M1巨噬细胞以及结肠部位表达的结果图；B为细胞摄取流式定量结果图；C为细胞摄取流式定量分析图；D为细胞摄取荧光图。***代表p<0.001，脂质体组作为对照。
图8显示实施例5中广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对促炎、抗炎细胞因子表达的影响。其中，A为空白、广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体抑制促炎因子(IL-6、IL-18、IL-12、IL-1β)表达的图；B为空白、广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体促进抗炎因子(IL-10、TGF-β)的表达的图；C为空白、广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对IL-1β、TGF-β的蛋白质免疫印迹(Western Blot)结果图；D为空白、广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12的酶联免疫吸附(ELISA)定量结果图。*、**、***分别代表p<0.05、p<0.01、p<0.001。
图9显示实施例6中广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对M1巨噬细胞重极化的影响。其中，A为广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对M2巨噬细胞表面标志物Arg1的影响；B为广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对M2巨噬细胞表面标志物CD206的影响。*、**、***分别代表p<0.05、p<0.01、p<0.001，M1空白组作为对照。
图10显示实施例7中广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对M1巨噬细胞活性氧影响的结果。其中，A为M1、M2、广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体的活性氧流式检测结果图；B为M1、M2、广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体的活性氧流式结果定量图。*、**、***分别代表p<0.05、p<0.01、p<0.001。
图11显示实施例8中广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对NF-κB、MAPK信号通路以及NLRP3的影响。其中，A为空白、广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对P-p65和IκB-α表达影响的蛋白质免疫印迹(Western Blot)结果图；B为空白、广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对MAPKs家族蛋白表达影响的蛋白质免疫印迹(Western Blot)结果图；C为空白、广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对NLRP3、pro-IL-1β、IL-1β表达影响的蛋白质免疫印迹(Western Blot)结果图。
图12显示实施例9中脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体在小鼠体内分布的实验结果。其中，A为脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体的体内荧光分布结果图；B为脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体的体内荧光强度变化统计结果图；C为脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体在主要脏器中的分布结果图；D为脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体在结肠部位24小时的荧光强度统计结果图。*代表p<0.05。
图13显示实施例10中广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对小鼠疾病活动指数、体重变化、结肠长度的影响。其中，A为广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对疾病活动指数的影响结果图；B为广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对体重变化的影响结果图；C为各组结肠照片；D为广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对结肠长度的影响结果图。*、**、***分别代表p<0.05、p<0.01、p<0.001。
图14显示实施例11中广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对小鼠肠道通透性的影响。*、**分别代表p<0.05、p<0.01。
图15显示实施例12中广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对小鼠结肠组织中炎症细胞因子(IL-6,IL-12,IFN-γ,IL-1β,TNF-α)的影响。*、**、***分别代表p<0.05、p<0.01、p<0.001。
图16显示实施例13中广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对小鼠结肠组织中Treg细胞影响的流式分析图。其中，A为各组的Treg细胞的流式检测结果图；B为各组的Treg细胞的流式结果定量图。*代表p<0.05。
图17显示实施例13中广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对小鼠结肠组织中DC细胞影响的流式分析图。其中，A为各组的DC细胞的流式检测结果图；B为各组的DC的流式结果定量图。*、**分别代表p<0.05、p<0.01。
图18显示实施例14中广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体的体内安全性评价结果。其中，A为广藿香醇、脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对动物脏器系数的影响；B为各组的组织病理切片图。
图19为显示本发明的研究思路概括图。
具体实施方式
为了更好地对本发明进行说明，下面将结合实施例对本发明进行清楚、完整的描述，但不能把它们理解为对本发明保护范围的限制。基于本发明中的实施例，熟悉本领域的技术人员可以在本发明的精神和实质的范围内对实施方案进行各种改进和调整。
实施例1：乳铁蛋白修饰的脂质体的制备
称取蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000(30:6:6:1,w/w)(均购于上海艾韦特医药科技有限公司)和广藿香醇(成都曼思特生物科技有限公司)，用三氯甲烷溶解。所得溶液在37℃条件下将三氯甲烷减压蒸干，并形成一层薄膜。薄膜中加入磷酸盐缓冲溶液水化，形成脂质水分散体。使用超声波细胞粉碎机(JY92-IIN，宁波新芝生物科技股份有限公司)，在5％的功率下超声5min。之后使用过膜挤出仪，反复挤压至使脂质体通过粒径为200nm的膜，制成粒径均一的脂质体。使用葡聚糖凝胶柱(G-50)(GE Healthcare,USA)除去游离的广藿香醇从而得到纯化的脂质体。称取1mg乳铁蛋白(南京精瑞久安生物技术有限公司)，用磷酸盐缓冲溶液配制成1mg/mL溶液，以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000的物质的量为依据加入稍过量乳铁蛋白溶液于纯化后的脂质体中，在4℃摇床上孵育12～16h，制备成乳铁蛋白修饰的脂质体。使用分子量为100K的超滤管，3000rpm离心40min，除去游离的乳铁蛋白，得到纯化的乳铁蛋白修饰的脂质体。
实施例2：乳铁蛋白修饰的脂质体的表征
(1)乳铁蛋白与N-羟基丁二酰亚胺酯的反应
称取1mg乳铁蛋白，用超纯水配制成1mg/mL溶液，并用相同方法制备二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000溶液。将乳铁蛋白溶液与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000溶液混合后置于4℃的摇床上，孵育12～16小时。取反应后的溶液，置于分子量为14K的透析袋中，磁力搅拌透析24h后取出，此时得到反应产物二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-乳铁蛋白-聚乙二醇2000。将乳铁蛋白溶液、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-乳铁蛋白-聚乙二醇2000溶液分别与芥子酸基质(上海源叶生物科技有限公司)混合，将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000与肉桂酸基质(上海源叶生物科技有限公司)混合，分别取2μL混合后的溶液滴加至载物台上，通过MALDI-TOF-MS仪(AgilentTechnologies,USA)检测物质的分子量。
如图1所示，乳铁蛋白的分子量在82000Da左右，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000的分子量在2000Da左右，而乳铁蛋白和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000反应后的产物除了在82000Da左右有峰，在85000Da左右和87000Da左右出现了新的峰，证明一个乳铁蛋白分子连接上了一个或者两个分子的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000，因此导致了分子量的增大。
(2)脂质体偶联乳铁蛋白的定量
按实施例1中的方法制备纯化的乳铁蛋白修饰的脂质体，并置于-80℃冷冻后，放入冷冻真空干燥机(LABCONCO 76705-70,USA)，待脂质体完全变成冻干粉末后取出。称取适量的冻干粉末，以磷酸盐缓冲液配制成溶液，再称取1mg乳铁蛋白，并以磷酸盐缓冲溶液配制成1mg/mL溶液。在上述两溶液中加入四分之一体积的5倍浓缩的蛋白上样缓冲液(5×Loading Buffer)，在95℃以上水浴锅煮样10-15min。配制浓度为10％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，将胶板固定后放入电泳槽。将乳铁蛋白溶液按照每孔2.5μg、5μg、7.5μg、10μg、15μg、20μg蛋白量上样，乳铁蛋白修饰的脂质体上样20μL。上样完成后进行电泳，电泳结束后进行考马斯染色，脱色液脱色，最后使用凝胶成像仪(ChemiDoc MPTMImaging System,BIORAD,USA)显色。使用imageJ成像图片进行分析，对脂质体中偶联的乳铁蛋白进行定量。
如图2所示，纯化后的乳铁蛋白修饰的脂质体在80kDa左右有明显条带。通过imageJ软件分析条带的灰度值，可以得出浓度与灰度值的标准曲线方程：y＝0.0003x-10.186，R2＝0.9901。通过公式进一步计算出每毫克脂质体修饰了0.113mg乳铁蛋白。
(3)乳铁蛋白修饰的脂质体的形态、粒径、多分散系数及Zeta电位的测定
按实施例1中的方法制备纯化的脂质体和纯化的乳铁蛋白修饰的脂质体，使用激光粒径仪(Zetasizer Nano ZS90,Malvern,UK)进行粒径、多分散系数和Zeta电位的测定。
如图3A和B所示，乳铁蛋白修饰的脂质体粒径为140nm，多分散系数为0.2，Zeta电位为-10mV。
如图4A和B所示，透射电镜结果表示乳铁蛋白修饰的脂质体粒径均一，分散性良好。
(4)体外稳定性评价
按实施例1中的方法制备纯化的脂质体和纯化的乳铁蛋白修饰的脂质体，并溶解于含10％山羊血清的磷酸盐缓冲溶液中(pH＝7.4)，置于37℃的恒温摇床上，分别在1h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取200μL脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体溶液测量粒径，观察粒径是否有显著变化。
如图5A所示，乳铁蛋白修饰的脂质体稳定性较好。
(5)体外释放评价
按实施例1中的方法制备纯化的脂质体和纯化的乳铁蛋白修饰的脂质体，并以磷酸盐缓冲溶液分别配制成1mL的溶液，装入截留分子量为14K的透析袋中。使用含20％乙醇的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)作为溶出介质。将透析袋置于大量的溶出介质中，置于37℃摇床，转速100rpm。分别在设定时间点取0.5mL释放介质，并补充0.5mL新鲜的释放介质。通过GC-MS(Agilent Technologies,USA)测定各时间点的药物浓度最终计算得出药物的体外释放曲线。
如图5B所示，药物在12h释放达到60％左右，之后开始缓慢释放，在48h达到80％，具有缓释作用。
实施例3：细胞安全性评价
将骨髓来源的巨噬细胞(提取自Balb/c型小鼠)按照每孔1×104个细胞接种于96孔板中，每孔100μL，并诱导其分化为M1型巨噬细胞。待细胞分化完成后，分为游离广藿香醇、实施例1中制备的脂质体、实施例1中制备的乳铁蛋白修饰的脂质体三组，每组均按照一定浓度梯度给药，给药后继续培养24h，再按照20μL每孔加入噻唑蓝(MTT)(Sigma-Aldrich,USA)，继续孵育4h，之后吸去上清留下紫色结晶。每孔加入200μL二甲基亚砜，室温下放于摇床上直至紫色结晶完全溶解，使用酶标仪(Multiskan,ThermoFisher，,USA)检测每孔的OD值(波长490nm)，计算细胞的存活率(％)＝实验组平均OD值/空白组平均OD值×100％。
如图6所示，当广藿香醇的剂量范围在0-32μg/mL时，脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体对细胞几乎没有毒性，细胞的存活率始终保持在80％以上，生物安全性较好，对巨噬细胞主要起调控作用而不是杀伤作用。
实施例4：细胞摄取评价
(1)载香豆素-6脂质体的制备
称取蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000(30:6:6:1,w/w)和广藿香醇，用三氯甲烷溶解并加入香豆素-6(上海百灵威科技有限公司)。按实施例1中的方法分别制备载香豆素-6的脂质体和载香豆素-6的乳铁蛋白修饰的脂质体(香豆素-6终浓度均为200μg/mL)，超声、过膜使粒径均一，使用葡聚糖凝胶柱(G-50)除去游离香豆素-6。
(2)细胞摄取实验
将骨髓来源的巨噬细胞(提取自Balb/c型小鼠)按每孔1×106个细胞种板，并诱导其分化为M1型巨噬细胞。待细胞分化完成后，分别加入实施例4(1)中的载香豆素-6的脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体并共孵育，孵育1h后，弃掉上清，使用磷酸盐缓冲溶液清洗三遍，除去多余的脂质体和培养基。加入胰酶(碧云天生物技术有限公司)消化细胞，1500rpm离心5min，弃上清，磷酸盐缓冲溶液重悬细胞，使用流式细胞仪(FACS Calibur,BectonDickinson,USA)检测细胞中荧光强度。另取一批细胞，按照同样方法孵育1h，弃掉上清，磷酸盐缓冲溶液清洗三遍后，使用4％的多聚甲醛(Sigma-Aldrich,USA)覆盖细胞，固定15min。使用磷酸盐缓冲溶液清洗三遍，除去多聚甲醛。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(碧云天生物技术有限公司)对细胞核染色10min。磷酸盐缓冲溶液清洗三遍后，使用荧光显微镜(CARL ZEISS,Germany)观察细胞对脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体摄取情况。
如图7所示，乳铁蛋白修饰的脂质体比没有修饰的脂质体被细胞摄取的更多，乳铁蛋白修饰的脂质体摄取量约为脂质体的1.4倍。可以证明，乳铁蛋白修饰的脂质体可以更好地被M1型巨噬细胞摄取，乳铁蛋白的修饰达到了增加摄取的效果。
实施例5：细胞因子检测
将骨髓来源的巨噬细胞(提取自Balb/c型小鼠)按每孔1×106个细胞种板，并诱导其分化为M1、M2型巨噬细胞。待其分化完成后，设置M1、M2空白对照组及M1分别与游离广藿香醇、实施例1中制备的脂质体、实施例1中制备的乳铁蛋白修饰的脂质体共孵育组。共孵育24h后采用实时荧光定量PCR(q-PCR)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测细胞因子的变化。
如图8所示，乳铁蛋白修饰的脂质体抑制促炎因子(IL-6、IL-18、IL-12、IL-1β)表达的效果最优，促进抗炎因子(IL-10、TGF-β)的表达也是最优。因此乳铁蛋白修饰的脂质体能有效抑制M1巨噬细胞促炎作用，增加其抗炎作用，具有良好的抗炎效果。
实施例6：巨噬细胞的重极化
按实施例5中的方法对骨髓来源的巨噬细胞(提取自Balb/c型小鼠)进行处理，用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测M2型巨噬细胞的表面标志物(Arg1和CD206)的mRNA水平。
如图9所示，乳铁蛋白修饰的脂质体可以显著增加Arg1和CD206的mRNA水平，表明M1型巨噬细胞发生了重极化，转变为M2型巨噬细胞。
实施例7：细胞内活性氧水平检测
将骨髓来源的巨噬细胞(提取自Balb/c型小鼠)按每孔1×106个细胞种板，并诱导其分化为M1、M2型巨噬细胞。待其分化完成后，设置M1、M2空白对照组及M1分别与游离广藿香醇、脂质体、乳铁蛋白修饰的脂质体共孵育组。共孵育6h，检测细胞中活性氧的水平。同时设立阳性对照组，以1:1000的比例稀释阳性对照(Rosup,50mg/mL)，与细胞共孵育1h，消化并收集细胞。用无血清培养基按照1:1000的比例稀释2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(Sigma-Aldrich,USA)，加入到收集了细胞的各个样品中，置于37℃恒温培养箱(MCO-18AIC,Sanyo,Japan)中孵育20min，每隔一段时间轻轻摇晃。探针装载完成后，用无血清培养基漂洗细胞3次，除去过量的2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐，使用流式细胞仪分析细胞荧光情况。
如图10所示，乳铁蛋白修饰的脂质体可以明显降低M1型巨噬细胞内活性氧水平，因此可以减轻由于活性氧造成的炎症加剧。
实施例8：抗炎机制评价
按实施例5中的方法对骨髓来源的巨噬细胞(提取自Balb/c型小鼠)进行处理，用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测MAPK通路的蛋白变化(Erk,p-Erk,Jnk,p-Jnk,p38,p-p38)，同时检测NF-κB的通路的蛋白变化(p-p65,IκB-α)，以及NLRP3炎症小体、pro-IL-1β和IL-1β的蛋白变化。
如图11所示，乳铁蛋白修饰的脂质体能够显著降低IκB-α的降解和p65的磷酸化，降低MAPKs家族的激活，有效降低Erk、p38和JNK的磷酸化水平，并且下调了NLRP3的水平，从而抑制pro-IL-1β转化成IL-1β。
实施例9：体内靶向性评价
将SPF级Balb/c小鼠(源自中国科学院上海药物研究所)分为五组：正常组，模型组，模型组加游离广藿香醇，模型组加实施例1中制备的脂质体，模型组加实施例1中制备的乳铁蛋白修饰的脂质体。除正常组外其余各组小鼠先空白饮用水7天，再给予小鼠2％葡聚糖硫酸钠(上海翊圣生物科技有限公司)7天，再饮用日常饮用水14天，以葡聚糖硫酸钠7天/间歇14天的处理模式经历3个循环，诱导产生慢性结肠炎。每个循环间隙给予药物治疗。诱导期间视动物情况调整葡聚糖硫酸钠浓度。
将诱导成功的结肠炎模型组小鼠随机分成两组，分别对每组小鼠尾静脉注射等量的荧光染料CY5(上海百灵威化学技术有限公司)标记的脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体。在设定的时间点(0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h)用异氟烷(上海百灵威化学技术有限公司)麻醉小鼠，采用小动物活体成像系统(Caliper PerkinElmer,Hopkinton,MA,USA)对每组小鼠进行拍摄。等到拍完24h的时间点，将小鼠安乐死，解剖分离出小鼠结肠和主要的脏器(心，肝，脾，肺，肾)，并摆放在拍摄活体成像所用的黑色纸板上，再次用小动物活体成像系统对脏器和结肠进行成像。将活体成像照片中小鼠体内的荧光强度的平均值与时间作图，绘制纳米粒在小鼠体内的时间-荧光分布柱状图。对小鼠结肠部位的荧光强度进行定量，做统计分析。
如图12所示，在结肠炎小鼠模型中，脂质体能有效蓄积在结肠组织，乳铁蛋白修饰的脂质体的蓄积效果较优于脂质体。表明乳铁蛋白修饰的脂质体具有更好的靶向结肠组织的能力。
实施例10：体内药效学评价
按实施例9中的方法对小鼠进行诱导、给药。整个诱导周期内，每日记录小鼠的体重变化，同时观察小鼠的粪便性状及便血情况。疾病活动指数按照以下方式进行评估：
表1疾病活动指数评分标准
Figure BDA0002460027530000131
动物实验周期到达终点时，将小鼠安乐死，解剖分离小鼠的结肠，用磷酸盐缓冲溶液润洗，滤纸滤干，测量小鼠结肠长度，并拍照。
如图13所示，乳铁蛋白修饰的脂质体对结肠炎模型小鼠起到的治疗作用最好，显著降低了疾病活动指数和体重下降率，并有效抑制结肠缩短。
实施例11：肠道通透性分析
按实施例9中的方法对小鼠进行诱导、给药。在动物实验周期到达终点前，每组各取5只小鼠，禁食24h后灌胃服用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran)(上海百灵威化学技术有限公司)(100mg/mL，磷酸盐缓冲溶液溶解)，剂量为44mg/100g。4h后眼眶取血，收集血清，用等量磷酸盐缓冲溶液稀释后，取100μL置于96孔板中在485nm激发光下检测异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran)的量。
如图14所示，乳铁蛋白修饰的脂质体降低肠道通透性的效果最明显。
实施例12：结肠组织q-PCR检测
按实施例9中的方法对小鼠进行诱导、给药。动物实验周期到达终点时，将小鼠安乐死，解剖分离小鼠的结肠。称取20mg的结肠组织，用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测炎症细胞因子的变化。
如图15所示，乳铁蛋白修饰的脂质体下调炎症细胞因子(IL-6,IL-12,IFN-γ,IL-1β,TNF-α)mRNA水平的效果最好。
实施例13：肠道炎症微环境研究
按实施例9中的方法对小鼠进行诱导、给药。动物实验周期到达终点时，将小鼠安乐死，解剖分离小鼠的结肠。用流式细胞术对结肠组织中Treg细胞和DC细胞进行定量检测。
如图16所示，未治疗的结肠炎模型组(葡聚糖硫酸钠组)，相比于正常组小鼠(磷酸盐缓冲溶液组)，结肠组织中Treg细胞的数量明显的下降。而在给予游离广藿香醇，脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体治疗后的结肠炎模型小鼠的结肠组织中，Treg细胞的数量出现增加，特别是在脂质体治疗组。
如图17所示，未治疗的结肠炎模型组(葡聚糖硫酸钠组)，相比于正常组小鼠(磷酸盐缓冲溶液组)，结肠组织中DC细胞的数量明显的增加。而在给予游离广藿香醇，脂质体和乳铁蛋白修饰的脂质体治疗后的结肠炎模型小鼠的结肠组织中，DC细胞的数量出现下降，特别是乳铁蛋白修饰的脂质体治疗组。
实施例14：体内安全性评价
按实施例9中的方法对小鼠进行诱导、给药。动物实验周期到达终点时，将小鼠安乐死，取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾，称重，计算脏器系数。心、肝、脾、肺、肾用4％福尔马林溶液进行固定，石蜡包埋制片，切片脱蜡后用苏木精-伊红染色，使用组织切片成像仪(TCS-SP8,Leica Germany)拍摄，观察并评价。
如图18所示，各给药组的主要脏器病理切片均无明显病变，证明了游离药物、脂质体与乳铁蛋白修饰的脂质体生物安全性良好。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (22)

1.一种乳铁蛋白修饰的脂质体，所述脂质体由以下原料组成：
乳铁蛋白、蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000和广藿香醇；
其中，蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000的比例为(29~32):(5~7):(5~7):(0.5~1.5) (w/w)；
其中，所述广藿香醇包裹在脂质体中；
其中，所述乳铁蛋白所含的氨基通过与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000中的N-羟基丁二酰亚胺反应，从而连接在脂质体表面。
2. 根据权利要求1所述的乳铁蛋白修饰的脂质体，其中，蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000的比例为30:6:6:1 (w/w)。
3. 根据权利要求1所述的乳铁蛋白修饰的脂质体，
其中，所述乳铁蛋白修饰的脂质体的粒径为120~150 nm；和/或
其中，所述乳铁蛋白修饰的脂质体的多分散指数为0.1~0.3；和/或
其中，所述乳铁蛋白修饰的脂质体的Zeta电位为-8~-12 mV。
4. 根据权利要求3所述的乳铁蛋白修饰的脂质体，其中，所述乳铁蛋白修饰的脂质体的粒径为140 nm。
5.根据权利要求3所述的乳铁蛋白修饰的脂质体，其中，所述乳铁蛋白修饰的脂质体的多分散指数为0.2。
6. 根据权利要求3所述的乳铁蛋白修饰的脂质体，其中，所述乳铁蛋白修饰的脂质体的Zeta电位为-10 mV。
7.根据权利要求1所述的乳铁蛋白修饰的脂质体，其中，基于1重量份的所述乳铁蛋白修饰的脂质体，所述广藿香醇的含量为0.036~0.040重量份，和/或所述乳铁蛋白的含量为0.112~0.115重量份。
8.根据权利要求7所述的乳铁蛋白修饰的脂质体，其中，基于1重量份的所述乳铁蛋白修饰的脂质体，所述广藿香醇的含量为0.038重量份。
9.根据权利要求7所述的乳铁蛋白修饰的脂质体，其中，基于1重量份的所述乳铁蛋白修饰的脂质体，所述乳铁蛋白的含量为0.113重量份。
10.一种制备如权利要求1所述的乳铁蛋白修饰的脂质体的方法，包括以下步骤：
1）将蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000和广藿香醇以二氯甲烷或三氯甲烷溶解得到溶液；
2）将所述溶液减压蒸发除去有机溶剂得到一层薄膜，并将薄膜用磷酸盐缓冲溶液水化，得到脂质水分散体；
3）将所述脂质水分散体进行超声破碎，之后使用过膜挤出仪反复挤压至脂质体通过粒径为200 nm的微孔滤膜，得到脂质体；
4）利用葡聚糖凝胶柱G-50将所述脂质体除去游离的广藿香醇，得到纯化的脂质体；
5）将所述纯化的脂质体与用磷酸盐缓冲溶液配制的乳铁蛋白溶液混合并孵育12~16h，得到乳铁蛋白修饰的脂质体，其中，所述孵育温度为4℃；
6）将所述乳铁蛋白修饰的脂质体用超滤离心除去游离的乳铁蛋白，得到纯化的乳铁蛋白修饰的脂质体。
11. 根据权利要求10所述的制备乳铁蛋白修饰的脂质体的方法，其中，步骤1）中蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000比例为30:6:6:1 (w/w)。
12. 根据权利要求10所述的制备乳铁蛋白修饰的脂质体的方法，
其中，步骤2）中所述减压蒸发的温度为35~40℃；和/或
其中，步骤3）中所述超声破碎的功率为5%~10%；所述超声破碎的时间为4~7min。
13.根据权利要求12所述的制备乳铁蛋白修饰的脂质体的方法，其中，步骤2）中所述减压蒸发的温度为37℃。
14.根据权利要求12所述的制备乳铁蛋白修饰的脂质体的方法，其中，步骤3）中所述超声破碎的功率为5%。
15. 根据权利要求12所述的制备乳铁蛋白修饰的脂质体的方法，其中，所述超声破碎的时间为5 min。
16.根据权利要求10所述的制备乳铁蛋白修饰的脂质体的方法，
其中，基于1重量份的所述乳铁蛋白修饰的脂质体，所述广藿香醇的含量为0.036~0.040重量份，和/或所述乳铁蛋白的含量为0.112~0.115重量份。
17.根据权利要求16所述的制备乳铁蛋白修饰的脂质体的方法，其中，基于1重量份的所述乳铁蛋白修饰的脂质体，所述广藿香醇的含量为0.038重量份。
18.根据权利要求16所述的制备乳铁蛋白修饰的脂质体的方法，其中，基于1重量份的所述乳铁蛋白修饰的脂质体，所述乳铁蛋白的含量为0.113重量份。
19. 根据权利要求10所述的制备乳铁蛋白修饰的脂质体的方法，其中，步骤6）中，所述超滤离心的超滤管分子截留量为100 KD，所述超滤离心的速度为2500~3500 rpm；所述超滤离心的时间为35~45 min。
20. 根据权利要求19所述的制备乳铁蛋白修饰的脂质体的方法，其中，步骤6）中，所述超滤离心的速度为3000rpm；所述超滤离心的时间为40 min。
21.权利要求1-9中任一项所述的乳铁蛋白修饰的脂质体在制备炎症性肠病靶向递药系统中的应用。
22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎、克罗恩病。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101816629A (zh) * 2009-02-26 2010-09-01 北京大学 一种双重靶向脂质体及其制备方法和应用
CN105708802A (zh) * 2016-03-24 2016-06-29 石河子大学 一种紫花牡荆素肺靶向脂质体及其制备方法与应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8865657B2 (en) * 2005-08-19 2014-10-21 New York University Compositions and methods for inactivating or suppressing inflammatory cells
US20130323314A1 (en) * 2011-12-30 2013-12-05 University Of Hyderabad Novel Nanoparticles of Lactoferrin Useful for Preparing a Pharmaceutical Composition Facilitating Easy Delivery of the Drug and a Process for Preparing the Same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101816629A (zh) * 2009-02-26 2010-09-01 北京大学 一种双重靶向脂质体及其制备方法和应用
CN105708802A (zh) * 2016-03-24 2016-06-29 石河子大学 一种紫花牡荆素肺靶向脂质体及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gastrointestinal tract abnormalities in autism, inflammatory bowel disease and many other clinical entities may be due to T.Gondii infection;department of social pediatrics, et al;《Open Access Scientific Reprots》;20120812;第1卷(第4期);第1-45页 *
Lactoferrin-modified Poly(ethylene glycol)-grafted BSA nanoparticles as a dual-targeting carrier for treating brain gliomas;Zhigui Su,et al;《molecular pharmaceutics》;20140429(第11期);第1823-1834页 *
Liposomes as possible carriers for lactoferrin in the local treatment of inflammatory diseases;M Trif,et al;《Exp Biol Med(Maywood)》;20010630;第226卷(第6期);第559-564页 *
LRP1 receptor-mediated immunosuppression of α-MMC on monocytes;Nianhua Deng,et al;《International immunopharmacology》;20191231(第70期);第80-87页 *
P38MAPK信号通路：炎性肠病治疗的新靶;易文全等;《华西医学》;20061231;第21卷(第1期);第194-195页 *
Patchouli alcohol activates PXR and suppresses the NF-κB-mediated intestinal inflammatory;Guohui Zhang,et al;《Journal of Ethnopharmacology》;20191012(第248期);第1-19页 *
Patchouli alcohol ameliorates dextran sodium sulfate-induced experimental colitis and suppresses tryptophan catabolism;Chang Qu,et al;《Pharmacological Research》;20171231(第121期);第70-82页 *
VEN-120,a recombinant human lactoferrin,promotes a regulatory T cell[Treg]phenotype and drives resolution of inflammation in distinct murine models of inflammatory bowel disease;Christopher F.et al;《Journal of Crohn"s and Colitis》;20170502;第1101-1112页 *
乳铁蛋白作为靶向功能分子的研究进展;赵超越等;《中国生化药物杂志》;20141231;第34卷(第9期);第181-184页 *
炎症性肠病特异性靶向给药系统的研究进展;李伟等;《医学分子生物学杂志》;20181231;第15卷(第3期);第176-180页 *

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