CN115957348A - 靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种靶向类风湿性关节炎的脂质体递药系统、制备方法及应用，本发明是中药有效成分药物制剂领域，公开了一种靶向治疗类风湿性关节炎的脂质体递药系统的制备方法。本发明以脂质成分磷脂及胆固醇等为原材料制备纳米脂质体(liposome，Lipo)作为内核并包覆中药有效成分益母草碱(leonurine，Leo)，形成脂质体益母草碱(Lipo@Leo)，经滑膜细胞归巢肽HAP‑1修饰，制备出多肽修饰的纳米脂质体递药系统(HAP‑Lip@Leo)。经体内外实验表明，该脂质体纳米递药系统能实现靶向类风湿性关节炎的滑膜细胞，同时又具有生物安全性、缓释等的优点，为中药新剂型研发提供新思路，对类风湿性关节炎的治疗具有实用价值。

Description

靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及药物制剂技术领域，具体地，涉及一种靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统、制备方法及应用。

背景技术

类风湿性关节炎是一种常见自身免疫性和全身性炎症的慢性疾病，以关节滑膜的慢性炎症和进行性关节破坏为主要特征，患者常伴有持续性关节炎疼痛、肿胀和僵硬，甚至导致累积的关节损伤和不可逆转的残疾。据统计，类风湿性关节炎在全球普通人群的平均患病率约0.2～1％，我国类风湿性关节炎患病率约为0.3～0.6％。类风湿性关节炎严重影响了患者的生活质量，导致其预期寿命缩短，并且伴随着与医疗成本和工作能力降低等相关的社会经济负担。类风湿性关节炎的发病机制复杂，且尚未完全阐明，因此迄今为止尚无治愈方法。目前临床上治疗类风湿性关节炎的方法，经常伴随耐药性和副作用，且治疗效果并不理想。滑膜成纤维细胞向软骨和骨骼的迁移在类风湿性关节炎的软骨破坏中起关键作用，而研究发现，益母草碱可以抑制滑膜成纤维细胞的迁移和侵袭，还可以抑制促炎细胞因子和MMP的产生。

益母草始记于《神农本草经》，为唇形科益母草属植物益母草(Leonurusjaponicus Houtt.)的新鲜或干燥地上部分，其味苦辛，性微寒，入肝、心、膀胱经，具有活血调经、利水消肿、清热解毒之功效。益母草碱是中药益母草中得到的独特的生物碱，具有多种药理作用，如抗炎、抗子宫收缩作用、抗血小板聚集和抑制血管收缩反应、心血管及神经保护作用等。然而，益母草碱的结构导致其水溶性和脂溶性较差，跨膜能力弱，生物利用度低，这使得益母草碱在临床中的广泛应用受到了阻碍。

脂质体是具有磷脂双分子层结构的微小囊泡，可包封水溶性和脂溶性药物。脂质体的组成主要包括磷脂和胆固醇，是两亲性分子的集合，粒径、电荷、成分和分子结构容易控制，且可生物降解，免疫原性小、安全无毒；脂质体通过细胞的内吞和融合作用，直接将药物送入细胞内，因此脂质体是理想的载药体系。未经修饰的脂质体虽有一定的被动靶向能力，但是其不能特异性的与靶细胞结合，到达类风湿性关节炎发病部位的脂质体被细胞摄取的效率并不高。而HAP-1是一种滑膜细胞归巢肽，它可以特异性靶向滑膜成纤维细胞，因此，以滑膜细胞归巢肽HAP-1修饰的脂质体药物可以通过HAP-1的特异性靶向作用主动靶向到类风湿性关节炎关节的滑膜成纤维细胞，发挥益母草碱的药理作用，抑制滑膜成纤维细胞的迁移和侵袭，从而骨破坏达到治疗类风湿性关节炎的效果。因此，滑膜成纤维细胞归巢肽HAP-1修饰的脂质体具有深刻的研究价值与广泛的临床应用前景。

发明内容

本发明的目的在于构建一种滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统及其制备方法，增加中药制剂中可以有效治疗类风湿性关节炎的方法。

一种靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统，由包封益母草碱的脂质体纳米载体及滑膜成纤维细胞归巢肽HAP-1构成，脂质体通过薄膜水化法制备，脂质体和滑膜成纤维细胞归巢肽HAP-1通过搅拌共孵育实现修饰。

优选的，滑膜细胞归巢肽HAP-1为HAP-1、聚乙二醇-磷脂复合物两部分通过搅拌共孵育共价连接所形成的线性嵌段共聚物，其摩尔比1:1～5:1。

优选的，所述HAP-1的氨基酸序列为SFHQFARATLAS。

优选的，所述的聚乙二醇-磷脂复合物使用的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇，其中平均分子量为400～5000；磷脂复合物为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺；所述磷脂酰乙醇胺为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。

优选的，所采用药物为益母草碱的游离碱或其盐。

一种靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统的制备方法，其特征在于：载药脂质体采用pH梯度法或硫酸铵梯度法制备：称取处方量的磷脂和胆固醇，将其溶于适量有机溶剂并于30～50℃条件下旋转蒸干成膜，加入一定浓度的缓冲盐水化，超声过膜，即得均匀空白脂质体；再加入一定浓度的益母草碱溶液后调节pH，30～65℃条件下孵育1～10min后超滤法离心清洗除去游离药物，即得益母草碱脂质体。

优选的，制备脂质体的磷脂为大豆磷脂、氢化大豆磷脂、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、二油酰磷脂酰乙醇胺及其衍生物中的一种或几种的混合；所用有机溶剂为为甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷的一种或几种的混合；使用pH梯度法初始pH范围为3～4，调节后pH范围为6～8；使用硫酸铵浓度范围为100～500mM。

优选的，所述脂质体与滑膜成纤维细胞归巢肽通过搅拌共孵育通过静电作用或疏水作用力进行膜融合，其质量比为1:1～500:1。

优选的，所述脂质体平均粒径为60～180nm，修饰滑膜成纤维细胞归巢肽的脂质体粒径在80～200nm。

靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统可靶向治疗类风湿性关节炎。

本发明以磷脂、胆固醇为原料制备纳米脂质体作为内核并包载中药益母草碱，将HAP-1多肽与聚乙二醇-磷脂复合物两部分通过搅拌共孵育共价连接合成线性嵌段共聚物，将其修饰脂质体益母草碱，构建滑膜成纤维细胞归巢肽HAP-1修饰的主动靶向脂质体递药系统。该脂质体递药系统中既能利用滑膜成纤维细胞归巢肽HAP-1增加该系统生物相容性，又能利用滑膜成纤维细胞归巢肽主动趋向滑膜成纤维细胞，靶向类风湿性关节炎的炎性关节腔，将有效成分递送至病灶，还能发挥脂质体缓慢释放药物的作用，延长药物作用时间。

本发明中，采用的药物为中草药益母草的有效成分益母草碱，已有研究表明益母草碱具有抗炎、抗氧化和心脑血管保护作用。将益母草碱包载入脂质体并以滑膜成纤维细胞归巢肽修饰，增加关节病灶部位的药物聚集并持续释放药物，提高对类风湿性关节炎的药物疗效。

本发明中，所述滑膜成纤维细胞归巢肽HAP-1通过HAP-1多肽与聚乙二醇-磷脂复合物搅拌共孵育得到。

本发明中，所述主动靶向类风湿性关节炎的脂质体递药系统通过滑膜成纤维细胞归巢肽HAP-1与益母草碱脂质体及聚乙二醇-磷脂复合物搅拌共孵育得到。

本发明通过下述方法构建滑膜成纤维细胞修饰的靶向脂质体递药系统：

HAP-1多肽与聚乙二醇-磷脂复合物搅拌共孵形成共价结合的复合物，经透析冻干，与聚乙二醇-磷脂复合物混合溶解；

以磷脂、胆固醇等为原材料用薄膜水化法制备脂质体，并利用pH梯度法或硫酸铵梯度法包载益母草碱药物，制备成脂质体益母草碱。

将预先制备的脂质体益母草碱和滑膜成纤维细胞归巢肽HAP-1搅拌共孵育并整粒。

本发明中，所述靶向脂质体递药系统的内核为脂质体益母草碱，与外层滑膜成纤维细胞归巢肽以静电力或疏水作用力相互作用而融合成滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统。

本发明中，所述脂质体平均粒径为60～180nm，包载益母草碱和修饰滑膜成纤维细胞归巢肽后最终平均粒径为80～200nm。

本发明采用人类风湿性成纤维细胞样滑膜细胞(MH7A)模拟类风湿性关节炎环境。

本发明通过尾巴根部皮下注射矿物油分散的灭活结核杆菌构建大鼠类风湿性关节炎模型(AIA)，评价该滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统的体内药效，该方法为本领域常见且公认。

本发明所制的滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统给药方式为静脉注射。

本发明的优点在于：

制备的滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统不同于其他纳米载体，该靶向脂质体递药系统在治疗类风湿性关节炎中具有独特优势：

该脂质体能通过pH梯度法或硫酸铵梯度法有效包载益母草碱，载药量高、泄漏率低，且具有缓释效果，可延长药物作用时间；

利用脂质体表面修饰的滑膜成纤维细胞归巢肽可以使其特异性靶向类风湿性关节炎关节的滑膜成纤维细胞。

该脂质体益母草碱通过滑膜成纤维细胞归巢肽的修饰，增加该系统生物相容性，提高纳米载体特定细胞摄取率，减少副作用。

附图说明

图1为本发明中滑膜成纤维细胞归巢肽HAP-1的核磁共振图谱。图中A为聚乙二醇-磷脂复合物DSPE-PEG₅₀₀₀-MAL氢谱图；B为HAP-1多肽与聚乙二醇-磷脂复合物形成共价结合DSPE-PEG₅₀₀₀-HAP氢谱图。

图2为本发明中滑膜成纤维细胞归巢肽和聚乙二醇-磷脂复合物不同摩尔比的靶向递药系统的粒径和电位表征图，图中A，B分别为脂质体和滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体的平均粒径和Zeta电位。

图3为本发明中不同条件下脂质体对益母草碱的包封率(EE％)与载药量(LE％)。

图4为本发明不同药脂比(Leo/Total lipid)的包封率(EE％)与载药量(LE％)(图A)，粒径与zeta电位(图B)。

图5为本发明中益母草碱脂质(Lipo@Leo)体和益母草碱靶向脂质体递药系统(HAP-Lipo@Leo)的透射电镜图。

图6为本发明中纳米递药系统中益母草碱的体外释放图。

图7为本发明中纳米递药系统在炎性刺激后人类风湿性成纤维样滑膜细胞的吸附能力共聚焦分析，图中A为纳米脂质体对细胞的共聚焦图像，B为ImageJ定量分析图。

图8为本发明中纳米递药系统的体外安全性评价，图中A为细胞活力测定结果，B为溶血实验结果。

图9为本发明中纳米递药系统体外抑制炎症实验结果，图中A为TNF-α的浓度测定结果，B为IL-1β的浓度测定结果。

图10为本发明中体内纳米靶向性的实验结果，图中A为AIA大鼠在不同时间静脉注射HAP-Lipo@DiD后的后肢成像；B为A中各个时间内后肢成像荧光强度的ImageJ定量分析图；C为静脉注射24小时后HAP-Lipo@DiD在后肢荧光图像。

图11为本发明中大鼠体内药效实验结果图，图中A为各组大鼠四爪和尾巴的临床评分结果，B为各组大鼠的足趾容量变化。

图12为本发明中纳米递药系统体内抑制炎症实验结果，图中A为TNF-α的浓度测定结果，B为IL-1β的浓度测定结果。

图13为本发明中各组大鼠关节组织的组织学分析。

图14为本发明中不同组别大鼠治疗结束后踝关节micro-CT分析，图中A分别为各组大鼠后爪的代表性图像，各组大鼠踝关节在第30天的代表性显微CT图像，各组大鼠的骨小梁的代表性图像，B为通过分析Micro-CT数据得到的组织形态学参数，BMD：骨矿物质密度；C为组织矿物密度(TMD)，D为骨体积分数(BV/TV)，E为总孔隙率(Total porosity)。

图15为本发明中各组大鼠经不同处理的安全性评价分析。图中A-D为正常大鼠和AIA大鼠经不同处理30天后的血清生化结果，其中A为谷草转氨酶(AST)，B为谷丙转氨酶(ALT)，C为肌酐(CRE)，D为尿素氮(BUN)。

具体实施方式

为了使本发明技术方案更容易理解，现结合附图采用具体实施例的方式，对本发明的技术方案进行清晰、完整的描述。

实施例1

滑膜成纤维细胞归巢肽HAP-1的制备：

按照HAP-1:DSPE-PEG₅₀₀₀-MAL摩尔比为1:1.5精确称量并溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，置于磁力搅拌装置上避光搅拌过夜，第二天全部转移至透析袋中，超纯水透析24h，冷冻干燥，得到DSPE-PEG₅₀₀₀-HAP。核磁共振仪检测其核磁图谱，如图1所示，由图可看出，A图显示出在7.0ppm处有马来酰亚胺特征峰，而B图中该峰消失，显示DSPE-PEG₅₀₀₀-MAL中的马来酰亚胺基团已经与HAP-1反应，DSPE-PEG₅₀₀₀-HAP制备成功备用。

实施例2

脂质体的制备：

按照SPC：胆固醇质量比为8:1精确称量并溶于无水乙醇中，按照薄膜水化法制备空白脂质体：置于旋蒸仪，50℃旋蒸30min至形成均匀薄膜，加入硫酸铵溶液水化，探针超声5min，在1000bar的压力下经过高压微射流纳米分散仪循环1次，粒度仪测定该脂质体平均粒径约为120nm，zeta电位约为-15mV。

实施例3

滑膜成纤维细胞归巢肽修饰靶向脂质体递药系统的制备：

按照DSPE-PEG₅₀₀₀-HAP:DSPE-mPEG₂₀₀₀摩尔比为1:1/1:2/1:3溶解于4％的乙醇溶液中，加入脂质体(制备如实施例2所述)，置于磁力搅拌装置上搅拌1h得到滑膜成纤维细胞归巢肽修饰靶向脂质体。粒度仪测定滑膜成纤维细胞归巢肽修饰纳米脂质体，得到其平均粒径与zeta电位如图2所示，改变DSPE-PEG₅₀₀₀-HAP与DSPE-mPEG₂₀₀₀的比例后，粒径和zeta电位均无明显变化，故选择DSPE-PEG5000-HAP:DSPE-mPEG2000＝1:1以提高靶向效率。

实施例4

脂质体益母草碱的制备：

益母草碱溶于200mM/250mM/300Mm硫酸铵溶液中，并加入不同比例修饰或空白脂质体(制备如实施例2、3所述)，孵育3min/5min/8min，立即取出，置于冰上冷却。冷却后将离心管内的液体全部转移至超滤离心管中，离心(5000rpm，10min)，过滤去除游离益母草碱，重复操作离心三次后，得到超滤离心管上层为益母草碱纳米脂质体，将离心后的游离益母草碱收集定量，紫外分光光度计测定游离益母草碱，根据公式：

包封率＝(总益母草碱-游离益母草碱)/总益母草碱×100％

计算益母草碱的包封率，可见图3，脂质体对益母草碱的包封率与载药量主要受外水相硫酸铵浓度的影响，当硫酸铵溶液浓度为300mM时，益母草碱的包封率明显升高，达到85％。根据实验结果，选出50℃，300mM硫酸铵溶液条件下包封5min为最终包封条件。改变益母草碱与脂质的比值得到不同的包封率与载药量，由图4可得，当Leo/total lipid投料比进一步提高到20％时，LE％由7.13±0.18％提高到11.43±0.40％。

实施例5

滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统的体外释放：

包载益母草碱的滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统制备方式同实施例4所示，通过透析法考察益母草碱的释放行为，以pH 7.4的PBS为释放液，将益母草碱，益母草碱脂质体及滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统分别封装入1ml透析袋(MWCO＝8000-14000Da)，在50ml离心管中浸没于释放液中，将离心管置于37℃水浴摇床，定点取出2mL释放液以测定释放的益母草碱浓度，同时补充2mL新鲜释放液。使用紫外分光光度计在277nm处测定其吸光度值，根据标准曲线计算药物释放百分比。如图6，游离益母草碱在2h释放量已接近80％，而脂质体益母草碱和滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统持续释放至12h，释放曲线才趋于平缓，可见脂质体益母草碱及靶向脂质体递药系统均有缓释效果，能够达到持续药物输送的目的。

实施例6

滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统的体外靶向性研究：

在24孔细胞培养板上接种1×10⁴个MH7A细胞，培养基为DMDM培养基+10％ FBS+1％ PSG，待细胞贴壁后给予1μg/mL的LPS刺激，置于5％ CO₂的细胞培养箱中培养24h后，弃去原培养基，更换0.5mL用DMEM培养基稀释的DiD标记的样品溶液，继续培养，2h后将细胞置于激光共聚焦荧光显微镜下观察。如图7所示，相较于未修饰的脂质体，滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体能够更多聚集到受炎性刺激的MH7A细胞，且加入过量的HAP-1多肽后，脂质体的细胞聚集明显减少，说明HAP-1多肽修饰的脂质体可以特异性靶向类风湿性关节炎的滑膜成纤维细胞。

实施例7

滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统体外安全性评价：

在96孔细胞培养板上接种1×10⁴个MH7A细胞，培养基为DMEM培养基+10％ FBS+1％ PS，待细胞贴壁后给予1μg/ml的LPS刺激，置于5％CO₂的细胞培养箱中培养24h后，分别加入不同浓度(0、30、60、150、300和600μg/mL)的Lipo@Leo和HAP-Lipo@Leo，共孵育24h后，取出培养液，用100μL Alamar Blue溶液(细胞培养液中10％)在37℃下再孵育4h。然后在570nm和600nm波长的酶标仪上进行分析。计算细胞存活率并报告为对照组的百分比。

含肝素的试管采集大鼠全血进行溶血试验，2000转/分的速度离心10min以获得红细胞，洗涤三次，悬浮于生理盐水中，得到2％的红细胞悬液，分别加入不同浓度的HAP-Lipo@Leo，设置阴性对照(生理盐水)和阳性对照(Milli Q水)，样品在37℃下孵育3h，1800rpm离心10min。最后在540nm处测量上清液吸光度，计算红细胞的溶血率。

如图8所示，MH7A细胞的存活率都在80％以上，表明两种脂质体具有良好的细胞相容性。HAP-Lipo@Leo的溶血率呈剂量依赖性，但在浓度高达1600μg/mL时，溶血率仍低于5％。因此，HAP-Lipo@Leo表现出良好的血液相容性。

实施例8

滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统体外炎症抑制研究：

在24孔细胞培养板上接种1×10⁴个MH7A细胞，培养基为DMEM培养基+10％ FBS+1％ PS，待细胞贴壁后给予10μg/ml的LPS刺激，置于5％CO₂的细胞培养箱中培养24h后，按照分组分别加入0.5mL的游离益母草碱，益母草碱脂质体，滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的益母草碱脂质体，继续培养2h后，收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定细胞培养液中TNF-α、IL-1β。如图9所示，相较于游离药组与未修饰的脂质体组，滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体降低细胞炎性因子的效果更好，这说明滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体在体外可以有效的抑制细胞炎症。

实施例9

滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统的体内靶向性研究：

建立大鼠类风湿性关节炎模型(AIA模型)：

选取160～180g的SD大鼠固定，每只大鼠在其尾巴根部皮下注射用100μL矿物油分散的0.2mg热灭活的结核分枝杆菌(冰浴研磨)。随后在固定的时间观察大鼠足趾变化，并测量足趾肿胀程度(足体积)。

将空白脂质体与空白靶向脂质体分别与荧光染料DiD混合均匀(质量比1000:1)，得到荧光空白脂质体与荧光靶向空白脂质体。选取造模成功的SD大鼠随机分为两组，分别为荧光空白脂质体给药组、荧光靶向脂质体给药组，每组3只，分别尾静脉注射相应样品(DiD＝2mg/kg)，在注射后3、6、12、24h使用小动物活体成像系统观察大鼠后爪的荧光，并在24h后对大鼠进行安乐死，取其后腿，观察荧光并使用ImageJ计算荧光强度。

如图10所示，静脉注射Lipo@DiD和HAP-Lipo@DiD时，3小时后在RA大鼠后肢观察到明显的荧光信号，且实时成像显示，HAP-Lipo@DiD组后爪的荧光强度远高于Lipo@DiD组。HAP-Lipo@DiD组在24h仍显示较强荧光，定量分析显示，HAP-Lipo@DiD组后肢的荧光强度强于Lipo@DiD组，表明在RA大鼠发炎的后肢中，HAP-Lipo比Lipo积累更多。在注射后24小时获得RA大鼠脏器和后肢的离体近红外图像，显示HAP-Lipo@DiD组后肢显示出较强的荧光。这些结果表明，滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体可以在体内靶向类风湿性关节炎的病变部位。

实施例10

滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统对类风湿性关节炎的治疗作用研究：

建立大鼠类风湿性关节炎模型(AIA模型)：

选取160～180g的SD大鼠固定，每只大鼠在其尾巴根部皮下注射用100μL矿物油分散的0.2mg热灭活的结核分枝杆菌(冰浴研磨)。随后在固定的时间观察大鼠足趾变化，并测量足趾肿胀程度(足体积)。

滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体对AIA模型的药效学研究：

选取SD大鼠随机分为5组，分别为疾病模型组、空白对照组、游离药给药组、益母草碱脂质体给药组、靶向脂质体给药组，每组6只。疾病模型组，游离给药组，益母草碱脂质体给药组，靶向脂质体给药组用如上方法造模，在造模第一天给药，按益母草碱10mg/kg/天的剂量尾静脉给予相应的药物。给药30天。疾病模型组与空白对照组每天等量的注射生理盐水，在给药过程中每两天对大鼠的四个爪子和尾巴进行评分。评分规则如下(最高关节炎评分为20)：

0分：无红斑无肿胀；

1分：有轻微的红斑和肿胀；

2分：有扩散的的红斑和轻微的肿胀；

3分：有中度的红斑和肿胀；

4分：有严重的红斑和肿胀，关节变形。

此外每天还用足趾容量测量仪测量后爪的足趾容量并记录。给药30天后所有大鼠进行麻醉，腹主动脉取血后使用ELISA试剂盒测定炎性因子IL-1β和TNF-α；取出其对应的后足，进行相关处理后使用Micro-CT成像系统进行观察与分析，并对大鼠后爪踝关节部位进行石蜡包埋、切片后用苏木精-伊红(H&E)、番红固绿(SOFG)、马松三色染色(Masson)和甲苯胺蓝(TB)染色，在显微镜下观察相应染色切片并拍照。

如图11，12，13，14所示，治疗组都可以缓解关节炎大鼠足肿胀程度，减缓类风湿性关节炎引起的骨破坏，起到保护关节的作用。脂质体益母草碱治疗组优于游离益母草碱治疗组，这可能是由于脂质体益母草碱的被动靶向作用。滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体组在类风湿性关节炎中的治疗作用明显优于游离益母草碱组和脂质体益母草碱组，说明滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体体通过精准递送药物取得了良好的治疗类风湿性关节炎的效果。

实施例11

滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统对大鼠的体内安全性评价：

诱导后第30天(实施例10)，采集各组大鼠血液和主要器官，采用试剂盒检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)含量，并对主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)切片进行H&E染色。得到图15所示结果，血清生化分析显示，各组大鼠的CRE、AST、ALT、BUN水平正常，均无显著性差异，显示肝肾功能良好。H&E染色未见明显的病理改变或损伤，说明滑膜成纤维细胞归巢肽修饰的靶向脂质体递药系统毒性较小。

应当注意，在此所述的实施例仅为本发明的部分实施例，而非本发明的全部实现方式，所述实施例只有示例性，其作用只在于提供理解本发明内容更为直观明了的方式，而不是对本发明所述技术方案的限制。在不脱离本发明构思的前提下，所有本领域普通技术人员没有做出创造性劳动就能想到的其它实施方式，及其它对本发明技术方案的简单替换和各种变化，都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统，其特征在于：由包封益母草碱的脂质体纳米载体及滑膜细胞归巢肽HAP-1构成，脂质体通过薄膜水化法制备，脂质体和滑膜细胞归巢肽HAP-1通过搅拌共孵育实现包覆。

2.如权利要求1所述的靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统，其特征在于：所述滑膜细胞归巢肽HAP-1为HAP-1、聚乙二醇-磷脂复合物两部分通过共价连接所形成的线性嵌段共聚物，其摩尔比1:1～5:1。

3.如权利要求2所述的靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统，其特征在于：所述HAP-1的氨基酸序列为SFHQFARATLAS。

4.如权利要求2所述的靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统，其特征在于：所述的聚乙二醇-磷脂复合物使用的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇，其中平均分子量为400～5000；磷脂复合物为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺；所述磷脂酰乙醇胺为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。

5.如权利要求2所述的靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统，其特征在于：所采用药物为益母草碱的游离碱或其盐。

6.如权利要求1至5任一项所述的靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统的制备方法，其特征在于：载药脂质体采用pH梯度法或硫酸铵梯度法制备：称取处方量的磷脂和胆固醇，将其溶于适量有机溶剂并于30～50℃条件下旋转蒸干成膜，加入一定浓度的缓冲盐水化，超声过膜或通过高压为射流纳米分散仪，即得均匀空白脂质体；再加入一定浓度的益母草碱溶液后调节pH，30～65℃条件下孵育1～10min后超滤法离心清洗除去游离药物，即得益母草碱脂质体。

7.如权利要求6所述的靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统的制备方法，其特征在于：制备脂质体的磷脂为大豆磷脂、氢化大豆磷脂、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、二油酰磷脂酰乙醇胺及其衍生物中的一种或几种的混合；所用有机溶剂为为甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷的一种或几种的混合；使用pH梯度法初始pH范围为3～4，调节后pH范围为6～8；使用硫酸铵溶液浓度范围为100～500mM。

8.如权利要求7所述的靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统的制备方法，其特征在于：该脂质体与滑膜细胞归巢肽HAP-1通过搅拌共孵育经由静电作用或疏水作用力进行膜融合，其质量比为1:1～500:1。

9.如权利要求8所述的靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统的制备方法，其特征在于：所述脂质体平均粒径为60～180nm，修饰滑膜细胞归巢肽HAP-1的脂质体粒径在80～200nm。

10.如权利要求1至5任一项所述的靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统的应用，其特征在于：靶向类风湿性关节炎脂质体递药系统可靶向治疗类风湿性关节炎。

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