CN112402378A - 含硒键的ros响应型地塞米松脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

含硒键的ros响应型地塞米松脂质体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及含硒键的ROS响应型地塞米松脂质体及其制备方法和应用。本发明的响应型脂质体，由巨噬细胞高表达叶酸靶向受体、药物活性成分和ROS响应磷脂材料组成；其制备方法包括Di‑Se‑PC磷脂的制备和ROS响应的功能化脂质体制备的方法步骤。该纳米脂质体为典型球形结构，粒径在100~200 nm，且具有明确的靶向性，稳定、高效地实现地塞米松对类风湿性关节炎的ROS响应型输送，能够减少糖皮质激素用药副作用、增强疗效，具有新的临床实用价值。

Description

含硒键的ROS响应型地塞米松脂质体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，提供一种含硒键的ROS响应型地塞米松脂质体及其制备方法和应用，具体涉及一种靶向治疗类风湿性关节炎的ROS响应型地塞米松脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性炎症自身免疫性疾病，表现为关节肿胀、疼痛和僵直，严重影响了患者的生活质量。临床上治疗RA的方法除外科关节置换治疗外，主要利用抗炎及降低免疫反应的RA药物进行治疗，包括非甾体类抗炎药(NSAIDs)、糖皮质激素(GCs)，抗风湿性药物(DMARDs)和生物技术药物。尽管RA化疗药物能够在一定程度上控制关节炎症、缓解患者痛苦，但非甾体类抗炎药物、糖皮质激素等药物长期应用或大剂量应用会产生一系列的不良反应和副作用，包括胃肠道损害，高血压、骨质疏松、消化性溃疡、胃肠道出血、肝损伤及心力衰竭，限制RA化疗药物的临床疗效及治疗的依从性。此外，研究表明肿瘤坏死因子(TNF-α)阻断剂和IL-6抑制剂等生物技术药物治疗RA效果明显优于传统抗风湿性药物，高昂价格及强烈毒性同样限制了它们广泛地应用。因此，如何趋利避害，扬长避短，最大限度地发挥RA化疗药物的减毒增效，对于RA药物治疗意义重大且具有极大的临床应用前景。
纳米制剂可增加亲脂性药物脂溶性，赋予药物靶向作用，提高其生物利用度，从而实现药物的减毒增效作用。其中，脂质体(Liposomes)是一种或多种磷脂材料组成的纳米囊泡，基于各种天然或合成脂质的纳米系统在RA药物递送方面受到了极大的关注。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述现有技术中RA临床治疗药物易引起不良反应和副作用，治疗效果差的缺陷，提供了一种靶向治疗RA的ROS响应型地塞米松脂质体及其制备方法和应用。
为实现上述目的之一，本发明的技术方案如下：
含硒键的ROS响应型地塞米松脂质体，地塞米松负载于Di-Se-PC磷脂药物载体上，并表面修饰DSPE-PEG2000-FA，在水溶液中通过亲疏水作用自组装为新型纳米脂质体制剂，所述Di-Se-PC磷脂的结构式：
Figure BDA0002801235560000021
所述叶酸靶向受体为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸(DSPE-PEG2000-FA)，其结构式：
Figure BDA0002801235560000022
本发明制备的叶酸靶向ROS响应型地塞米松脂质体形貌为典型球形结构，均一大小；平均粒径为100～200nm，包封率89.96％～95.31％。而且，本发明制备的叶酸靶向ROS响应型地塞米松脂质体稳定性良好，4℃放置两月后，纳米制剂药物包封率无显著性变化(*P>0.05)。
为实现上述目的之二，本发明的技术方案如下：
上述含硒键的ROS响应型地塞米松脂质体的制备方法，具体步骤如下：
1)ROS响应型Di-Se-PC磷脂的制备
取硒基丙酸、溴代十八烷严格按照摩尔比1：1溶于质量分数25％的甲醇溶液中，室温下反应48h。反应结束后，利用0.1M稀盐酸调节体系pH＝1，乙酸乙酯萃取，蒸发浓缩产物后过柱纯化产物，得到白色固体，记为中间体；
甘油磷酸胆碱、羰基二咪唑和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯加入到上述中间体的二甲基亚砜溶液中，45℃条件下反应过夜。反应结束后，蒸发浓缩反应液，在冰乙醚中沉淀析出产物，过滤后硅胶柱色谱纯化，得到淡黄色蜡状固体Di-Se-PC。
2)ROS响应型地塞米松脂质体的制备
将Di-Se-PC磷脂、Dex、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)溶解于三氯甲烷与甲醇混合液(3：1，v/v)，旋转蒸发除去有机溶剂形成脂质薄膜。室温氮气吹干后，加入生理盐水水化该脂质薄膜，经超声处理和0.22μm微孔滤膜过滤，得到ROS响应型地塞米松脂质体Dex@ROS-Lips，保存于4℃备用。
3)叶酸靶向ROS响应型地塞米松脂质体的制备
将溶解于生理盐水的DSPE-PEG2000-FA与步骤2)制备的Dex@ROS-Lips脂质体溶液在37℃温度下共孵育2h，置于截留分子量3500的透析袋中透析4h，已除去未插入的DSPE-PEG2000-FA，制备得到Dex@FA-ROS-Lips，保存于4℃备用。
优选的，步骤1)中Di-Se-PC磷脂合成中间体、甘油磷酸胆碱、羰基二咪唑、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的投料摩尔比例为1：2.2～2.5：1.5～2：0.5～1。
优选的，步骤2)中Di-Se-PC磷脂、胆固醇、Dex、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-FA组合的质量比为1：0.1～0.5：0.3～0.5：0.2～0.4：0.02～0.05。
为实现上述目的之三，本发明的技术方案如下：
上述含硒键的ROS响应型地塞米松脂质体制备能够体内递送治疗类风湿性关节炎药物的应用。
本发明的Dex@FA-ROS-Lips脂质体具有明确炎症部位靶向性，长循环和体内药物响应释放，生物利用度高。本发明的Dex@FA-ROS-Lips纳米脂质体能够提高Dex抗炎作用，减少糖皮质激素类药物毒副作用，提高Dex用药安全。
本发明的靶向治疗类风湿性关节炎的ROS响应型地塞米松脂质体能够通过药物的靶向输送，减少给药用量，增强对类风湿性关节炎的疗效，同时降低毒副作用，具有新的临床实用价值。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明利用ROS响应型Di-Se-PC磷脂对地塞米松进行负载，并表面修饰DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-FA叶酸靶向剂，其改进之处将地塞米松制备成一种高分散性、长循环和主动靶向的生物安全性好的纳米剂型。
本发明的纳米脂质体有效解决了地塞米松水溶性低，不稳定等缺陷，同时纳米化的设计提高了体内生物利用度进一步增强地塞米松的抗炎作用。
本发明纳米脂质体一方面可提高地塞米松抗炎作用，另一方面可减少了地塞米松毒副作用的发生几率，提高了地塞米松用药安全。
附图说明
图1ROS响应型Di-Se-PC磷脂材料合成的化学反应方程式。
图2Di-Se-PC磷脂的质谱、核磁共振氢谱和碳谱图。
图3地塞米松脂质体ROS响应释放示意图。
图4靶向ROS响应型地塞米松脂质体粒径、粒径分布的动态光散射测量图及透射电镜图。
图5靶向ROS响应型地塞米松脂质体在不同浓度的H2O2溶液中的释药曲线
图6靶向ROS响应型地塞米松脂质体体外Raw 264.7细胞毒性图。
图7脂质体靶向佐剂性关节炎大鼠(AIA)模型的活体成像图。
图8药物治疗前与治疗后地塞米松、ROS响应靶向脂质体和生理盐水组关节炎大鼠关节肿胀率图。
图9药物治疗前与治疗后地塞米松、ROS响应靶向脂质体和生理盐水组对关节炎大鼠体重影响图。
图10佐剂性关节炎大鼠踝关节滑膜组织病理学(H&E)切片图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将更为清楚。但实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
1)一种ROS响应型Di-Se-PC磷脂合成
取0.56g/6.01mmol硒基丙酸与2g/6.01mmol溴代十八烷严格溶于质量分数25％的甲醇溶液中，室温下反应48h。反应结束后，利用0.1M稀盐酸调节体系pH＝1，乙酸乙酯萃取，蒸发浓缩产物后过柱纯化产物(洗脱剂：己烷/乙酸乙酯，3:1)，得到0.86g白色固体(产率：41％)，记为中间体；
取0.3g/1.16mmol甘油磷酸胆碱、0.71g/4.36mmol羰基二咪唑和0.29g/1.94mmol1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯加入到1g/2.91mmol上述中间体的二甲基亚砜(15mL)溶液中，45℃条件下反应过夜。反应结束后，蒸发浓缩反应液，在冰乙醚中沉淀析出产物，过滤后硅胶柱色谱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇/水，65:25:4)，得到0.43g淡黄色蜡状固体Di-Se-PC(产率：42.8％)。
2)另一种ROS响应型Di-Se-PC磷脂合成
取0.56g/6.01mmol硒基丙酸与2g/6.01mmol溴代十八烷溶于质量分数45％的甲醇溶液中，室温下反应60h。反应结束后，利用0.1M稀盐酸调节体系pH＝1，乙酸乙酯萃取，蒸发浓缩产物后过柱纯化产物(洗脱剂：己烷/乙酸乙酯，3:1)，得到0.86g白色固体(产率：41％)，记为中间体；
取0.3g/1.16mmol甘油磷酸胆碱，0.96g/5.82mmol羰基二咪唑和0.29g/1.94mmol1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯加入到1g/2.91mmol上述中间体的二氯甲烷/二甲基亚砜(20mL，1:1)溶液中，45℃条件下反应过夜。反应结束后，蒸发浓缩反应液，在冰乙醚中沉淀析出产物，过滤后硅胶柱色谱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇/水，65:25:4)，得到0.51g淡黄色蜡状固体Di-Se-PC(产率：49.2％)。
图1是ROS响应性Di-Se-PC硫醚磷脂合成化学反应方程式，明确合成路线。
图2是Di-Se-PC硫醚磷脂的1HNMR和13C NMR。如图所示，3.25ppm峰为甘油磷酸胆碱上-N(CH3)3基团化学位移，1.46-1.22ppm为硬脂酸链-CH2特征峰化学位移值。同样，13C NMR各峰化学位移值均具有良好的归属，均证明实施例1中Di-Se-PC的成功合成。
实施例2：
1)ROS响应型地塞米松脂质体制备
利用薄膜分散法制备ROS响应型地塞米松脂质体。精密称取40mg Di-Se-PC磷脂，20mg胆固醇，8mg DSPE-PEG2000和1.5mg地塞米松溶解于20mL三氯甲烷与甲醇混合液(3：1，v/v)，40℃水浴减压旋蒸有机溶剂形成脂质薄膜。室温氮气吹干后，加入10mL生理盐水(pH＝7.4)，55℃、100rpm水化干燥脂质膜。将制备的地塞米松脂质体超声处理20min后，利用LiposoFastTM挤出器将脂质体悬液依次经过0.45μm、0.22μm、0.1μm聚碳酸脂滤膜，得到制备的ROS响应型地塞米松脂质体制剂。
2)ROS响应型地塞米松脂质体制备
利用薄膜分散法制备ROS响应型地塞米松脂质体。精密称取40mg Di-Se-PC磷脂，20mg胆固醇，8mg DSPE-PEG2000和3.0mg地塞米松溶解于20mL三氯甲烷与甲醇混合液(3：1，v/v)，40℃水浴减压旋蒸有机溶剂形成脂质薄膜。室温氮气吹干后，加入10mL生理盐水(pH＝7.4)，55℃、100rpm水化干燥脂质膜。待制备的地塞米松脂质体超声处理20min后，利用LiposoFastTM挤出器将脂质体悬液依次经过0.45μm、0.22μm、0.1μm聚碳酸脂滤膜，得到制备的ROS响应型地塞米松脂质体制剂。
实施例3：叶酸靶向ROS响应型地塞米松脂质体制备
1)利用后插入法制备叶酸靶向ROS响应型地塞米松脂质体。将溶解于生理盐水的3mg DSPE-PEG2000-FA与实施例2制备的Dex@ROS-Lips脂质体溶液在37℃温度下共孵育2h，置于截留分子量3500的透析袋中透析4h，已除去未插入的DSPE-PEG2000-FA，制备得到Dex@FA-ROS-Lips，保存于4℃备用。
2)粒径与形貌测定
取1mL上述1)中脂质体悬液以生理盐水(pH＝7.4)稀释20倍后，利用激光粒度分析仪(DLS)测定其粒径和粒径分布，如图4A所示，叶酸靶向ROS响应型地塞米松脂质体平均粒径为124±25nm。
取10μL稀释20倍的脂质体悬液，滴加到300目碳膜支撑的铜网上，2％磷钨酸染色5min。室温干燥后，利用透射电子显微镜(TEM)观察脂质体的纳米形貌，如图4B所示，见脂质体呈球形，大小基本均一。
3)包封率测定
利用高效液相色谱(HPLC)测定地塞米松标准品工作曲线，色谱条件：反相C18色谱柱150mm×4.6mm×5μm；流动相：40％乙腈-60％水；检测波长：λ＝242nm。取地塞米松标准品溶于色谱级乙腈中，制备浓度为62.6、31.25、17.5、8.2和4.3μg/mL的标准溶液，20μL进样，记录色谱峰面积A，计算标准曲线(A＝0.943c+1.147，相关系数r＝0.999)。实施例3中叶酸靶向ROS响应型地塞米松脂质体包封率为89.96％。
4)稳定性与体外响应释放
脂质体混悬液于放置2周后，脂质体对地塞米松磷酸钠的包封率无显著性变化切，表明样品具有良好的稳定性，可低温较长时间保存。
利用透析法测定Dex@FA-ROS-Lips脂质体体外响应释放速率。将1.0mL Dex@FA-ROS-Lips转移到纤维素酯透析袋(MWCO 3500Da)中，放置40mL于不同浓度0.5mM或1mM H2O2透析液中进行透析。在预定的时间点，取2mL释放介质样并加入等量的新鲜PBS透析液，HPLC测定不同时间点药物释放浓度。计算释放率(％)的公式为：释放率(％)＝(Wn/W)×100％。其中，Wn为Dex@FA-ROS-Lips脂质体在某一时间点累积释放量；W为脂质体包裹Dex总量。如图5所示，在37℃、0.5mM或1mM H2O2释放介质中孵育72h，Dex@FA-ROS-Lips表现出快速释放行为，具ROS响应性。
实施例4：叶酸靶向ROS响应型地塞米松脂质体体外细胞毒性实验
1)细胞培养
巨噬细胞Raw 264.7来源于中国科学院上海细胞库。在含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM D-谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI 1640培养Raw 264.7细胞，并保持在37℃、5％CO2环境下。细胞达到80％汇合率后，利用0.25％胰蛋白酶/EDTAPBS溶液(pH＝7.4)消化传代。
2)CCK-8检测
取对数期Raw 264.7细胞，按照每孔1×104到细胞密度铺96孔板，37℃、5％CO2孵育过夜。然后1μg/mL LPS致炎6h，设置药物浓度梯度分别为：Dex(100μM、50μM、25μM、12.5μM及6.25μM)；Dex@FA-ROS-Lips(以Dex量计，100μM、50μM、25μM、12.5μM及6.25μM)。每孔加入100μL不同浓度的药物，继续培养24h。利用CCK-8法分析对Dex@FA-ROS-Lips对Raw 264.7巨噬细胞的体外细胞毒性。
结果：
由图6可知，1.56μM，3.13μM，6.25μM及12.5μM的Dex@FA-ROS-Lips脂质体均对Raw264.7细胞促生长增值，表明ROS响应型地塞米松脂质体对巨噬细胞无细胞毒性且具有一定的促细胞生长功能。
实施例5：ROS响应型地塞米松脂质体炎症靶向性实验
1)佐剂性关节炎大鼠模型建立
雄性SD大鼠，6-8周龄，150-180g体重，由济南朋悦实验动物公司提供。皮内注射0.1mL弗氏完全佐剂于大鼠右后足足底部诱发佐剂型关节炎AIA。
2)活体成像实验
为了考察Dex@FA-ROS-Lips脂质体靶向关节炎病变部位，利用近红外荧光染料Cy5.5标记纳米制剂，在制备的AIA炎症模型进行大鼠体内可见光活体成像实验。具体方案：取AIA炎症模型大鼠，尾静脉注射游离Cy5.5溶液和Cy5.5荧光标记Dex@FA-Cy5.5-ROS-Lips脂质体于上述AIA炎症模型大鼠(n＝3)，给药剂量0.2mg Cy5.5/kg。在预设时间点(2h，4h和24h)，利用小动物活体成像系统检测纳米粒和游离的Cy5.5靶向关节炎病变部位的情况。
结果：
由图7可知，相比于对照AIA炎症大鼠，尾静脉注射游离Cy5.5的踝关节部位只有少量红色荧光，该结果表明游离药物能很少到达关节炎症部位。在AIA炎症模型大鼠的原发性脚掌关节炎部位呈现出明显的亮黄色，说明叶酸靶向性Dex@FA-Cy5.5-ROS-Lips脂质体能够主动靶向至关节炎症部位，提高病变部位的药物浓度。
实施例6：ROS响应型地塞米松脂质体体内药效学实验
1)佐剂性关节炎大鼠模型建立
雄性SD大鼠，6-8周龄，150-180g体重，由济南朋悦实验动物公司提供。皮内注射0.1mL弗氏完全佐剂于大鼠右后足足底部诱发佐剂型关节炎AIA。
2)药效学实验
将AIA炎症模型大鼠随机分组为生理盐水组、游离Dex组、未载药ROS-Lips和Dex@FA-ROS-Lips组(n＝6)。其中，游离Dex组和Dex@FA-ROS-Lips组给药剂量1.25mg Dex/kg，每隔两天一次，连续14天。在致炎前和致炎后3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27天，分别测定大鼠右侧原发性足趾容积。在致炎后11、13、15、17、19、21、23、25和27天，测定大鼠左侧继发性足趾容积，计算肿胀度(肿胀度＝致炎后容积-致炎前容积)。
于造模27天后，每组取2只受试AIA大鼠关节滑膜及软骨，置于4％多聚甲醛中固定。经脱钙、脱水及常规石蜡包埋后冷冻切片(5μm)，进行苏木精和伊红染色，荧光显微镜下观察其病理学变化情况。
结果：
脚掌关节肿胀率越低，说明药物治疗效果好。由图8可知，叶酸靶向的Dex@FA-ROS-Lips脂质体治疗组的AIA关节炎模型鼠的关节肿胀率，包括原发性和继发性肿胀，均显著低于游离Dex和非靶向地塞米松纳米药物。该结果表明本发明的ROS响应的地塞米松靶向脂质体对类风湿性关节炎具有最好的治疗效果。
与正常SD大鼠相比，AIA模型大鼠体重会降低，且与炎症诱发程度成正比。治疗后模型大鼠体重逐渐升高，可判断大鼠脚掌关节炎症状减轻，且初步说明纳米药物生物相容性良好。从图9中可以看出，Dex@FA-ROS-Lips脂质体治疗组的模型大鼠的体重明显增加，说明药物治疗减轻了模型关节炎症状。与此同时也表明纳米脂质体组没有明显的不良副作用，未导致AIA模型大鼠体重明显下降。
由图10可知，A为正常SD大鼠对照组，显示滑膜组织无炎性细胞浸润，骨纤维整齐排列，关节软骨表面光滑，关节间隙正常；B为AIA炎症模型大鼠组，显示滑膜组织炎性细胞浸润，出现典型的血管翳，软骨及骨关节破坏严重；C为游离Dex实验组，滑膜组织中淋巴细胞浸润，关节间隙增宽，关节表面毛糙，软骨及骨一定程度破坏；D为Dex@FA-ROS-Lips脂质体治疗组，滑膜组织少量巨噬细胞浸润，关节软骨表面光滑，无纤维组织增生，关节间隙与正常组相似。病理切片表明，经过Dex@FA-ROS-Lips脂质体治疗两周后，AIA模型大鼠踝关节炎性浸润细胞明显减少，具有较强的抗炎作用。
本发明的关键在于首次合成的生物安全性良好的ROS响应型Di-Se-PC磷脂作为Dex载体；进一步分析，本发明根据RA炎症部位的高浓度ROS和叶酸FA受体的高表达的特异性病理特征，利用ROS响应型Di-Se-PC磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000及DSPE-PEG2000-FA为药物载体，将Dex药物制备成高分散性、主动靶向FA受体且ROS响应型的脂质体纳米制剂，进而可以避免本发明纳米制剂在体内被内皮网状系统(RES)清除，从而延长血液循环，同时叶酸主动靶向RA的病变部位释放地塞米松，提高治疗效果。
本发明新合成的药物载体Di-Se-PC功能化磷脂结构如下所示：
Figure BDA0002801235560000091
而且，本发明制备的ROS响应型Di-Se-PC磷脂在高浓度过氧化氢H2O2作用下发生如下降解反应：
Figure BDA0002801235560000101
分析原因在于，由于本发明的ROS响应型Di-Se-PC磷脂具有均衡的双亲性，能够与胆固醇、DSPE-PEG2000及DSPE-PEG2000-FA通过亲水-疏水和自组装为纳米脂质体实现对Dex药物的有效包裹；因此，如响应释放示意图3所示，当脂质体靶向于RA活性氧微环境，亲脂性Di-Se-PC硫醚磷脂被氧化亚砜后，由疏水性转变为亲水性，脂质体纳米结构破坏，因而响应释放出Dex药物。
上述具体的实施方式表明本发明制备的Dex@FA-ROS-Lips纳米脂质体为球形结构、均一大小，平均粒径为100～200nm，包封率89.96％～95.31％；同时，上述具体的实施方式证明了本发明的Dex@FA-ROS-Lips纳米脂质体具有高分散性、长循环和主动靶向的特点，有效解决了地塞米松水溶性低，不稳定等缺陷，而且进一步增强地塞米松的抗炎作用，减少糖皮质激素类药物毒副作用，提高Dex用药安全。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (7)

1.含硒键的ROS响应型地塞米松脂质体，其特征在于，所述脂质体包括ROS响应型Di-Se-PC磷脂、巨噬细胞高表达的叶酸靶向受体、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和药物活性成分；并且，药物活性成分负载于ROS响应型Di-Se-PC磷脂纳米载体上，表面修饰有叶酸靶向受体和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，以叶酸靶向受体为关节炎处巨噬细胞靶向剂；
其中，所述Di-Se-PC磷脂的结构式：
Figure FDA0002801235550000011
并且，所述脂质体为典型球形结构，均一大小，平均粒径为100～200nm，包封率89.96％～95.31％。
2.含硒键的ROS响应型地塞米松脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)ROS响应型Di-Se-PC磷脂的制备
取硒基丙酸、溴代十八烷按照摩尔比1：1溶于质量分数25％的甲醇溶液中，室温下反应48h，反应结束后用0.1M稀盐酸调节体系pH＝1，然后乙酸乙酯萃取、蒸发浓缩产物后过柱纯化产物得到白色固体，即为中间体；
甘油磷酸胆碱、羰基二咪唑和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯加入到含有上述中间体的二甲基亚砜溶液中，45℃条件下反应过夜，反应结束后蒸发浓缩反应液，在冰乙醚中沉淀析出产物，过滤后硅胶柱色谱纯化，得到淡黄色蜡状固体，即为ROS响应型Di-Se-PC磷脂；
2)ROS响应型地塞米松脂质体的制备
将步骤1)制备的ROS响应型Di-Se-PC磷脂、Dex、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)溶解于三氯甲烷与甲醇混合液(3：1，v/v)，旋转蒸发除去有机溶剂形成脂质薄膜，然后室温氮气吹干后加入生理盐水水化该脂质薄膜，经超声处理和0.22μm微孔滤膜过滤，得到ROS响应型地塞米松脂质体Dex@ROS-Lips，保存于4℃备用；
3)叶酸靶向ROS响应型地塞米松脂质体的制备
将溶解于生理盐水的DSPE-PEG2000-FA与步骤2)制备的Dex@ROS-Lips脂质体溶液在37℃温度下共孵育2h，置于截留分子量3500的透析袋中透析4h，除去未插入的DSPE-PEG2000-FA，制备得到Dex@FA-ROS-Lips，保存于4℃备用。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1)中甘油磷酸胆碱、羰基二咪唑、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和步骤1)制备的中间体投料摩尔比为2.2～2.5：1.5～2：0.5～1：1。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤2)中ROS响应型Di-Se-PC磷脂、Dex、胆固醇与DSPE-PEG2000的质量比为1：0.1～0.5：0.3～0.5：0.2～0.4。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤2)中脂质体水化温度为50～60℃、水化时间为0.5～1.5h。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤3)中DSPE-PEG2000-FA与步骤2)制得的ROS响应型地塞米松脂质体Dex@ROS-Lips的质量比为0.02～0.05：1。
7.含硒键的ROS响应型地塞米松脂质体制备体内递送治疗类风湿性关节炎药物的应用。
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