CN110742856A - 靶向递送并消耗大量h2o2的同时释放co的纳米凝胶药物载体、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体、制备方法及其应用，所述纳米凝胶药物载体为树状多肽纳米凝胶药物载体，包括作为载体的树状多肽纳米凝胶以及在树状多肽纳米凝胶的内部空腔负载的一氧化碳释放分子CORM401，还包括在树状多肽纳米凝胶的表面包裹的通过叶酸修饰的透明质酸。基于本发明的纳米凝胶药物载体制备多功能抗炎药物(CPHs)，可通过HA‑FA靶向进入活化的巨噬细胞,通过消耗过量H2O2迅速释放大量的CO，而生成的CO不仅有效抑制细胞增殖，还能通过诱导血红素加氧酶的激活(HO‑1)和下调p38MAPK,NF‑kB(p50/p65)和TLR‑2的表达明显抑制炎性因子的分泌。而且CPHs可大量消耗骨关节炎关节部位ROS，有效抑制关节软骨及细胞外基质的降解。

Description

靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体、 制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及纳米凝胶载药体系技术领域，尤其是靶向递送、消耗大量H2O2同时释放CO的纳米凝胶载药体系，以旨在消除骨关节炎部位分泌的大量H2O2，同时可以释放出具有抗炎功能的CO分子，针对骨关节炎的抗炎治疗。
背景技术
炎症与多种疾病密切相关，如癌症、感染、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、骨关节炎等。骨关节炎(OA)是一种由关节炎症引起的慢性疾病，已与癌症、心血管疾病并列为严重威胁人类健康的三大杀手。OA的产生可归结于关节软骨受损引起的促炎和抗炎通路失调，进而导致软骨细胞外基质(ECM,主要是胶原II和蛋白聚糖)降解，临床表现主要有关节肿胀、疼痛，严重时甚至会导致关节畸形、残废等。目前临床上主要通过注射皮质类固醇药物如地塞米松来治疗骨关节炎。地塞米松是一种人工合成的皮质类固醇，由于可减轻炎症和减少软骨细胞外基质的丢失而被广泛应用于骨关节炎的治疗。但此类药物面临半衰期短、易被清除，需频繁给药等诸多问题，且其长期大剂量使用还会引起严重的毒性和副作用如胃脘痛、恶心、消化不良、呕吐、胃肠道溃疡以及肾衰竭或出血。虽然目前已发展了多种能响应释放皮质类固醇的纳米药物，但此类药物由于不具有靶向功能，因此仍不能克服皮质类固醇药物疗效低、副作用大等问题。故，开发一些新的治疗方法和抗炎药物来实现对骨关节炎的高效治疗具有重要意义。
近年来，活化巨噬细胞已成为动脉粥样硬化斑块不稳定性和类风湿性关节炎损伤的生物标志物，并作为此类疾病影像学和治疗的主要靶点，且骨关节炎部位的炎症与活化的巨噬细胞有密切关系，活化巨噬细胞可在细胞内分泌大量ROS(正常细胞ROS浓度1-8μΜ，活化巨噬细胞最高可达到1000μΜ)，这些ROS分子溢出不仅可通过脂质过氧化和DNA损伤来对周围组织产生细胞外毒性,甚至还会降解关节软骨的细胞外基质。在众多ROS(如单线态氧、羟基自由基、超氧阴离子、H2O2)中，H2O2是最为稳定的一种，也是各种ROS的前驱体。作为一种重要的炎症因子，H2O2在骨关节炎部位的长时间大量存在不仅可放大促炎通路，并促使正常巨噬细胞向活化巨噬细胞转变，进而严重恶化炎症反应。因此，可通过消耗活化巨噬细胞分泌产生的大量H2O2来显著降低炎症部位的ROS浓度和炎性因子水平。
CO是一种奇特的内源性信号分子,不仅对重要的细胞和器官有保护作用，还可以诱导产生对抗氧化应激的血红素加氧酶(HO-1)，而持续的氧化应激是造成炎症的重要原因(ROS就是氧化应激的产物之一)，因此，CO被视为一种理想的抗炎药物。Leah A.Mitchell等人通过非人类灵长类动物食蟹猴肺炎症模型证明吸入低浓度CO在啮齿类动物肺损伤模型中具有抗炎保护作用。此外，在动物研究中将吸入皮质类固醇药物作为阳性对照物，CO在减少性粒细胞流入气道这方面几乎与类固醇一样有效，但在减少促炎细胞因子提高抗炎因子的产生方面则没有CO那么有效。CO高效抗炎效应与激活以下细胞信号通路有关，如核转录因子NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、Janus激酶-信号传导等。虽然具有重要的抗炎潜力，但CO疗法在临床上的广泛应用还面临诸多问题，这主要归结于其气体特性，该特性使得CO的可控递送和细胞内智能释放变得极具挑战，而高浓度CO如果不能以可控方式安全递送至目标组织并在细胞内智能释放的话，则有可能引起中毒。
为实现CO的可控递送与响应释放，目前已发展出多种响应释放机制的CO释放分子，如基于配体交换释放的钌羰基络合物，基于紫外光响应释放的锰羰基络合物和铁羰基络合物，以及基于近红外光响应释放的功能化锰羰基络合物和铁羰基络合物。但是，由于存在配体交换释放可控性差、紫外光组织渗透性有限且易引起光毒性等缺点，使得他们都不是作为CO递送的最佳选择，基于环境特殊性质响应释放的CO释放分子由于不受外部条件限制而备受关注。
现有技术中已成功构建了基于光动力疗法驱动的CO可控递送系统，该系统可利用比紫外光具有更深的穿透性和更小的光毒性的近红外光照射产生具有氧化性质的H2O2来智能释放CO，光动力治疗和CO可控释放二者的结合取得了显著的协同抗癌效果。更重要的是，在该研究中还证实了CORM401的氧化响应释放机制，这是一种在正常生理环境下可稳定数小时，但在高浓度H2O2的条件下则能被快速氧化释放CO的亲水性CORMs。CORM401的上述特性刚好可用于消耗活化巨噬细胞内的高浓度H2O2、并响应释放CO，进而实现对骨关节炎的高效治疗，且不会对正常细胞产生毒副作用。但如何将CORM401高效递送到活化巨噬细胞内是一个难题。
发明内容
本发明目的在于提供一种靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体、制备方法及其应用，基于骨关节炎周围存在大量活化巨噬细胞，且活化巨噬细胞会分泌出大量H2O2会进一步诱导正常巨噬细胞向活化巨噬细胞转变，因此，本发明选用在大量H2O2存在的情况下会释放出CO的CO释放分子CORM401作为抗炎药物，以针对骨关节炎的抗炎治疗。
CO释放分子在消耗H2O2的同时会释放出具有抗炎效果的CO气体,不仅可以解决骨关节炎部位大量存在的H2O2的问题，其释放的CO是一种内源性具有抗炎功能的小分子，可以进行抗炎治疗。
体内环境非常复杂，想要达到有效抗炎，必须保证抗炎药物可以靶向递送到需求部位。因此，本发明选用与活化巨噬细胞细胞膜上过量表达的CD44和FA-β有特异性结合作用的透明质酸和叶酸作为配体，使抗炎药物可以靶向递送至炎症部位。
具体地，选用叶酸和透明质酸作为靶向材料。尤其是在透明质酸长链上修饰叶酸材料，可选的是，叶酸在透明质酸链的接枝率为3.9％。
为保证CO释放分子CORM401作为抗炎药物能够安全的递送至体内且不对正常组织和细胞产生毒性，本发明选用以多面体倍半硅氧烷POSS为核赖氨酸为接枝单元形成的三代树状大分子POSS-G3-Lys与交联剂3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯(DSP)交联形成的空白纳米凝胶PDNs作为载体。
具体地，上述所提到的空白纳米凝胶PDNs中，大分子POSS-G3-Lys与交联剂DSP摩尔比为1:2。
为了使CO释放分子CORM401尽可能多的负载在空白纳米凝胶空腔内部，本发明选用三种比例用于实际操作。
具体地，在上述提到的CORM401负载过程中，CORM401与空白纳米凝胶的质量比分别是3:7、2:3、1:1。
为了使抗炎药物被递送至炎症部位，本发明选用叶酸修饰的透明质酸作为靶向材料包裹在纳米凝胶周围。
具体地，在上述包裹叶酸修饰的透明质酸的过程中，负载有CORM401的纳米凝胶与叶酸修饰的透明质酸的质量比为3:1。
为了方便抗炎药物进入体内被细胞吸收，纳米凝胶尺寸控制在240-280nm之间。
在具体实施过程中，本发明提供具有靶向递送、消耗H2O2释放CO的多功能抗炎药物递送系统的制备方法。首先，通过三代树状大分子POSS-G3-Lys与交联剂DSP交联得到具有丰富内部空腔结构的空白纳米凝胶PDNs，然后，通过超声搅拌的方法在空白纳米凝胶内部负载大量CORM401，最后，通过静电吸附作用将带有负电荷的叶酸修饰的透明质酸包裹在带有正电荷纳米凝胶外围，包括以下步骤：
步骤1.将叶酸与HOBt和EDC混合溶解在DMSO溶液中,避光搅拌1h后，与透明质酸水溶液混合，加入EDA，避光搅拌48h，透析去除未反应物质，冷冻干燥得到叶酸修饰的透明质酸HA-EDA-FA；
步骤2，将三代树状大分子POSS-G3-Lys与交联剂3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯(DSP)通过交联得到空白纳米凝胶PDNs；
步骤3，将CORM401溶液逐滴滴入步骤2得到的空白纳米凝胶PDNs溶液中，搅拌8-12h，透析去除游离物质，冷冻干燥得到纳米凝胶CPs；
步骤4.将得到的纳米凝胶CPs溶解于水溶液中，缓慢加入HA-EDA-FA水溶液，搅拌4-8h，冷冻干燥得到纳米凝胶CPHs。
具体地，步骤1为：在黑暗条件中，将叶酸与催化剂HOBt，EDC混合溶解于DMSO中，避光搅拌1h后，将得到的混合溶液缓慢倒入提前透明质酸水溶液中，加入EDA连接叶酸和透明质酸，避光搅拌48h后，在水溶液中透析去除游离的叶酸和催化剂，冷冻干燥得到产物HA-EDA-FA。
具体地，步骤2为：将交联剂溶解在DMF中，逐滴加入到含有大分子POSS-G3-Lys的DMF溶液，搅拌8-12h后，分别在DMF和水溶液中透析，去除溶液中未反应材料，冷冻干燥得到空白纳米凝胶PDNs。
具体地，步骤3为：将CORM401溶解在甲醇溶液中，缓慢的滴加到含有空白纳米凝胶的甲醇溶液中，之后将混合溶液超声5min后搅拌0.5h，为了使疏水性CORM401更好的负载在空白纳米凝胶空腔内部，将混合溶液分散到水溶液中，搅拌4-6h，在水溶液中透析，得到负载有CORM401的纳米凝胶CPs。
具体地，步骤4为：将HA-EDA-FA水溶液缓慢加入到步骤3所得到的CPs水溶液中，搅拌4-8h，冷冻干燥得到纳米凝胶CPHs。
更具体地，步骤1中，透析时截留分子量为3000Da，其余步骤透析时截留分子量为1000Da。
更具体地，步骤1中，所述的叶酸与HOBt，EDC的摩尔比为1:8:8。
更具体地，步骤2中，所述的POSS-G3-Lys与交联剂的摩尔比为1:2，所得到的空白纳米凝胶粒径保持在240-280nm之间。
更具体地，步骤3中，所述空白纳米凝胶与CORM401的质量比分别为7:3、3:2、1:1。
与现有技术相比，本发明具有以下显著的有益效果：
1)本发明构建的基于靶向递送、消耗过量H2O2同时释放具有抗炎效果的CO纳米凝胶载药体系可将纳米凝胶靶向递送至炎症部位，更加容易被活化巨噬细胞吞噬，可以在使用较小的药物剂量情况下取得更好的治疗效果；
2)本发明构建的基于靶向递送、消耗过量H2O2同时释放具有抗炎效果的CO纳米凝胶载药体系在细胞内部可以消耗过量存在的H2O2，H2O2是炎症恶化的一个重要原因，它会诱导正常巨噬细胞向活化巨噬细胞转变。消耗细胞内部过量存在的H2O2可以阻止炎症进一步恶化；
3)本发明构建的基于靶向递送、消耗过量H2O2同时释放具有抗炎效果的CO纳米凝胶载药体系在细胞消耗H2O2的同时会释放CO气体，CO是一种内源性的具有抗炎功能的小分子，更容易穿透细胞膜，提高细胞抗炎信号通路的激活和抗炎因子的分泌；
4)本发明构建的基于靶向递送、消耗过量H2O2同时释放具有抗炎效果的CO纳米凝胶载药体系在正常细胞内的吞噬情况较少，且在正常细胞内存在少量的H2O2，这些H2O2并不足以使CORM401释放CO气体，因此，在正常组织周围CPHs纳米凝胶并没有毒性，且纳米凝胶所用到的载体PDNs能够被细胞降解，具有良好的生物安全性。
由此，本发明可基于靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体制备多功能抗炎药物(CPHs)，可以通过HA-FA靶向进入活化的巨噬细胞,通过消耗过量H2O2迅速释放大量的CO，而生成的CO不仅有效地抑制细胞增殖，还能通过诱导血红素加氧酶的激活(HO-1)和下调p38 MAPK,NF-kB(p50/p65)和TLR-2的表达明显抑制炎性因子的分泌。体内实验进一步证实，CPHs可大量消耗骨关节炎(OA)关节部位ROS，有效抑制关节软骨及其细胞外基质的降解。
应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。另外，所要求保护的主题的所有组合都被视为本公开的发明主题的一部分。
结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。
附图说明
附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：
图1为本发明所构建的纳米凝胶载药体系的纳米凝胶形貌及CPHs在不同H2O2浓度和不同孵育时间内CO释放图。
图2为纳米凝胶在细胞内的吞噬图。
图3为活化巨噬细胞与纳米凝胶孵育后细胞内CO释放图和H2O2、ROS浓度变化图。
图4为活化巨噬细胞与纳米凝胶孵育后抗炎效果图。
图5为活化巨噬细胞与纳米凝胶孵育后细胞内线粒体膜电位变化图、血红素加氧酶(HO-1)变化图和细胞活性图。
图6为活化巨噬细胞与纳米凝胶孵育后细胞内激活抗炎信号通路效果图。
图7为纳米凝胶治疗患有骨关节炎老鼠流程图、老鼠关节部位ROS浓度对比图。
图8为纳米凝胶治疗老鼠骨关节炎后，关节部位Micro-CT图。
图9为纳米凝胶治疗老鼠骨关节炎后，关节部位抗炎效果图。
具体实施方式
为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。
在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施，这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外，本发明公开的一些方面可以单独使用，或者与本发明公开的其他方面的任何适当组合来使用。
实施例1
基于靶向递送、消耗过量H2O2同时释放具有抗炎效果的CO纳米凝胶载药体系的构建
首先，得到有叶酸修饰的透明质酸HA-EDA-FA材料，将叶酸与HOBt和EDC混合溶解在DMSO溶液中(叶酸与HOBt，EDC的摩尔比为1:8:8),避光搅拌1h后，与透明质酸水溶液混合，加入EDA，避光搅拌48h，透析去除未反应物质(透析时截留分子量为3000Da)，冷冻干燥得到产物HA-EDA-FA。
然后，通过三代树状大分子POSS-G3-Lys与交联剂3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯(DSP)交联得到具有丰富内部空腔结构的空白纳米凝胶PDNs，将交联剂溶解在DMF中，逐滴加入到含有大分子POSS-G3-Lys的DMF溶液，搅拌8-12h后，分别在DMF和水溶液中透析(透析时截留分子量为1000Da)，去除溶液中未反应材料，冷冻干燥得到空白纳米凝胶PDNs。
然后，在空白纳米凝胶内部负载三个浓度的CORM401(空白纳米凝胶与CORM401的质量比分别为7:3、3:2、1:1)，将CORM401溶解在甲醇溶液中，缓慢的滴加到含有空白纳米凝胶的甲醇溶液中，之后将混合溶液超声5min后搅拌0.5h，为了使疏水性CORM401更好的负载在空白纳米凝胶空腔内部，将混合溶液分散到水溶液中，搅拌4-6h，在水溶液中透析(透析时截留分子量为1000Da)，得到负载有CORM401的纳米凝胶CPs。
最后，通过静电吸附作用将带有负电荷的叶酸修饰的透明质酸包裹在带有正电荷纳米凝胶外围，将HA-EDA-FA水溶液缓慢加入到之前所得到的CPs水溶液中，搅拌4-8h，冷冻干燥得到纳米凝胶CPHs，所得到的空白纳米凝胶粒径保持在240-280nm之间。
结果如图1所示，三种纳米凝胶PDNs、CPs、CPHs具有良好的分散性指数，粒径尺寸保持在240-280nm之间，保证可以顺利被细胞吞噬。
实施例2
细胞外检测CO释放情况
为探究CO释放分子CORM401释放CO的条件，我们通过超声检测和CO气体检测仪检测CO释放情况。称取5mg纳米凝胶溶于2.5mL水溶液置于5mL离心管中，加入2.5mL不同浓度的H2O2(PBS，50μM，500μM，10mM)之后,置于室温2h后，通过超声成像观察CO气体是否产生。称取4mg纳米凝胶溶于2mL水溶液置于小玻璃瓶中，将小玻璃瓶置于密闭空间内，加入2mL不同浓度的H2O2(PBS，50μM，500μM，10mM)，以加入H2O2时的时间点为0分钟，每隔10分钟分别记录CO气体检测仪的示数(ppm)。
如图1所示，CO释放不仅H2O2浓度相关,还和孵育时间有关，即孵育时间越长，H2O2浓度越大，CO释放量越大。
实施例3
纳米凝胶在细胞内的吞噬与CO释放
为了追踪纳米凝胶在细胞内的吞噬情况，纳米凝胶标记cy5.5通过激光共聚焦显微镜显示红色荧光。将巨噬细胞接种在激光共聚焦培养皿中(4X105/皿)，孵育24h后，加入LPS(5μg/mL)诱导正常细胞向活化巨噬细胞转变，孵育24h，之后加入含有不同的纳米凝胶材料的培养基(CPs 100μg/mL、CPHs 150μg/mL、Control)400μL，孵育4h后加入细胞核染液Hoechst33342探针孵育30min，用PBS冲洗两次，在激光共聚焦显微镜下观察细胞状态。
如图2所示，正常巨噬细胞中有较少的纳米凝胶被吞噬，没有包裹靶向材料HA-EDA-FA、只包裹一种靶向材料HA和靶向受体被封闭的细胞仅有少量的纳米凝胶被吞噬，而含有双靶向材料的一组细胞具有很好的细胞吞噬效果。
实施例4
纳米凝胶在细胞内抗炎效果
探究纳米凝胶在细胞内的抗炎效果，本发明通过FL-CO-1和PdCl探针检测了细胞内CO释放情况、通过CellROXTM Deep Red探针检测了ROS、通过ROSGreenTM andAmplex Red探针检测了H2O2水平变化、通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测了细胞内炎性因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)水平的改变和细胞内血红素加氧酶(HO-1)的变化、JC-1MitoMP Detection Kit检测了细胞内线粒体膜电位的变化、及细胞内抗炎信号通路(p38 MAPK,NF-kB(p50/p65)和TLR-2)的变化。
如图3所示，在纳米凝胶处理过后，CPHs组细胞内CO浓度明显提高，而CPs组仅有少量CO释放出来，因为细胞内并不含有纳米凝胶，所以control组和LPS组没有发现明显的CO存在。与CO含量相对应的是，CPHs组细胞内ROS和H2O2水平显著降低与正常细胞水平相似，而CPs组细胞内ROS和H2O2浓度与活化巨噬细胞相比仅有小幅度降低。
如图4-6所示，在纳米凝胶处理过后，CPHs组细胞炎性因子TNF-α，IL-1β，IL-6明显降低，炎性信号通路p38 MAPK,NF-kB(p50/p65表达下调，这预示着CPHs组有优异的抗炎性能；同时细胞内线粒体膜电位下降，ATP生成降低，最终导致活化巨噬细胞活性降低。而CPs组与CPHs组相比，抗炎性能及抑制活化巨噬细胞性能都远不如后者。在实验过程中分别加入了地塞米松组(Dex-p)，地塞米松作为临床中治疗骨关节炎的一类常见药物，与本发明的纳米凝胶进行对比，检验纳米凝胶的抗炎性能，结果如图4-6所示，地塞米松组虽然具有良好的抗炎效果，但是与CPHs相比还存在一定差异。
实施例5
动物实验
大鼠骨关节炎模型构建如下；
在正常大鼠右腿关节处注射碘乙酸钠(MIA，5mg溶于50μL生理盐水)诱导大鼠产生骨关节炎，经过3天的诱导，可以看到关节处有明显的肿胀发生，随机将大鼠分为以下几组：
1)正常对照组
2)OA组
3)Dex-p组(Dex-p浓度2mg/mL)
4)CPs(材料浓度1mg/mL)
5)CPH-1(材料浓度1mg/mL)
6)CPH-2(材料浓度1.5mg/mL)
7)CPH-3(材料浓度2mg/mL)
治疗期间为期23天，每四天注射一次，每组均在关节局部注射100μL不同的材料，正常组和OA组不做处理，每次注射后对老鼠称量体重，观测体重变化。第23天，在老鼠关节周围注射L-012探针，观察关节周围ROS的含量。之后，处死老鼠，取出关节标本，一部分标本用多聚甲醛固定3天，期间通过Micro-CT观测关节软骨表面降解情况，三天之后用5％的硝酸溶液脱钙处理24h，将标本进行脱水处理、修剪、包埋、切片处理后进行H&E染色和番红固绿染色；另一部分标本用10％NP40进行裂解，之后离心(10000×g，15min，4℃)取上清，通过ELISA检测关节部位周围炎性因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)的表达。
动物实验结果如图7-9所示：
图9为治疗流程图和关节周围ROS浓度的改变，如图所示，CPH-1，CPH-2，CPH-3组关节部位荧光强度较其他几组有明显降低，且三组内部没有差异。
图8为Micro-CT三维图和正视图、侧视图，如图所示，CPH-1，CPH-2，CPH-3三组关节软骨表面光滑，无明显降解情况，情况和正常组织差不多。而Dex-p组和CPs组由于无法将药物递送至炎症部位发挥治疗作用，因此CPs组和Dex-p组关节软骨降解严重。同时，通过软件分析Micro-CT图得到几组标本的BV/TV(骨体积/总体积)，Tb.S(骨小梁间隙)和Tb.Pf(骨小梁模式因子)。BV/TV可以直接反映骨量的变化。Tb.S是指骨小梁之间髓腔的平均宽度，其值的增加意味着可能发生骨吸收和骨质疏松。此外,Tb.Pf测量凸凹小梁骨的程度，Tb.Pf值表示骨小梁从杆到板的变化。当骨质疏松症发生时，Tb.Pf值会增加。在图8a中，OA组、Dex-p组、CPs组关节软骨明显出现降解情况，而CPHs处理有效抑制了关节软骨的退化。如图8b所示，与正常组和CPHs组相比，OA组、Dex-p组和CPs组BV/TV明显下调、Tb.S显著增加。在OA组、Dex-p组和CPs组中观察到的Tb.Pf值(图8d)进一步证实了三种治疗方式可能导致了严重的骨质疏松。此外，值得注意的是，三种浓度的CPHs处理对Tb.S和Tb.Pf没有影响。综上所述，Micro-CT结果明确证实了CPHs在OA治疗中的高效抗炎活性。
作为骨性关节炎的一个特征，关节软骨的逐渐破坏是由ECM的逐渐丧失引起的。因此，本发明在这里进一步进行H&E和番红固绿染色，以评估关节软骨的降解和ECM的损失。如图9a所示，在关节软骨内，正常对照组软骨表面整齐光滑(H&E染色)，蛋白多糖(番红固绿染色)均匀分布。而OA组、Dex-p组和CPs组的软骨表面极为不规则，蛋白多糖在ECM中的分布也不均匀，这表面出骨关节炎的改变进展。值得注意的是，经过CPHs处理后，关节表面光滑完整且大部分关节软骨有较好的蛋白多糖表达，这证明软骨ECM未被降解。
图9为组织部位炎性因子的表达情况。通过有效抑制OA关节内促炎因子的表达，进一步证实了CPHs具有高度的抗炎活性。如图9所示与OA组相比CPH-1，CPH-2，CPH-3组关节部位的TNF-α，IL-1β，IL-6表达水平都显著的降低，这些结果与之前的结果一致。
综上所述，本发明的纳米凝胶药物载体，以树状多肽纳米凝胶为载体，通过静电吸附靶向配体和物理包裹CORM401，构建了一种可特异性靶向活化巨噬细胞、且能可控负载CORM401的多功能纳米载药系统。树状多肽纳米凝胶是一种兼具纳米凝胶和树状多肽所有优点于一体的新型功能高分子材料，如具备了纳米凝胶稳定性高，可同时负载亲/疏水性药物且负载量高，细胞摄取率高，药物生物利用度高等诸多优点；具备了树状多肽优异的生物相容性，生物降解性，水溶性和耐蛋白酶水解等独特性能，此外，还可为静电吸附靶向配体和物理包裹药物提供丰富的外围基团和内部空腔。我们在本发明中，将树状多肽纳米凝胶作为理想递送载体，用于可控负载CORM401。此外，为实现对活化巨噬细胞的特异性靶向，我们在纳米凝胶表面还进一步静电包覆了叶酸修饰的透明质酸。活化巨噬细胞表面会同时过度表达叶酸受体和CD44受体，因此，将其对应的配体(叶酸和透明质酸)同时结合到纳米凝胶表面则有望实现对活化巨噬细胞的特异性靶向。
为证明叶酸/透明质酸双靶向配体对活化巨噬细胞的靶向作用、证明CORM401在活化巨噬细胞内响应释放CO，消耗H2O2和抑制ROS的生成能力，以及CO的抗炎潜力，本发明首先成功合成了以多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)为核、赖氨酸为分枝单元的树状多肽，并通过双硫键交联策略构建了树状多肽纳米凝胶，通过调控CORM401的投入量实现了对CORM401的可控负载；以及通过静电吸附作用，在纳米凝胶表面成功包覆了叶酸修饰的透明质酸，形成靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体。
结合以上实施例以及动物试验，我们系统评价了该多功能递送系统对活化巨噬细胞的靶向作用、在活化巨噬细胞内响应释放CO、消耗H2O2和抑制ROS的生成能力，以及抑制活化巨噬细胞分泌炎性因子的能力。最后，我们通过局部注射的方式，进一步验证和评价该多功能递送系统在骨关节炎部位的抗炎性能。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims (12)

1.一种靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体，其特征在于，所述纳米凝胶药物载体为树状多肽纳米凝胶药物载体，包括作为载体的树状多肽纳米凝胶以及在树状多肽纳米凝胶的内部空腔负载的一氧化碳释放分子CORM401，还包括在树状多肽纳米凝胶的表面包裹的通过叶酸修饰的透明质酸。
2.根据权利要求1所述的靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体，其特征在于，所述纳米凝胶的粒径控制在240-290nm。
3.根据权利要求1所述的靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体，其特征在于，所述叶酸修饰的透明质酸材料中，叶酸在透明质酸链上的接枝率为3.9％。
4.根据权利要求1所述的靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体，其特征在于，所述叶酸修饰的透明质酸通过静电吸附作用在纳米凝胶外围。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体，其特征在于，所述纳米凝胶为以多面体低聚倍半硅氧烷POSS为核的三代赖氨酸树状高分子为分支单元POSS-G3-Lys，并通过交联剂3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯进行交联得到空白纳米凝胶PDNs。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1、将以多面体低聚倍半硅氧烷POSS为核的三代赖氨酸树状高分子POSS-G3-Lys与交联剂3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺)酯(DSP)交联成空白纳米凝胶PDNs；
步骤2、将CORM401与含有PDNs空白纳米凝胶材料在溶液中混合，透析去除未包裹的CORM401，冷冻干燥得到CORM401@PDNs纳米凝胶；
步骤3、利用静电吸附的方式，将得到的CPs纳米凝胶与叶酸修饰的透明质酸HA-EDA-FA在水溶液中进行包裹，冷冻干燥得到CPHs纳米凝胶。
7.根据权利要求6所述的靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤1的具体实现包括：
在DMF溶液中溶解交联剂后逐滴滴入含有POSS-G3-Lys材料的甲醇溶液中，POSS-G3-Lys与交联剂摩尔比为1:2，室温搅拌8-12h，通过透析袋透析去除没有反应的交联剂和POSS-G3-Lys，冷冻干燥得到空白凝胶材料PDNs。
8.根据权利要求6所述的靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2的具体实现包括：
将CORM401溶解在甲醇溶液中后滴入含有PDNs空白纳米凝胶材料的甲醇溶液中，超声搅拌均匀后分散到水溶液中，透析去除未包裹入空白材料的CORM401，冷冻干燥得到CORM401@PDNs纳米凝胶。
9.根据权利要求6所述的靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体的制备方法，其特征在于，在所述步骤3中，利用物理吸附的方式，将得到的CORM401@PDNs纳米凝胶溶解在水溶液中，将合成的叶酸修饰的透明质酸HA-EDA-FA溶解在水溶液后滴入纳米凝胶水溶液中，搅拌8-12h，冷冻干燥得到CPHs纳米凝胶。
10.根据权利要求6所述的靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体的制备方法，其特征在于，在各个透析过程中，透析袋截留分子量1000Da。
11.根据权利要求6所述的靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体的制备方法，其特征在于，将叶酸和催化剂EDC,HOBt按照摩尔比1:8:8的比例加入到DMSO溶液中,避光搅拌1h，与透明质酸水溶液混合后，加入EDA黑暗中搅拌48h，透析除去杂质，冷冻干燥得到HA-EDA-FA。
12.一种根据权利要求1-5中任意一项所述的靶向递送并消耗大量H2O2的同时释放CO的纳米凝胶药物载体在制备关节炎药物中的应用。
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