CN113278092B - 一种聚合物载体材料及其制剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种聚合物载体材料及其制剂和应用。本发明所述聚合物载体材料，其以3,3’‑二硫代二丙酸作为连接臂将姜黄素连接到壳寡糖的骨架上，所述聚合物载体材料的结构如式I所示：
Figure DDA0003081013890000011
其中，n≥2。在本发明的设计中，姜黄素作为载体材料的一部分，形成疏水腔用于亲脂性化疗药物多烯紫杉醇的负载，同时由其参与构成的聚合物结构具有抗肿瘤作用，可以增强多烯紫杉醇的化疗敏感性。亲水端壳寡糖一方面起到长循环的作用，另一方面其可增加药物穿过血脑屏障的能力。二硫键作为还原敏感的连接臂的引入使得聚合物纳米粒能够在肿瘤细胞内高还原状态下发生断裂，实现化疗药物在肿瘤部位的高效释放。

Description

一种聚合物载体材料及其制剂和应用
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种聚合物载体材料及其制剂和 应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本申请的总体背景的理 解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一 般技术人员所公知的现有技术。
胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，占原发性恶性脑肿瘤的70％，由 于生长迅速、侵袭性强以及高度异质性，脑胶质瘤治愈率较低，复发率高， 是当前致死率最高的肿瘤之一。目前手术治疗、放射治疗及化学治疗共同 构成了胶质瘤综合治疗体系，尽管如此其5年生存率仍不到5％。手术目 前仍是脑胶质瘤的治疗的主要手段，但由于胶质瘤呈侵袭性生长，手术难 以全部切除，术后易复发，因此常需联合化学治疗。化学治疗由于血脑屏 障的存在所需药物剂量大，伴随严重的全身毒副反应。并且由于传统化疗 药物本身的疏水性、不稳定性以及单一药物化疗易产生耐药性等的限制， 其化疗效果不足以让人满意。
多烯紫杉醇是利用从欧洲红豆杉中提取的非细胞毒性前体化合物经 过进一步的结构修饰得到的具有细胞毒性的半合成紫杉烷类衍生物。作为 广谱抗癌药物，多烯紫杉醇对多种癌症都有一定的治疗作用，如非小细胞 肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等。研究表明局部注射多烯紫杉 醇对脑胶质瘤表现出显著的活性。多烯紫杉醇的抗肿瘤作用机制和紫杉醇 类似，均为通过稳固胞质中的微管蛋白并诱导形成微管束，抑制其解聚， 从而干扰肿瘤细胞有丝分裂和增殖，进而达到抗肿瘤的效果。多烯紫杉醇 溶解度为4μg/mL，目前在临床上使用的泰素帝
Figure BDA0003081013870000011
仍需要添加 非离子型表面活性剂吐温80作为增溶剂，并配以13％乙醇溶液溶解。由 于添加的乙醇及吐温80等辅料容易导致红细胞溶血和明显的过敏反应等 毒副作用，严重限制了多烯紫杉醇的使用。此外，因为缺少肿瘤靶向性，单纯多西紫杉醇药物溶液静脉注射进行系统性给药容易对正常组织造成 损伤。以及，虽然多烯紫杉醇是常见的肿瘤化疗药物，但因血脑屏障(BBB) 的存在，其不能进入脑内，对胶质瘤无明显疗效，只能局部使用，但局部 使用往往带有创伤而且有毒性。
发明内容
为了改善现有技术的不足，本申请提供了一种聚合物载体材料及其制 剂和应用。本发明以含二硫键(-SS-)的3,3’-二硫代二丙酸作为连接臂，将 单端羧化后的姜黄素作为材料结构的一部分通过酰胺化反应接枝到壳寡糖 的骨架上，得到具有还原敏感的两亲性聚合物载体材料。并且进一步将该 聚合物载体材料用作药物载体或用于构建药物递送系统，尤其将其用于制 备载多烯紫杉醇的药物制剂，该制剂在体内具有较长的循环时间、可突破 血脑屏障，具有肿瘤靶向性可在肿瘤微环境内富集，并且在肿瘤微环境内 高效释药，具有显著增强的抑制脑胶质瘤的效果。
具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个 的结合构成本发明的技术方案。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种聚合物载体材料，其以3,3’- 二硫代二丙酸作为连接臂将姜黄素连接到壳寡糖的骨架上，所述聚合物载体 材料的结构如式I所示：
Figure BDA0003081013870000021
其中，n≥2，优选地，n为2-30。
姜黄素是一种从姜科植物郁金、姜黄等的根茎中提取到的生物活性药 物，属于天然多酚类化合物。已有研究证实姜黄素具有多种生理活性及药理 作用，包括抗炎、抗氧化、抑菌、抗病毒、抗动脉粥样硬化、保肝保肾、抑 制血管生成等。因此，姜黄素通常是作为药物活性成分使用，但由于其水溶 性差且在光照和碱性环境中不稳定，通常被制成脂质体、纳米粒、β-环糊精 包合物、微球、微乳等注射剂，将姜黄素包裹在其内，以提高姜黄素类化合物的生物利用度和药物稳定性。然而不同于常规的，本申请以姜黄素作为载 体材料结构的一部分，将姜黄素结构整体构建到聚合物材料的骨架结构中形 成疏水腔，用于负载亲脂性药物，比如多烯紫杉醇，作为载体材料使用，同 时含有姜黄素结构的聚合物载体材料本身也具备了抗肿瘤活性。
在本发明的第二方面，本发明提供了制备上述第一方面中所述的聚合物 载体材料的方法，其包括：将3,3’-二硫代二丙酸分子内脱水得到的酸酐与姜 黄素进行酯化反应得到单端羧化姜黄素，将单端羧化姜黄素通过酰胺化反应 连接到壳寡糖的骨架上，即得。
在一些具体的实施方式中，3,3’-二硫代二丙酸在乙酰氯存在下，分子内 脱水生成3,3’-二硫代二丙酸酐(DTDPA)；在4-二甲氨基吡啶(DMAP)的 催化下，姜黄素的一端羟基和3,3’-二硫代二丙酸酐发生酯化反应生成中间产 物还原敏感的单端羧化姜黄素(CUR-ss-COOH)；在1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)的催化下，将单端羧 化姜黄素通过酰胺键连接到壳寡糖的氨基上，合成具有还原敏感性的聚合物 壳寡糖-ss-姜黄素(CSO-ss-CUR)，其结构如式I所示，其中，n≥2，优选n 为2-30。本发明的所述聚合物载体材料的合成路线可如图1所示。
在本发明的第三方面，本发明提供了上述第一方面中所述的聚合物载体 材料在制备药物载体或药物递送系统中的应用。
如前文中所述的，本申请的聚合物载体材料壳寡糖-ss-姜黄素 (CSO-ss-CUR)具有两亲性，其中，姜黄素作为载体材料结构的一部分形 成疏水腔能够负载亲脂性药物。因此，在本发明的第四方面，本发明还提供 了一种空白药物载体，其由上述第一方面中所述的聚合物载体材料制备得 到。
并且，本发明提供了制备所述空白药物载体的方法，其包括：将聚合物 载体材料壳寡糖-ss-姜黄素(CSO-ss-CUR)分散在溶剂中，超声，聚合物载 体材料自组装形成纳米粒，自组装形成的纳米粒即为空白药物载体。
进一步地，在这些实施方式中，超声后经过滤、冷冻干燥可获得所述空 白药物载体。在本发明的一些实施方式中，所述溶剂为磷酸盐缓冲液(PBS) 溶液。具体地，在一些实施方式中，所述空白药物载体的制备方法包括：将 聚合物载体材料壳寡糖-ss-姜黄素分散在pH＝7.4的PBS中，避光搅拌使完全 溶解。将该溶液超声后，经0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥，即得。
在本发明的第五方面，本申请提供了一种药物制剂或药物递送系统，其 包含上述第一方面中所述的聚合物载体材料或上述第四方面中所述的空白 药物载体和至少一种药物。所述药物为疏水性药物，在本发明优选的实施方 式中，所述药物为多烯紫杉醇。
在本发明的第六方面，本申请提供了一种制备上述第五方面所述的药物 制剂或药物递送系统的方法，其包括：将所述至少一种药物与本发明上述第 一方面中所述的聚合物载体材料或上述第四方面中所述的空白药物载体混 合，超声。
进一步地，在本发明的实施方式中，超声后透析离心可分离得到所述药 物制剂或药物递送系统，以及，可经冷冻干燥进行保存。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为多烯紫杉醇时，所述制备方法 包括：将多烯紫杉醇溶解后滴加至溶解的聚合物载体材料或空白药物载体 中，避光搅拌后超声，透析离心过滤后冷冻干燥，即得载多烯紫杉醇的聚合 物纳米粒。
比如，所述多烯紫杉醇的溶剂可选用二甲基亚砜，所述聚合物载体材料 或空白药物载体的溶剂为水。
具体地，所述药物为多烯紫杉醇时，所述药物制剂为多烯紫杉醇制剂或 者多烯紫杉醇递送系统，其制备方法包括：将壳寡糖-ss-姜黄素溶于去离子 水中，室温下避光搅拌使其完全溶解。取多烯紫杉醇加入二甲亚砜(DMSO) 使完全溶解。将多烯紫杉醇的DMSO溶液在搅拌条件下缓慢滴加到壳寡糖 -ss-姜黄素的水溶液中，避光搅拌后超声。将混合溶液置于2000kDa的透析 袋中对蒸馏水透析，除去DMSO。透析结束后透析液转移至离心管中，离心， 上清液过0.8μm滤膜。冷冻干燥，即得。
发明人在研究中发现，多烯紫杉醇与壳寡糖-ss-姜黄素的投料比会影响 药物的载药量和包封率，在本发明的一些实施方式中，多烯紫杉醇与壳寡糖 -ss-姜黄素的投加质量比为1-3:10。在该投量比下，多烯紫杉醇的载药量可 达10％左右，最低不低于2％，包封率均高于30％。本发明的药物制剂或药 物递送系统具有良好的药物装载能力。
在本发明的第七方面，本发明提供了上述第一方面中所述的聚合物载体 材料或上述第四方面所述的空白药物载体或上述第五方面所述的药物制剂 或药物递送系统在制备治疗抗肿瘤的药物中的应用。
尤其是，所述药物为多烯紫杉醇时，所述肿瘤为脑胶质瘤。
相较于现有技术，本发明的优势在于：
本发明通过二硫键将亲水性材料壳寡糖和疏水性小分子药物姜黄素 偶联形成两亲性聚合物载体材料，并通过聚合物材料在水中的自组装包载 模型药物多烯紫杉醇。其中，疏水端小分子药物姜黄素作为载体材料的一 部分，形成疏水腔用于亲脂性化疗药物多烯紫杉醇的负载，同时聚合物载 体材料本身具有抗肿瘤作用，可以增强多烯紫杉醇的化疗敏感性。此外， 本发明提供的药物制剂能够起到长循环的作用，并且可以突破血脑屏障，可在肿瘤微环境内富集，并且在肿瘤微环境的高还原状态下发生聚合物的 断裂，聚合物载体结构破坏后实现药物在肿瘤部位的高效释放，能够较好 的抑制肿瘤。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解， 本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不 当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1为壳寡糖-ss-姜黄素的合成示意图。
图2为多烯紫杉醇/壳寡糖-ss-姜黄素纳米粒的粒径分布。
图3为多烯紫杉醇/壳寡糖-ss-姜黄素纳米粒的Zeta电位。
图4为多烯紫杉醇/壳寡糖-ss-姜黄素纳米粒的透射电镜图像。
图5为不同DTT条件下孵育24h的壳寡糖-ss-姜黄素纳米粒的粒径分 布变化。
图6为不同制剂在不同释放条件下的释放曲线。
图7示出了壳寡糖-ss-姜黄素纳米粒的溶血毒性实验结果。
图8示出了不同时间处理后C6细胞对游离香豆素6和载香豆素-6的壳 寡糖-ss-姜黄素纳米粒的摄取结果。
图9示出了给药后荷瘤小鼠主要器官的H&E染色结果(标尺：200μm)。
图10为小鼠尾静脉注射不同制剂后体内的实时荧光图像。
图11为本发明的技术原理图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用 于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件 的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员 所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获 得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使 用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法 及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示 范之用。
本发明中所涉及的名称及其缩写示意：
Figure BDA0003081013870000061
Figure BDA0003081013870000071
实验材料：3,3’-二硫代二丙酸(DTDP，上海毕得医药科技有限公司)； 姜黄素(CUR，阿法埃莎(中国)化学有限公司)；壳寡糖(CSO，MW＝5000 Da，南通飞宇生物科技有限公司)；4-二甲氨基吡啶(DMAP)、无水二甲基 亚砜、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二 酰亚胺(NHS)、戊二酸酐(GA)(阿拉丁试剂(上海)有限公司)；超干四 氢呋喃(北京伊诺凯科技有限公司)；乙醚、三乙胺、乙酸乙酯、乙酰氯、 丙酮(国药集团化学试剂有限公司)；二氯甲烷、甲醇(天津市富宇精细化 工有限公司)；氘代试剂(上海麦克林生化科技有限公司)；氮气(德洋特种 气体有限公司)。
实施例1壳寡糖-姜黄素聚合物的合成
第一步，3,3’-二硫代二丙酸在乙酰氯(DTDP)存在下，分子内脱水生 成3,3’-二硫代二丙酸酐(DTDPA)。
称取DTDP 0.5003g于25mL干燥圆底烧瓶中，加入3mL乙酰氯溶解， 70℃条件下回流反应4h。反应结束后旋转蒸发除去未反应的乙酰氯，加入 过量的冰乙醚，超声分散，冰浴条件下搅拌，抽滤除去溶于乙醚的未反应的 乙酰氯和DTDP，得到淡黄色固体，放置于真空干燥箱过夜，得产物DTDPA。
第二步，在4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下，姜黄素(CUR)的一 端羟基和3,3’-二硫代二丙酸酐(DTDPA)发生酯化反应生成中间产物还原 敏感的单端羧化姜黄素(CUR-ss-COOH)。
精确称取0.1608g已纯化的CUR粉末(0.44mmol)和0.020g DMAP (0.16mmol)置于25mL圆底烧瓶中，加入5mL无水四氢呋喃溶解，然后 加入200μL三乙胺，避光搅拌15min。精密称取0.0955g DTDPA(0.50mmol) 溶于1.5mL无水四氢呋喃，然后缓慢滴入上述溶液中，氮气保护条件下70℃ 避光反应24h。反应结束后，旋转蒸发除去有机溶剂，得到深红色油状液体。 加入10mL乙酸乙酯和5mL pH 4.0的盐酸溶液分散，收集有机层，水层用 10mL乙酸乙酯萃取三次，旋转蒸发除去乙酸乙酯。粗产物采用硅胶柱层析 方法进行分离提纯，二氯甲烷/甲醇为洗脱剂(CH2Cl2：CH3OH＝500：1-150： 1)进行梯度洗脱，得到深红色CUR-ss-COOH产物。
第三步，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二 酰亚胺(EDC/NHS)的催化下，将单端羧化姜黄素通过酰胺键连接到壳寡糖 (CSO)的氨基上，从而合成了还原敏感的聚合物壳寡糖-ss-姜黄素 (CSO-ss-CUR)，合成路线如图1所示。
称取50mg单端羧化姜黄素(CUR-ss-COOH)于西林瓶中，加入5mL 无水DMSO溶解，然后加入一定量的EDC，室温下搅拌1h后，加入NHS， 继续搅拌活化3h。称取一定量的壳寡糖CSO于25mL圆底烧瓶中，加入5 mL的去离子水溶解，然后加入5mL DMSO稀释。将活化后形成的活性酯 溶液在快速搅拌下缓慢滴加到壳寡糖溶液中，室温下反应24h，得到反应物 溶液。将反应物溶液置于2000kDa的透析袋中，先对DMSO透析24h以除 去游离的小分子，然后对蒸馏水透析72h除去有机溶剂，冷冻干燥得到终产 物。
实施例2空白聚合物纳米粒的制备
选择探头超声法制备空白聚合物纳米粒。即称取4mg聚合物壳寡糖-ss- 姜黄素(实施例1制备)分散在4mL pH＝7.4的PBS中(1％,w/w)，避光搅 拌30min使完全溶解。将聚合物溶液置于探头超声下100W超声10min (2s/2s)后，经0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥，备用。
实施例3载多烯紫杉醇的聚合物纳米粒的制备
选择改良的透析-超声法进行载多烯紫杉醇纳米粒的制备。精密称取10 mg壳寡糖-ss-姜黄素，溶于5mL去离子水中，室温下避光搅拌30min使其 完全溶解。精密称取适量多烯紫杉醇(用量考察表1)，加入1mLDMSO使 完全溶解。将多烯紫杉醇的DMSO溶液在搅拌条件下缓慢滴加到壳寡糖-ss- 姜黄素的水溶液中，避光搅拌4h后于探头超声30min(100w，2s/2s)。将 混合溶液置于2000kDa的透析袋中对蒸馏水透析24h，除去DMSO。透析 结束后透析液转移至离心管中，3500r/min离心10min，上清液过0.8μm滤 膜。冷冻干燥，备用。
为了获得高载药量的载药纳米粒，考察了制备过程中不同多烯紫杉醇/ 聚合物的投料比对纳米粒载药量和包封率的影响，结果如表1所示。随着多 烯紫杉醇的投料量的不断增加，载药量呈现不断升高的趋势。当多烯紫杉醇 /壳寡糖-ss-姜黄素从1：10增加到3：10时，载药量从2.13±0.54％增加到了 8.96±0.56％，表明该纳米载药系统具有较好的药物装载能力。而包封率呈现 先增大后减小的趋势，当多烯紫杉醇/壳寡糖-ss-姜黄素从1：10增加到2： 10时，包封率从33.63±1.21％增大到40.27±4.00％；而当多烯紫杉醇/壳寡糖 -ss-姜黄素从2:10增加到3：10时，包封率又从40.27±4.00％下降至 35.23±3.26％。包封率的降低可能时由于多烯紫杉醇投料量过大超过聚合物 的最大负载能力所致。
表1不同多烯紫杉醇的投料量对多烯紫杉醇/壳寡糖-ss-姜黄素纳米粒 载药量和包封率的影响(n＝3)
Figure BDA0003081013870000091
粒径和电位：将按制备得到的纳米粒溶液稀释成适当倍数，利用动态激 光粒度分析仪(DLS)测定其粒径分布、多分散系数(PDI)和Zeta电位。 (见图2、图3)。说明粒径大小分布均一，稳定性良好。
形态：将制备得到的纳米粒溶液稀释成适当倍数，用覆有碳膜的铜网沾 取，自然晾干后用2％(w/v)的磷钨酸溶液染色，滤纸吸去多余液体，干燥 后用透射电镜(TEM)观察纳米粒的外形，见图4。结果表明聚合物自组装 形成了具有均匀球形的纳米粒，粒径大小均一，分散性良好，无明显聚集。
还原敏感性考察：考察还原条件下纳米粒的粒径分布变化以验证其还原 敏感性。取一定量的空白壳寡糖-ss-姜黄素纳米粒溶液，分别加入10mM的 DTT，在37℃，100r/min转速的恒温振荡器中孵育12h和24h后，利用 DLS测定其粒径分布的变化，见图5。
实验例1载多烯紫杉醇聚合物纳米粒的体外释放行为考察
利用动态膜透析法评价载多烯紫杉醇聚合物纳米粒在不同释放介质中 的释放行为，释放介质为含0.5％Tween 80的pH＝7.4的PBS缓冲液。精密 量取制备的多烯紫杉醇/壳寡糖-ss-姜黄素(DTX/CSO-ss-CUR)和非还原敏 感的聚合物多烯紫杉醇/壳寡糖-cc-姜黄素(DTX/CSO-cc-CUR)纳米粒溶液 (含30μg多烯紫杉醇)加入透析袋(MW 2000kDa)中，扎紧透析袋两端， 将其置于25mL含不同浓度DTT的释放介质中(释放介质：含0.5％Tween 80 的pH 7.4的PBS溶液)，使释放介质完全没过透析袋。将装有样品的离心管 放置于37℃，100r/min恒温振荡器中孵育。在给定的时间点，从离心管中 取出0.5mL的释放介质，并重新补加等体积的空白释放介质。取出的样品 用0.22μm的微孔滤膜过滤，HPLC测定多烯紫杉醇的含量，进而计算累积 释放率见图6。
实验例2溶血实验
取健康家兔全血于润过肝素的离心管中，3000r/min离心10min，弃去 上层血浆，加入适量生理盐水混匀，相同条件再次离心。重复上述操作三次， 直至上清液无色，得到堆积的红细胞。移取1mL红细胞于50mL容量瓶中， 用生理盐水稀释至刻度，制得浓度2％的红细胞悬液，备用。配制5mg/mL 的纳米粒溶液，按表2的实验设计方案，用生理盐水配制成浓度为1.0、0.75、 0.5、0.25、0.1mg/mL的纳米粒溶液，蒸馏水组和生理盐水组分别作为阳性和阴性对照。将样品试管置于37℃水浴孵育1h后，3000r/min离心10min， 取上清液，以相应纳米粒溶液作为参比，用紫外分光光度计在541nm处测 吸光度值，根据以下公式进行溶血率的计算：
Figure BDA0003081013870000101
其中，Asample、Anegative和Apositive分别代表待测样品组、生理盐水组和蒸 馏水组的吸光度值。
表2溶血实验方案
Figure BDA0003081013870000111
纳米粒的溶血率是考察其生物利用安全性的一个重要指标，决定了其是 否可通过静脉注射的方式进行给药，以发挥其治疗作用通常要求静脉注射制 剂的溶血率要低于5％。如表3和图7所示，壳寡糖-ss-姜黄素纳米粒的溶血 率在0.1-1mg/mL的范围内，始终小于5％，满足静脉注射制剂的溶血率要 求，说明该纳米粒对红细胞无明显的作用，具有良好的生物体内应用潜力。
表3溶血实验结果(n＝3)
Figure BDA0003081013870000112
实验例3细胞摄取
将C6细胞以1×105个/孔的细胞密度接种于12孔板中，孵育过夜使其充 分贴壁。分别加入游离的香豆素6溶液(2μg/mL)和壳寡糖-ss-姜黄素溶液 (含香豆素2μg/mL)各1mL,将细胞分别孵育2h、4h后，向每孔中加入 4％的多聚甲醛，4℃下固定10min。PBS洗三次后向每孔中加入150μL的 DAPI染色液，室温放置3-5min。吸弃DAPI染色液，用PBS洗涤细胞2-3 次。将细胞置于荧光倒置显微镜进行拍摄，见图8。结果表明，和游离的香 豆素-6相比，2h和4h之后，香豆素-6/壳寡糖-ss-姜黄素纳米粒处理后的C6 细胞中有更高的荧光强度，说明C6细胞对载香豆素-6的壳寡糖-ss-姜黄素纳 米粒摄取效率更高，表明壳寡糖-ss-姜黄素纳米粒具有良好的细胞穿透能力， 并能在较短时间内被细胞摄取，结果表明将药物包封于纳米粒中能够使其更 多浓集于病变细胞，是提高抗肿瘤效果的重要原因。
实验例4体内抑瘤评价
取对数生长期鼠C6脑胶质瘤细胞消化，离心弃去原有培养基，PBS洗 2-3次以除去残留血清。细胞计数后加入PBS重悬，得到浓度为2×106个/mL 的细胞悬液。将0.1mL的细胞悬液通过皮下注射到Balb/c雌性小鼠腋下， 定期观察肿瘤的生长情况，并用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤 的体积，当肿瘤体积大小约为100mm3时，选取肿瘤大小均一，生长状况良 好的小鼠35只，随机分成7组(每组5只)，分别为生理盐水组、
Figure BDA0003081013870000121
组、姜黄素组(Cur)、姜黄素+
Figure BDA0003081013870000122
组(Cur+DTX)、壳寡糖-ss-姜黄素 组(CSO-ss-CUR)、多烯紫杉醇/壳寡糖-ss-姜黄素组(DTX/CSO-ss-CUR) 以及多烯紫杉醇/壳寡糖-cc-姜黄素组(DTX/CSO-cc-CUR)。首次给药时间记 为0天，每3天尾静脉注射相应处方量的药物一次，连续给药4次。记录小 鼠的体重变化，并用游标卡尺量取肿瘤的长、短径变化，计算肿瘤体积的变 化。给药结束后，脱颈处死小鼠，剖离肿瘤组织，比较肿瘤体积大小。分别 剥出各组小鼠的心、脑、肝、脾、肾等主要器官，利用4％的多聚甲醛溶液 固定，然后进行苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin，H&E)染色。
结果发现，和生理盐水组相比，各治疗组均呈现出一定的治疗效果。其 中，治疗3天后，多烯紫杉醇/壳寡糖-ss-姜黄素组和多烯紫杉醇/壳寡糖-cc- 姜黄素组肿瘤体积(分别为111.27mm3和122.05mm3)对比
Figure BDA0003081013870000123
组 (291.90mm3)肿瘤开始明显减小，在治疗6天后多烯紫杉醇/壳寡糖-ss-姜 黄素组肿瘤体积开始明显小于多烯紫杉醇/壳寡糖-cc-姜黄素组(分别为80.85 和148.85mm3)，这时
Figure BDA0003081013870000124
组(385.92mm3)肿瘤体积大于以上两组； 治疗12天后，多烯紫杉醇/壳寡糖-ss-姜黄素组肿瘤体积75.67mm3，与多烯 紫杉醇/壳寡糖-cc-姜黄素组和
Figure BDA0003081013870000125
组相比肿瘤体积明显减少(分别为 225.77和551.02mm3)。此外，壳寡糖-ss-姜黄素组也表现出了一定的抑瘤效 果，并且其抑瘤效果相较于姜黄素组、
Figure BDA0003081013870000126
组以及姜黄素+
Figure BDA0003081013870000127
组更为明显。
相比于
Figure BDA0003081013870000128
组，DTX/CSO-ss-CUR和DTX/CSO-cc-CUR制剂组的 肿瘤体积显著减小，说明两制剂组具有更好的抗肿瘤效果。这主要归因于纳 米粒在体内较长的循环时间、较高的血药浓度和肿瘤靶向性。此外， DTX/CSO-ss-CUR组的肿瘤体积小于DTX/CSO-cc-CUR组，说明前者的治 疗效果更好，这可能是因为在肿瘤部位存在较高的GSH浓度，使得DTX/CSO-ss-CUR能够更多的在肿瘤微环境中滞留，并在GSH作用下二硫 键能够快速断裂释放药物，具有更好的释药能力，体现了还原敏感纳米药物 载体递送药物的优势。
图9为荷瘤小鼠在给药12天后各组织的H&E染色结果，从图中可以看 到，与生理盐水组相比，多烯紫杉醇/壳寡糖-ss-姜黄素制剂组的主要脏器并 未出现明显的病理状态，说明纳米药物递送体系具有良好的生物相容性和安 全性。
实验例5体内组织分布
将Balb/c小鼠随机分成两组，即DIR组和DIR/壳寡糖-ss-姜黄素组，每 组平行5只，脱毛处理后分别尾静脉注射DIR和DIR/壳寡糖-ss-姜黄素。分 别于给药后1h、2h、4h将小鼠置于气麻装置中，完全麻醉后放置在IVIS kinetics活体成像仪下拍摄活体荧光照片。选择745nm为激发波长，ICG发 射通道，曝光时间为3s。在4h拍摄后脱颈处死小鼠，剖取其心、脑、肝、 脾、肾、肺，用PBS清洗3次以除去表面残留的血和组织粘连，置于活体成 像仪下拍摄离体组织荧光照片，数据经系统自带Living Image软件分析计算。
图10是游离DIR和DIR/壳寡糖-ss-姜黄素在体内的实时荧光分布图， 结果显示，DIR/壳寡糖-ss-姜黄素能够快速分布在脑组织及其他组织器官中， 而游离DIR在4h内仅在脑内短时间少量存在，证明壳寡糖-ss-姜黄素纳米 粒可经血液循环穿透血脑屏障，将药物递送于脑组织中。给药4h后处死老 鼠，剖离心、肝、脾、肺、肾、脑，荧光拍摄结果显示DIR/壳寡糖-ss-姜黄 素组的脑中的荧光仍然较强。
结果显示DIR/壳寡糖-ss-姜黄素在脑中的荧光强度高于游离DIR组，证 明壳寡糖-ss-姜黄素自组装形成的纳米粒能够穿过血脑屏障，使得药物更多 的富集在脑组织，发挥治疗作用。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管 参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来 说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中 部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何 修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种聚合物载体材料的制备方法，其特征在于，将3,3’-二硫代二丙酸分子内脱水得到的酸酐与姜黄素进行酯化反应得到单端羧化姜黄素，将单端羧化姜黄素通过酰胺化反应连接到壳寡糖的骨架上，即得；
所述聚合物载体材料，其以3,3’-二硫代二丙酸作为连接臂将姜黄素连接到壳寡糖的骨架上，所述聚合物载体材料的结构如式I所示：
其中，n=3。
2.权利要求1中所述的聚合物载体材料在制备药物载体或药物递送系统中的应用。
3.一种空白药物载体，其特征在于，由权利要求1中所述的聚合物载体材料制备得到。
4.根据权利要求3所述的空白药物载体，其特征在于，其制备方法包括：将权利要求1所述的聚合物载体材料分散在溶剂中，超声，聚合物载体材料自组装形成纳米粒，自组装形成的纳米粒即为空白药物载体；
所述溶剂为PBS溶液。
5.根据权利要求4所述的空白药物载体，其特征在于，所述超声后还经过滤、冷冻干燥，得到空白药物载体。
6.一种药物制剂或药物递送系统，其特征在于，包含权利要求1中所述的聚合物载体材料或权利要求3中所述的空白药物载体和至少一种药物；
所述药物为疏水性药物。
7.如权利要求6所述的药物制剂或药物递送系统，其特征在于，所述疏水性药物为多烯紫杉醇。
8.一种制备权利要求6中所述的药物制剂或药物递送系统的方法，其特征在于，将所述至少一种药物与权利要求1所述的聚合物载体材料或权利要求3所述的空白药物载体混合，超声；
超声后透析离心分离得到所述药物制剂或药物递送系统。
9.根据权利要求8所述的药物制剂或药物递送系统的方法，其特征在于，将得到的药物制剂或药物递送系统经冷冻干燥进行保存。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述药物为多烯紫杉醇，所述制备方法包括：将多烯紫杉醇溶解后滴加至溶解的所述聚合物载体材料或所述空白药物载体中，避光搅拌后超声，透析离心过滤后冷冻干燥，即得载多烯紫杉醇的聚合物纳米粒；
所述多烯紫杉醇的溶剂为二甲基亚砜，所述聚合物载体材料或空白药物载体的溶剂为水。
11.权利要求1所述的聚合物载体材料或权利要求3所述的空白药物载体或权利要求6所述的药物制剂或药物递送系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为脑胶质瘤。
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