CN113321812B - 一种聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸大分子化合物、载药系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学、药学、医学等多学科交叉领域，更具体地，涉及一种聚乳酸‑羟乙基淀粉‑叶酸大分子化合物、载药系统及其制备方法和应用。该大分子化合物由叶酸和聚乳酸分别通过酯键与羟乙基淀粉偶联得到；其具有式(一)所示的结构式：
Figure DDA0003093733260000011
实验证明以该大分子化合物为载体，包载抗癌药物CN的纳米载药体系能显著提升肿瘤靶向性，降低给药剂量，降低毒副作用，在血液环境中能够维持长时间的稳定，显著改善肿瘤免疫微环境，实现对肿瘤干细胞的清除，从而显著增强药物的抗肿瘤活性。

Description

一种聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸大分子化合物、载药系统及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学、药学、医学等多学科交叉领域，更具体地，涉及一种聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸大分子化合物、载药系统及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康最主要的因素。化疗是目前治疗肿瘤最有效的手段之一。许多常见的化疗药物虽然有一定的治疗效果，但目前上市的大量化疗药物仍存在着极大的缺陷。由于大多化疗药物为有机小分子其水溶性差，导致其生物利用度低。由于化疗药物在体内非特异的全身分布，导致其在杀伤肿瘤细胞的同时，也将大量正常细胞一同杀伤，产生严重的毒副作用。经过近几十年的科技发展，纳米载药系统成为了能够有效解决上述问题的有效手段之一。目前已有多种载药纳米制剂进入市场，另外还有大量纳米制剂处于临床研究及临床前研究阶段。
两亲性聚合物载药纳米系统是目前研究比较多的纳米载药系统之一。它能够提供一个疏水的核心增溶疏水性药物分子，同时其亲水的外壳能够降低蛋白吸附，减少网状内皮系统的吞噬清除作用，延长药物在体内的半衰期。其次，利用肿瘤组织高表达的某些受体，在两亲性聚合物载药纳米系统表面修饰其特异性的配体，可以显著地提高药物的肿瘤靶向性，降低全身性的毒副作用，增强抗肿瘤疗效。目前，聚乙二醇是在两亲性聚合物载药纳米系统中使用较多的亲水性分子，已有基于聚乙二醇的载药纳米制剂上市。但在临床使用过程中，大量研究发现，使用聚乙二醇做为亲水表面分子的载药纳米制剂，容易在患者体内诱导产生特异性清除该载药纳米系统的抗体，产生耐受。
利用天然来源的、生物相容性更好的羟乙基淀粉替代聚乙二醇有望能够解决上述问题。目前利用羟乙基淀粉作为亲水片段，制备两亲性载药纳米系统的报道甚少。本课题组前期报道了一种基于两亲性羟乙基淀粉偶联聚乳酸共聚物的纳米载药体系，能够实现载药纳米系统在体内血液系统的长时间循环，且不引起机体的免疫排斥反应，但其肿瘤靶向性较差，导致大量载药纳米粒在非肿瘤部位蓄积，从而产生一定的毒副作用和抗肿瘤活性的降低。
另一方面，现有的两亲性聚合物载药纳米系统虽然能够一定程度提高治疗效果，但是往往其用药剂量较大，而化疗药物公知在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有一定的较大的毒副作用，因此，如何在提高纳米载药系统肿瘤治疗效果的同时，降低药物用药剂量，是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸大分子化合物、载药系统及其制备方法和应用，实验证明基于该大分子化合物的纳米载药体系能显著提升肿瘤靶向性，降低给药剂量，降低毒副作用，在血液环境中能够维持长时间的稳定，显著改善肿瘤免疫微环境，实现对肿瘤干细胞的清除，从而显著增强药物的抗肿瘤活性，旨在解决现有技术纳米载药体系靶向性不高、药物剂量大、抗肿瘤活性不高、毒副作用大等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物，该大分子化合物为由叶酸和聚乳酸分别通过酯键与羟乙基淀粉偶联得到；其具有式(一)所示的结构式：
Figure GDA0003429188500000021
其中，聚乳酸的分子量为6～10KDa，羟乙基淀粉的分子量为100～150KDa；所述聚乳酸在羟乙基淀粉上的接枝率为0.5～1；所述叶酸在羟乙基淀粉上的接枝率为10～30。
优选地，所述聚乳酸在羟乙基淀粉上的接枝率为0.7～0.9；所述叶酸在羟乙基淀粉上的接枝率为15～25。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的大分子化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)使叶酸的羧基与羟乙基淀粉的羟基发生酯化反应，得到中间产物；
(2)将步骤(1)所述中间产物通过分离提纯后，将该中间产物的羟基与聚乳酸的羧基发生酯化反应，所得产物经分离提纯后得到所述大分子化合物。
优选地，步骤(1)具体为：将叶酸、羧基活化试剂以及缚酸剂混合，混合后溶于有机溶剂中，使叶酸结构式中的羧基与所述羧基活化试剂发生反应生成活化酯；然后将该活化酯与含有羟基的羟乙基淀粉发生取代反应，使得叶酸与该含有羟基的羟乙基淀粉通过酯键相连接，得到中间产物。
优选地，步骤(2)具体为：将聚乳酸、羧基活化试剂以及缚酸剂混合，混合后溶于有机溶剂中，使聚乳酸结构中含有的羧基发生取代反应转化生成活化酯；然后将该活化酯与步骤(1)所述中间产物发生取代反应，通过酯键相连接，得到所述大分子化合物。
优选地，所述羧基活化试剂为二环己基碳二亚胺或1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺；所述有机溶剂为二甲亚砜和/或四氢呋喃；所述缚酸剂为4-二甲氨基吡啶，吡啶和三乙胺中的一种或多种；所述聚乳酸、羟乙基淀粉与叶酸的投料摩尔比为(2～6):1:(10～30)。
优选地，所述聚乳酸、羟乙基淀粉与叶酸的投料摩尔比为(3～5):1:(15～25)。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的大分子化合物在制备纳米药物载药系统中的应用，该纳米药物载药系统用于制备治疗癌症的药物。
优选地，所述癌症为乳腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或黑色素瘤。
按照本发明的另一个方面，提供了一种基于所述的聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物的纳米载药系统，所述纳米载药系统包括所述的两亲性聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物和药物。
优选地，所述药物为基于喜树碱的二聚体化合物，该二聚体化合物具有如式(二)所示的结构：
Figure GDA0003429188500000041
式(二)中，x为1-4的整数，y为1-4的整数。
优选地，x为1-3的整数，y为1-3的整数。
优选地，该二聚体化合物结构式中，x＝2，y＝2。即该优选化合物的结构式如式(三)所示：
Figure GDA0003429188500000042
优选地，所述纳米载药系统中载药纳米粒的尺寸为100-200nm。
优选地，所述纳米载药系统载药量为1～15％。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物的纳米载药系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述的两亲性聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物溶解于水中，在冰浴下超声乳化，同时加入溶解有如式(二)所示的二聚体化合物的有机溶液，得到超声后的乳液；
(2)将步骤(1)得到的乳液减压蒸馏除去二氯甲烷，得到包载有所述二聚体化合物药物的基于两亲性聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物的纳米载药系统。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的纳米载药系统在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
优选地，所述癌症为乳腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或黑色素瘤。
按照本发明的另一个方面，提供了一种抗癌药物，包含所述的纳米载药系统和药学上可接受的添加剂。
优选地，所述抗癌药物，其剂型为注射剂、粉针剂、口服剂、喷雾剂、胶囊剂或栓剂。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提出了一种聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸大分子化合物，该大分子化合物通过酯键将叶酸、聚乳酸与羟乙基淀粉进行偶联，通过对该化合物进行体内外肿瘤靶向性评价，发现其对乳腺癌表现出良好的肿瘤靶向性，其能够快速更多地将药物递送至肿瘤组织，促进乳腺肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取，并在肿瘤胞内高还原性条件下快速释放出药物，发挥更好的肿瘤杀伤活性。
(2)本发明提供的基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸大分子化合物的纳米载药体系，显著降低了药物CN的毒性，在给药剂量为游离药物和非叶酸靶向载药体系的一半剂量的情况下，仍可取得与游离药物和非叶酸靶向载药体系相当的抗肿瘤活性，显著抑制乳腺癌肿瘤的瘤体积和瘤重。
(3)本发明提供的基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸大分子化合物的纳米载药体系，在相同的给药剂量下，显示出了比游离药物和非叶酸靶向载药体系更好的抗肿瘤活性，显著抑制乳腺癌的瘤体积和瘤重，显著抑制乳腺癌中肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，显著延长乳腺癌小鼠的生存期。
(4)本发明提供的基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸大分子化合物的纳米载药体系，能显著增强药物CN诱导产生免疫原性细胞死亡(ICD)和抑制吲哚胺-2,3-加氧酶(IDO)的活性，促进淋巴结树突状细胞(DC)的成熟，增加脾脏效应记忆T细胞的量，并维持较高的中心记忆T细胞，改善肿瘤微环境，降低肿瘤中免疫抑制性T细胞的占比，增加色氨酸的含量，降低IL-6，IL-13，TGF-β的浓度，从而实现对肿瘤干细胞的清除。
(5)本发明提供的基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸大分子化合物的纳米载药体系，能将药物靶向递送至肿瘤部位，既能杀伤肿瘤又能调节肿瘤免疫微环境，增强肿瘤治疗效果，实现肿瘤化疗和免疫治疗的联合，增强抗肿瘤疗效，且实验证明其肿瘤抑制效果优于目前市面上成熟的一线药物伊立替康和紫杉醇注射剂泰素，瘤体积瘤重均低于伊立替康和泰素的一半，因此本发明提出的纳米载药体系具有良好的应用前景。
(6)本发明提出的聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸大分子化合物通过酯键将叶酸和聚乳酸与羟乙基淀粉进行偶联，得到两亲性大分子，该分子具有良好的生物相容性。利用乳化溶剂挥发法将抗肿瘤小分子CN包载到聚合物纳米粒的疏水核心，形成粒径在200nm左右且分布均一的载药纳米粒。该载药纳米粒具有良好的稳定性，能够在血液系统长时间循环，通过叶酸的靶向作用，快速特异地富集于肿瘤部位。在叶酸受体的介导下，肿瘤细胞将载药纳米粒摄取入胞。在肿瘤细胞内还原物质的作用下，部分药物CN还原为CPT和NLG919，促进纳米粒的解聚，纳米粒的解聚又反过来促进药物的释放，从而杀伤肿瘤同时抑制吲哚胺-2,3-加氧酶(IDO)活性。一方面，药物CN和其还原产物CPT通过诱导免疫原性细胞死亡，促进树突状细胞成熟及其抗原提呈，从而引发抗肿瘤免疫反应和抗肿瘤免疫记忆。另一方面，药物CN和其还原产物NLG通过抑制IDO，抑制了色氨酸向犬尿氨酸的转变，维持了肿瘤微环境中高浓度的色氨酸，降低了免疫调节T细胞的占比，降低了免疫抑制性细胞因子IL-6,IL-13和TGF-β的含量，从而解除了肿瘤微环境中的免疫抑制。一正一反两个方面，同时增强了抗肿瘤免疫反应，改善了肿瘤干细胞小境，使休眠的肿瘤干细胞解除周期抑制，从而增强了肿瘤干细胞对免疫细胞和化疗药物的敏感性，最终实现了对肿瘤干细胞和肿瘤细胞的有效清除。综上，载有药物CN基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的载药纳米系统，在多种小鼠三阴性乳腺癌模型中均取得了良好的抗肿瘤效果，显著延长了小鼠的生存期。
附图说明
图1为本发明实施例1化合物聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸(PLA-HES-FA,PHF)的制备流程图；
图2为本发明实施例1制备的化合物PHF的核磁共振H谱(600M)；
图3为本发明实施例1制备的化合物PH的核磁共振H谱(600M)；
图4为本发明制备的包载药物CN的物聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸载药纳米粒(CN@PHF)的粒径形貌以及血液稳定性；
图5为本发明制备的载药纳米粒CN@PHF的药物释放；
图6为本发明制备载药纳米粒CN@PHF的肿瘤靶向性及杀伤肿瘤细胞的活性评价；
图7为本发明制备的载药纳米粒CN@PHF最佳给药剂量的筛选；
图8为本发明制备的载药纳米粒CN@PHF抗肿瘤活性的评价；
图9为利用免疫切片对本发明制备的载药纳米粒CN@PHF进行的抗肿瘤机制评价；
图10为利用流式细胞术对本发明制备的载药纳米粒CN@PHF，从免疫细胞的角度进行的抗肿瘤机制评价；
图11为利用利用多种手段对本发明制备的载药纳米粒CN@PHF，改善肿瘤干细胞小境的评价；
图12为各种药物处理后，小鼠生存期的评价。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物(在本发明中缩写为PLA-HES-FA,进一步缩写为PHF)，该大分子化合物为由叶酸和聚乳酸分别通过酯键与羟乙基淀粉偶联得到。其为具有式(一)所示的结构式：
Figure GDA0003429188500000081
其中，聚乳酸的分子量为6～10Kda(对应n范围约为97～161)，羟乙基淀粉的分子量为100～150KDa；所述聚乳酸在羟乙基淀粉上的接枝率为0.5～1，优选为0.7～0.9；所述叶酸在羟乙基淀粉上的接枝率为10～30，优选为15～25。
优选实施例中，聚乳酸的分子量为8KDa，羟乙基淀粉的分子量为130KDa。
本发明还提供了一种所述的大分子化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)使叶酸的羧基与羟乙基淀粉的羟基发生酯化反应，得到中间产物；
(2)将步骤(1)所述中间产物通过分离提纯后，将该中间产物的羟基与聚乳酸的羧基发生酯化反应，所得产物经分离提纯后得到所述大分子化合物。
一些实施例中，步骤(1)具体为：将叶酸、羧基活化试剂以及缚酸剂混合，混合后溶于有机溶剂中，使叶酸结构式中的羧基与所述羧基活化试剂发生反应生成活化酯；然后将该活化酯与含有羟基的羟乙基淀粉发生取代反应，使得叶酸与该含有羟基的羟乙基淀粉通过酯键相连接，得到中间产物。所述羧基活化试剂为二环己基碳二亚胺或1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺；所述有机溶剂为二甲亚砜和/或四氢呋喃；所述缚酸剂为4-二甲氨基吡啶，吡啶和三乙胺中的一种或多种。有机溶剂用于溶解叶酸、聚乳酸、羟乙基淀粉和羧基活化试剂；缚酸剂也用作催化剂，可用于催化取代反应。
一些实施例中，步骤(2)具体为：将聚乳酸、羧基活化试剂以及缚酸剂混合，混合后溶于有机溶剂中，使聚乳酸结构中含有的羧基发生取代反应转化生成活化酯；然后将该活化酯与步骤(1)所述中间产物发生取代反应，通过酯键相连接，得到所述大分子化合物。
一些实施例中，步骤(1)和(2)所述中间产物通过如下步骤进行分离提纯：将所得中间产物采用乙醇沉淀，沉淀溶解后用超纯水透析，最后冷冻干燥得到所述中间产物。
一些实施例中，步骤(1)所述中间产物通过如下步骤进行分离提纯：将所得中间产物依次采用乙醇沉淀，沉淀用二甲亚砜溶解后用超纯水透析，最后冷冻干燥得到所述中间产物。
本发明步骤(1)和步骤(2)可在较宽的温度范围内反应，比如在20℃-60℃。聚乳酸、羟乙基淀粉与叶酸的投料摩尔比为(2～6):1:(10～30)，优选为(3～5):1:(15～25)，进一步优选为4:1:20。实验发现过大的叶酸接枝率会导致制备得到的大分子化合物溶解性降低。缚酸剂也用作催化剂，其用量可与叶酸或聚乳酸用量相当，有机溶剂用于溶解原料。
本发明还提供了所述的大分子化合物在制备纳米药物载药体系中的应用，该纳米药物载药体系用于制备治疗癌症的药物。
一些实施例中，所述癌症为乳腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或黑色素瘤。
本发明还提供了一种基于所述的聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物的纳米载药系统，所述纳米载药系统包括所述的两亲性聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物和药物，所述药物优选为基于喜树碱的二聚体化合物，该二聚体化合物具有如式(二)所示的结构：
Figure GDA0003429188500000101
式(二)中，x为1-4的整数，y为1-4的整数。
优选实施例中，x为1-3的整数，y为1-3的整数。
优选实施例中，该二聚体化合物结构式中，x＝2，y＝2。即该优选化合物的结构式如式(三)所示：
Figure GDA0003429188500000102
一些实施例中，所述的二聚体化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1：使喜树碱结构式中的羟基发生取代反应转化为碳酰氯化合物；然后将该碳酰氯化合物与含有二硫键的烷基二醇发生酯化反应，使得喜树碱与该含有二硫键的烷基二醇通过碳酸酯键相连接，得到中间产物；
S2：将步骤S1所述中间产物通过分离提纯后，使其结构中含有的羟基发生取代反应转化为活化产物，该活化产物为碳酰氯化合物；然后将该碳酰氯化合物与NLG919发生取代反应，使得所述中间产物与NLG919通过碳酸酯键相连接，所得产物经分离提纯后得到所述二聚体化合物。
一些实施例中，步骤S1具体为：将喜树碱、酰氯试剂以及缚酸剂混合，混合后溶于有机溶剂中，使喜树碱结构式中的羟基与所述酰氯试剂发生反应生成碳酰氯化合物；然后将该碳酰氯化合物与含有二硫键的烷基二醇发生取代反应，使得喜树碱与该含有二硫键的烷基二醇通过碳酸酯键相连接，得到中间产物。步骤S2具体为：将步骤S1所述中间产物、酰氯试剂以及缚酸剂混合，混合后溶于有机溶剂中，使其结构中含有的羟基发生取代反应转化生成碳酰氯化合物；然后将该碳酰氯化合物与NLG919发生取代反应，使得所述中间产物与NLG919通过碳酸酯相连接，得到所述二聚体化合物。所述酰氯试剂为光气和/或三光气。所述有机溶剂为二氯甲烷，氯仿或四氢呋喃中的一种或多种；所述缚酸剂为4-二甲氨基吡啶，吡啶或三乙胺中的一种或多种。有机溶剂用于溶解喜树碱和酰氯试剂；缚酸剂也用作催化剂，可用于催化三光气的分解。步骤S1所述中间产物通过如下步骤进行分离提纯：将所得中间产物依次采用稀酸水溶液、饱和食盐水、超纯水萃取反应产物(将没有反应完的催化剂、酰氯试剂、含有二硫键的烷基二醇等除掉)，分离获得有机相，先用干燥剂除水，然后除去有机溶剂，最后将获得的有机相干燥后得到所述中间产物。
一些实施例中，步骤S2所述分离提纯包括如下步骤：步骤S2所得产物依次采用稀酸水溶液、饱和食盐水、超纯水萃取，以除去未参与反应的原料，分离获得有机相，先用干燥剂除水，然后除去有机溶剂，得到粗产物，用HPLC对产物进行纯化，最后经干燥得到所述二聚体化合物。
一些实施例中，所述含有二硫键的烷基二醇为2,2’-二硫二乙醇、二硫二甲醇、3,3’-二硫二丙醇或4,4’-二硫二丁醇中的一种或多种。
本发明步骤S1和步骤S2可在较宽的温度范围内反应，比如在-5℃-30℃，一些实施例中为了避免光气转化为气相，选择在冰上反应。喜树碱、含有二硫键的烷基二醇与NLG919的理论反应摩尔比为1:1:1，加料比在该比值附近即可。缚酸剂也用作催化剂，其用量可与喜树碱用量相当，缚酸剂用量为酰氯试剂光气或三光气用量的3-4倍，有机溶剂用于溶解原料。
本发明实施例中所述羟乙基淀粉原料购买于武汉华科大生命科技有限公司，所用羟乙基淀粉的分子量为130KDa，羟乙基的取代度为0.4。本发明所述聚乳酸原料购买于济南岱罡生物工程有限公司，聚乳酸的分子量为8KDa。本发明优选实施例中所述药物CN，即为如式(三)所述的基于喜树碱的二聚体化合物，纯度为99％。
羟乙基淀粉(HES)是一种改性的天然多糖，它是高支化淀粉经酸水解、并与环氧乙烷反应得到的产物。羟乙基淀粉在临床上主要用作血浆扩容剂，也是治疗低血容量和休克的首选药物。羟乙基淀粉具有良好的生物相容性，与葡萄糖相比它具有更低的超敏反应发生率。羟乙基淀粉还具有良好的水溶性和生物相容性，它在体内可被α-淀粉酶降解，并通过肾小球滤过从尿液排出。利用羟乙基淀粉的上述优势，将其作为两亲性聚合物载药纳米系统，有望得到一种能够在体内实现长时间稳定循环，提高药物半衰期的载药纳米体系。乳腺癌细胞表明高表达叶酸受体，叶酸能够与肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性的结合。因此在纳米粒的表面进行叶酸的修饰，有望能够实现肿瘤特异性靶向递送纳米药物，并提高肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取。
一些实施例中，所述纳米载药系统中载药纳米粒的尺寸为100-200nm。该纳米载药系统最高载药量可达15％。
本发明还提供了一种所述的基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物的纳米载药系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述的两亲性聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物溶解于水中，在冰浴下超声乳化，同时加入溶解有如式(二)所示的二聚体化合物的二氯甲烷溶液，得到超声后的乳液；
(2)将步骤(1)得到的乳液置于旋转蒸发仪中，减压蒸馏除去二氯甲烷，得到包载有所述二聚体化合物药物的基于两亲性聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物的纳米载药系统。
一些实施例中，所述纳米载药系统的剂型为注射剂、粉针剂、口服剂、喷雾剂、胶囊剂或栓剂。
本发明优选实施例中，通过在选择羟乙基淀粉为亲水片段，选择聚乳酸为疏水段，选择叶酸作为肿瘤特异性靶向分子，结合乳化溶剂挥发法，制备得到包载药物CN的，粒径在200nm左右，且分布均一，结构稳定的载药纳米粒。与无叶酸靶向的纳米粒相比，该纳米粒显著增加了肿瘤部位纳米粒的富集速度和富集量，促进了肿瘤细胞对纳米粒的摄取，在多种乳腺癌4T1小鼠模型中均显示出了更好的抗肿瘤效果，同时降低了毒副作用，延长了小鼠生存期。本发明提供的基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸大分子化合物的纳米载药体系，能显著增强药物CN诱导产生免疫原性细胞(ICD)死亡和抑制吲哚胺-2,3-加氧酶(IDO)的活性，促进淋巴结树突状细胞(DC)的成熟，增加脾脏效应记忆T细胞的量，并维持较高的中心记忆T细胞，改善肿瘤微环境，降低肿瘤中免疫抑制性T细胞的占比，增加色氨酸的含量，降低IL-6，IL-13，TGF-β的浓度，从而实现对肿瘤干细胞的清除。既能杀伤肿瘤又能调节肿瘤免疫微环境，增强肿瘤治疗效果，实现肿瘤化疗和免疫治疗的联合，增强抗肿瘤疗效，且实验证明其肿瘤抑制效果优于目前市面上成熟的一线药物伊立替康和紫杉醇注射剂泰素，因此本发明提出的纳米载药体系具有良好的应用前景。
以下为实施例：
实施例1
制备化合物PHF和PH。
按照如图1所述的流程示意图制备如式(一)所示的化合物PHF，按照如下步骤进行：
(1)将叶酸(20mmol,8.828mg)，二环己基碳二亚胺(40mmol，8.253mg)溶于10mL二甲亚砜中，加入4-二甲氨基吡啶(40mmol,4.887mg)，40℃反应30分钟。
(2)将羟乙基淀粉(1mmol，130mg)溶于5mL二甲亚砜，加入至(1)中反应体系，40℃继续反应48小时。
(3)将(2)中反应液加入至100ml乙醇中沉淀，8000rpm离心10min，沉淀用二甲亚砜溶解，置于透析袋中(Mw 8000Da)，用超纯水透析两天后，冷冻干燥，得到纯的FA-HES。
(4)将聚乳酸(4mmol,32mg)，二环己基碳二亚胺(8mmol，1.651mg)溶于10mL二甲亚砜中，加入4-二甲氨基吡啶(8mmol,0.977mg)，40℃反应30分钟。
(5)将FA-HES(1mmol，130mg)溶于5mL二甲亚砜，加入至(4)中反应体系，40℃继续反应48小时。
(6)将(5)中反应液加入至100ml乙醇中沉淀，8000rpm离心10min，沉淀用二甲亚砜溶解，置于透析袋中(Mw 8000Da)，用超纯水透析两天后，冷冻干燥，得到纯的如式(一)所示的化合物PHF，其中聚乳酸的分子量为8KDa，羟乙基淀粉的分子量为130KDa；聚乳酸在羟乙基淀粉上的接枝率为0.86；叶酸在羟乙基淀粉上的接枝率为20。
按照如图1所述的流程示意图制备无叶酸靶向的大分子化合物PH，按照如下步骤进行：
(1)将聚乳酸(4mmol,32mg)，二环己基碳二亚胺(8mmol，1.651mg)溶于10mL二甲亚砜中，加入4-二甲氨基吡啶(8mmol,0.977mg)，40℃反应30分钟。
(2)将HES(1mmol，130mg)溶于5mL二甲亚砜，加入至(4)中反应体系，40℃继续反应48小时。
(3)将(2)中反应液加入至100ml乙醇中沉淀，8000rpm离心10min，沉淀用二甲亚砜溶解，置于透析袋中(Mw 8000Da)，用超纯水透析两天后，冷冻干燥，得到纯的化合物PH,其中聚乳酸的分子量为8KDa，羟乙基淀粉的分子量为130KDa；聚乳酸在羟乙基淀粉上的接枝率为0.86。
对分离提纯得到的化合物进行核磁共振测试，从而确定化合物的结构。其1H NMR(600MHz)数据如图2所示，PHF的核磁共振氢谱上既存在羟乙基淀粉葡萄糖环上羟基质子峰，即化学位移为4.5ppm到6ppm之间的多重峰，也能发现化学位移为1-2ppm之间的聚乳酸的甲基质子峰，还能发现化学位移为6ppm到8ppm之间的叶酸苯环上的质子峰。核磁共振谱图证实了PLA-HES-FA已制备成功。如图3所示，PH的核磁共振氢谱上既存在羟乙基淀粉葡萄糖环上羟基质子峰，即化学位移为4.5ppm到6ppm之间的多重峰，也能发现化学位移为1-2ppm之间的聚乳酸的甲基质子峰。核磁共振谱图证实了PLA-HES(缩写为PH)已制备成功。
实施例2
包载药物CN基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的载药纳米粒(CN@PHF)和包载药物CN基于聚乳酸-羟乙基淀粉的载药纳米粒(CN@PH)的制备和表征。
取PHF(100mg)或PH(100mg)溶于5mL超纯水中，置于冰上。将药物CN(20mg)溶于0.25mL二氯甲烷，缓慢逐滴加入至PHF水溶液中，边滴加边超声乳化。所得乳液用旋转蒸发仪除去二氯甲烷，置于透析袋中(Mw 3500Da)，用超纯水透析一天后，冷冻干燥，得到CN@PHF或CN@PH的载药纳米粒。
通过紫外分光光度法检测CN@PHF和CN@PH中CN的载药量。将CN@PHF或CN@PH称重得到质量W1(mg)，通过紫外分光光度法测得CN@PHF或CN@PH中的CN质量为W2(mg)，载药量采用公式DLC(％)＝W2/W1×100％。包封率EE(％)＝W2/20×100％。配置1mg/mL的冻干粉水溶液，超声10min，备用。取1mL用激光粒度仪(Nano-ZS90,Malvern)检测CN@PHF和CN@PH的水合粒径，粒径分布及ζ电位，测定温度25℃，激光光源：He-Ne激光，波长为633nm。
检测结果如表1所示。CN@PHF和CN@PH均能形成粒径在200nm左右，分布均一的载药纳米粒。CN@PHF为电中性，CN@PH表面带一定的正电荷，且CN@PHF的载药量和包封率均高于CN@PH，说明CN@PHF的组装行为优于CN@PH。
表1纳米粒的理化性质表征。
Figure GDA0003429188500000161
将1mg/ml的纳米粒CN@PHF分散液20uL滴于通网上，用0.1％磷钨酸染色，室温下自然干燥后，用透射电子显微镜(TEM,H-700FA，HITACHI)观察其形貌，加速电压为20KV-125KV。将1mg/ml的纳米粒CN@PHF分散液20uL滴加于云母片上，室温下于无尘处干燥。利用原子力显微镜(AFM,Bruker Multimode 8)扫描样品，成像模式为Scan Asyst Mode inAir，扫描探针型号为SLN-10，扫描范围1μm。将CN@PHF在DTT浓度10mM的PBS溶液中室温孵育12h后，分别用DLS和TEM对其粒径进行检测。将CN@PHF与CN@PH分别加入到含有10％胎牛血清的PBS溶液中，连续10天，每天用DLS检测纳米粒的粒径评价纳米粒的稳定性。
本发明制备的包载药物CN基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的载药纳米粒(CN@PHF)的TEM，AFM分别如图4内容a和内容b所示，CN@PHF的粒径约为170nm。图4内容c所示的DLS结果显示，CN@PHF的水合粒径约为200nm，TEM与AFM结果与DLS结果相吻合。如图4内容c和内容d所示，CN@PHF在还原性条件下解组装，变成粒径更小的HES纳米粒。如图4内容e所示，纳米粒在模拟血液的环境中能够维持稳定，粒径无显著变化。
实施例3
包载药物CN基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的载药纳米粒(CN@PHF)的药物释放研究。
将CN@PHF和CN@PH分散与PBS(10mM，pH7.4)，置于透析袋中(MWCO＝3.5kDa)。将透析袋置于DTT浓度分别为0和10mM的透析外液中(10mM PBS,PH7.4，含0.8％吐温80)，于摇床上，37℃，180rpm/min振摇。在给定的时间点，取2mL释放液，再补充2mL新鲜释放外液继续振摇。用HPLC对所取释放外液中药物CN的含量进行检测。
如图5所示，模拟血液循环中无还原性物质存在的条件下，CN@PHF和CN@PH均只有少量药物释放，且CN@PHF比CN@PH释放量更少，说明CN@PHF比CN@PH更稳定。而在模拟肿瘤细胞内部有较高还原性物质存在的情况下，CN@PHF比CN@PH释放更快更多。药物释放的结果表明了CN@PHF比CN@PH具有更好的血液长循环特性和肿瘤特异性药物释放特性。
实施例4
包载药物CN基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的载药纳米粒(CN@PHF)的肿瘤靶向性和抗肿瘤活性研究。
为了研究载药纳米粒的肿瘤靶向性，将荧光染料DiR与药物CN共同包载到载体PHF和PH中，形成纳米粒DiR@PHF和DiR@PH，利用紫外分光光度计测定DiR载药量。
体外细胞摄取。将三阴性乳腺癌4T1细胞按照1×104个细胞每孔的密度接种到4块6孔板中，过夜。分别用含有PBS，DiR，DiR@PH和DiR@PHF(等DiR量)的细胞培养液孵育细胞2h。胰酶消化细胞，用流式细胞仪对细胞进行检测。结果如图6内容a和内容b所示。
体外细胞杀伤。将三阴性乳腺癌4T1细胞按照5×103个细胞每孔的密度接种到4块96孔板中，过夜。分别用含有PBS，CN，CN@PH和CN@PHF的细胞培养液孵育细胞48h。细胞存活率通过MTT法进行检测，步骤为加入20μL MTT溶液(5.0mg/mL)，孵育4h后，吸去培养基，加入150μL DMSO溶解MTT还原生成的甲臜，通过酶标仪单波长法492nm检测每个孔的吸光值，以空白培养基培养的细胞作为100％生存率。结果如图6内容c所示，IC50如表2所示。
体内肿瘤靶向。在6周龄，20g雌性BALB/c小鼠背部右侧后方皮下接种小鼠乳腺癌4T1细胞悬液1×106个细胞，建立小鼠乳腺癌4T1皮下瘤小鼠模型。当原位瘤体积约为100mm3时，将小鼠随机分为3组，每组3只，分别通过尾静脉注射DiR，DiR@PH和DiR@PHF(等DiR量)，在预先设定好的时间点麻醉小鼠并进行活体成像(IVIS Lumina XR,Caliper,USA,激发波长为748nm,发射波长为780nm)。72小时后对小鼠进行安乐死处理，取出小鼠的心肝脾肺肾和肿瘤，并进行成像。结果如图6内容d、内容e、内容f和内容g所示。
表2不同药物对4T1细胞的IC50
Figure GDA0003429188500000181
如图6内容a和内容b所示，肿瘤细胞对DiR@PHF纳米粒的摄取显著高于DiR@PH。如图6内容c所示细胞杀伤的结果与细胞摄取的结果相一致，CN@PHF对三阴性乳腺癌4T1细胞的杀伤显著强于CN@PH和游离CN。CN包载到PH中形成的纳米粒，较游离CN的细胞杀伤显著降低。叶酸的靶向作用增强了细胞对CN@PHF的摄取，从而增强了对细胞的杀伤作用。如图6内容d和内容e所示，DiR@PHF在尾静脉注射30分钟后，就有大量纳米粒在肿瘤部位富集，而DiR@PH在8小时后才在肿瘤部位显示出与之相当的荧光强度。随着时间的延长DiR@PHF在肿瘤部位的荧光强度显著高于DiR@PH。如图6内容f和内容g所示离体组织成像也显示出DiR@PHF在肿瘤部位的富集量显著高于无叶酸靶向的纳米粒组DiR@PH，而在其他组织器官中的富集显著低于DiR@PH。
综上，表面修饰叶酸赋予了基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的载药纳米粒CN@PHF更好的肿瘤特异性靶向能力，促进了肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取，并增强了载药纳米粒对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例5
利用小鼠4T1乳腺癌皮下瘤模型考察CN@PHF的最佳给药剂量及其安全性，具体步骤如下：
在6周龄，20g雌性BALB/c小鼠背部右侧后方皮下接种小鼠乳腺癌4T1细胞悬液1×106个细胞，建立小鼠乳腺癌4T1皮下瘤小鼠模型。当皮下瘤体积约为100mm3时，将小鼠随机分为6组，每组6只，分别给予尾静脉注射生理盐水(saline)，CN(2.4mg/kg)，CN@PH(CN的剂量为2.4mg/kg)，低剂量CN@PHF L(CN的剂量为1.2mg/kg),中剂量CN@PHF M(CN的剂量为2.4mg/kg),高计量CN@PHF H(CN的剂量为4.8mg/kg)。记第一天给药时间为第1天，再分别于第4、7、10天按上述剂量给药。自第1天起，每隔一天测量一次小鼠体重及瘤体积，绘制瘤体积-时间曲线。在第17天处死小鼠，剥离瘤称重，拍照。取心肝脾肺肾肿瘤，制备切片，进行HE染色。结果如图7所示。
如图7内容a、内容b、内容c和内容d所示，在给药剂量为游离CN和CN@PH一半的情况下，低剂量CN@PHF L组表现出与游离CN和CN@PH相当的肿瘤抑制率，有效的抑制了肿瘤的生长。中剂量CN@PHF M组表现出了与高剂量组CN@PHF H相当的肿瘤抑制活性，但是高剂量CN@PHF H组小鼠表现出了一定程度的体重下降。如图7内容e HE切片所示，上述药物均未引起显著的组织器官损伤。综上，最佳给药剂量确定为中剂量CN@PHF M，CN的剂量为2.4mg/kg。
实施例6
利用小鼠4T1乳腺癌原位瘤模型考察CN@PHF的抗肿瘤活性，具体步骤如下：
在6周龄，20g雌性BALB/c小鼠腹部第四对乳房左侧乳房垫中接种小鼠乳腺癌4T1细胞悬液5×105个细胞，建立小鼠乳腺癌4T1原位瘤小鼠模型。当原位瘤体积约为100mm3时，将小鼠随机分为6组，每组10只，分别通过尾静脉注射生理盐水(Saline)，CN，泰素(Taxol)，伊立替康(Irinotecan)，CN@PH，CN@PHF，其中CN的剂量为2.4mg/kg，泰素和伊立替康给药浓度与CN的摩尔浓度相同。记第一天给药时间为第1天，再分别于第4、7、10天按上述剂量给药。自第1天起，每隔一天测量一次小鼠体重及瘤体积，绘制瘤体积-时间曲线。在第19天处死小鼠，剥离原位瘤称重，拍照。对肿瘤进行HE染色，TUNEL染色研究肿瘤细胞凋亡情况，Ki67染色研究肿瘤细胞增殖情况。结果如图8所示。
图8内容a为小鼠瘤体积，图8内容b为瘤重，可以看出CN@PHF,CN@PH,CN均组能够显著抑制肿瘤的生长，瘤体积显著小于生理盐水组和阳性药物泰素和伊立替康组。其中CN@PHF组小鼠瘤体积和瘤重显著小于其他各组，表现出了最强的抗肿瘤活性。图8内容e为HE，TUNEL和Ki67切片染色，内容c和内容d分别为对切片中TUNEL和Ki67荧光强度的定量。从结果可以看出CN@PHF处理后肿瘤部位的坏死面积大于其他各组，肿瘤细胞凋亡显著高于其他各组，肿瘤细胞增殖显著低于其他各组，切片数据进一步证实CN@PHF表现出了更好的抗肿瘤效果。
实施例7
利用小鼠4T1乳腺癌原位瘤模型考察CN@PHF的抗肿瘤机制，具体步骤如下：
在6周龄，20g雌性BALB/c小鼠腹部第四对乳房左侧乳房垫中接种小鼠乳腺癌4T1细胞悬液5×105个细胞，建立小鼠乳腺癌4T1原位瘤小鼠模型。当原位瘤体积约为100mm3时，将小鼠随机分为6组，每组6只，分别通过尾静脉注射生理盐水(Saline)，CN，泰素(Taxol)，伊立替康(Irinotecan)，CN@PH，CN@PHF，其中CN的剂量为2.4mg/kg，泰素和伊立替康给药浓度与CN的摩尔浓度相同。记第一天给药时间为第1天，再分别于第4、7、10天按上述剂量给药。自第1天起，每隔一天测量一次小鼠体重及瘤体积，绘制瘤体积-时间曲线。在第17天处死小鼠，剥离原位瘤，瘤旁淋巴结和脾脏。对肿瘤进行免疫荧光染色，HMGB-1，CRT染色研究药物在肿瘤部位引起免疫原性细胞死亡的能力，CD4和FoxP3共染研究肿瘤部位抑制抗肿瘤免疫的免疫调节细胞Treg的量，CD133染色评价肿瘤部位肿瘤干细胞的量。结果如图9所示。
剥离的脾脏和肿瘤，用眼科剪剪碎后在溶有胶原酶1和DNA酶的1640培养基中37℃孵育60min，挤压过200目筛网，制备单细胞悬液。瘤旁淋巴结挤压过200目筛网，制备单细胞悬液。分别对淋巴结树突状细胞(DC)的成熟(CD11c，CD80,CD86,MHC-Ⅱ)，肿瘤部位免疫调节性T细胞(CD4,CD25,FOXP3)，和脾脏的免疫记忆T细胞(CD3,CD8,CD44,CD62L)进行流式分析。考察药物对肿瘤免疫的影响。结果如图10所示。
图9内容a和内容b显示CN@PHF在三阴性乳腺癌小鼠4T1原位瘤模型中表现出了最好的抗肿瘤活性，瘤重和瘤体积显著低于其他各组。图9内容d为免疫荧光切片，内容c、内容e、内容f、内容g分别为对HMGB-1，CRT，CD133和Treg的定量。内容c、内容e显示CN@PHF具有最强的诱导免疫细胞死亡的能力，表现在CN@PHF能够在肿瘤部位诱导更高的HMGB-1的释放和CRT的外翻。如图9内容d和内容g所示，CN@PHF显著抑制了肿瘤部位免疫调节T细胞Treg的量。如图9内容d和内容f所示，CN@PHF实现了对肿瘤部位肿瘤干细胞的高效清除。
图10内容a显示CN@PHF显著促进了瘤旁淋巴结中DC细胞的成熟。图10内容b显示CN@PHF显著抑制了肿瘤部位的Treg细胞在CD4+T细胞中的占比。图10内容c和内d表明，CN@PHF有效的引发了抗肿瘤免疫记忆反应，显著增加了效应记忆T细胞的含量，同时维持了较高的中心记忆T细胞的含量。
综上结果表明，CN@PHF能够通过诱导免疫细胞死亡，激活了瘤旁淋巴结树突状细胞(DC)的成熟及抗原提呈，促进了抗肿瘤免疫反应，引发了抗肿瘤免疫记忆。同时CN@PHF通过抑制肿瘤部位的免疫调节T细胞(Treg)，从而解除了肿瘤微环境的免疫抑制，进一步增强了抗肿瘤免疫反应。最终，实现了对肿瘤干细胞的有效杀伤。
实施例8
利用小鼠4T1乳腺癌原位瘤模型考察CN@PHF对肿瘤干细胞小境的影响，具体步骤如下：
在6周龄，20g雌性BALB/c小鼠腹部第四对乳房左侧乳房垫中接种小鼠乳腺癌4T1细胞悬液5×105个细胞，建立小鼠乳腺癌4T1原位瘤小鼠模型。当原位瘤体积约为100mm3时，将小鼠随机分为6组，每组10只，分别通过尾静脉注射生理盐水(Saline)，CN，泰素(Taxol)，伊立替康(Irinotecan)，CN@PH，CN@PHF，其中CN的剂量为2.4mg/kg，泰素和伊立替康给药浓度与CN的摩尔浓度相同。记第一天给药时间为第1天，再分别于第4、7、10天按上述剂量给药。在第13天，向瘤内注射50μL Edu(8mg/ml)。三小时后，处死小鼠，剥离原位瘤，将其分为两份。其中一份用眼科剪剪碎后在溶有胶原酶1和DNA酶的1640培养基中37℃孵育60min，挤压过200目筛网，制备单细胞悬液，对肿瘤干细胞的细胞周期(CD133,EdU，hoechst33342)进行流式分析，考察药物对肿瘤干细胞休眠的影响。结果如图11a所示。另外一份，加入500μLPBS和400μL甲醇，匀浆，离心，取上清，用HPLC对上清中色氨酸的含量进行检测。结果如图11所示。
如图11内容a所示，临床一线使用的化疗药物如Taxol和Irinotecan会增加肿瘤干细胞的休眠，导致周期抑制，而CN@PHF可以解除这种周期抑制，从而有效清除肿瘤干细胞。图11内容b表明，CN@PHF能够有效的抑制吲哚胺2,3-加氧酶(IDO)的活性，从而维持肿瘤部位较高的色氨酸含量。此外，如图11内容c、内容d和内容e所示，CN@PHF显著降低了肿瘤部位免疫抑制性细胞因子IL-6,IL-13和TGF-β的含量。CN@PHF通过维持抑制IDO，维持了肿瘤部位较高的色氨酸浓度，降低了免疫抑制性细胞因子的含量，从而改善了整个肿瘤微环境，使其不再利于肿瘤干细胞和肿瘤细胞生长增殖。
实施例9
利用小鼠4T1乳腺癌原位瘤模型考察CN@PHF对小鼠生存期的影响，具体步骤如下：
在6周龄，20g雌性BALB/c小鼠腹部第四对乳房左侧乳房垫中接种小鼠乳腺癌4T1细胞悬液5×105个细胞，建立小鼠乳腺癌4T1原位瘤小鼠模型。当原位瘤体积约为100mm3时，将小鼠随机分为6组，每组10只，分别通过尾静脉注射生理盐水(Saline)，CN，泰素(Taxol)，伊立替康(Irinotecan)，CN@PH，CN@PHF，其中CN的剂量为2.4mg/kg，泰素和伊立替康给药浓度与CN的摩尔浓度相同。记第一天给药时间为第1天，再分别于第4、7、10天按上述剂量给药。自第1天起，每隔一天测量一次小鼠体重及瘤体积，绘制瘤体积-时间曲线。当小鼠瘤体积超过2000mm3，则视为死亡，对其进行安乐死处理。记录小鼠生存期。实验结果如图12所示。
图12内容a、内容b、内容c、内容d、内容e、内容f和内容g表明，CN@PHF能够显著增加三阴性乳腺癌小鼠的平均生存期。相较于生理盐水组和阳性药物Taxol,Irinotecan组，以及游离药物CN组，CN@PHF延长小鼠平均生存期约10天。相较于无叶酸靶向的CN@PH组，有叶酸靶向的CN@PHF组延长了小鼠平均生存期约5天。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物，其特征在于，该大分子化合物为由叶酸和聚乳酸分别通过酯键与羟乙基淀粉偶联得到；其具有式(一)所示的结构式：
Figure FDA0003429188490000011
其中，聚乳酸的分子量为6～10KDa，羟乙基淀粉的分子量为100～150KDa；所述聚乳酸在羟乙基淀粉上的接枝率为0.5～1；所述叶酸在羟乙基淀粉上的接枝率为10～30。
2.如权利要求1所述的大分子化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)使叶酸的羧基与羟乙基淀粉的羟基发生酯化反应，得到中间产物；
(2)将步骤(1)所述中间产物通过分离提纯后，将该中间产物的羟基与聚乳酸的羧基发生酯化反应，所得产物经分离提纯后得到所述大分子化合物。
3.如权利要求1所述的大分子化合物在制备纳米药物载药系统中的应用，该纳米药物载药系统用于制备治疗或预防癌症的药物。
4.一种基于如权利要求1所述的聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物的纳米载药系统，其特征在于，所述纳米载药系统包括如权利要求1所述的两亲性聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物和药物。
5.如权利要求4所述的纳米载药系统，其特征在于，所述药物为基于喜树碱的二聚体化合物，该二聚体化合物具有如式(二)所示的结构：
Figure FDA0003429188490000021
式(二)中，x为1-4的整数，y为1-4的整数。
6.如权利要求5所述的纳米载药系统，其特征在于，该二聚体化合物结构式中，x＝2，y＝2。
7.如权利要求4-6任意一项所述的基于聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物的纳米载药系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将所述的两亲性聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物溶解于水中，在冰浴下超声乳化，同时加入溶解有如式(二)所示的二聚体化合物的有机溶液，得到超声后的乳液；
(2)将步骤(1)得到的乳液减压蒸馏除去有机溶剂，得到包载有所述二聚体化合物药物的基于两亲性聚乳酸-羟乙基淀粉-叶酸的大分子化合物的纳米载药系统。
8.如权利要求4至6任一项所述的纳米载药系统在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，所述癌症为乳腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或黑色素瘤。
10.一种抗癌药物，其特征在于，包含如权利要求4至6任一项所述的纳米载药系统和药学上可接受的添加剂。
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