CN108503718A - 一种羟烷基淀粉偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种羟烷基淀粉偶联物及其制备方法和应用。该羟烷基淀粉偶联物由疏水链段和iRGD肽分别共价偶联至羟烷基淀粉上形成。本发明提供的羟烷基淀粉偶联物在水中可以自组装成纳米簇，并可以以高的包封率和载药量负载药物，特别是阿霉素，体外药物释放研究显示负载有药物的纳米簇具有还原响应性释药的性质。

Description

一种羟烷基淀粉偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及载药系统技术领域，更具体地，涉及一种羟烷基淀粉偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
化学治疗是目前肿瘤治疗的五大手段之一，主要利用化学药物杀死肿瘤细胞或者抑制肿瘤细胞的增殖，由于化学药物没有靶向性，也会对人体正常细胞产生杀伤作用，导致严重的毒副反应。基于高分子材料的还原响应性纳米载药系统近年来被广泛的研究用于抗肿瘤药物的输送，这些纳米载体静脉注射后，可以通过增强的渗透与滞留效应在肿瘤部位富集，减少在正常组织器官的聚集，从而降低毒副作用，这些纳米载体可以通过内吞的途径进入肿瘤细胞，在肿瘤细胞内高浓度还原型谷胱甘肽的作用下解体，释放负载的药物，发挥药效。但是这些纳米载体仍具有很多不足，比如载药量、包封率低下，导致载药成本较高；内吞效率低下、进入肿瘤细胞内药物释放缓慢，导致其抗肿瘤活性和游离药物相比没有显著的增强，甚至比游离药物更低。
iRGD肽是一种具有环状结构的穿膜肽，其序列为CRGDK/RGPD/EC，其中RGD序列可以与整合素特异性结合，因此iRGD肽能够靶向肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞等具有较高整合素表达的细胞或组织，iRGD肽在和肿瘤细胞表达的整合素结合后，可以被特定的酶切割，暴露出穿膜片段，该片段可以和肿瘤细胞表面的神经毛菌素作用，介导穿膜效应的发生。但是如何将这种iRGD肽有效地与还原响应性药物载体结合，从而提高肿瘤细胞对还原响应性药物载体的摄取，进一步提高抗肿瘤活性还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的，提供了一种羟烷基淀粉偶联物。该羟烷基淀粉偶联物由疏水链段和iRGD肽分别共价偶联至羟烷基淀粉上形成。
得到的羟烷基淀粉偶联物具有iRGD靶向，具有还原响应性。将上述物质分散在溶剂如水中，可以自组装形成纳米簇，可以很高的包封率和载药量负载药物，同时，负载了药物的纳米簇具有强的肿瘤细胞杀伤效果。
在本发明一个优选实施方式中，疏水链段和iRGD肽分别通过二硫键共价偶联至羟烷基淀粉上，从而提高羟烷基偶联物对肿瘤的靶向治疗作用，降低药物对正常组织和器官的毒副作用。
在本发明一个优选实施方式中，羟烷基淀粉与疏水链段和iRGD肽均通过酰胺键和二硫键共价偶联，进一步优选先通过酰胺键再通过二硫键共价偶联。
在本发明一个优选实施方式中，羟烷基淀粉为羟乙基淀粉、羟丙基淀粉或羟丁基淀粉，优选为羟乙基淀粉。
其中，羟乙基淀粉的平均分子量优选为25～480kDa，优选为130kDa，羟乙基的摩尔取代度为0.4～0.6，优选为0.4。
在本发明优选实施方式中，羟乙基淀粉的规格可以为480/0.4，480/0.5，480/0.6，200/0.4，200/0.5，200/0.6，130/0.4，130/0.5，130/0.6，70/0.5，25/0.5，优选130/0.4，其中130表示羟乙基淀粉的分子量，单位为kDa，0.4为羟乙基的摩尔取代度。
在本发明一个优选实施方式中，疏水链段可以为C15～C20的直链烷烃，优选为C18的直链烷烃。
在本发明一个优选实施方式中，当疏水链段为C18的直链烷烃，羟烷基淀粉为羟乙基淀粉时，所形成的物质可以用iRGD-HES-SS-C18表示。
在本发明一个优选实施方式中，羟烷基淀粉、疏水链段、iRGD肽的摩尔比为100:5.5～9.0:1.8～5.4，优选为100:7.1:3.6。
在本发明一个优选实施方式中，该羟烷基淀粉偶联物的结构式可以为如式(I)的结构(该结构为iRGD-HES-SS-C18的结构之一)：
本发明的第二个目的，提供了一种羟烷基淀粉偶联物的制备方法，包括：
1)使所述羟烷基淀粉羧甲基化得到羧甲基化羟烷基淀粉；
2)使所述羧甲基化羟烷基淀粉与2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸反应，得到羟烷基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物；
3)使所述羟烷基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物与带有巯基的所述疏水链段反应，得到同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和所述疏水链段的羟烷基淀粉；
4)使所述同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和所述疏水链段的羟烷基淀粉与巯基化的iRGD肽反应，得到所述羟烷基淀粉偶联物。
在本发明一个优选实施方式中，步骤1)具体为：
将所述羟烷基淀粉与氯乙酸在碱性条件下反应得到所述羧甲基化羟烷基淀粉；所述反应温度优选为50-80℃，进一步优选为70℃，反应时间优选为2-4h。
其中，羟烷基淀粉、氯乙酸的摩尔比优选为(0.5～1.5):1.9，进一步优选为1:1.9。
在本发明一个优选实施方式中，羟烷基淀粉、碱性条件中氢氧根、氯乙酸的摩尔比优选为(0.5～1.5):3.8:1.9，进一步优选为1:3.8:1.9。
在本发明一个优选实施方式中，所述羟烷基淀粉为羟乙基淀粉。
在本发明一个优选实施方式中，步骤1)可以进一步优选为：
将羟乙基淀粉溶于超纯水，加入氢氧化钠活化羟基，室温搅拌0.5～2h，优选0.5h，得到反应液A，再向反应液A中加入氯乙酸,室温搅拌溶解，然后移至70℃油浴搅拌反应2-4h，优选3h，得到反应液B；所述羟乙基淀粉中的糖环、氢氧化钠和氯乙酸的摩尔比为(0.5～1.5):3.8:1.9，优选为1:3.8:1.9；所述羟乙基淀粉的浓度为30～70mg/mL，优选为50mg/mL；
将获得的反应液B倾入至甲醇中，搅拌，得到混悬液C，所述甲醇体积与上述超纯水体积比为(5～15):1，优选为10:1；
将混悬液C过滤，得到白色沉淀，所述白色沉淀用甲醇洗涤，再在室温下真空干燥，得到干燥的白色沉淀；将获得的干燥的白色沉淀复溶于超纯水，用超纯水透析2～4天，优选3天，冷冻干燥后得到白色固体为羧甲基化羟乙基淀粉，其中透析袋的截留分子量优选为3500Da。
在本发明一个优选实施方式中，步骤2)具体为：
使所述羧甲基化羟烷基淀粉与2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在的条件下反应，得到羟烷基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物。
其中，所述羧甲基化羟烷基淀粉中的游离羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐反应摩尔比优选为(0.4～1.0):2:1:1，进一步优选为0.6:2:1:1。其中，所述反应时间优选为24～48h，优选48h。
在本发明一个优选实施方式中，羧甲基化羟烷基淀粉为羧甲基化羟乙基淀粉。
在本发明一个优选实施方式中，步骤2)可以进一步优选为：
将羧甲基化羟乙基淀粉溶于超纯水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐，室温搅拌反应24～48h，优选48h，得到反应液D；
所述羧甲基化羟乙基淀粉中的游离羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐反应摩尔比为0.4～1.0:2:1:1，优选0.6:2:1:1，所述羧甲基化羟乙基淀粉的浓度为20～50mg/mL，优选33.3mg/mL；
将反应液D用超纯水透析2～4天，优选3天，冷冻干燥后得到白色固体为羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物；其中透析袋的截留分子量优选为3500Da。
在本发明一个优选实施方式中，步骤3)中：
所述羟烷基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物中2-吡啶基和带有巯基的所述疏水链段的摩尔比为1.5:(0.8～1.2)，优选1.5:1。
所述反应时间优选为24～48h，进一步优选为24h。
所述疏水链段优选为C15～C20的直链烷烃。该带有巯基的所述疏水链段为带有巯基的C15～C20的直链烷烃，当直链烷烃为C18的直链烷烃，该带有巯基的所述疏水链段为十八硫醇。
在本发明一个优选实施方式中，步骤3)具体可以进一步优选为：
将羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物溶于二甲亚砜，加入正十八硫醇，室温搅拌反应24～48h，优选24h，得到反应液E；
所述羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物中2-吡啶基和正十八硫醇的摩尔比为1.5:(0.8～1.2)，优选1.5:1，所述羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物浓度为30～50mg/mL，优选39mg/mL；
将得到的反应液E倾入至乙醇/乙醚混合溶剂中，搅拌，得到混悬液F；所述乙醇/乙醚混合溶剂的体积与上述的二甲亚砜的体积比为5～15:1，优选为10:1，所述乙醇/乙醚混合溶剂中乙醇与乙醚的体积比为1:1；
将混悬液F过滤得到白色沉淀，所述白色沉淀用乙醇/乙醚混合溶剂洗涤，再在室温下真空干燥，得到干燥的白色沉淀；
将白色沉淀分散于超纯水，用超纯水透析2～4天，优选3天，冷冻干燥后得到白色固体为同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉；其中透析袋的截留分子量优选为3500Da。
在本发明一个优选实施方式中，步骤4)中，同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和所述疏水链段的羟烷基淀粉2-吡啶基和所述巯基化iRGD肽的摩尔比优选为1:(1.2～1.5)，进一步优选为1:1.4。
所述反应时间优选为24～48h，进一步优选为24h。
在本发明一个优选实施方式中，步骤3)具体可以进一步优选为：
将同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉分散于超纯水，加入巯基化iRGD肽，室温搅拌反应24～48h，优选24h，得到反应液G；
所述同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉中2-吡啶基和巯基化iRGD肽的摩尔比为1:(1.2～1.5)，优选1:1.4，所述同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉的浓度为20～40mg/mL,优选26.5mg/mL；
将获得的反应液G用超纯水透析2～4天，优选3天，冷冻干燥后得到白色固体为目标物质；其中透析袋的截留分子量优选为3500Da。
本发明的合成路线图可以如图1所示：
将羟乙基淀粉与氯乙酸在氢氧化钠存在的条件下反应生成式(Ⅱ)所示的羧甲基化羟乙基淀粉；
将步骤(1)获得的羧甲基化羟乙基淀粉与2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在的条件下反应生成式(Ⅲ)所示的羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物；
将羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物与正十八硫醇反应生成式(Ⅳ)所示的同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉；
将同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉和巯基化的iRGD肽反应生成具有式(I)结构的化合物(iRGD-HES-SS-C18)。
本发明的第三个目的，提供了上述羟烷基淀粉偶联物或羟烷基淀粉偶联物的制备方法在制备靶向药物载体中的应用。
其中，可以将本发明的羟烷基淀粉偶联物分散在超纯水中，该羟烷基淀粉偶联物在超纯水中可以自组装成纳米簇，可以以高的包封率和载药量负载药物，药物优选为阿霉素。
其中，组装成的纳米簇的平均直径为100～300nm，优选为200nm。
本发明提供的纳米簇具有还原响应性释药的性质，在肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽(GSH)的存在下可以解组装，释放负载的药物。
本发明提供的纳米簇具有肿瘤靶向性，负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇比负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇和游离阿霉素具有更强的肿瘤细胞杀伤效果，而iRGD靶向纳米簇本身具有良好的生物相容性。
总体而言，通过本发明的技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明在羟烷基淀粉上通过共价偶联如二硫键偶联了疏水链段，并修饰了iRGD肽作为肿瘤靶向分子，得到iRGD靶向的还原响应性羟烷基淀粉偶联物。该偶联物在超纯水水中可以自组装成纳米簇，并可以以高的包封率和载药量负载阿霉素。
(2)本发明提供的纳米簇具有还原响应性释药的性质，在肿瘤细胞内高浓度GSH的存在下可以解组装，释放负载的药物。
(3)本发明提供的纳米簇具有肿瘤靶向性，负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇比负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇和游离阿霉素具有更强的肿瘤细胞杀伤效果，而iRGD靶向纳米簇本身具有良好的生物安全性。
附图说明
图1为本发明一个优选实施方式中式(I)物质的合成路线图；
图2为本发明实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物的核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物的红外光谱图；
图4为本发明实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物在超纯水中自组装成纳米簇的粒径分布图；
图5为本发明实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物在超纯水中自组装成纳米簇的电镜图；
图6为本发明试验例3中负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇的药物释放图；
图7为本发明实施例3中负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇的肿瘤细胞杀伤效果图。
图8为本发明实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物自组装成纳米簇的生物安全性评价图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种羟乙基淀粉偶联物，包括如下步骤：
(1)将羟乙基淀粉1.00g(糖环为5.6mmol)溶于20mL超纯水，加入氢氧化钠0.85g(21.2mmol)活化羟基，室温搅拌0.5h，得到反应液A，再向反应液A中加入氯乙酸1.00g(10.6mmol),室温搅拌溶解，然后移至70℃油浴搅拌反应3h，得到反应液B；
(2)将步骤(1)获得的反应液B倾入至200mL甲醇中，搅拌，得到混悬液C；
(3)将步骤(2)获得的混悬液C过滤，得到白色沉淀，用甲醇分三次洗涤沉淀，每次50mL，再在室温下真空干燥，得到干燥的白色沉淀；
(4)将步骤(3)获得的干燥的白色沉淀复溶于超纯水，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，冷冻干燥后得到白色固体为羧甲基化羟乙基淀粉；
(5)将步骤(4)获得的羧甲基化羟乙基淀粉1.0g(羧基为0.6mmol)溶于30mL超纯水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐383.4mg(2.0mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺115.1mg(1.0mmol)和2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐220.5mg(1.0mmol)，室温搅拌反应48h，得到反应液D；
(6)将步骤(5)获得的反应液D用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，冷冻干燥后得到白色固体为羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物；
(7)将步骤(6)获得的羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物195.6mg(2-吡啶基为0.11mmol)溶于5mL二甲亚砜，加入正十八硫醇20.0mg(0.07mmol)，室温搅拌反应24h，得到反应液E；
(8)将步骤(7)获得的反应液E倾入至50mL乙醇/乙醚混合溶剂(1:1,V/V)中，搅拌，得到混悬液F；
(9)将步骤(8)获得的混悬液F过滤得到白色沉淀，用乙醇/乙醚混合溶剂(1:1,V/V)分三次洗涤白色沉淀，每次10mL，再在室温下真空干燥，得到干燥的白色沉淀；
(10)将步骤(9)获得的干燥的白色沉淀分散于超纯水，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，冷冻干燥后得到白色固体为同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉；
(11)将步骤(10)获得的同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉79.5mg(2-吡啶基为0.014mmol)分散于3mL超纯水，加入巯基化iRGD肽21.0mg(0.020mmol)，室温搅拌反应24h,得到反应液G；
(12)将步骤(11)获得的反应液G用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量优选为3500Da，冷冻干燥后得到白色固体为目标羟乙基淀粉偶联物。
实施例2
本实施例提供了一种羟乙基淀粉偶联物，包括如下步骤：
步骤(1)～(6)和实施例1相同
(7)将步骤(6)获得的羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物195.6mg(2-吡啶基为0.11mmol)溶于5mL二甲亚砜，加入正十八硫醇17.2mg(0.06mmol)，室温搅拌反应24h，得到反应液E；
(8)将步骤(7)获得的反应液E倾入至50mL乙醇/乙醚混合溶剂(1:1,V/V)中，搅拌，得到混悬液F；
(9)将步骤(8)获得的混悬液F过滤得到白色沉淀，用乙醇/乙醚混合溶剂(1:1,V/V)分三次洗涤白色沉淀，每次10mL，再在室温下真空干燥，得到干燥的白色沉淀；
(10)将步骤(9)获得的干燥的白色沉淀分散于超纯水，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，冷冻干燥后得到白色固体为同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉；
(11)将步骤(10)获得的同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉79.5mg(2-吡啶基为0.018mmol)分散于3mL超纯水，加入巯基化iRGD肽26.5mg(0.025mmol)，室温搅拌反应24h,得到反应液G；
(12)将步骤(11)获得的反应液G用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量优选为3500Da，冷冻干燥后得到白色固体为目标物质羟乙基淀粉偶联物。
实施例3
本实施例提供了一种羟乙基淀粉偶联物，包括如下步骤：
步骤(1)～(6)和实施例1相同
(7)将步骤(6)获得的羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物195.6mg(2-吡啶基为0.11mmol)溶于5mL二甲亚砜，加入正十八硫醇22.9mg(0.08mmol)，室温搅拌反应24h，得到反应液E；
(8)将步骤(7)获得的反应液E倾入至50mL乙醇/乙醚混合溶剂(1:1,V/V)中，搅拌，得到混悬液F；
(9)将步骤(8)获得的混悬液F过滤得到白色沉淀，用乙醇/乙醚混合溶剂(1:1,V/V)分三次洗涤白色沉淀，每次10mL，再在室温下真空干燥，得到干燥的白色沉淀；
(10)将步骤(9)获得的干燥的白色沉淀分散于超纯水，用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量为3500Da，冷冻干燥后得到白色固体为同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉；
(11)将步骤(10)获得的同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉79.5mg(2-吡啶基为0.011mmol)分散于3mL超纯水，加入巯基化iRGD肽15.4mg(0.015mmol)，室温搅拌反应24h,得到反应液G；
(12)将步骤(11)获得的反应液G用超纯水透析3天，其中透析袋的截留分子量优选为3500Da，冷冻干燥后得到白色固体为目标物质羟乙基淀粉偶联物。
试验例1
实施例1中目标羟乙基淀粉偶联物的化学结构确认：
采用核磁共振氢谱和红外光谱确认实施例1制备的目标物质的化学结构。图2和图3为本发明实施例1制备的目标物质的红外光谱图和核磁共振氢谱图。
由图2可知，与羟乙基淀粉的红外光谱相比，羧甲基化羟乙基淀粉的红外光谱图在1593cm-1处出现了一个新的吸收峰，归属于羧基负离子的非对称伸缩振动峰。与羧甲基化羟乙基淀粉的红外光谱图相比，羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物在1643cm-1处的吸收峰增强，在1581cm-1处出现一个新的吸收峰，分别归咎于新形成的酰胺键中C＝O伸缩振动和2-吡啶基中芳环骨架振动。与羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物的红外光谱图相比，同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和正十八硫醇的羟乙基淀粉的红外光谱图在2922和2852cm-1处的吸收峰增强，归咎于正十八硫醇中饱和C-H的非对称和对称伸缩振动，而在1581cm-1处的吸收峰减弱，归咎于2-吡啶基二硫基与十八硫醇之间的交换。与同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和正十八硫醇的羟乙基淀粉的红外光谱图相比，实施例1目标物质的红外光谱图在1643cm-1处的吸收峰增强，在1552cm-1处出现了一个新的吸收峰，分别归咎于iRGD肽酰胺键中C＝O伸缩振动和N-H弯曲振动。
由图3可知，羧甲基化羟乙基淀粉的核磁谱图在4.12ppm处出现的峰，对应于羧甲基中的亚甲基氢。羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物的核磁谱图在7.2～8.6和2.9ppm处出现的峰，分别对应于2-(2-吡啶基二硫基)乙胺中的芳香氢和亚甲基氢。同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和正十八硫醇的羟乙基淀粉的核磁谱图在0.86、1.17～1.40、1.60、2.29和2.71ppm处出现的峰，对应于十八硫醇中的甲基和亚甲基氢。实施例1目标物质的核磁谱图显示2-吡啶基的核磁信号消失，表明巯基化iRGD肽的成功取代。
通过核磁共振氢谱图分别计算了羧甲基化羟乙基淀粉中羧甲基的取代度(MSCM)、羟乙基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物中2-(2-吡啶基二硫基)乙胺的取代度(MSPDA)、同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和正十八硫醇的羟乙基淀粉中正十八硫醇的取代度(MSC18)以及式(Ⅰ)物质中iRGD肽的取代度(MSiRGD)。取代度定义为羟乙基淀粉平均每100个糖环上所偶联的取代基个数。
实施例1中，MSCM计算为10.9％，MSPDA计算为10.8％，MSC18计算为7.1％，MSiRGD计算为3.6％。
实施例2中，MSCM计算为10.9％，MSPDA计算为10.8％，MSC18计算为5.8％，MSiRGD计算为4.4％。
实施例3中，MSCM计算为10.9％，MSPDA计算为10.8％，MSC18计算为7.9％，MSiRGD计算为2.8％。
试验例2
实施例1中得到的羟乙基淀粉偶联物的自组装行为：
实验溶液的配制：称取本发明实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物4mg，加入2mL超纯水，超声分散5min，配制成2mg/mL的水溶液；称取20mg磷钨酸，溶于1mL超纯水，配制成2％的磷钨酸水溶液。
取1mL本实施例制备的羟乙基淀粉偶联物水溶液，用动态光散射对本实施例制备的羟乙基淀粉偶联物组装体的粒径分布进行测量。
图4为本实施例制备的羟乙基淀粉偶联物组装体的粒径分布图。实验结果表明，本实施例制备的羟乙基淀粉偶联物组装体粒径呈正态分布，粒径分布较窄，平均直径约200nm。
取50μL本实施例制备的羟乙基淀粉偶联物水溶液，滴加在覆盖有碳支持膜的铜网上，在空气中自然干燥，然后用2％磷钨酸染色2min，用透射电子显微镜对本实施例制备的羟乙基淀粉偶联物组装体的形貌进行观察。
图5为本实施例制备的羟乙基淀粉偶联物组装体的电镜图。实验结果表明，本实施例制备的羟乙基淀粉偶联物组装体呈近似球形，由较小的纳米颗粒组成，具有纳米簇的形貌特征，粒径分布均一，直径约200nm。
试验例3
羟乙基淀粉偶联物自组装纳米簇的载药行为：
载药方法：称取本发明实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物33mg，加入6mL超纯水，超声分散5min；称取盐酸阿霉素7mg，溶于1mL超纯水，加入4mg三乙胺对盐酸阿霉素进行脱盐酸；然后将阿霉素水溶液加入至本发明实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物的水溶液，室温搅拌6h,用超纯透析2天，透析袋截留分子量为3500Da，冷冻干燥后得到负载有阿霉素的iRGD靶向纳米簇。
通过同样的方法以同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和十八硫醇的羟乙基淀粉制备了负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇。
通过紫外分光光度法检测本实施例制备的载药纳米簇的载药量。将本实施例制备的载药纳米簇称重测得质量W1，通过紫外分光光度法测得本实施例制备的载药纳米簇中阿霉素的质量W2，载药量(DLC)采用公式DLC(％)＝W2/W1×100％。
将盐酸阿霉素的投料量设为W3，本发明实施例1制备的式(Ⅰ)或式(Ⅳ)物质投料量设为W4，理论载药量(DLCt)采用公式DLCt(％)＝W3/(W3+W4)×100％。
包封率(EE)采用公式EE(％)＝DLC/DLCt×100％。
本实施例制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇中阿霉素的载药量和包封率分别为15.1％和84.0％，本实施例制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇中阿霉素的包封率和载药量分别为14.0％和76.8％。
试验例4
试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇的药物释放行为：
药物溶液的配制：将本发明试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇溶解在水中，超声5min，配制成1.0mg/mL的水溶液。
释放液的配制：
(1)释放液I(PBS pH7.4,DTT 20mmol/L)：称取8g氯化钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，2.16g十二水合磷酸氢二钠，3.08g DTT，5g吐温-80，加入超纯水溶解，并定容至1000ml，然后用氢氧化钠溶液调节pH至7.4。
(2)释放液II(PBS pH7.4)：称取8g氯化钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，2.16g十二水合磷酸氢二钠，5g吐温-80，加入超纯水溶解，并定容至1000ml，然后用氢氧化钠溶液调节pH至7.4。
将1mL药物溶液装入透析袋中(截留分子量：3500Da)，密封，然后将装有药物溶液的透析袋浸没在30mL的释放液中，再置于摇床中震荡，温度为37℃，转速为150rpm。分别在1、2、3、4、6、16、28和48h时间点取出1mL释放液，再补充1mL相应的释放液。每种释放液中的药物释放实验平行做三组。药物释放实验全程在避光的条件下进行。取出的释放液通过荧光测定药物浓度并计算累积释放量。试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇的累积释放量结果见表1。
表1试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇的累积释放量结
果
由表1可知，试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇在含20mmol/L DTT的释放液I中释放速度明显快于不含DTT的释放液II，并且在释放液I中释放更完全。在不含DTT的释放液II条件下，试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇在48h的药物释放总量只有38.4％，而在含20mmol/L DTT的释放液I条件下，试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇在48h的药物释放总量可以达到59.4％。这表明，本发明试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇具有还原响应性药物释放的特性。通过DTT模拟还原性环境可知，本发明负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇具有还原响应性药物释放的特性，在肿瘤细胞内高浓度GSH的存在下可以解组装，释放负载的药物。图6为试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇的药物释放曲线图。
试验例5
试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇的体外抗肿瘤活性：
实验药物的配制：将本发明试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇溶解在超纯水中，超声5min，配制成6.6mg/mL水溶液(其中阿霉素含量为1mg/mL)；将本发明试验例3制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇溶解在超纯水中，超声5min，配制成7.1mg/mL水溶液(其中阿霉素含量为1mg/mL)；将游离阿霉素溶解在水中配制成1mg/mL的阿霉素水溶液。
HepG-2细胞杀伤实验分为三个组，游离阿霉素实验组、试验例3制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇实验组和试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇实验组。每个实验组由配制的高浓度水溶液(其中阿霉素含量为1mg/mL)通过DMEM培养基稀释成0.1、0.4、0.7、1、3、5和10μg/mL的浓度并加入至96孔板中和细胞孵育，每孔细胞数量约为5000，每个实验组中的每个浓度重复4个孔，6h后将含有药物的培养基移去，并用无菌PBS缓冲液(pH 7.4,6.7mmol/L)洗三次，补充新鲜的培养基，然后继续培养18h。
细胞存活率通过MTT方法检测，以空白培养基孵育的细胞作为100％存活率。游离阿霉素实验组(DOX)、试验例3制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇实验组(DOX@HES-SS-C18)和试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇实验组(DOX@iRGD-HES-SS-C18)对HepG-2细胞杀伤效果见表3。
表2HepG-2细胞杀伤效果
由表2可知，与游离阿霉素实验组和试验例3制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇实验组实相比，试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇实验组的细胞存活率显著降低，抑制HepG-2细胞生长作用明显。相比游离阿霉素实验组(IC50为5.3μg/mL)和试验例3制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇实验组(IC50为5.4μg/mL)，试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇实验组的半抑制浓度显著降低(IC50仅为2.8μg/mL)，表明试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇比试验例3制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇和游离阿霉素具有更强的HepG-2细胞杀伤作用。
4T1细胞杀伤实验也分为三个组，游离阿霉素实验组、试验例3制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇实验组和试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇实验组。每个实验组由配制的高浓度水溶液(其中阿霉素含量为1mg/mL)通过DMEM培养基稀释成0.1、0.4、0.7、1、3、5、10、20和30μg/mL的浓度并加入至96孔板中和细胞孵育，每孔细胞数量约为5000，每个实验组中的每个浓度重复4个孔，6h后将含有药物的培养基移去，并用无菌PBS缓冲液(pH7.4,6.7mmol/L)洗三次，补充新鲜的培养基，然后继续培养18h。
细胞存活率通过MTT方法检测，以空白培养基孵育的细胞作为100％存活率。游离阿霉素实验组(DOX)、试验例3制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇实验组(DOX@HES-SS-C18)和试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇实验组(DOX@iRGD-HES-SS-C18)对4T1细胞杀伤效果见表3。
表3 4T1细胞杀伤效果
由表3可知，与游离阿霉素实验组和试验例3制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇实验组实相比，试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇实验组的细胞存活率显著降低。相比游离阿霉素实验组(IC50为16.5μg/mL)和试验例3制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇实验组(IC50为14.7μg/mL)，试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇实验组的半抑制浓度显著降低(IC50仅为6.2μg/mL)，表明试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇比试验例3制备的负载有阿霉素、没有iRGD靶向的纳米簇和游离阿霉素对4T1细胞具有更强的杀伤作用。图7为本发明试验例3制备的负载有阿霉素、iRGD靶向纳米簇的肿瘤细胞杀伤效果图。
试验例6
式(I)物质自组装纳米簇的生物安全性：
实验药物的配制：将本发明实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物溶解在超纯水中，超声5min，配制成20mg/mL的水溶液。
通过DMEM培养基将实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物的高浓度水溶液(20mg/mL)稀释成0.001、0.01、0.1、0.5和1mg/mL的浓度并加入至96孔板中和细胞孵育，每孔细胞数量约为5000，每个浓度重复4个孔，6h后将含有药物的培养基移去，并用无菌PBS缓冲液(pH7.4,6.7mmol/L)洗三次，补充新鲜的培养基，然后继续培养18h。
细胞存活率通过MTT方法检测，以空白培养基孵育的细胞作为100％存活率。
图8为本发明实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物自组装纳米簇的生物安全性评价图。由图8可知，实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物自组装纳米簇在0.001～1mg/mL的浓度范围内，HepG-2和4T1细胞的存活率均高于90％，表明本发明实施例1制备的羟乙基淀粉偶联物自组装纳米簇具有良好的生物相容性。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种羟烷基淀粉偶联物，其特征在于，所述羟烷基淀粉偶联物由疏水链段和iRGD肽分别共价偶联至羟烷基淀粉上形成。
2.根据权利要求1所述的羟烷基淀粉偶联物，其特征在于，所述疏水链段和iRGD肽分别通过二硫键共价偶联至所述羟烷基淀粉上。
3.根据权利要求1或2所述的羟烷基淀粉偶联物，其特征在于，所述羟烷基淀粉为羟乙基淀粉、羟丙基淀粉或羟丁基淀粉，优选为羟乙基淀粉；所述羟乙基淀粉的平均分子量优选为25～480kDa，所述羟乙基的摩尔取代度为0.4～0.6；
和/或，所述疏水链段为C15～C20的直链烷烃，优选为C18的直链烷烃。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的羟烷基淀粉偶联物，其特征在于，所述羟烷基淀粉、所述疏水链段、所述iRGD肽的摩尔比100:5.5～9.0:1.8～5.4，优选为100:7.1:3.6。
5.权利要求1至4中任一项所述的羟烷基淀粉偶联物的制备方法，其特征在于，包括：
1)使所述羟烷基淀粉羧甲基化得到羧甲基化羟烷基淀粉；
2)使所述羧甲基化羟烷基淀粉与2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸反应，得到羟烷基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物；
3)使所述羟烷基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物与带有羟基的所述疏水链段反应，得到同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和所述疏水链段的羟烷基淀粉；
4)使所述同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和所述疏水链段的羟烷基淀粉与巯基化的iRGD肽反应，得到所述羟烷基淀粉偶联物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：
将所述羟烷基淀粉与氯乙酸在碱性条件下反应得到所述羧甲基化羟烷基淀粉；所述反应温度优选为50-80℃，反应时间优选为2-4h；所述羟烷基淀粉、氯乙酸的摩尔比优选为(0.5～1.5):1.9，进一步优选为1:1.9。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体为：
使所述羧甲基化羟烷基淀粉与2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在的条件下反应，得到羟烷基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物；所述羧甲基化羟烷基淀粉中的游离羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐反应摩尔比优选为(0.4～1.0):2:1:1，进一步优选为0.6:2:1:1；所述反应时间优选为24～48h，优选48h。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中：
所述羟烷基淀粉-2-(2-吡啶基二硫基)乙胺偶联物中2-吡啶基和带有羟基的所述疏水链段的摩尔比为1.5:(0.8～1.2)，优选1.5:1；所述反应时间优选为24～48h，进一步优选为24h；所述疏水链段优选为C15～C20的直链烷烃。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述同时偶联有2-(2-吡啶基二硫基)乙胺和所述疏水链段的羟烷基淀粉2-吡啶基和所述巯基化iRGD肽的摩尔比优选为1:(1.2～1.5)，进一步优选为1:1.4；所述反应时间优选为24～48h，进一步优选为24h。
10.权利要求1至4中任一项所述的羟烷基淀粉偶联物或权利要求5至9中任一项所述的羟烷基淀粉偶联物的制备方法在靶向药物载体中的应用。
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