CN110317281B - 透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了透明质酸‑g‑叶酸两亲性聚合物及其应用，主链为亲水性透明质酸、侧链为疏水性的叶酸，可高效稳定负载小分子抗癌药物，延长药物的血液循环时间；在肿瘤部位的富集量高，达到12.0%ID/g，到达肿瘤组织后，双重靶向纳米药物与肿瘤细胞表面紧密结合并通过受体介导的内吞作用有效进入肿瘤细胞内，然后在肿瘤细胞内实现药物快速释放，从而产生高效治疗作用。本发明聚合物生物相容性和可降解性好，方便排出体外；克服了药物运载效率低、肿瘤部位富集量少、细胞内吞效率低、细胞内释放慢等不足；而且本方法制备简单，原料来源丰富，所得纳米药物具有优异的冻干再分散性能，有利于大规模生产和应用。

Description

透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物及其应用
技术领域
本发明属于聚合物纳米药物技术领域，涉及一种基于纯天然物质的生物相容性、生物可降解聚合物材料及其应用，具体涉及一种叶酸接枝的透明质酸两亲性聚合物、以及由其制备的双重靶向抗肿瘤纳米药物与应用。
背景技术
聚合物纳米粒子作为抗癌药物载体在癌症治疗方面具有显著的优势，然而现有的聚合物纳米药物在肿瘤中的分布一般为1-5%ID/g，导致药物的生物利用率差。研究者们在纳米药物表面键合靶向分子以引导纳米药物特异性地结合靶细胞并介导其细胞内吞，期望实现主动靶向治疗，从而提高疗效并降低全身毒性。此举虽然可以在一定程度上增加疗效，但一方面由于细胞表面的受体处于动态变化过程且受体-配体结合存在饱和状态，限制了单一靶向纳米药物的疗效；另一方面会增加制备成本，并可能对纳米药物的结构尺寸等造成影响。
此外，现有的纳米药物大多设计复杂，且生物相容性和生物可降解性欠佳。因此，开发可双重靶向肿瘤、制备简单、无需额外修饰靶向分子、生物相容性好、且冻干粉剂再分散性能优异的纳米药物具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是，提供一种叶酸接枝的透明质酸两亲性聚合物及其制备方法和应用，并基于其制备双重靶向的抗肿瘤纳米药物，提高了纳米药物在肿瘤部位的富集量，提高肿瘤细胞选择性，增强细胞的摄取能力。
为达到上述目的，本发明具体的技术方案为：
透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物，其主链为透明质酸，侧链为叶酸；所述透明质酸的分子量为8～500 kDa，优选10～100 kDa；叶酸的取代度为3～18%，优选5～15%；叶酸和透明质酸之间通过酯键连接。所述透明质酸-g-叶酸的化学结构式如下（n = 21～1325，m =0.06n～0.36n）：
Figure 532644DEST_PATH_IMAGE001
上述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物称为HA-g-FA聚合物，可以通过一步酯化反应得到：所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物的制备方法包括以下步骤，透明质酸与叶酸在N,N’-二环己基碳二亚胺、4-(二甲氨基)吡啶存在下通过一步酯化反应得到所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物；即透明质酸（HA）的羟基与叶酸（FA）的羧基在N,N’-二环己基碳二亚胺/4-(二甲氨基)吡啶（DCC/DMAP）催化下通过酯化反应得到HA-g-FA两亲性聚合物。更具体为所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物的制备方法包括以下步骤，将N,N’-二环己基碳二亚胺加入叶酸溶液中，于30℃搅拌12小时后，加入4-(二甲氨基)吡啶和透明质酸溶液，于30℃下反应24小时，然后经透析、冻干得到所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物；比如在FA的二甲亚砜（DMSO）溶液中加入DCC，于30℃搅拌12小时后，接着加入DMAP和HA的DMSO溶液，于30℃下反应24小时，然后经透析、冻干得到HA-g-FA两亲性聚合物。本发明的反应条件温和，通过调节反应条件调控叶酸的取代度，具有优异的技术效果，同时由于通过透明质酸的羟基修饰叶酸，且控制叶酸的取代度低于20%，不影响透明质酸的靶向性；尤其是解决了现有技术高温（60～80℃）反应的缺陷，避免了60℃带来的透明质酸降解的问题。
取代度的修饰比例太高会影响透明质酸本身的物理化学性质，并且导致透明质酸的靶向性降低或丧失；取代度过高可能导致疏水性太强，包裹的药物释放速度缓慢，不利于癌症的治疗；取代度过高，疏水作用力大，可能导致叶酸暴露于纳米药物表面的含量较少，不利于叶酸靶向；叶酸太多对纳米药物的粒径、载药能力及靶向能力无明显帮助，它们均存在平台效应。本发明的透明质酸-g-叶酸聚合物具有两亲性，且叶酸本身可形成氢键，其在水溶液中能够与可形成氢键的疏水抗癌药物组装形成纳米药物，因此本发明公开了一种双重靶向的纳米药物，所述纳米药物由上述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物与小分子抗癌药物组装形成；该纳米药物的亲水外层主要由具有主动靶向的透明质酸构成，表面暴露有少量可主动靶向的叶酸，疏水内层由叶酸和疏水药物构成。
上述技术方案中，所述小分子抗癌药物可选自但不局限于：阿霉素、表阿霉素或者索拉菲尼等。
优选的技术方案中，双重靶向的纳米药物中，载体对小分子抗癌药物的包封率为45%～80%；所述纳米药物的载药量为5%～32 wt.%，纳米药物的粒径为50～200纳米，粒径分布为0.05～0.30。
本发明还公开了上述双重靶向纳米药物的制备方法，搅拌下，将含有透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物与小分子抗癌药物的溶液滴入水中，然后透析，得到双重靶向纳米药物；具体为先将小分子药物和上述透明质酸-g-叶酸聚合物两亲性聚合物分别溶解在二甲亚砜中，再混合均匀后，缓慢滴入搅拌下的超纯水中，将得到的溶液搅拌3-5分钟后依次用水和磷酸缓冲液透析，即得到双重靶向纳米药物。
上述方法得到的纳米药物，在高倍稀释、加入血清及长期存放过程中均具有优异的稳定性，且其冻干粉再分散性能优异。
本发明公开了一种双重靶向纳米药物冻干粉，其制备方法为，搅拌下，将含有透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物与小分子抗癌药物的溶液滴入超纯水中，然后透析，得到双重靶向纳米药物；接着将双重靶向纳米药物采用液氮冷冻，并在冷冻干燥机上冻干，得到双重靶向纳米药物冻干粉。
本发明公开了上述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物、双重靶向纳米药物或者双重靶向纳米药物冻干粉在制备抗肿瘤药物中的应用。上述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物在制备上述双重靶向纳米药物或者双重靶向纳米药物冻干粉中的应用；或者上述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物作为小分子抗癌药物载体或者在制备小分子抗癌药物载体中的应用。优选的，肿瘤为卵巢癌。
上述基于透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物的纳米药物具有双主动靶向性，可延长药物的体内血液循环时间，提高药物特异性识别肿瘤的能力，增加药物在肿瘤细胞中的内吞量；同时纳米药物在细胞内溶酶体/内涵体酸性条件下，可快速释放药物，从而提高药物的生物利用度；并且两亲性聚合物基于全天然的透明质酸和叶酸合成得到，在体内透明质酸酶的作用下可快速降解，方便排出体外。
本发明中，所述纳米药物载体由全天然的靶向分子透明质酸和叶酸构成，透明质酸是一种亲水性的天然多糖，能够与多种恶性肿瘤（如卵巢癌）结合；叶酸可部分暴露于纳米药物表面，并与恶性肿瘤（如卵巢癌）结合；纳米药物通过受体介导的内吞作用有效内吞进入肿瘤细胞内，并在肿瘤细胞内的酸性环境下，快速释放药物，高效杀死癌细胞。
由于上述方案的实施，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1.本发明公开的透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物，基于全天然的透明质酸和叶酸通过一步酯化反应得到，反应条件温和，制备简单，可大批量生产，且生物相容性好，可方便排出体外；克服了现有技术中设计制备复杂、反应条件苛刻（如高温，可导致透明质酸降解）、生物相容性和降解性差、难以临床转化的缺陷。
2.本发明公开的基于透明质酸-g-叶酸的双重靶向纳米药物制备简单，通过冷冻干燥可得到冻干粉剂，便于长期稳定储存，加入水或缓冲溶液重新分散即可使用，粒径变化小；克服了现有纳米药物需要复杂的条件、不易保存、使用不便等缺陷。
3. 本发明公开的基于透明质酸-g-叶酸的双重靶向纳米药物具备优异的稀释、血清和储存稳定性，从而保证纳米药物稳定，延长了药物的体内循环时间；克服了现有技术中药物泄漏、运载效率低的缺陷；并且该纳米药物可在酸性环境中快速释放药物，发挥药效。
4. 本发明公开的基于透明质酸-g-叶酸的双重靶向纳米药物具有CD44和叶酸受体双重靶向的性能，可以高效主动靶向到肿瘤细胞表面，并通过受体介导的内吞作用进入到肿瘤细胞内，有效增加细胞内吞能力；克服了普通纳米药物肿瘤细胞选择性差和细胞摄取能力低等问题。
5.本发明公开的基于透明质酸-g-叶酸的双重靶向纳米药物由全天然的靶向分子构成，无需额外修饰靶向分子即可有效进入肿瘤细胞内，在肿瘤部位的富集率高，达到12.0%ID/g，远高于现有技术的水平；对肿瘤细胞具有高细胞毒性。
6. 本发明公开的纳米药物在荷卵巢癌小鼠移植模型中展现了优异的肿瘤抑制效果，且毒副作用较小，在癌症的治疗领域具有较大的应用潜力。
附图说明
图1为实施例一中HA-g-FA两亲性聚合物的合成路线图；
图2为实施例一中HA-g-FA两亲性聚合物的核磁图；
图3为实施例十中HA/FA-NPs-DOX纳米药物的粒径分布图；
图4为实施例十三中HA/FA-NPs-DOX纳米药物在高倍稀释、加入血清、长期储存及冻干再分散后的粒径变化图；
图5为实施例十三中HA/FA-NPs-DOX纳米药物的体外药物释放结果图；
图6为实施例十四中HA/FA-NPs-DOX纳米药物表面叶酸含量的表征；
图7为实施例十七中HA/FA-NPs-DOX纳米药物在SKOV-3细胞以及FA封闭、HA封闭或FA/HA双封闭的SKOV-3细胞内的摄取和药物释放结果图；
图8为实施例十八中不同HA/FA-NPs-DOX纳米药物对SKOV-3细胞的细胞毒性结果图；
图9为实施例十八中HA/FA-NPs-DOX纳米药物在SKOV-3细胞以及FA封闭、HA封闭或FA/HA双封闭的SKOV-3细胞中的细胞毒性结果图；
图10为实施例十九中HA/FA-NPs-DOX纳米药物在小鼠体内的血液循环结果图；
图11为实施例二十中HA/FA-NPs-DOX纳米药物以及Lipo-DOX在荷SKOV-3肿瘤裸鼠各脏器的体外荧光成像结果图；
图12为实施例二十一中HA/FA-NPs-DOX纳米药物以及Lipo-DOX在荷SKOV-3肿瘤裸鼠各脏器的生物分布结果图；
图13为实施例二十二中HA/FA-NPs-DOX纳米药物在荷SKOV-3皮下瘤裸鼠体内的相对肿瘤生长变化结果图。
图14为实施例二十二中HA/FA-NPs-DOX纳米药物在荷SKOV-3皮下瘤裸鼠体内的相对体重生长变化结果图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一 合成聚合物透明质酸-叶酸（HA-g-FA）(M nHA = 35 kDa，DS = 8.5%)
图1为实施例中聚合物HA-g-FA的合成路线图。在氮气氛围下，向叶酸（FA，175 mg，0.40 mmol）的无水二甲亚砜（DMSO，5 mL）溶液中加入1.5 mL N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC，163 mg，0.79 mmol）的DMSO溶液，于30℃搅拌12小时，然后依次加入1 mL 4-二甲氨基吡啶（DMAP，97 mg，0.79 mmol）和4 mL透明质酸（HA，200 mg，0.53 mmol -CH2OH）的无水DMSO溶液，在30℃反应24小时。反应结束后，经抽滤、透析、冷冻干燥得到透明质酸-g-叶酸（HA-g-FA）聚合物，产率93%。核磁图见图2,1H NMR(D2O：DMSO-d 6 ):透明质酸（HA）: δ(ppm)1.86–2.01，3.28–4.02，4.21–4.75； 叶酸（FA）: δ(ppm) 6.64，7.63，8.61。核磁结果表明其结构为透明质酸-g-叶酸（HA-g-FA），通过紫外可见光谱定量叶酸的取代度(DS)为8.5%，取代度为每100个糖单元上取代的叶酸个数。
实施例二 合成聚合物HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 6.4%)
于氮气氛围下，在叶酸（FA，116 mg，0.26 mmol）的无水DMSO（3 mL）溶液中加入1mL DCC（109 mg，0.53 mmol）的无水DMSO溶液，于30℃搅拌12小时，然后依次加入1 mL DMAP（64 mg，0.53 mmol）和4 mL透明质酸（HA，200 mg，0.53 mmol -CH2OH）的DMSO溶液，在30℃反应24小时。反应结束后，经抽滤、透析、冷冻干燥得到透明质酸-g-叶酸（HA-g-FA）聚合物，产率93%。核磁结果表明其结构为HA-g-FA，其中FA的取代度(DS)为6.4%。
实施例三 合成聚合物HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 11.1%)
于氮气氛围下，在叶酸（FA，232 mg，0.52 mmol）的无水DMSO（6 mL）溶液中加入2mL DCC（218 mg，1.06 mmol）的无水DMSO溶液，于30℃搅拌12小时，然后依次加入1 mL DMAP（128 mg，1.06 mmol）和4 mL透明质酸（HA，200 mg，0.53 mmol -CH2OH）的无水DMSO溶液，在30℃反应24小时。反应结束后，经抽滤、透析、冷冻干燥得到透明质酸-g-叶酸（HA-g-FA）聚合物，产率93%。核磁结果表明其结构为HA-g-FA，其中叶酸的取代度(DS)为11.1%。
实施例四 合成聚合物HA-g-FA (M nHA = 20 kDa，DS = 7.5%)
于氮气氛围下，在叶酸（FA，116 mg，0.26 mmol）的DMSO（3 mL）溶液中加入1 mLDCC（109 mg，0.53 mmol）的DMSO溶液，于30℃搅拌12小时，然后依次加入1 mL DMAP（64 mg，0.53 mmol）和4 mL透明质酸（HA，200 mg，0.53 mmol -CH2OH）的DMSO溶液，在30℃反应24小时。反应结束后，经抽滤、透析、冷冻干燥得到透明质酸-g-叶酸（HA-g-FA）聚合物，产率93%。核磁结果表明其结构为HA-g-FA，其中叶酸的取代度(DS)为7.5%。
实施例五 合成聚合物HA-g-FA (M nHA = 20 kDa，DS = 10.2%)
于氮气氛围下，在叶酸（FA，116 mg，0.26 mmol）的无水DMSO（3 mL）溶液中加入1mL DCC（109 mg，0.53 mmol）的DMSO溶液，于30℃搅拌12小时，然后依次加入1 mL DMAP（64mg，0.53 mmol）和4 mL透明质酸（HA，200 mg，0.53 mmol -CH2OH）的无水DMSO溶液，在30℃反应24 小时。反应结束后，经抽滤、透析、冷冻干燥得到透明质酸-g-叶酸（HA-g-FA）聚合物，产率93%。核磁结果表明其结构为HA-g-FA，其中叶酸的取代度(DS)为10.2%。
实施例六 合成聚合物HA-g-FA (M nHA = 20 kDa，DS = 13.4%)
于氮气氛围下，在叶酸（FA，232 mg，52 mmol）的无水DMSO（6 mL）溶液中加入2 mLDCC（218 mg，1.06 mmol）的DMSO溶液，于30℃搅拌12小时，然后依次加入1 mL DMAP（128mg，1.06 mmol）和4 mL透明质酸（HA，200 mg，0.53 mmol -CH2OH）的无水DMSO溶液，在30℃反应24 小时。反应结束后，经抽滤、透析、冷冻干燥得到透明质酸-g-叶酸（HA-g-FA）聚合物，产率93%。核磁结果表明其结构为HA-g-FA，其中叶酸的取代度(DS)为13.4%。
实施例七 合成聚合物HA-g-FA (M nHA = 50 kDa，DS = 10.6%)
于氮气氛围下，在叶酸（FA，232 mg，52 mmol）的无水DMSO（6 mL）溶液中加入2 mLDCC（218 mg，1.06 mmol）的DMSO溶液，于30℃搅拌12小时，然后依次加入1 mL DMAP（128mg，1.06 mmol）和4 mL透明质酸（HA，200 mg，0.53 mmol -CH2OH）的无水DMSO溶液，在30℃反应24 小时。反应结束后，经抽滤、透析、冷冻干燥得到透明质酸-g-叶酸（HA-g-FA）聚合物，产率93%。核磁结果表明其结构为HA-g-FA，其中叶酸的取代度(DS)为10.6%。
实施例八 合成聚合物HA-g-FA (M nHA = 8.9 kDa，DS = 10.5%)
于氮气氛围下，在叶酸（FA，232 mg，52 mmol）的无水DMSO（6 mL）溶液中加入2 mLDCC（218 mg，1.06 mmol）的DMSO溶液，于30℃搅拌12小时，然后依次加入1 mL DMAP（128mg，1.06 mmol）和4 mL透明质酸（HA，200 mg，0.53 mmol -CH2OH）的无水DMSO溶液，在30℃反应24 小时。反应结束后，经抽滤、透析、冷冻干燥得到透明质酸-g-叶酸（HA-g-FA）聚合物，产率93%。核磁结果表明其结构为HA-g-FA，其中叶酸的取代度(DS)为10.5%。
实施例九 合成聚合物HA-g-FA (M nHA = 300 kDa，DS = 11.5 %)
于氮气氛围下，在叶酸（FA，232 mg，52 mmol）的无水DMSO（6 mL）溶液中加入2 mLDCC（218 mg，1.06 mmol）的DMSO溶液，于30℃搅拌12小时，然后依次加入1 mL DMAP（128mg，1.06 mmol）和4 mL透明质酸（HA，200 mg，0.53 mmol -CH2OH）的无水DMSO溶液，在30℃反应24 小时。反应结束后，经抽滤、透析、冷冻干燥得到透明质酸-g-叶酸（HA-g-FA）聚合物，产率93%。核磁结果表明其结构为HA-g-FA，其中叶酸的取代度(DS)为11.5%。
实施例十 包裹小分子抗癌药物阿霉素的HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 8.5%)纳米药物的制备
包裹阿霉素（DOX）的HA-g-FA纳米药物（HA/FA-NPs-DOX）通过溶剂置换法制备。将HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 8.5%)的二甲亚砜（DMSO）溶液(10 mg/mL，1 mL)与DOX的DMSO溶液(10 mg/mL，0.25、0.43、0.69 mL)分别混合搅拌均匀后缓慢滴入搅拌着的超纯水中，滴加完后搅拌3分钟，然后装入预先准备好的透析袋中（SPECTRA/POR，MWCO：3500 Da），依次用一次水和磷酸缓冲溶液透析，分别形成纳米药物。通过DLS测得平均粒径分别为80、93、103 nm，粒径分布分别为0.23、0.17、0.15；通过紫外可见光谱测得DOX的包封率为70.4%、69.9%、68.8%，实际载药量为15.0 wt.%、23.1%、31.4 wt.%，对应DOX体积为0.25 mL、0.43 mL、0.69 mL（理论载药量为20、30、40 wt.%）。图3为包载0.43 mL DOX的纳米药物的粒径分布图。
实施例十一 包裹小分子抗癌药物阿霉素的HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 6.4%)纳米药物的制备
将HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 6.4%)的DMSO溶液(10 mg/mL，1 mL)与DOX的DMSO溶液(10 mg/mL，0.43 mL)混合搅拌均匀后缓慢滴入搅拌着的超纯水中，搅拌3分钟后，装入预先准备好的透析袋中（SPECTRA/POR，MWCO：3500 Da），依次用一次水和磷酸缓冲溶液透析，形成纳米药物。其平均粒径为115 nm，粒径分布为0.18。通过紫外可见光谱测得DOX的包封率为55.8%，实际载药量为19.3 wt.%。
实施例十二 包裹小分子抗癌药物阿霉素的HA-g-FA(M nHA = 35 kDa，DS = 11.1%)纳米药物的制备
将HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 11.1%)的DMSO溶液(10 mg/mL，1 mL)与DOX的DMSO溶液(10 mg/mL，0. 43 mL)混合搅拌均匀后缓慢滴入搅拌着的超纯水中，搅拌3分钟后，装入预先准备好的透析袋中（SPECTRA/POR，MWCO：3500 Da），依次用一次水和磷酸缓冲溶液透析，形成纳米药物。其平均粒径为89 nm，粒径分布为0.17。通过紫外可见光谱测得DOX的包封率为71.6%，实际载药量为23.5 wt.%。
实施例十三 HA/FA-NPs-DOX纳米药物的稳定性、冻干粉再分散性及体外药物释放
采用基于HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 8.5%)制备的阿霉素纳米药物（HA/FA-NPs-DOX，DLC = 23.1 wt.%）研究其稳定性、冻干粉分散性能以及体外药物释放行为。上述所得阿霉素纳米药物的稳定性分别采用磷酸缓冲溶液稀释100倍，加入10%的胎牛血清，或者于4℃冰箱中放置1个月，并通过动态光散射检测其粒径变化。HA/FA-NPs-DOX经冷冻干燥后加入超纯水重新分散。图4为HA/FA-NPs-DOX纳米药物的稳定性及冻干粉再分散的粒径分布图。结果表明，HA/FA-NPs-DOX纳米药物具有优异的稀释、血清和长期储存稳定性，粒径无明显变化，且其冻干粉可快速再分散，粒径与冻干前相比变化不大。
冻干粉制备具体方法是基于HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 8.5%)制备的阿霉素纳米药物（HA/FA-NPs-DOX，DLC = 23 wt.%），首先将其置于Eppendorf管中，并在液氮中冷冻3分钟，然后将其放置于冷冻干燥机上-80℃冻干30小时，即得到纳米药物冻干粉。再分散时，加入冻干前同等量的水复溶，用移液枪吹打使其完全分散即可得到再分散的纳米药物，其粒径及粒径分布与冻干之前相近。
体外释放实验中，分别取上述500 μL阿霉素纳米药物（0.5 mg/mL）装入透析袋中（SPECTRA/POR，MWCO：12-14 kDa）并分别置于25 mL的磷酸缓冲液（pH 7.4，10 mM）和醋酸/醋酸钠缓冲液（pH 5.0，10 mM）中，于37℃和100 rpm 的摇床中进行释放。在设定的时间点（1、2、4、6、8、10、12、24、36和48小时）取出5 mL的释放介质，并补加相同体积的新鲜介质。结果直接通过荧光来测试。图5为HA-g-FA阿霉素纳米药物的体外释放结果图。结果表明：阿霉素纳米药物在酸性条件下可快速释放药物，DOX在48小时内释放出约90%；而在正常的生理条件下（pH 7.4），DOX的释放相对较慢，48小时内释放出约50%。
实施例十四 HA/FA-NPs-DOX纳米药物表面叶酸含量的测定
将3 mg基于HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 6.4、8.5、11.1%)制备的HA/FA-NPs-DOX纳米药物（DLC = 19.3、23.1、23.5 wt.%）冻干后复溶于0.6 mL D2O中，然后加入0.05mg的丙烯酸作为内参。通过核磁谱图中叶酸与丙烯酸的峰面积比值计算得到纳米药物表面的叶酸含量，当HA-g-FA聚合物中的FA的DS为6.4、8.5和11.1%时，分别有20.8%、26.9%和26.2%的叶酸暴露于纳米药物表面。图6为HA/FA-NPs-DOX纳米药物（DS = 8.5%）的核磁图。
实施例十五 包裹小分子抗癌药物表阿霉素的HA/FA-NPs-EPI纳米药物的制备及体外释放
将HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 6.4、8.5、11.1%)，(M nHA = 20 kDa，DS = 7.5、10.2、13.4%)或（M nHA = 50 kDa，DS = 10.6、35.1%）的DMSO溶液(10 mg/mL，1 mL)与表阿霉素（EPI）的DMSO溶液(10 mg/mL，0.111、0.176、0.25 mL)混合搅拌均匀后缓慢滴入搅拌着的超纯水中，搅拌3分钟后，装入预先准备好的透析袋中（SPECTRA/POR，MWCO：3500 Da），依次用一次水和磷酸缓冲溶液透析，形成HA/FA-NPs-EPI纳米药物。纳米药物的粒径为75-134nm，粒径分布为0.12-0.23，通过紫外可见光谱测得EPI的包封率为53%-76.7%，实际载药量为5.6 wt.%-16.1 wt.%，释放结果表明，HA/FA-NPs-EPI纳米药物在酸性环境下（pH 5.0）可快速释放EPI，48小时内释放出86%以上；下表给出部分具体数据，其中表阿霉素（EPI）的DMSO溶液(10 mg/mL，0.176mL)。
Figure 740902DEST_PATH_IMAGE002
实施例十六 包裹小分子抗癌药物索拉菲尼的HA/FA-NPs-SOR纳米药物的制备及体外释放
将HA-g-FA (M nHA = 35 kDa，DS = 6.4、8.5、11.1%)或M nHA = 20 kDa，DS = 7.5、10.2、13.4%)的DMSO溶液(10 mg/mL，1 mL)与索拉菲尼（SOR）的DMSO溶液(10 mg/mL，0.176、0.25、0.333 mL)混合搅拌均匀后缓慢滴入搅拌着的超纯水中，搅拌3分钟后，装入预先准备好的透析袋中（SPECTRA/POR，MWCO：3500 Da），依次用一次水和磷酸缓冲溶液透析，形成HA/FA-NPs-SOR纳米药物。纳米药物的粒径为88-94 nm，粒径分布为0.08-0.15。通过高效液相色谱测得SOR的包封率为47%-58%，实际载药量为7.6 wt.%-16.2 wt.%。释放结果表明，HA/FA-NPs-SOR纳米药物在酸性环境下（pH 5.0）可快速释放SOR，48小时内释放出65%以上。
实施例十七 HA/FA-NPs-DOX纳米药物在细胞内摄取及药物释放情况
采用共聚焦激光扫描显微镜观察了HA/FA-NPs-DOX纳米药物(M nHA = 35 kDa，DS =8.5%，DLC = 23 wt.%)在卵巢癌细胞(SKOV-3)中的细胞内吞和细胞内释放行为。首先将SKOV-3细胞以1×105个/孔的密度铺于细胞培养板中，并于37℃，5%二氧化碳条件下培养24小时。加样前4小时将培养基换成无FA的RPMI-1640培养基，然后向每个孔中加入100 μLHA/FA-NPs-DOX纳米药物，其中DOX在孔中的最终浓度为20 μg/mL。在37℃，5%二氧化碳条件下培养4小时后，移去培养基并用PBS溶液洗涤3次。接着用4%的多聚甲醛溶液固定15分钟后用PBS溶液清洗3次。最后用DAPI对细胞核进行染色3分钟，并用PBS溶液清洗3次。封闭受体实验时在加入HA/FA-NPs-DOX纳米药物之前采用游离的HA溶液（5 mg/mL）或FA溶液（0.5mg/mL）预先与细胞孵育4小时，接下来的步骤如前所述。制备好的样品采用共聚焦激光扫描显微镜进行观察和拍摄。
图7为HA/FA-NPs-DOX纳米药物在SKOV-3细胞、FA或HA单封闭以及FA和HA双封闭的SKOV-3细胞中的药物摄取及释放结果图（I是未封闭的细胞，II是用游离FA封闭的细胞，III是用游离HA封闭的细胞，IV是用游离FA和HA双封闭的细胞，V为M nHA = 50 kDa，DS = 35.1%的纳米药物/未封闭的细胞）。结果表明：HA/FA-NPs-DOX纳米药物可以很快内吞进入细胞，并在细胞内将DOX释放出来，培养4小时后，其细胞内DOX荧光几乎全部分布于细胞核，且强度要明显强于游离FA或HA单封闭对照组和FA/HA双封闭对照组。而基于HA-g-FA（DS =35.1%）制备的HA/FA-NPs-DOX纳米药物虽然可以内吞进入细胞，但其药物释放较为缓慢，主要分布于细胞质中。采用Image J进行荧光定量发现，在受体封闭后，HA/FA-NPs-DOX纳米药物在细胞中的内吞量明显降低，未封闭组与单封闭和双封闭对照组之间存在显著性差异（p< 0.001），且单封闭组相比于双封闭组也有显著差异，说明该纳米药物有显著的双重靶向性能。
实施例十八 HA/FA-NPs-DOX纳米药物的细胞毒性测试
HA/FA-NPs-DOX纳米药物(M nHA = 35 kDa；DS = 6.4、8.5、 11.1%；DLC约为20wt.%)在SKOV-3细胞中的毒性通过MTT法测定。首先将80 µL细胞铺于96孔培养板中，使细胞的最终密度为3×103个/孔，并置于37℃，5%二氧化碳条件下培养24小时使单层细胞的覆盖率达到70~80%。加样前4小时将培养基换成无FA的RPMI-1640培养基，然后向每孔中加入20µL不同浓度的HA/FA-NPs-DOX纳米药物，使得DOX在孔内的最终浓度为0.001-40 μg/mL。待继续培养68小时后，向每孔中加入10 µL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的PBS溶液(5 mg/mL)，并继续培养4小时以使MTT与活细胞作用。随后移除含有MTT的培养液，向每孔中加入150 μL DMSO以溶解活细胞与MTT作用产生的紫色甲瓒结晶，并使用酶标仪(BioTek)测定每孔在570 nm处的吸收。细胞相对存活率通过与只有细胞的空白对照孔在570 nm处的吸收相比得到。实验平行四组进行。封闭受体实验时在加入HA/FA-NPs-DOX纳米药物之前将游离的HA溶液（5 mg/mL）或FA溶液（0.5 mg/mL）与细胞预先孵育4小时，接下来的步骤如前所述。
细胞存活率(%)=(OD570样品/OD570对照)×100%
图8为不同HA/FA-NPs-DOX纳米药物对SKOV-3细胞的细胞毒性结果图；图9为HA/FA-NPs-DOX纳米药物在SKOV-3细胞、FA或HA单封闭以及FA和HA双封闭的SKOV-3细胞中的细胞毒性结果图。结果表明：HA/FA-NPs-DOX纳米药物具有抗肿瘤活性，且取代度为8.5时其抗肿瘤活性最佳，其半致死浓度为1.71 μg/mL；双受体封闭后抗肿瘤活性达到最低，半致死浓度相比未封闭组增加了2-4倍，说明该纳米药物有着优异的双重靶向性能。采用透明质酸为载体制备的纳米药物(M nHA = 35 kDa；DLC约为20 wt.%)进行了细胞毒性实验（MTT），具体步骤如前所述，结果发现在相同的孵育时间下，SKOV-3细胞的半致死浓度为6.98 μg/mL。
采用A549肺癌细胞、U87脑胶质瘤细胞以及L929成纤维细胞进行了细胞毒性实验（MTT），具体步骤如前所述，结果发现在相同的孵育时间下，三种细胞的半致死浓度分别为2.51、5.79、25.69 μg/mL，说明本发明HA/FA-NPs-DOX纳米药物对SKOV-3细胞的细胞毒性强。
采用同样的MTT法测试空载体（HA/FA-NPs）的细胞毒性，结果表明，即使在浓度高至2 mg/mL时，SKOV-3细胞和L929成纤维细胞的存活率依然约为100%。
实施例十九 HA/FA-NPs-DOX纳米药物的小鼠体内循环研究
以下动物实验操作均符合苏州大学实验动物中心的批准协议。将3只体重约为16g的裸鼠分为一组，通过尾静脉给药HA/FA-NPs-DOX纳米药物(M nHA = 35 kDa，DS = 8.5%，DOX剂量：11.2 mg/kg)。在给药后5 min、10 min 、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h各时间点眼眶取血，每次取血量约为40微升，通过离心（3000 rpm，15 min）取15μL血浆，然后加入700 μL DMSO于37℃，200 rpm摇床中放置一天萃取DOX，结果用荧光测试。
图10为HA/FA-NPs-DOX纳米药物在小鼠体内的血液循环结果图。结果表明：HA/FA-NPs-DOX纳米药物具有良好的稳定性，可以在小鼠体内实现长循环，其血液循环半衰期为5.9 h，而据文献报道游离DOX的体内循环半衰期仅有0.5 h左右，相比之下有了明显的延长。
实施例二十HA/FA-NPs-DOX纳米药物在卵巢癌荷瘤裸鼠各脏器的体外成像研究
将六只肿瘤体积达到200 mm3的皮下卵巢癌荷瘤裸鼠随机分成两组，每组裸鼠通过尾静脉分别注射（1）HA/FA-NPs-DOX纳米药物(M nHA = 35 kDa，DS = 8.5%，DLC = 23wt.%)；（2）Lipo-DOX溶液，DOX剂量为11.2 mg/kg。8 h后，将每只裸鼠的心、肝、脾、肺、肾及肿瘤取出洗净，并固定在黑色塑料板上，放入Maestro活体成像仪内，在560 nm的发射波长下测定DOX在各脏器的分布强度。
图11为HA/FA-NPs-DOX纳米药物及Lipo-DOX在荷瘤裸鼠各脏器的体外成像图。结果表明：HA/FA-NPs-DOX纳米药物在肿瘤部位的富集量相比Lipo-DOX有显著的提高。
实施例二十一 HA/FA-NPs-DOX纳米药物在荷皮下卵巢癌裸鼠各脏器的生物分布研究
将六只肿瘤体积达到200 mm3的荷瘤裸鼠随机分成两组，每组裸鼠通过尾静脉分别注射（1）HA/FA-NPs-DOX纳米药物(M nHA = 35 kDa，DS = 8.5%，DLC = 23 wt.%)；（2）Lipo-DOX溶液，DOX剂量为11.2 mg/kg）。8 h后，将每只裸鼠的心、肝、脾、肺、肾及肿瘤取出洗净、称重，然后加入600 微升1%曲拉通，用匀浆机匀浆，再加入900微升DMSO，置于-20℃冰箱，24h后离心取上清液进行荧光测试分析。
%ID/g=器官内DOX的质量/（注射入DOX的质量×器官的实际质量）×100%
图12为HA/FA-NPs-DOX纳米药物在荷卵巢癌裸鼠各脏器的生物分布结果图。结果表明：HA/FA-NPs-DOX纳米药物在肿瘤部位有很高的富集量，达到12.0%ID/g，而Lipo-DOX在肿瘤部位的富集少，只有5.6%ID/g。说明本发明的双重靶向的HA/FA-NPs-DOX纳米药物可有效进入肿瘤细胞内，在肿瘤部位的富集率高。
实施例二十二HA/FA-NPs-DOX纳米药物在荷皮下卵巢癌裸鼠体内的抗肿瘤效果研究
将肿瘤体积达到120 mm3的荷瘤裸鼠随机分成三组（每组6只），这天被定为第0天。通过尾静脉分别注射（1）HA/FA-NPs-DOX纳米药物(M nHA = 35 kDa，DS = 8.5%，DLC = 23wt.%)；（2）游离DOX溶液；（3）PBS溶液；其中DOX的剂量为11.2 mg/kg。裸鼠肿瘤体积定期用卡尺进行测量，裸鼠体重变化定期用天平称量。肿瘤的体积大小通过V=0.5×L×W×W公式计算得到（L是肿瘤最长点的长度；W是测量肿瘤最短点的长度）。26天后，每组随机取一只老鼠通过颈与脊椎骨脱臼处死，取出心、肝、脾、肺、肾及肿瘤，用4%甲醛固定，切片，并用苏木精和曙红（H&E）染色用于组织学分析。其余裸鼠继续观察。在整个治疗过程中，裸鼠自然死亡或肿瘤体积超过1000 mm3均认为该鼠死亡。
相对肿瘤体积（%）=肿瘤体积/第0天肿瘤体积×100。
相对体重（%）=裸鼠体重/第0天裸鼠体重×100。
图13和14分别为HA/FA-NPs-DOX纳米药物在荷瘤裸鼠体内的肿瘤生长变化和体重生长变化结果图。结果表明：HA/FA-NPs-DOX纳米药物可以有效抑制肿瘤生长，具有很高的抗肿瘤活性；而游离DOX抑制肿瘤生长的程度有限。裸鼠体重变化情况及存活实验表明HA/FA-NPs-DOX纳米药物对体重没有影响，副作用小，存活时间最长，而游离DOX使裸鼠体重降低了30%左右，毒副作用大，26天内全部死亡。此外，H&E染色组织学分析结果显示HA/FA-NPs-DOX纳米药物对应的肿瘤组织有大面积的坏死，但其它器官均正常；而游离DOX和PBS组对应的肿瘤组织生长旺盛，且游离DOX组毒副作用大。同时通过TUNEL也可以看出HA/FA-NPs-DOX纳米药物治疗的肿瘤有很明显的细胞凋亡，而游离DOX和PBS组细胞凋亡很少。
本发明的聚合物可以大幅提高疏水药物的水溶性，保护药物不被降解，延长药物的循环时间，降低药物的毒副作用，通过肿瘤组织增强的渗透和滞留效应(EPR)被动靶向及双重主动靶向富集到肿瘤部位，增强肿瘤的治疗效果。

Claims (10)

1.一种透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物，其特征在于：所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物的主链为透明质酸，侧链为叶酸；所述透明质酸的分子量为10～100 kDa；叶酸的取代度为5～15%。
2.根据权利要求1所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物，其特征在于，所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物的化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
3.根据权利要求1所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物，其特征在于，所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物的制备方法包括以下步骤，透明质酸与叶酸在N,N’-二环己基碳二亚胺、4-(二甲氨基)吡啶存在下通过一步酯化反应得到所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物。
4.根据权利要求1所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物，其特征在于，所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物的制备方法包括以下步骤，将N,N’-二环己基碳二亚胺加入叶酸溶液中，于30℃搅拌12小时后，加入4-(二甲氨基)吡啶和透明质酸溶液，于30℃下反应24小时，然后经透析、冻干得到所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物。
5.一种双重靶向纳米药物，其特征在于：所述纳米药物由权利要求1所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物与小分子抗癌药物组装形成。
6. 根据权利要求5所述双重靶向纳米药物，其特征在于：所述小分子抗癌药物包括阿霉素、表阿霉素或者索拉菲尼；所述双重靶向纳米药物的包封率为45%～80%，载药量为5%～32 wt.%；所述双重靶向纳米药物的粒径为50～200纳米，粒径分布为0.05～0.30。
7.根据权利要求5所述双重靶向纳米药物，其特征在于，所述双重靶向纳米药物的制备方法为，搅拌下，将含有透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物与小分子抗癌药物的溶液滴入水中，然后透析，得到双重靶向纳米药物。
8.一种双重靶向纳米药物冻干粉，其特征在于，所述双重靶向纳米药物冻干粉的制备方法为，将权利要求5和7所述的双重靶向纳米药物采用液氮冷冻，并在冷冻干燥机上冻干，得到双重靶向纳米药物冻干粉。
9.权利要求1所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物、权利要求5所述双重靶向纳米药物或者权利要求8所述双重靶向纳米药物冻干粉在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求1所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物在制备权利要求5所述双重靶向纳米药物或者权利要求8所述双重靶向纳米药物冻干粉中的应用；或者权利要求1所述透明质酸-g-叶酸两亲性聚合物作为小分子抗癌药物载体或者在制备小分子抗癌药物载体中的应用。
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