CN110812493A - 一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法及应用，可有效解决药物口服以后容易在胃内被降解，以及口服给药中目前存在的易摄取，难转运的困境，并提供口服给药系统构建的问题。先培养凝结芽孢杆菌使其产生芽孢，再通过酰胺化反应在芽孢表面修饰可以与胆汁酸受体结合的脱氧胆酸，随后物理负载抗肿瘤药物阿霉素和索拉非尼，即得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物；本发明具有简便的制备方法、生产费用低和胃酸环境稳定等优点，并保留了载药芽孢的再生能力，集生物载体和化疗为一体，进一步高效的将药物递送至体循环，为口服给药的肿瘤治疗提供了技术支持。

Description

一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方 法及应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法及应用。
背景技术
凝结芽孢杆菌（Bacillus Coagulans, BC）是美国食品和药物管理局批准的“普遍认为安全”的乳酸菌类，可以在肠道微环境中定植，产生大量的乳酸，氨基酸，维生素等，用于治疗肠道炎症和调节肠道平衡。值得注意的是，BC的休眠体芽孢（Spore）被包裹在厚厚的疏水蛋白质外壳中，是生物学中最稳定的静态结构之一，可以抵抗恶劣的酸性环境、有毒化学物质和极端温度等。此外，芽孢的生理活性会被肠道微环境中的一些营养物质触发，因此口服后可以在肠道出芽生长成益生菌定植在肠道，同时伴有疏水性蛋白外壳脱落。基于益生菌芽孢的体内纳米生成器为口服给药提供了潜在的安全、高效的治疗策略。
细胞内的高效转运对纳米粒（NPs）的跨上皮吸收具有重要意义。顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白（ASBT）介导的细胞内转运途径不仅可以克服顶端膜屏障，还可以实现特异、高效的细胞内转运，增加基底测药物的释放。脱氧胆酸（DA）可以与胆汁酸结合，通过ASBT介导的内吞作用增加NPs的内化，促进口服给药的NPs有效地通过上皮细胞运输并进入体循环，提高包封药物的生物利用度。
结肠癌已被公认为消化道最常见的恶性肿瘤之一，具有相当高的发生率和死亡率。尽管化疗仍被视为抑制肿瘤生长或转移的主要策略，但大多数化疗药物通过静脉注射给药，这可能会导致严重的副作用，如局部炎症，心脏毒性和过敏反应。此外，由于肿瘤的异质性和耐药性，传统的单一化疗通常无法满足临床治疗的需要。因此，协同化学治疗和靶向治疗药物共同负载到益生菌芽孢中是一种更加全面的肿瘤治疗手段。
将抗肿瘤药物负载到DA修饰的益生菌芽孢表面（Spore-DA），以提高肠上皮吸收的效率。利用芽孢在胃肠道微环境中的生理特征构建了一个体内纳米自主生成器，在肠道微环境中，芽孢表面连接有DA的疏水性蛋白外壳脱落，并与负载的亲水性药物功能化自组装成大量装载药物的治疗性NPs。随后，产生的大量NPs通过ASBT介导的内吞作用途径被上皮细胞有效的吸收，这可以克服肠上皮细胞的多种生物屏障并增加基底外侧药物的释放量。这种自主纳米生成器的构建开启了口服给药的新篇章，提高了口服给药的生物利用度，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的是提供一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法及应用，可有效解决药物口服以后容易在胃内被降解，以及口服给药中目前存在的易摄取，难转运的困境，并提供口服给药系统构建的问题。
本发明解决的技术方案是，一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法，先培养凝结芽孢杆菌使其产生芽孢，再通过酰胺化反应在芽孢表面修饰可以与胆汁酸受体结合的脱氧胆酸，随后物理负载抗肿瘤药物阿霉素和索拉非尼，即得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物；具体步骤如下：
（1）培养凝结芽孢杆菌：将凝结芽孢杆菌置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度150~180r/min，使用营养肉汁琼脂培养凝结芽孢杆菌，利用革兰氏染色法观察菌生长到对数期时，将得到的菌液收集，备用；
（2）提取芽孢：首先配置含0.005%~0.008% MnSO4·H2O的营养肉汁琼脂产孢培养基，然后加入体积3~5%（V:V）的步骤（1）培养得到的菌液，置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度150~180r/min继续培养48h；用革兰氏染色法观察细菌一端开始膨大，继续培养72h，通过生物扫描电子显微镜（SEM）再次监测芽孢杆菌的孢子形成程度，当有90%的益生菌形成芽孢之后，将培养的细菌芽孢混合溶液放置在60~80℃烘箱中加热30~60min，以确保能够杀死营养细胞；放置室温后，使用低温离心机在10000r/min离心30min，收集益生菌芽孢，用1M KCl、0.5M NaCl溶液洗涤2~4次，用去离子水重悬离心得到沉淀，冻干，得到芽孢粉末（spore），备用；
（3）制备功能化芽孢：首先将30~90mg的脱氧胆酸（DA）、30~90mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10~30mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶解于10~20mL无水乙醇中，室温反应1~2h以活化羧基，得混合溶液；然后取步骤（2）冷冻干燥的芽孢粉末30~90mg分散于10~20mL去离子水中加入混合溶液，在室温下搅拌反应24h，反应结束后用低温离心机在10000~12000r/min离心30min，得到功能化芽孢（Spore-DA）；
（4）制备自主纳米生成器及药物复合物：取步骤（3）制备得到的功能化芽孢5~10mg分散在5~10mL去离子水中，为第一混合液；将10~20mg抗肿瘤药物溶解到1~2mL去离子水中，为第二混合液；然后将第二混合液在搅拌下逐滴滴加到第一混合液中，室温下，搅拌反应24h；反应结束后，将混合液在10000~12000r/min低温离心30min，得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物；所述的抗肿瘤药物为：阿霉素、索拉非尼、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱、米托蒽醌等抗肿瘤药物的一种。
所述方法制备的基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物在制备口服药物中的应用。
所述方法制备的基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物在制备基于益生菌芽孢在肠道微环境的生理特征构建的自主纳米制剂中的应用。
所述方法制备的基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物在制备基于胆汁酸转运体DA介导的肠道细胞转运药物中的应用。
本发明制备的自主纳米生成器可以在肠道微环境中高效生成大量的治疗性NPs，随后可以NPs通ASBT受体介导的内吞作用将药物顺利递送到体循环中，缓慢释放药物，实现化疗和靶向疗法的协同作用，有效杀死肿瘤细胞。
本发明提供一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物，具有简便的制备方法、生产费用低和胃酸环境稳定等优点，并保留了载药芽孢的再生能力，集生物载体和化疗为一体；选择凝结芽孢杆菌的芽孢作为药物制剂载体，既可以响应肠道微环境生长成益生菌定植在肠道，调节肠道微生物，又可以利用在生成过程中脱落的疏水性蛋白与芽孢表面负载的抗肿瘤药物进行自组装形成治疗性纳米粒。芽孢表面功能性修饰的靶向肠细胞转运受体分子可以有效介导纳米粒穿透肠上皮细胞，进一步高效的将药物递送至体循环，为口服给药的肿瘤治疗提供了技术支持，不仅是口服纳米递送系统上的创新，具有巨大的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明治疗期间各组小鼠的相对肿瘤体积统计曲线图。
图2为本发明治疗结束时每组中5只小鼠的实际肿瘤体积示意图。
图3为本发明治疗期间各组小鼠的体重统计曲线图。
图4为本发明治疗结束时每组所有小鼠的体重统计图。
图中，a) saline, b) spores, c) DOX + SOR, d) DOX/SOR/Spore, e) DOX/SOR/Spore-HA, f) DOX/SOR/Spore-DA + TCA, and g) DOX/SOR/Spore-DA。
具体实施方案
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）培养凝结芽孢杆菌：将凝结芽孢杆菌置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度150r/min，使用营养肉汁琼脂培养凝结芽孢杆菌，利用革兰氏染色法观察菌生长到对数期时，将得到的菌液收集，备用；
（2）提取芽孢：首先配置含0.005% MnSO4·H2O的营养肉汁琼脂产孢培养基，然后加入体积5%（V:V）的步骤（1）培养得到的菌液，置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度150r/min继续培养48h；用革兰氏染色法观察细菌一端开始膨大，继续培养72h，通过生物扫描电子显微镜（SEM）再次监测芽孢杆菌的孢子形成程度，当有90%的益生菌形成芽孢之后，将培养的细菌芽孢混合溶液放置在80℃烘箱中加热30min，以确保能够杀死营养细胞；放置室温后，使用低温离心机在10000r/min离心30min，收集益生菌芽孢，用1M KCl、0.5M NaCl溶液洗涤3次，用去离子水重悬离心得到沉淀，冻干，得到芽孢粉末（spore），备用；
（3）制备功能化芽孢：首先将30mg的脱氧胆酸（DA）、30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶解于10mL无水乙醇中，室温反应1h以活化羧基，得混合溶液；然后取步骤（2）冷冻干燥的芽孢粉末30mg分散于10mL去离子水中加入混合溶液，在室温下搅拌反应24h，反应结束后用低温离心机在10000r/min离心30min，得到功能化芽孢（Spore-DA）；
（4）制备自主纳米生成器及药物复合物：取步骤（3）制备得到的功能化芽孢5mg分散在5mL去离子水中，为第一混合液；将10mg抗肿瘤药物溶解到1mL去离子水中，为第二混合液；然后将第二混合液在搅拌下逐滴滴加到第一混合液中，室温下，搅拌反应24h；反应结束后，将混合液在10000r/min低温离心30min，得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物。
实施例2
本发明在具体实施中，一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）培养凝结芽孢杆菌：将凝结芽孢杆菌置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度160r/min，使用营养肉汁琼脂培养凝结芽孢杆菌，利用革兰氏染色法观察菌生长到对数期时，将得到的菌液收集，备用；
（2）提取芽孢：首先配置含0.006% MnSO4·H2O的营养肉汁琼脂产孢培养基，然后加入体积3%（V:V）的步骤（1）培养得到的菌液，置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度160r/min继续培养48h；用革兰氏染色法观察细菌一端开始膨大，继续培养72h，通过生物扫描电子显微镜（SEM）再次监测芽孢杆菌的孢子形成程度，当有90%的益生菌形成芽孢之后，将培养的细菌芽孢混合溶液放置在70℃烘箱中加热50min，以确保能够杀死营养细胞；放置室温后，使用低温离心机在10000r/min离心30min，收集益生菌芽孢，用1M KCl、0.5M NaCl溶液洗涤2次，用去离子水重悬离心得到沉淀，冻干，得到芽孢粉末（spore），备用；
（3）制备功能化芽孢：首先将60mg的脱氧胆酸（DA）、60mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和20mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶解于15mL无水乙醇中，室温反应1.5h以活化羧基，得混合溶液；然后取步骤（2）冷冻干燥的芽孢粉末60mg分散于15mL去离子水中加入混合溶液，在室温下搅拌反应24h，反应结束后用低温离心机在11000r/min离心30min，得到功能化芽孢（Spore-DA）；
（4）制备自主纳米生成器及药物复合物：取步骤（3）制备得到的功能化芽孢8mg分散在8mL去离子水中，为第一混合液；将15mg抗肿瘤药物溶解到1.5mL去离子水中，为第二混合液；然后将第二混合液在搅拌下逐滴滴加到第一混合液中，室温下，搅拌反应24h；反应结束后，将混合液在11000r/min低温离心30min，得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物。
实施例3
本发明在具体实施中，一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）培养凝结芽孢杆菌：将凝结芽孢杆菌置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度180r/min，使用营养肉汁琼脂培养凝结芽孢杆菌，利用革兰氏染色法观察菌生长到对数期时，将得到的菌液收集，备用；
（2）提取芽孢：首先配置含0.008% MnSO4·H2O的营养肉汁琼脂产孢培养基，然后加入体积4%（V:V）的步骤（1）培养得到的菌液，置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度180r/min继续培养48h；用革兰氏染色法观察细菌一端开始膨大，继续培养72h，通过生物扫描电子显微镜（SEM）再次监测芽孢杆菌的孢子形成程度，当有90%的益生菌形成芽孢之后，将培养的细菌芽孢混合溶液放置在60℃烘箱中加热60min，以确保能够杀死营养细胞；放置室温后，使用低温离心机在10000r/min离心30min，收集益生菌芽孢，用1M KCl、0.5M NaCl溶液洗涤4次，用去离子水重悬离心得到沉淀，冻干，得到芽孢粉末（spore），备用；
（3）制备功能化芽孢：首先将90mg的脱氧胆酸（DA）、90mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和30mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶解于20mL无水乙醇中，室温反应2h以活化羧基，得混合溶液；然后取步骤（2）冷冻干燥的芽孢粉末90mg分散于20mL去离子水中加入混合溶液，在室温下搅拌反应24h，反应结束后用低温离心机在12000r/min离心30min，得到功能化芽孢（Spore-DA）；
（4）制备自主纳米生成器及药物复合物：取步骤（3）制备得到的功能化芽孢10mg分散在10mL去离子水中，为第一混合液；将20mg抗肿瘤药物溶解到2mL去离子水中，为第二混合液；然后将第二混合液在搅拌下逐滴滴加到第一混合液中，室温下，搅拌反应24h；反应结束后，将混合液在12000r/min低温离心30min，得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物。
本发明所制备的基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的合成方法简单，形成的治疗性纳米粒具有良好的水分散性，良好的生物相容性，在体内体外均能能够自主产生治疗纳米粒，利用胆汁酸途径逃避溶酶体的摄取进而穿透肠上皮细胞进入体循环，随后通过EPR效应靶向到肿瘤部位，达到抗肿瘤效果。本发明经多次反复试验，均取得了一致的结果，有关试验资料如下：
一、基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物体外自动生成纳米粒行为实验
实验是否可以在体外自主形成纳米颗粒（NPs），选择阿霉素（DOX）和索拉非尼（SOR）作为抗肿瘤药物负载到DA修饰的芽孢表面得到DOX/SOR/Spore-DA。分别将Spore和DOX/SOR/Spore-DA在培养基中孵育适宜时间，通过透射电子显微镜（TEM）评估孵育前后的生长行为和形貌变化。结果显示培养前芽孢表面光滑，符合扫描透射电镜（SEM）的表征。孵育6h后，在孢子周围观察到一些蛋白质样的片层结构，但没有形成NPs。DOX/SOR/Spore-DA孵育2h后，其表面开始粗糙，并在周围观察到有一些物质脱落脱。随着培养时间的延长，DOX/SOR/Spore-DA周围观察到NPs。结果表明，芽孢的正常生理生长过程中不会形成NPs，而DOX/SOR/Spore-DA在不需要任何附加的外部驱动力的情况下，能够萌发并自主形成治疗性NPs。
二、基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物内吞机制实验
Caco-2细胞接种在12孔板中培养48 h。将Caco-2细胞与free DOX+SOR，DOX/SOR/Spore，DOX/SOR/Spore-DA和DOX/SOR/Spore-DA+TCA组分别孵育0.5 h，1 h和2 h后，收集用PBS洗涤过的给药细胞，然后通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析肠上皮细胞对各组制剂的内吞机制。其中DOX/SOR/Spore-DA+TCA组是首先将Caco-2细胞与DA抑制剂牛磺胆酸钠（TCA，100mM）孵育30 min后再加入DOX/SOR/Spore-DA孵育。结果显示，孵育2 h后，DOX/SOR/Spore-DA组的摄取率达到61.4%，显著高于他组，而预先孵育ASBT受体抑制剂抑制后，摄取率则降至36.9%。这些结果都表明，DOX/SOR/Spore-DA NPs通过ASBT介导的内吞途径被肠上皮细胞摄取。
三、基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的药代动力学实验
SD大鼠（200-220g）禁食过夜，自由饮水，随机分成5组：free DOX+SOR，DOX/SOR/Spore，DOX/SOR/Spore-DA+TCA和DOX/SOR/Spore-DA，将剂量相当于15mg/kg的DOX和30mg/kg的SOR通过口服灌胃方式给药。分别在15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h时间点从眼眶采集血液样品并用高效液相（HPLC）检测药物含量。数据显示，在4h时，DOX/SOR/Spore-DA的C max值为3.43μg/mL，DOX/SOR/Spore-DA组的相对生物利用度（936%）高于DOX/SOR/Spore-DA+TCA（116%）。结果表明，DOX/SOR/Spore-DA具有良好的跨上皮转运能力，可作为一种有价值的自主纳米粒产生体，相对于口服free DOX+SOR组，药物生物利用度提高了9.36倍。
Table 1.口服给药后不同组的药代动力学参数
Formulation C<sub>max</sub>(mg/mL) T<sub>max</sub> (h) AUC 0-t(μg*h/mL) F<sub>rel</sub>%
Free DOX+SOR(Oral) 0.56±0.26 0.5 1.87±5.3 100
DOX/SOR/Spore-HA 2.30±0.43 0.5 14.06±3.6 751
DOX/SOR/Spore-DA 3.43±0.31 4.0 17.50±4.1 936
DOX/SOR/Spore-DA+TCA 0.46±0.18 0.5 2.16±0.6 116
各组在肿瘤期间， e) DOX/SOR/Spore-HA和 g) DOX/SOR/Spore-DA两组的肿瘤生长速度缓慢，且g组的生长速度最慢，而其他组的小鼠肿瘤体积均在不断增加，说明g) DOX/SOR/Spore-DA组具有显著抑制肿瘤生长的效果。治疗结束后，Saline组的平均肿瘤体积为855.086 mm3，而DOX/SOR/Spore-DA组的平均肿瘤体积为174.5mm3，因此，肿瘤抑制率为79.6%。
图1-4所示，治疗期间，DOX+SOR组的体重明显下降，说明DOX+SOR可引起全身毒性和副作用，而DOX/SOR/Spore-DA组体重明显呈上升趋势，说明本发明体系没有明显的毒副作用。
四、基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的体内抗肿瘤作用实验
在将平均肿瘤体积约100mm3的SW620荷瘤BALB/c裸鼠随机分成7组：Control，Spore，freeDOX+SOR，DOX/SOR/Spore，DOX/SOR/Spore-DA+TCA和DOX/SOR/Spore-DA。每个含药制剂组的DOX和SOR的剂量分别设定为15mg/kg和30mg/kg。每2天测量肿瘤大小，同时记录体重。评估相对肿瘤体积来检测体内的抗肿瘤效果。结果显示，Control，Spore和DOX/SOR/Spore组的肿瘤生长迅速，而DOX+SOR组肿瘤生长受到中度抑制。但是在治疗过程中，DOX+SOR可引起全身毒性和副作用，显示在荷瘤小鼠的活性降低和体重减轻。相反，口服DOX/SOR/Spore-DA治疗14天后，能够明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长速度，并且小鼠体重呈上升趋势，初步表明没有明显的毒副作用。而在提前给予TCA的治疗组中，DOX/SOR/Spore-DA组治疗效果明显下降。结果表明，DOX/SOR/Spore-DA可形成NPs，随后通过ABST介导的内吞作用被肠上皮吸收，提高了体内肿瘤的治疗效果。
在对上述试验中，还对其他实施例进行了同样的试验，均取得了相同或相近似的结果，这里不一一列举，试验表明，本发明方法稳定可靠、产品质量好，与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：
（1）本发明所制备的自主纳米生成器及其药物组合物，利用芽孢自身的生理生长特性，在胃内保持稳定性，并能够在肠道微环境中保持活性重新生长成为益生菌定植在肠道并伴随着疏水性蛋白外壳的脱落，同时，与表面修饰的亲水性物质结合从而自主生产大量的治疗性纳米粒。
（2）本发明所制备的自主纳米生成器及其药物组合物可以利用修饰的能与胆汁酸受体结合的脱氧胆酸，通过ABST介导的内吞作用使肠上皮吸收纳米粒，促进肠道转运作用，最终使口服药物的生物利用度提高了9.36倍。
（3）本发明所制备的纳米自主发生器及其药物组合物的合成方法简单，DA修饰的载药孢子具有良好的水分散性，良好的生物相容性，在体内体外能够自主产生大量的治疗性纳米粒，利用胆汁酸途径逃避溶酶体的摄取穿透肠上皮细胞进入体循环，随后通过EPR效应靶向到肿瘤部位，最终DOX/SOR/Spore-DA组的肿瘤抑制率可以达到79.6%。
本发明提供一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物，具有简便的制备方法、生产费用低和胃酸环境稳定等优点，并保留了载药芽孢的再生能力，集生物载体和化疗为一体；选择凝结芽孢杆菌的芽孢作为药物制剂载体，既可以响应肠道微环境生长成益生菌定植在肠道，调节肠道微生物，又可以利用在生成过程中脱落的疏水性蛋白与芽孢表面负载的抗肿瘤药物进行自组装形成治疗性纳米粒。芽孢表面功能性修饰的靶向肠细胞转运受体分子可以有效介导纳米粒穿透肠上皮细胞，进一步高效的将药物递送至体循环，为口服给药的肿瘤治疗提供了新思路，不仅是口服纳米递送系统上的创新，更具有产生巨大经济和社会效益的潜力。

Claims (7)

1.一种基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法，其特征在于，先培养凝结芽孢杆菌使其产生芽孢，再通过酰胺化反应在芽孢表面修饰可以与胆汁酸受体结合的脱氧胆酸，随后物理负载抗肿瘤药物阿霉素和索拉非尼，即得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物；具体步骤如下：
（1）培养凝结芽孢杆菌：将凝结芽孢杆菌置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度150~180r/min，使用营养肉汁琼脂培养凝结芽孢杆菌，利用革兰氏染色法观察菌生长到对数期时，将得到的菌液收集，备用；
（2）提取芽孢：首先配置含0.005%~0.008% MnSO4·H2O的营养肉汁琼脂产孢培养基，然后加入体积3~5%的步骤（1）培养得到的菌液，置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度150~180r/min继续培养48h；用革兰氏染色法观察细菌一端开始膨大，继续培养72h，通过生物扫描电子显微镜再次监测芽孢杆菌的孢子形成程度，当有90%的益生菌形成芽孢之后，将培养的细菌芽孢混合溶液放置在60~80℃烘箱中加热30~60min，以确保能够杀死营养细胞；放置室温后，使用低温离心机在10000r/min离心30min，收集益生菌芽孢，用1M KCl、0.5M NaCl溶液洗涤2~4次，用去离子水重悬离心得到沉淀，冻干，得到芽孢粉末，备用；
（3）制备功能化芽孢：首先将30~90mg的脱氧胆酸（DA）、30~90mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10~30mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶解于10~20mL无水乙醇中，室温反应1~2h以活化羧基，得混合溶液；然后取步骤（2）冷冻干燥的芽孢粉末30~90mg分散于10~20mL去离子水中加入混合溶液，在室温下搅拌反应24h，反应结束后用低温离心机在10000~12000r/min离心30min，得到功能化芽孢；
（4）制备自主纳米生成器及药物复合物：取步骤（3）制备得到的功能化芽孢5~10mg分散在5~10mL去离子水中，为第一混合液；将10~20mg抗肿瘤药物溶解到1~2mL去离子水中，为第二混合液；然后将第二混合液在搅拌下逐滴滴加到第一混合液中，室温下，搅拌反应24h；反应结束后，将混合液在10000~12000r/min低温离心30min，得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物；所述的抗肿瘤药物为：阿霉素、索拉非尼、紫杉醇、多烯紫杉醇、羟基喜树碱、米托蒽醌抗肿瘤药物的一种。
2.根据权利要求1所述的基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养凝结芽孢杆菌：将凝结芽孢杆菌置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度150r/min，使用营养肉汁琼脂培养凝结芽孢杆菌，利用革兰氏染色法观察菌生长到对数期时，将得到的菌液收集，备用；
（2）提取芽孢：首先配置含0.005% MnSO4·H2O的营养肉汁琼脂产孢培养基，然后加入体积5%的步骤（1）培养得到的菌液，置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度150r/min继续培养48h；用革兰氏染色法观察细菌一端开始膨大，继续培养72h，通过生物扫描电子显微镜再次监测芽孢杆菌的孢子形成程度，当有90%的益生菌形成芽孢之后，将培养的细菌芽孢混合溶液放置在80℃烘箱中加热30min，以确保能够杀死营养细胞；放置室温后，使用低温离心机在10000r/min离心30min，收集益生菌芽孢，用1M KCl、0.5M NaCl溶液洗涤3次，用去离子水重悬离心得到沉淀，冻干，得到芽孢粉末，备用；
（3）制备功能化芽孢：首先将30mg的脱氧胆酸（DA）、30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶解于10mL无水乙醇中，室温反应1h以活化羧基，得混合溶液；然后取步骤（2）冷冻干燥的芽孢粉末30mg分散于10mL去离子水中加入混合溶液，在室温下搅拌反应24h，反应结束后用低温离心机在10000r/min离心30min，得到功能化芽孢；
（4）制备自主纳米生成器及药物复合物：取步骤（3）制备得到的功能化芽孢5mg分散在5mL去离子水中，为第一混合液；将10mg抗肿瘤药物溶解到1mL去离子水中，为第二混合液；然后将第二混合液在搅拌下逐滴滴加到第一混合液中，室温下，搅拌反应24h；反应结束后，将混合液在10000r/min低温离心30min，得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物。
3.根据权利要求1所述的基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养凝结芽孢杆菌：将凝结芽孢杆菌置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度160r/min，使用营养肉汁琼脂培养凝结芽孢杆菌，利用革兰氏染色法观察菌生长到对数期时，将得到的菌液收集，备用；
（2）提取芽孢：首先配置含0.006% MnSO4·H2O的营养肉汁琼脂产孢培养基，然后加入体积3%的步骤（1）培养得到的菌液，置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度160r/min继续培养48h；用革兰氏染色法观察细菌一端开始膨大，继续培养72h，通过生物扫描电子显微镜再次监测芽孢杆菌的孢子形成程度，当有90%的益生菌形成芽孢之后，将培养的细菌芽孢混合溶液放置在70℃烘箱中加热50min，以确保能够杀死营养细胞；放置室温后，使用低温离心机在10000r/min离心30min，收集益生菌芽孢，用1M KCl、0.5M NaCl溶液洗涤2次，用去离子水重悬离心得到沉淀，冻干，得到芽孢粉末，备用；
（3）制备功能化芽孢：首先将60mg的脱氧胆酸（DA）、60mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和20mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶解于15mL无水乙醇中，室温反应1.5h以活化羧基，得混合溶液；然后取步骤（2）冷冻干燥的芽孢粉末60mg分散于15mL去离子水中加入混合溶液，在室温下搅拌反应24h，反应结束后用低温离心机在11000r/min离心30min，得到功能化芽孢；
（4）制备自主纳米生成器及药物复合物：取步骤（3）制备得到的功能化芽孢8mg分散在8mL去离子水中，为第一混合液；将15mg抗肿瘤药物溶解到1.5mL去离子水中，为第二混合液；然后将第二混合液在搅拌下逐滴滴加到第一混合液中，室温下，搅拌反应24h；反应结束后，将混合液在11000r/min低温离心30min，得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物。
4.根据权利要求1所述的基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养凝结芽孢杆菌：将凝结芽孢杆菌置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度180r/min，使用营养肉汁琼脂培养凝结芽孢杆菌，利用革兰氏染色法观察菌生长到对数期时，将得到的菌液收集，备用；
（2）提取芽孢：首先配置含0.008% MnSO4·H2O的营养肉汁琼脂产孢培养基，然后加入体积4%的步骤（1）培养得到的菌液，置于37℃恒温震荡培养箱，震荡速度180r/min继续培养48h；用革兰氏染色法观察细菌一端开始膨大，继续培养72h，通过生物扫描电子显微镜再次监测芽孢杆菌的孢子形成程度，当有90%的益生菌形成芽孢之后，将培养的细菌芽孢混合溶液放置在60℃烘箱中加热60min，以确保能够杀死营养细胞；放置室温后，使用低温离心机在10000r/min离心30min，收集益生菌芽孢，用1M KCl、0.5M NaCl溶液洗涤4次，用去离子水重悬离心得到沉淀，冻干，得到芽孢粉末，备用；
（3）制备功能化芽孢：首先将90mg的脱氧胆酸（DA）、90mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和30mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶解于20mL无水乙醇中，室温反应2h以活化羧基，得混合溶液；然后取步骤（2）冷冻干燥的芽孢粉末90mg分散于20mL去离子水中加入混合溶液，在室温下搅拌反应24h，反应结束后用低温离心机在12000r/min离心30min，得到功能化芽孢；
（4）制备自主纳米生成器及药物复合物：取步骤（3）制备得到的功能化芽孢10mg分散在10mL去离子水中，为第一混合液；将20mg抗肿瘤药物溶解到2mL去离子水中，为第二混合液；然后将第二混合液在搅拌下逐滴滴加到第一混合液中，室温下，搅拌反应24h；反应结束后，将混合液在12000r/min低温离心30min，得基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物。
5.权利要求1-4所述方法制备的基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物在制备口服药物中的应用。
6.权利要求1-4所述方法制备的基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物在制备基于益生菌芽孢在肠道微环境的生理特征构建的自主纳米制剂中的应用。
7.权利要求1-4所述方法制备的基于益生菌芽孢的自主纳米生成器药物组合物在制备基于胆汁酸转运体DA介导的肠道细胞转运药物中的应用。
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