CN112438996A - 一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法及应用，可有效解决各种胃酸不耐受的益生菌口服过胃后失活或者活性降低，进而造成在肠道定植效率低的难题，以及抑制有害细菌的生长和增殖，恢复和重建肠道屏障，调节肠道菌群，进而实现对结肠炎和结肠炎相关性结肠癌的有效防治问题，首先，培养益生菌，使其产生芽孢，然后通过挤压器提取芽孢衣壳并制备成粒径均一、性质稳定的衣壳纳米材料(Capsid Nano‑materials，CNMs)，再将衣壳纳米材料与益生菌在其生长培养基中共孵育，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物；本发明制备方法简单、生产费用低和胃酸环境稳定，调节肠道菌群，增强肠道屏障，为炎性肠病和炎症诱发的癌症治疗提供了新的技术支持。

Description

一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方 法及应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，特别是一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法及应用。
背景技术
近年来，益生菌疗法由于其在调节肠道微生物、环境和免疫系统之间的平衡方面具有显著的优势而被广泛应用于多种疾病的临床治疗中。大多数益生菌经口服后难以在极端的胃酸环境中大量存活，因此，能够顺利到达肠道定植并发挥作用的活菌数量得不到保证，从而限制了大多数益生菌在口服给药系统中的应用。芽孢杆菌属作为可以产生芽孢的一类益生菌，不仅可以促进肠道消化，而且可以用于治疗肠道炎症和调节宿主共生菌群并且抑制病原菌的生长。最重要的是，益生菌芽孢被厚厚的疏水性芽孢衣壳包裹，能够抵抗外界环境压力，是生物学中最稳定的静态结构之一，因此在复杂多变的胃肠道环境中具有较高的存活率，进而实现在肠道的高效定植，为体内益生菌递送奠定了基础。但是，益生菌芽孢在肠道内萌发效率不能被很好的控制，而且萌发时释放的离子可能会打破肠道的离子稳态，这限制了益生菌芽孢的广泛使用。综上所述，需要开发一种能够抵抗极端胃肠环境的纳米材料用于益生菌的口服递送。
受益生菌芽孢自然生理结构的启发，本发明中通过简单的压力滤膜挤压器从不同菌株的芽孢中制备具有生物活性的多功能芽孢衣壳纳米生物材料。该方法制备的纳米材料具有较高的抗逆性和良好的抗炎作用。另外，该纳米材料保留了衣壳中的各种结合蛋白和结构域蛋白，对益生菌具有天然的趋近性和亲和力。上述特点为其锚定在各种不耐酸的益生菌表面作为保护性“盔甲”用于益生菌的有效递送提供了有利的依据。因此，本发明中制备了一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌的组合物。该系统可以保护益生菌的固有活性不受胃肠道环境的影响，抑制有害细菌的生长，实现益生菌在肠道的竞争性定植以及爆发式增殖，维持肠道黏膜稳态，调节肠道微生物组。这种基于益生菌芽孢衣壳制备的纳米材料锚定在益生菌表面作为其递送中的保护性“盔甲”的益生菌递送系统，具有显著的结肠炎治疗以及结肠炎相关性癌症的防治效果，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法及应用，可有效解决各种胃酸不耐受的益生菌口服过胃后失活或者活性降低，进而造成在肠道定植效率低的难题，以及抑制有害细菌的生长和增殖，恢复和重建肠道屏障，调节肠道菌群，进而实现对结肠炎和结肠炎相关性结肠癌的有效防治问题。
本发明解决的技术方案是，一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，首先，培养益生菌，使其产生芽孢，然后通过挤压器提取芽孢衣壳并制备成粒径均一、性质稳定的衣壳纳米材料 (Capsid Nano-materials，CNMs)，再将衣壳纳米材料与益生菌在其生长培养基中共孵育，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物；具体步骤如下：
（1）培养益生菌：将益生菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为120~160r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004%~0.006% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；
所述的益生菌是芽孢杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、梭菌、酵母菌或肠球菌中的一种；
所述的营养肉汁液体培养基是，牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g和NaCl 5.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.0；
（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的2-4%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为120~160r/min下继续培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004%~0.006% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，产生芽孢后，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在70~90℃烘箱中加热20~40min，放置室温，12000r/min离心15min，收集沉淀；沉淀用质量浓度0.9% NaCl溶液洗涤2~4次，用去离子水重悬，得芽孢溶液，冻干，得芽孢粉末（spore），备用；
（3）制备芽孢衣壳纳米材料：将步骤（2）的芽孢粉末，用去离子水分散，配置成菌落单位1×1010~1×1011CFUs的芽孢溶液；将芽孢溶液置于挤压器中，使芽孢溶液强制反复先后通过挤压器内部孔径800nm、400nm、200nm的滤膜或滤板，得粒径均匀的混合溶液，离心，得滤饼，冻干，得芽孢衣壳纳米材料（CNMs）；
所述的挤压器为：滤膜挤出器、高压均质机、脂质体挤出器或高压纳米均质机，以及高压超滤中原理相近似仪器中的一种；
（4）制备芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物：将步骤（3）得到的芽孢衣壳纳米材料（CNMs）与步骤（1）得到的益生菌菌液置入营养肉汁液体培养基中，室温孵育5~7h，然后用在4℃下10000~12000r/min离心8-12min，得沉淀，沉淀用去离子水洗涤3次，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物。
所述方法制备的芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物，既保留了芽孢衣壳中的各种结合蛋白和结构域蛋白，又对益生菌具有天然的趋近性和亲和力，能够锚定在益生菌表面，形成一系列纳米材料与益生菌的组合物，粒度均匀，对极端环境耐受性高，生物相容性好，通过抑制IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎因子，起到很好的抗炎作用，而且具有高效通过胃酸环境，实现在结肠的快速定植和增殖的优势，恢复和重建肠道屏障的完整性，维持肠道黏膜稳态，增加肠道菌群的丰富度和多样性，进而达到对炎性肠病和结肠炎相关性结肠炎的有效防治，制备方法简单、生产费用低和胃酸环境稳定，选择提取的益生菌芽孢衣壳纳米材料用来包裹各种不同种类的益生菌，既可以保护益生菌不受胃酸的损坏，又可以促进益生菌在肠道的指数增长和快速定植，调节肠道菌群，增强肠道屏障，为炎性肠病和炎症诱发的癌症治疗提供了新的技术支持，是口服微生态制剂上的创新，有巨大的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明益生菌定植效率比较图。
具体实施方案
下面通过实施例对本发明的具体实施方式作进一步的说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）培养益生菌：将益生菌芽孢杆菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为140r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.005% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；
（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的3%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为140r/min下继续培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.005% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，产生芽孢后，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在80℃烘箱中加热30min，放置室温，12000r/min离心15min，收集沉淀；沉淀用质量浓度0.9% NaCl溶液洗涤3次，用去离子水重悬，得芽孢溶液，冻干，得芽孢粉末（spore），备用；
（3）制备芽孢衣壳纳米材料：将步骤（2）的芽孢粉末，用去离子水分散，配置成菌落单位1×1010~1×1011CFUs的芽孢溶液；将芽孢溶液置于滤膜挤出器（NANOJ EX5滤膜挤出器）中，使芽孢溶液强制反复先后通过挤压器内部孔径800nm、400nm、200nm的滤膜或滤板，得粒径均匀的混合溶液，离心，得滤饼，冻干，得芽孢衣壳纳米材料（CNMs）；
（4）制备芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物：将步骤（3）得到的芽孢衣壳纳米材料（CNMs）与步骤（1）得到的益生菌菌液置入营养肉汁液体培养基中，室温孵育5~7h，然后用在4℃下11000r/min离心10min，得沉淀，沉淀用去离子水洗涤3次，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物。
实施例2
本发明在具体实施中，一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）培养益生菌：将益生菌双歧杆菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为130r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；
（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的2%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为130r/min下继续培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，产生芽孢后，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在72℃烘箱中加热38min，放置室温，12000r/min离心15min，收集沉淀；沉淀用质量浓度0.9% NaCl溶液洗涤2次，用去离子水重悬，得芽孢溶液，冻干，得芽孢粉末（spore），备用；
（3）制备芽孢衣壳纳米材料：将步骤（2）的芽孢粉末，用去离子水分散，配置成菌落单位1×1010~1×1011CFUs的芽孢溶液；将芽孢溶液置于脂质体挤出器（LiposoEasy LE-1）中，使芽孢溶液强制反复先后通过挤压器内部孔径800nm、400nm、200nm的滤膜，得粒径均匀的混合溶液，离心，得滤饼，冻干，得芽孢衣壳纳米材料（CNMs）；
（4）制备芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物：将步骤（3）得到的芽孢衣壳纳米材料（CNMs）与步骤（1）得到的益生菌菌液置入营养肉汁液体培养基中，室温孵育5~7h，然后用在4℃下12000r/min离心8min，得沉淀，沉淀用去离子水洗涤3次，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物。
实施例3
本发明在具体实施中，一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）培养益生菌：将益生菌乳杆菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为160r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.006% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；
（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的4%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为160r/min下继续培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.006% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，产生芽孢后，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在88℃烘箱中加热22min，放置室温，12000r/min离心15min，收集沉淀；沉淀用质量浓度0.9% NaCl溶液洗涤4次，用去离子水重悬，得芽孢溶液，冻干，得芽孢粉末（spore），备用；
（3）制备芽孢衣壳纳米材料：将步骤（2）的芽孢粉末，用去离子水分散，配置成菌落单位1×1010~1×1011CFUs的芽孢溶液；将芽孢溶液置于挤压器中，使芽孢溶液强制反复先后通过挤压器内部孔径800nm、400nm、200nm的滤膜或滤板，得粒径均匀的混合溶液，离心，得滤饼，冻干，得芽孢衣壳纳米材料（CNMs）；
所述的挤压器为：滤膜挤出器、高压均质机、脂质体挤出器或高压纳米均质机，以及高压超滤中原理相近似仪器中的一种；
（4）制备芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物：将步骤（3）得到的芽孢衣壳纳米材料（CNMs）与步骤（1）得到的益生菌菌液置入营养肉汁液体培养基中，室温孵育5~7h，然后用在4℃下10000r/min离心12min，得沉淀，沉淀用去离子水洗涤3次，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物。
本发明所制备的基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与不同益生菌的组合物，具有简便的制备方法，生产费用低并且使用对于芽孢杆菌的大部分益生菌具有普遍的适用性。本发明中所制备的芽孢衣壳纳米材料具有生物相容性好、对极端环境耐受性高，良好的抗炎作用等优点。另外，该纳米材料还能为益生菌的生长提供部分营养物质，促进益生菌的快速增殖和定植。将芽孢衣壳纳米材料包裹在各种不同的益生菌表面作为保护性涂层，既可以保护益生菌活性不受胃酸环境的影响，又可以促进益生菌在肠道的指数增长和快速定植，调节肠道菌群，增强肠道屏障，为炎性肠病和炎症诱发的癌症治疗提供了新的技术支持，不仅是口服微生态制剂上的创新，更具有巨大的经济和社会效益。本发明经多次反复试验，均取得了一致的结果，有关试验资料如下：
一、基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与不同益生菌组合物的制备实验
首先将不同益生菌分别接种在营养肉汁液体培养基中进行增殖培养，当生长至对数期时，取增殖培养的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的2-4%接种量接种于营养肉汁液体培养基中，并在营养肉汁液体培养基中加入培养基体积的0.004%~0.006% MnSO4·H2O，继续培养72h，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在80℃烘箱中高温加热30min，然后通过离心，洗涤得到纯净的芽孢沉淀，通过生物扫描电镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察芽孢的形貌。结果显示提取制备的芽孢呈椭圆形，粒径约为1-2μm。随后通过压力滤膜挤压设备制备芽孢衣壳纳米材料。结果显示提取制备的纳米材料来源于芽孢衣壳，且粒径均一，约为100nm，并且能够耐受体内模拟胃肠道环境。此外，SEM和TEM结果均显示芽孢衣壳纳米材料可以被成功锚定在不同的益生菌表面，形成一系列纳米粒与益生菌的组合物，并且在体内具有高的定植效率。
二、基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与不同益生菌组合物对正常小鼠的影响实验
将六周龄的BALB/c小鼠随机分为5组：Saline（生理盐水），BC（益生菌），Spore（芽孢溶液），CNMs（芽孢衣壳纳米材料）和CNMs@BC（本发明芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物）。每组5只，将包含1×107 CFUs益生菌的各组制剂口服给药，分别在给药后24h和48h后，取肠组织进行H&E染色，分析其病理学特征。另外，通过血常规指标分析各组制剂给药后的炎症反应。结果显示，Spore组给药后，粘膜层局部可见溃疡，上皮细胞脱落，固有层肠腺数量减少，结缔组织增生，伴有淋巴细胞与中性粒细胞点状浸润。而其他组均未见明显的组织损伤和炎症反应，说明本发明中所制备的芽孢衣壳纳米材料以及基于芽孢衣壳纳米材料与不同益生菌组合物对健康小鼠是安全的。此外，取小鼠结肠组织进行革兰氏染色，结果发现，相比于其他组，CNMs@BC组具有高的益生菌定植效率（见图1），据测试，定植效率（RelativeColonization Rate相对定植率）比益生菌组可高出1.5倍以上，达17.5%，且定植后不仅能够促进上皮细胞产生凝血酶，促进肠组织的屏障修复和重建，而且还能形成厚厚的粘液屏障，进而抵抗有害细菌对组织侵袭。
三、基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与不同益生菌组合物的体内抗炎作用实验
首先将六周龄的BALB/c小鼠在同一条件下喂养一周，使每只小鼠的肠道微生物群同步，减少肠道微生物群落的异质性。除了健康对照组给予正常饮用水外，其他模型小鼠均给予3%的DSS饮用水7天。通过肠组织H&E染色和组织病理分析以及血常规检测，初步判定炎症小鼠模型构建成功。随后，将小鼠随机分为6组，分别为Normal（生理盐水），DSS（硫酸葡聚糖），BC（益生菌），Spore（芽孢溶液），CNMs（芽孢衣壳纳米材料），和CNMs@BC（本发明芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物），将包含1×107 CFUs益生菌的各组制剂口服给药。当给药10天后，CNMs@BC组的小鼠体重逐渐恢复至健康小鼠水平，停止治疗，评估小鼠的各项指标。结果显示，与其他治疗组相比，CNMs@BC组小鼠的结肠长度与健康组无显著性差异，且疾病指数（DAI）较低，组织病理分析也未见明显的炎症指标，表明CNMs@BC具有显著的炎症治疗效果。此外，对肠组织进行western blotting分析，结果显示，CNMs@BC可以增加肠组织紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，对于肠组织屏障的恢复和重建具有重要意义。
四、基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与不同益生菌组合物的体内抗肿瘤效果实验
本发明中也进一步研究了各组制剂对于AOM/DSS诱导的结肠炎相关结肠癌（CAC）的防治效果。适应性饲养一周后，实验组腹腔注射致癌剂AOM（10 mg/kg）；正常组小鼠腹腔注射等量生理盐水。一周后，实验组自由饮用3% DSS—周，停用两周为一个循环，共三个循环建立结肠炎相关性结肠癌模型。在第一个循环开始时预防性灌胃给药，并记录小鼠每天的体重变化。第三个周期结束后，评估小鼠的结肠长度和各项肠组织病理指标。结果显示，在经BC处理和经孢子处理的组中，观察到体重增加较少，显示出对CAC的敏感性更高。相反，在预防过程中，CNMs和CNMs@BC可以增加CAC模型小鼠的体重，这表明CNMs和CNMs@BC可以抑制炎症的发生和发展，降低肿瘤发生的概率。此外，在CAC预防的第3个周期中，CNMs@BC治疗组DAI指数下降，显著抑制由粘膜炎症而引起的结肠MPO活性升高，结肠长度增加，肿瘤结节数量减少，表明其具有优越的预防作用。此外，Elisa试剂盒检测结果也表明，CNMs@BC组可以通过IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎因子起到良好的抗炎效果。免疫组织化学和Westernblotting表明CNMs@BC可以降低肿瘤发生密切相关的IL-6和STAT3信号通路。而BC和Spore组并没有表现出这种作用。这些结果表明，CNMs@BC能够有效抑制炎症的发生和发展，从而起到预防肿瘤的效果。
最后，将小鼠粪便样品通过16s rDNA基因测序进行分析。结果显示，CNMs和CNMs@BC处理后，OUT，Shannon和chao1的指数较其他处理组显着增加，表明微生物组的丰富度和多样性得到显著提高。CNMs@BC组显著提高了lactobacillus的相对丰度。此外，基于tax4fun的功能预测分析用于进一步研究微生物组的功能。Tax4fun功能注释簇热图显示，CNMs@BC处理可以减少与肿瘤发生和发展相关的物种的相对丰度。有趣的是，CNMs@BC治疗组与健康小鼠表现出相似的微生物群组成和功能，这表明CNMs@BC能够将小鼠的微生物群恢复至健康小鼠水平，具有良好的预防癌症作用。
在对上述试验中，分别对实施例1-3及其他不同益生菌进行了同样的试验，均取得了相同或相近似的结果，这里不一一列举，试验表明，本发明方法稳定可靠、产品质量好，与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：
所述方法制备的益生菌芽孢衣壳纳米材料，尺寸均匀，对极端环境耐受性高，生物相容性好，通过抑制IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎因子，可起到较好的抗炎作用。
所述方法制备的益生菌芽孢衣壳纳米材料，保留了芽孢衣壳中的各种结合蛋白和结构域蛋白，与益生菌具有天然的趋近性和亲和力，能够锚定在益生菌表面，形成一系列纳米材料与益生菌的组合物。
所述方法制备的基于芽孢衣壳制备的纳米材料与益生菌组合物具有高效通过胃酸环境实现在结肠的快速定植和增殖的优势，恢复和重建肠道屏障的完整性，维持肠道黏膜稳态，增加肠道菌群的丰富度和多样性，实现对于炎性肠病和结肠炎相关性结肠炎的有效防治。
本发明提供一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与不同益生菌的组合物，具有简便的制备方法、生产费用低和胃酸环境稳定等优点，选择提取的益生菌芽孢衣壳纳米材料用来包裹各种不同种类的益生菌，既可以保护益生菌不受胃酸的损坏，又可以促进益生菌在肠道的指数增长和快速定植，调节肠道菌群，增强肠道屏障，为炎性肠病和炎症诱发的癌症治疗提供了新的技术支持，不仅是口服微生态制剂上的创新，更具有巨大的经济和社会效益。

Claims (7)

1.一种基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，其特征在于，首先，培养益生菌，使其产生芽孢，然后通过挤压器提取芽孢衣壳并制备成粒径均一、性质稳定的衣壳纳米材料，再将衣壳纳米材料与益生菌在其生长培养基中共孵育，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物；具体步骤如下：
（1）培养益生菌：将益生菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为120~160r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004%~0.006% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；
所述的益生菌是芽孢杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、梭菌、酵母菌或肠球菌中的一种；
所述的营养肉汁液体培养基是，牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g和NaCl 5.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.0；
（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的2-4%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为120~160r/min下继续培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004%~0.006% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，产生芽孢后，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在70~90℃烘箱中加热20~40min，放置室温，12000r/min离心15min，收集沉淀；沉淀用质量浓度0.9% NaCl溶液洗涤2~4次，用去离子水重悬，得芽孢溶液，冻干，得芽孢粉末，备用；
（3）制备芽孢衣壳纳米材料：将步骤（2）的芽孢粉末，用去离子水分散，配置成菌落单位1×1010~1×1011CFUs的芽孢溶液；将芽孢溶液置于挤压器中，使芽孢溶液强制反复先后通过挤压器内部孔径800nm、400nm、200nm的滤膜或滤板，得粒径均匀的混合溶液，离心，得滤饼，冻干，得芽孢衣壳纳米材料；
所述的挤压器为：滤膜挤出器、高压均质机、脂质体挤出器或高压纳米均质机，以及高压超滤中原理相近似仪器中的一种；
（4）制备芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物：将步骤（3）得到的芽孢衣壳纳米材料与步骤（1）得到的益生菌菌液置入营养肉汁液体培养基中，室温孵育5~7h，然后用在4℃下10000~12000r/min离心8-12min，得沉淀，沉淀用去离子水洗涤3次，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物。
2.根据权利要求1所述的基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养益生菌：将益生菌芽孢杆菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为140r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.005% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；
（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的3%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为140r/min下继续培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.005% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，产生芽孢后，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在80℃烘箱中加热30min，放置室温，12000r/min离心15min，收集沉淀；沉淀用质量浓度0.9% NaCl溶液洗涤3次，用去离子水重悬，得芽孢溶液，冻干，得芽孢粉末，备用；
（3）制备芽孢衣壳纳米材料：将步骤（2）的芽孢粉末，用去离子水分散，配置成菌落单位1×1010~1×1011CFUs的芽孢溶液；将芽孢溶液置于滤膜挤出器（NANOJ EX5滤膜挤出器）中，使芽孢溶液强制反复先后通过挤压器内部孔径800nm、400nm、200nm的滤膜或滤板，得粒径均匀的混合溶液，离心，得滤饼，冻干，得芽孢衣壳纳米材料；
（4）制备芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物：将步骤（3）得到的芽孢衣壳纳米材料与步骤（1）得到的益生菌菌液置入营养肉汁液体培养基中，室温孵育5~7h，然后用在4℃下11000r/min离心10min，得沉淀，沉淀用去离子水洗涤3次，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物。
3.根据权利要求1所述的基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养益生菌：将益生菌双歧杆菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为130r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；
（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的2%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为130r/min下继续培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.004% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，产生芽孢后，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在72℃烘箱中加热38min，放置室温，12000r/min离心15min，收集沉淀；沉淀用质量浓度0.9% NaCl溶液洗涤2次，用去离子水重悬，得芽孢溶液，冻干，得芽孢粉末，备用；
（3）制备芽孢衣壳纳米材料：将步骤（2）的芽孢粉末，用去离子水分散，配置成菌落单位1×1010~1×1011CFUs的芽孢溶液；将芽孢溶液置于脂质体挤出器（LiposoEasy LE-1）中，使芽孢溶液强制反复先后通过挤压器内部孔径800nm、400nm、200nm的滤膜，得粒径均匀的混合溶液，离心，得滤饼，冻干，得芽孢衣壳纳米材料；
（4）制备芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物：将步骤（3）得到的芽孢衣壳纳米材料与步骤（1）得到的益生菌菌液置入营养肉汁液体培养基中，室温孵育5~7h，然后用在4℃下12000r/min离心8min，得沉淀，沉淀用去离子水洗涤3次，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物。
4.根据权利要求1所述的基于益生菌芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养益生菌：将益生菌乳杆菌冻干粉接种在营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为160r/min下进行培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.006% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，使其复苏并生长增殖，当细菌增殖至对数期时，收集菌液，备用；
（2）提取芽孢：将步骤（1）制备的菌液按照营养肉汁液体培养基体积的4%接种量，接种于营养肉汁液体培养基中，置于37℃的恒温培养箱中，在震荡速度为160r/min下继续培养，在培养过程中加入营养肉汁液体培养基体积的0.006% MnSO4·H2O，促进益生菌产生芽孢，产生芽孢后，将含有益生菌和芽孢的混合培养液放置在88℃烘箱中加热22min，放置室温，12000r/min离心15min，收集沉淀；沉淀用质量浓度0.9% NaCl溶液洗涤4次，用去离子水重悬，得芽孢溶液，冻干，得芽孢粉末，备用；
（3）制备芽孢衣壳纳米材料：将步骤（2）的芽孢粉末，用去离子水分散，配置成菌落单位1×1010~1×1011CFUs的芽孢溶液；将芽孢溶液置于挤压器中，使芽孢溶液强制反复先后通过挤压器内部孔径800nm、400nm、200nm的滤膜或滤板，得粒径均匀的混合溶液，离心，得滤饼，冻干，得芽孢衣壳纳米材料；
所述的挤压器为：滤膜挤出器、高压均质机、脂质体挤出器或高压纳米均质机，以及高压超滤中原理相近似仪器中的一种；
（4）制备芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物：将步骤（3）得到的芽孢衣壳纳米材料与步骤（1）得到的益生菌菌液置入营养肉汁液体培养基中，室温孵育5~7h，然后用在4℃下10000r/min离心12min，得沉淀，沉淀用去离子水洗涤3次，得芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物。
5.权利要求1-4任一项所述方法制备的芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物在制备抗炎生物活性材料中的应用。
6.权利要求1-4任一项所述方法制备的芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物在制备抗炎口服微生态制剂中的应用。
7.权利要求1-4任一项所述方法制备的芽孢衣壳纳米材料与益生菌组合物在制备防治炎症及癌症药物中的应用。
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