CN114196564A - 一株嗜盐四联球菌及其在生产抗癌胞外多糖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一种新型嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)及其在生产抗癌胞外多糖中的应用。所述嗜盐四联球菌是从东北自然发酵豆酱中分离筛选得到，保藏号为CGMCC No.23137，能高产胞外多糖，并且具有产糖周期短、安全无毒副作用的优点。该菌株所产胞外多糖能显著抑制人肝癌细胞增殖，诱导细胞调亡，有望开发成新的抗癌天然药物。

Description

一株嗜盐四联球菌及其在生产抗癌胞外多糖中的应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一株新型嗜盐四联球菌及其在生产抗癌胞外多糖中的应用
背景技术
在中国，癌症仍然是疾病死因之首，发病率与死亡率还在每年爬升，根据国家癌症中心发布的2021年中国癌症统计数据，2021年中国估量有万例新发肿瘤病例和死亡病例，肝癌作为仅次于肺癌、结肠癌和胃癌的第4类癌症相关致死原因,仍然是我国发病率和死亡率较高的常见肿瘤。目前临床上的手术治疗主要适用于早期癌症患者，晚期患者则常采用化疗和放疗进行治疗，但是目前临床上的大部分化疗药物都带有极大的机体损伤副作用，所以对于治疗癌症急需一个更有效的方法。
胞外多糖是乳酸菌在其生长和代谢过程中产生和分泌的水溶性长链多糖，乳酸菌胞外多糖除了可以调节肠道菌群，提高机体免疫能力，抑制腐败菌滋生外，还具有多种潜在的生物活性，包括抗氧化、抗炎、调节肠道菌群、抗肿瘤、免疫调节和抗菌等。
以生物活性物质作为预防癌症和抗癌药物研发已经逐渐成为热点，以生物活性肽为代表的的一系列活性药物作为分子量小，靶向性高，毒副作用小，在癌症临床治疗上具有重要的研究价值。近年来，很多微生物多糖也被证明对癌症有一定的抑制作用，由于基本无细胞毒性，成为食品科学、天然药物等领域的研究热点之一，具有广阔的应用前景。在乳酸菌抗肿瘤方面，已有多篇研究证实乳酸菌菌株及其分泌成分通过激活caspases原、下调抗凋亡蛋白Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bax对癌细胞发挥抗增殖和促凋亡作用。因此，筛选具有抑制癌细胞功能的益生菌胞外多糖及其高产菌株是目前社会的研究热点。本发明针对极限菌种嗜盐四联球菌筛选新型胞外多糖生产菌株，期望提高嗜盐四联球菌胞外多糖的品质和产量，丰富可利用乳酸菌胞外多糖种类，拓展抗癌细胞药物类型，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)及其在生产抗癌胞外多糖中的应用。所述嗜盐四联球菌筛选自东北自然发酵的豆酱，能高产胞外多糖。所述胞外多糖能显著抑制人肝癌细胞增殖，诱导细胞调亡，有望开发成新的抗癌天然药物。
本发明一方面涉及一种嗜盐四联球菌，命名为嗜盐四联球菌SNTH-8(Tetragenococcus halophilus SNTH-8)，已于2021年8月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.23137。
本发明一方面涉及嗜盐四联球菌SNTH-8在制备发酵食品、保健品或药品中的应用。
本发明还涉及嗜盐四联球菌SNTH-8在胞外多糖生产中的应用。
本发明还涉及一种胞外多糖的生产方法，包括将嗜盐四联球菌SNTH-8接种于液体产糖培养基中进行发酵的步骤。
所述胞外多糖的生产方法，包括如下步骤：
(1)将活化后的嗜盐四联球菌SNTH-8按2％(v/v)的接种量接种到液体产糖发酵培养基中，在30℃、160rpm条件下摇瓶培养48h，得种子液；
(2)将种子液接入50L发酵罐中，内有液体产糖发酵培养基30L，在温度30℃，转速160rpm，空气流速比1:0.55,罐压0.12kg/cm2的条件下发酵72h，得发酵液；
(3)以转速10000×g离心20min去除发酵液中的菌体，得到发酵上清液；
(4)将发酵上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，4℃醇沉36h后，以转速10000×g离心20min收集沉淀；
(5)用去离子水充分溶解沉淀，向其中加入同等剂量的10％(m/v)三氯乙酸溶液，4℃放置过夜；以转速10000×g离心20min，得上清液；
(6)将得到的上清液再次醇沉过夜，离心收集沉淀；
(7)将沉淀用去离子水溶解后装入透析袋中，用去离子水透析去除小分子杂质，得到胞外多糖溶液；
(8)将胞外多糖溶液进行冷冻干燥，即得到粉末状胞外多糖。
步骤(1)所述的液体产糖发酵培养基中各组分及其含量分别为：氯化钠150g/L、蛋白胨10g/L、乙酸钠(无水)3g/L、磷酸氢二钾3g/L、七水合硫酸镁0.575g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、蔗糖50g/L、柠檬酸三钠2.42g/L、酵母浸粉4g/L、牛肉浸膏8g/L、吐温80 1g/L。
本发明还提供了一种胞外多糖，是通过上述方法生产获得的。
所述的胞外多糖包含EPS1和EPS2两种多糖，均由阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成。
本发明还涉及所述胞外多糖在化妆品、食品、保健品或药品生产中的应用。
本发明还涉及一种抗肝癌药物组合物，包含上述胞外多糖。
本发明提供的嗜盐四联球菌SNTH-8具有优良的产胞外多糖的能力，其胞外多糖产量高达996mg/L，并且具有产糖周期短、安全无毒副作用的优点。
嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖包含EPS1和EPS2两种组分,分子量分别为14976Da和21 031Da。EPS1和EPS2的单糖组成相似，均由阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成，但是其单糖组成比例存在一定的差别，EPS1主要是由木糖、半乳糖和葡萄糖组成，而EPS2主要是由木糖、半乳糖和葡萄糖醛酸组成。其中，EPS1和EPS2中含量最高的单糖均为木糖。此外，EPS1和EPS2中均有葡糖醛酸，而且EPS2中葡萄糖醛酸的含量(25.54％)显著高于EPS1(1.43％)。扫描电镜结果显示，EPS1和EPS2两种多糖在结构上存在明显区别，EPS1在放大2.00K倍数下表面呈片状，十分光滑，在放大10.0K倍数下，可以清晰的看到片状多糖表面有细微的突起颗粒，这种光滑的形态表面可以用于制造塑化生物膜材料，与其他形态材料相比，稳定性更高；EPS2在放大2.00K倍数下呈现出多孔棒状且有分支的复杂结构，在放大10.0K倍数下，可以清楚地看到棒状的多孔高分支结构，这种管状分布结构易于形成水化聚合物，可以增加产品的持水性和溶解度，可应用于食品药品及化妆品行业。
嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖能显著抑制人肝癌HepG-2细胞的增殖，且抑制效果随多糖浓度的增大而增强，当多糖浓度为1000μg/mL时，EPS1和EPS2对HepG-2细胞的抑制率分別达到48.67％和56.12％。倒置显微镜观察结果显示，随着多糖浓度的增大，HepG-2细胞数量在不断减少，细胞间隙变大，细胞拉长变形并发生皱缩，说明HepG-2细胞的增殖受到了显著抑制。多糖组分EPS1和EPS2对HepG-2细胞克隆形成能力具有明显的抑制作用，当多糖浓度为1000μg/mL时，EPS1和EPS2处理下的HepG-2细胞近乎丧失增殖能力，无法形成克隆细胞团。EPS1和EPS2还可以显著诱导HepG-2细胞的调亡。因此，嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖组分有望开发成抗肝癌天然药物。
本发明提供的嗜盐四联球菌SNTH-8可直接用于制备饲料添加剂、发酵食品、保健品或药品，还可用于生产胞外多糖，其所产胞外多糖可广泛应用于化妆品、食品、保健品或药品中，应用前景广阔。
附图说明
图1为LZ4菌株的菌落形态与菌体形态图；
图2为菌落形态比较图；其中，a为高产胞外多糖的菌落形态，b为不产胞外多糖的菌落形态；
图3为PCR电泳图；
图4为LZ4菌株与相关菌株的系统发育树；
图5为不同碳源对胞外多糖产量及菌株生长的影响；
图6为蔗糖浓度对胞外多糖产量及菌株生长的影响；
图7为不同氮源对胞外多糖产量及菌株生长的影响；
图8为大豆蛋白胨浓度对胞外多糖产量及菌株生长的影响；
图9为不同磷酸盐对胞外多糖及菌株生长的影响；
图10为K2HPO4添加量对胞外多糖产量及菌株生长的影响；
图11为初始pH值对胞外多糖产量及菌株生长的影响；
图12为培养温度对胞外多糖产量及菌株生长的影响；
图13为接种量对胞外多糖产量及菌株生长的影响；
图14为指标变化趋势图；
图15为DEAE-52阴离子交换柱层析图；
图16为Sephadex G-100凝胶柱层析图；
图17为紫外光谱图；
图18为凝胶渗透色谱分布图；
图19为单糖标准品的PMP柱前衍生高效液相色谱图；
图20为EPS1和EPS2的PMP柱前衍生高效液相色谱图；
图21为扫描电镜图；其中，a为EPS1×2.00K；b为EPS1×10.0K；c为EPS2×2.00K；d为EPS2×10.0K)
图22为EPS1和EPS2作用于HepG-2细胞24h后的抑制效果；
图23为EPS1和EPS2作用于HepG-2细胞48h后的抑制效果；
图24为EPS1和EPS2作用于HepG-2细胞72h后的抑制效果；
图25为EPS1和EPS2作用后HepG-2细胞的倒置显镜观察图；
图26为EPS1和EPS2对HepG-2细胞的划痕图像；
图27为EPS1和EPS2处理HepG-2细胞14d后克隆形成情况；
图28为EPS1和EPS2诱导HepG-2细胞的凋亡情况。
具体实施方式
本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本发明实施例使用的培养基及其配方如下：
MRS培养基：蛋白胨10g/L、乙酸钠(无水)3g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水合硫酸镁0.575g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、葡萄糖20g/L、柠檬酸三钠2.42g/L、酵母浸粉4g/L、牛肉浸膏8g/L、吐温80 1g/L；
固体分离培养基：MRS培养基中添加氯化钠150g/L、那他霉素2g/L、碳酸钙10g/L、琼脂20g/L，调整pH值为7.0；
富集培养基：MRS培养基中添加氯化钠150g/L、那他霉素2g/L、结晶紫500μL/L,pH6.4；
液体产糖培养基：氯化钠150g/L、蛋白胨10g/L、乙酸钠(无水)3g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水合硫酸镁0.575g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、葡萄糖5g/L、蔗糖45g/L、柠檬酸三钠2.42g/L、酵母浸粉4g/L、牛肉浸膏8g/L、吐温80 1g/L，pH6.4。
下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐述。
实施例1菌株的分离筛选
1、筛选样品
实验样品为从辽宁省12个不同地区(锦州、沈阳、庄河、本溪、大连、公主岭、丹东、葫芦岛、铁岭、鞍山、辽中和辽阳)收集的192份自然发酵豆酱样品。
2、四联球菌初筛
取豆酱样品1g，加入9mL 0.9％的无菌生理盐水，充分混匀并浸泡15min；然后取1mL样品液接种于富集培养集中，30℃静置培养1-2d后，采用平板涂布法在固体分离培养基上培养5-6d。
挑取菌落较小、有明显溶钙圈、呈乳白色且不透明，与乳酸菌菌落形态相似的单菌落，进行革兰氏染色。镜检观察结果显示，呈对状或四联球状的菌体共106株，其编号为SY1—SY11、LY1—LY10、BX1—BX12、LZ1—LZ17、JZ1—JZ16、DL1—DL10、DD1—DD14、TL1—TL7、GZL1—GZL3、HLD1—HLD6。
将上述106株四联球菌的单菌落分别进行纯化培养，备用。
3、产糖四联球菌的复筛
(1)产糖菌株初步筛选：
将上述106株四联球菌分别接入MRS液体培养基活化2代后，取200μL菌液，均匀涂布在固体分离培养基上，置于30℃恒温培养箱中静置培养18-36h。观察平板菌落特征，挑取平板上相对粘稠且拉丝长度较大的产粘单菌落，在MRS-S固体琼脂平板上反复三区划线，直至整个平板上都布满粘稠状菌落而没有不产糖的菌落。最终，申请人选取49株产粘能力强的菌株进行后续复筛试验。
(2)产糖能力测定：
将49株产粘能力强的菌株活化后，分别以2％(v/v)的接种量接种到液体产糖培养基中，30℃培养48h。以转速10000×g离心20min去除发酵液中的菌体，得到的上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇。4℃醇沉36h后，以转速10000×g离心20min收集沉淀，用去离子水充分溶解沉淀后向其中加入同等剂量的10％(m/v)三氯乙酸溶液，4℃放置过夜。再次以转速10000×g离心20min去除蛋白。将得到的上清液再次醇沉过夜后离心，收集多糖沉淀。将多糖沉淀用去离子水溶解后装入透析袋(MW Cut-off 14000Da)中，用去离子水透析2天去除小分子杂质，即得到胞外粗多糖溶液，经过冷冻干燥得到粉末状胞外粗多糖。将粗多糖加入同等剂量的去离子水后，采用苯酚-硫酸法测定并比较胞外多糖产量，具体结果见表1。
表1 49株产粘菌株胞外多糖产量比较
Figure BDA0003294091870000061
Figure BDA0003294091870000071
从表1的结果可知，本发明初筛获得的106株四联球菌中LZ4菌株产糖能力最强，胞外多糖的产量最高，达0.905±0.009mg/ml，取得了意料不到的技术效果。
实施例2 LZ4菌株的鉴定
1、菌落形态鉴定
所述LZ4菌株的菌落较小，呈乳白色，不透明，表面光滑有光泽,粘稠，边缘整齐；革兰氏染色呈阳性，细胞呈球形，一般存在情况为四联或成对。菌落形态图和细胞形态图如图1和图2所示。
2、生理生化特性
对LZ4菌株进行生理生化特征试验鉴定：糖发酵试验；过氧化氢酶试验；明胶液化试验；产氨试验；葡萄糖产酸产气试验；硫化氢试验；吲哚试验；运动性检测试验。
3、分子生物学鉴定
(1)细菌DNA提取：
吸取100μL LZ4菌株的菌悬液于灭菌后的MRS液体培养基中，在37℃振荡培养箱中培养24h。按照细菌基因组试剂盒(Solarbio D1600)上的操作步骤提取该菌株的基因组。
(2)PCR扩增：
设计PCR上游引物27F和下游引物1492R，由上海生工生物工程股份有限公司合成。
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(5'--3')；
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(5'--3')。
PCR反应条件为：95℃预热5min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min20s，循环36次；72℃保持8min，4℃保温。
(3)PCR产物的检测：
得到的扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后检测，得到片段长约为1500bp的条带。电泳条带如图3所示。
(4)16S rDNA测序及序列比对
将PCR产物送样至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，获得LZ4菌株的16srDNA序列SEQ ID NO；1，如下所示：
gcatgcggtgctatacatgcagtcgaacgctgcttaagaagaaacttcggttttttcttaagcggagtggcggacgggtgagtaacacgtggggaacctatccatcagcgggggataacacttggaaacaggtgctaataccgcatacggctttttttcacctgaaagaaagctcaaaggcgctttacagcgtcactgatggctggtcccgcggtgcattagccagttggtgaggtaacggctcaccaaagcaacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgcaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgtcagcaaagaacaggagaaagaggaaatgctttttccatgacggtagctgaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtgatttaagtctgatgtgaaagcccccagctcaactggggagggtcattggaaactggatcacttgagtgcagaagaggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagttaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaccgccctagagatagggtttccccttcgggggcaaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttattgttagttgccagcattgagttgggcactctagcaagactgccggtgacaaaccggaggaaggcggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggaagtacaacgagcaagccaagccgcaaggcctagcgaatctctgaaagcttctctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatccgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccaaagtcggtgcggcaacccttaggggagccagccgcgaagggggacgaagg。
将SEQ ID NO；1在NCBI数据库中应用BLAST工具与GenBank数据库已有序列进行比对，结果显示与嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)的相似性最高。进一步，使用MEGA7.0构建系统进化树，结果如图4所示，本发明筛选到的LZ4菌株与嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)的同源性最高。
综上，结合LZ4菌株的菌落形态、生理生化性特性以及分子生物学鉴定结果，可以得出结论，LZ4菌株为一株新型的嗜盐四联球菌，将其命名为嗜盐四联球菌SNTH-8(Tetragenococcus halophilus SNTH-8)。
申请人已于2021年8月12日将所述嗜盐四联球菌SNTH-8(Tetragenococcushalophilus SNTH-8)保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23137。
实施例3嗜盐四联球菌SNTH-8发酵条件分析
1、碳源及其浓度对多糖合成和菌株生长的影响
在产糖培养基基础上，分别用2％(w/v)的葡萄糖、蔗糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和木糖作为碳源，测定发酵液中的多糖产量及菌株生物量，根据菌株胞外多糖产量和生长情况确定最佳碳源，并考察其最佳浓度。
从图5可知，嗜盐四联球菌SNTH-8不能利用鼠李糖和木糖发酵产糖，且菌株的生长情况不好。尽管葡萄糖在一定程度上可以促进菌株的生长，但是胞外多糖产量相较蔗糖偏少。因此，蔗糖是供试碳源中的最佳碳源。
进一步对蔗糖浓度进行单因素试验。从图6可知，随蔗糖浓度的升高，嗜盐四联球菌SNTH-8的胞外多糖产量出现先升高后降低的趋势。当蔗糖浓度为5％时，胞外多糖产量最大为0.988g/L。因此，培养基中蔗糖的最佳浓度是5％。
2、氮源及其浓度对多糖合成和菌株生长的影响
以上述经碳源优化后的培养基为基础，分别用1％(w/v)的蛋白胨、胰蛋白胨、酵母蛋白胨和大豆蛋白胨作为氮源，测定发酵液中的多糖产量及菌株生物量，根据菌株胞外多糖产量和生长情况确定最佳氮源，并考察其最佳浓度。
从图7可知，嗜盐四联球菌SNTH-8菌株能够利用大豆蛋白胨，胰蛋白胨，酵母蛋白胨，蛋白胨进行发酵产糖，但对不同分子量的氮源的利用程度一样。其中，蛋白胨为氮源时，菌体生长情况最好，产糖量也仅次于以大豆蛋白胨为氮源时的产糖量。最终确定蛋白胨为最佳氮源。
进一步对蛋白胨浓度进行单因素试验。从图8可知，随着蛋白胨浓度的升高，嗜盐四联球菌SNTH-8的胞外多糖产量出现先升高后降低的趋势。当蛋白胨浓度为1.0％时，胞外多糖产量最大为0.949g/L。因此，培养基中蛋白胨的最佳浓度是1.0％。
3、磷酸盐种类及其浓度对多糖合成和菌株生长的影响
在碳源及氮源已优化的基础上，用0.2％(w/v)的K2HPO4、Na2HPO4、KH2PO4、NaH2PO4作为磷酸盐组份，测定发酵液中的多糖产量及菌株生物量，确定最佳磷酸盐组份，并考察最优磷酸盐浓度。
从图9可知，嗜盐四联球菌SNTH-8能够利用K2HPO4、Na2HPO4、KH2PO4、NaH2PO4这四种磷酸盐进行发酵产糖，但四种磷酸盐对于菌株产糖的促进作用是不同的。其中，以K2HPO4为磷酸盐进行发酵时，菌株产糖量最高，因此确定K2HPO4为最佳磷酸盐。
进一步对磷酸盐浓度进行单因素试验。从图10可知，磷酸盐浓度在0.1-1.0％之间，嗜盐四联球菌SNTH-8的胞外多糖产量差异变化不明显。当磷酸盐浓度为0.3％，菌株生长情况最佳，胞外多糖产量可达0.862g/L。因此，培养基中K2HPO4的最佳浓度是0.3％。
4、培养基初始pH值对多糖合成和菌株生长的影响
将优化后产糖MRS液体培养基的pH值分别调整为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，测定不同pH下菌株的生长曲线和多糖产量。
从图11可知，pH值过高或过低都会抑制嗜盐四联球菌SNTH-8生长，菌株在pH为5.0-8.0的环境中，OD值>0.5，都能生长。胞外多糖产量随着pH值从5.0增大到7.0，呈现先上升后下降的趋势，菌株生长情况与产糖量趋势一致。培养基初始pH值对菌株产糖影响较为明显。培养基初始pH值为6.0时，嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖能力和菌株生长情况最优。因此，培养基最佳初始pH值为6.0。
5、培养温度对多糖合成和菌株生长的影响
将活化后的嗜盐四联球菌SNTH-8菌液以2％(v/v)的体积接种至优化后的产糖MRS液体培养基，分别置于15℃、25℃、30℃、37℃和45℃条件下恒温培养36h，以未接种的MRS液体培养基作对照。测定不同温度下菌株的生长曲线和多糖产量。
从图12可知，嗜盐四联球菌SNTH-8的胞外多糖产量受培养温度影响较为明显。菌株在25-37℃环境中都能生长，但当温度过高和过低时，菌株生长受到抑制，胞外多糖产量不高。当培养温度为30℃时，发酵液OD600值明显高于其他温度，为菌株的最适生长温度，胞外多糖产量最高。因此，嗜盐四联球菌SNTH-8的最佳产糖温度为30℃。
6、接种量对多糖合成和菌株生长的影响
将活化后的嗜盐四联球菌SNTH-8菌液分别以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0％(v/v)的体积接种至优化后产糖MRS液体培养基，置于30℃恒温培养箱中，培养36h。测定不同温度下菌株的生长曲线和多糖产量。
从图13可知，随着接种量的增加，嗜盐四联球菌SNTH-8的生长情况和胞外多糖产量均呈现先逐渐增加后降低的趋势。当接种量为2％时，嗜盐四联球菌SNTH-8菌株生长情况良好，其发酵液中胞外多糖含量最高。因此，嗜盐四联球菌SNTH-8的最佳接种量为2％。
7、正交试验发酵产糖条件优化结果
经过分析上面单因素实验的结果，选择了初始pH、培养温度、接种量三因素设计正交试验，实验因素水平见表2。
表2 L9(33)正交试验因素水平表
Figure BDA0003294091870000111
表3 L9(33)正交试验方案及结果
Figure BDA0003294091870000112
Figure BDA0003294091870000121
正交实验设计和实验结果见表3。根据正交实验极差R值可知，接种量是影响胞外多糖产量最重要的因素，初始pH次之，培养温度影响最小。
从图14可以看出，随着初始pH、培养温度、接种量这三个因素的变化，胞外多糖产量会发生不同的变化，但是胞外多糖变化趋势却明显不同。从实际经济角度出发，最终申请人选择A1B2C2组合，即初始pH值为6.0、培养温度为30℃、接种量为2％。
实施例4嗜盐四联球菌SNTH-8在生产胞外多糖中的应用
优化后的液体产糖培养基配方：氯化钠150g/L、蛋白胨10g/L、乙酸钠(无水)3g/L、磷酸氢二钾3g/L、七水合硫酸镁0.575g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、蔗糖50g/L、柠檬酸三钠2.42g/L、酵母浸粉4g/L、牛肉浸膏8g/L、吐温80 1g/L，pH6.0。
将嗜盐四联球菌SNTH-8接入MRS液体培养基活化2代后，按2％(v/v)的接种量接种到优化后的液体产糖培养基中，在30℃、160rpm条件下摇瓶培养48h，得种子液；将种子液接入50L的发酵罐中，内有优化后的液体产糖培养基30L，在温度30℃，转速160rpm，空气流速比1:0.55,罐压0.12kg/cm2的条件下发酵72h，得发酵液。
以转速10000×g离心20min去除发酵液中的菌体，得到上清液，测定上清液中胞外多糖的含量。结果显示，嗜盐四联球菌SNTH-8胞外多糖产量可达996mg/L。
实施例5嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖的制备
1、胞外粗多糖的提取纯化
将实施例4所述嗜盐四联球菌SNTH-8发酵上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，4℃醇沉36h后，以转速10000×g离心20min收集沉淀；用去离子水充分溶解沉淀，向其中加入同等剂量的10％(m/v)三氯乙酸溶液，4℃放置过夜；再次以转速10000×g离心20min去除蛋白。将得到的上清液再次醇沉过夜，离心收集沉淀。将沉淀用去离子水溶解后装入透析袋(MW Cut-off 14 000Da)中，用去离子水透析2天去除小分子杂质，即得到胞外粗多糖溶液，经过冷冻干燥得到粉末状胞外粗多糖。
采用柱层析法对粗胞外多糖进行纯化，先选用DEAE-Cellulose 52离子交换柱进行第一步纯化，利用蒸馏水洗脱多糖样品中的中性基团，利用不同梯度的离子强度大NaCl溶液洗脱浓带负电基团。随后采用Sephadex G-100凝胶柱进行进一步纯化。上样量为2mL，样品浓度为25mg/mL，洗脱速率为1mL/min，每管10mL。采用硫酸-苯酚法测定后绘制洗脱曲线。
从图15可知，嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖被分为两个组分，按出峰顺序分别命名为EPS1和EPS2。EPS1和EPS2分别是由水和0.1mol/L NaCl溶液洗脱出峰，这表明EPS1组分为中性多糖，而EPS2组分带有一定量的电负性基团，可能是带有酸性基团的酸性多糖。
分别将两个多糖组分EPS1和EPS2经Sephadex G-100凝胶柱进一步分级纯化。结果如图16所示，EPS1和EPS2经凝胶柱洗脱后均为单一峰，说明这两个组分均被成功分离纯化，且为均一多糖组分。
2、纯化多糖的纯度鉴定结果
在波长190～400nm范围内对两个胞外多糖组分EPS1和EPS2进行全波长紫外光谱扫描。扫描结果如图17所示，经过纯化后的两个多糖组分，在260nm和280nm处已经无明显的紫外吸收峰，说明这两个多糖组分均已不含核酸和蛋白成分。在190-200nm之间有较强的特征吸收峰，表明其具有多糖的明显特征。
3、多糖化学组成成分
粗多糖、EPS1和EPS2的化学组成结果如表4所示。
表4粗多糖、EPS1和EPS2的组成成分分析
Figure BDA0003294091870000131
Figure BDA0003294091870000141
nd*未检出。
由表4的数据可知，EPS1和EPS2的总糖含量分别为92.16％、91.08％，两者的总糖含量均高于粗多糖中的总糖含量(75.24％)，说明经过纯化以后，两个多糖组分的纯度得到显著提高；EPS1和EPS2中均不含蛋白质，这一结果与紫外全波长扫描结果一致，说明在分离纯化的过程中，粗多糖中的蛋白质被完全除去；此外，EPS1和EPS2中还分别含有0.35％和2.38％的糖醛酸，EPS2中的糖醛酸含量显著高于EPS1组分，二者的糖醛酸含量均低于粗多糖中的糖醛酸含量(6.83％)；此外，粗多糖、EPS1和EPS2均含有少量的硫酸基，含量分别为0.25％、0.16％和0.19％。
4、分子量检测结果分析
采用凝胶渗透色谱法(GPC)对多糖组分EPS1和EPS2的分子量进行检测，其凝胶渗透色谱图如图18(a)和(b)所示。由图中可以看出，EPS1和EPS2呈现对称的单一峰，证实了这两个多糖组分的相对分子质量分布均匀。EPS1和EPS2多糖组分的保留时间依次为：21.51min和21.98min，对应的分子量分别为14 976Da和21 031Da。
5、单糖组成分析
采用葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、木糖(Xly)、鼠李糖(Rha)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)为标准品，通过PMP柱前衍生高效液相色谱法，对纯化后的多糖组分EPS1和EPS2的单糖组成进行分析。
结合图19、20和表5可知，EPS1和EPS2的单糖组成相似，均由阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成，但是其单糖组成比例存在一定的差别，EPS1主要是由木糖、半乳糖和葡萄糖组成，而EPS2主要是由木糖、半乳糖和葡萄糖醛酸组成。其中，EPS1和EPS2中含量最高的单糖均为木糖，由此可以推测木糖是两个多糖组分结构中的主要单元。此外，EPS1和EPS2中均有葡糖醛酸，而且EPS2中葡萄糖醛酸的含量(25.54％)显著高于EPS1(1.43％)，这一结果与前述多糖的化学组成中糖醛酸含量测定结果一致。
表5胞外多糖纯化组分的单糖组成
Figure BDA0003294091870000142
Figure BDA0003294091870000151
6、多糖扫描电镜分析
纯化多糖EPS1和EPS2的扫描电镜结果，如图21所示。
EPS1在放大2.00K倍(图21a)时，多糖表面呈片状，可以观察到多糖表面十分光滑，呈现出薄板样形态；在放大10.0K倍(图21b)时，可以清晰的看到片状多糖表面有细微的突起颗粒。这种光滑的形态表面可以用于制造塑化生物膜材料，与其他形态材料相比，稳定性更高。
EPS2在放大2.00K倍(图21c)时，显示出多孔棒状且有分支的复杂结构，这种结构与Ye et al(2018)研究结果类似；在放大10.0K倍(图21d)时，可以更清楚地看到棒状的多孔高分支结构。这种管状分布结构易于形成水化聚合物，可以增加产品的持水性和溶解度，可应用于食品药品及化妆品行业。
实施例6嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖对人肝癌HepG-2细胞抑制作用
1、人肝癌HepG-2细胞的复苏及传代
人肝癌HepG-2细胞由沈阳农业大学畜牧兽医学院实验室提供。
从液氮罐中取出HepG-2细胞，37℃快速溶化。离心，去除上清并向细胞沉淀中加入培养基，混匀后转入细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2下培养，待细胞几乎长满培养瓶，进行传代操作。首先将旧培养基倒掉，PBS溶液清洗两次，然后加入胰酶，细胞松动后，去除胰酶，沿壁加入培养基，自下往上吹打使贴壁的细胞完全脱落，收集细胞，用培养液稀释混匀后转入新的培养瓶进行传代培养。
2、嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖对肝癌HepG-2细胞生长的抑制作用
(1)MTT法测定胞外多糖对肝癌HepG-2细胞的抑制作用试验
将对数生长期的HepG-2细胞消化成单细胞悬液，血球计数板计数后用新培养基释成2×105cells/mL，96孔板每孔接种100μL，置于37℃、5％CO2条件下培养24h。吸除旧培养液，向培养孔中依次加10μL不同浓度的多糖溶液(100、500和1000μg/mL，过滤除菌)，50μg/mL的5-氟尿嘧啶为阳性对照，分别培养24h、48h和72h后添加10μL(50μg/ml)的MTT溶液，并培养4h。吸除液体并向每孔加100μL的DMSO溶液，室温放置10min底溶解甲臜后混匀，然后采用酶标仪在570nm波长下测定对应吸光度。
抑制率(％)＝[1-(A样品-A空白)/(A对照-A空白)]×100。
公式中：A样品为添加多糖样品的吸光度；
A空白为不添加多糖样品的吸光度；
A对照-为不添加多和细胞的吸光度。
图22为胞外多糖对HepG-2细胞作用24h后的抑制效果。从图中可以看出，嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖组分EPS1和EPS2对HepG-2细胞的增殖抑制作用表现剂量依赖性，且抑制作用随多糖浓度的增大而增强。当最大浓度时1000μg/mL，EPS1和EPS2对HepG-2细胞的抑制率分别为34.21％和35.48％。
图23为胞外多糖对HepG-2细胞作用48h后的抑制效果。与24h相比，作用48h后，EPS1和EPS2对HepG-2细胞的增殖表现出更加明显的抑制作用，且抑制作用随多糖浓度的增大而增强。当多糖浓度为1000μg/mL时，EPS1和EPS2对HepG-2细胞的抑制率分别为42.67％和50.12％。
图24为胞外多糖对HepG-2细胞的作用72h后的抑制效果。EPS1和EPS2对HepG-2细胞的抑制作用更加明显，抑制活性同样具有一定的剂量依赖关系。当多糖浓度为1000μg/mL时，EPS1和EPS2对HepG-2细胞的抑制率分別达到48.67％和56.12％。
上述结果表明，本发明提供的嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖能显著抑制人肝癌HepG-2细胞的增殖，且EPS2的抑制效果要明显优于EPS1。
(2)倒置显微镜观察细胞形态变化
取对数生长期的HepG-2细胞，胰酶消化后用新鲜培养基稀释至2×105cells/mL，以每孔2mL的接种量接种于6空板中，培养24h后吸除旧培养液，加入同体积含有上述不同浓度多糖的新培养基，以不加多糖的培养基作为对照，再培养48h后置于倒置显微镜下观察。
从图25可知，不添加多糖的对照组HepG-2细胞生长良好，形态饱满均细胞间连接紧密，数量丰富。而不同浓度的胞外多糖EPS1和EPS2作用48h后，HepG-2细胞随着多糖浓度的增大，数量在不断减少，细胞间隙变大，细胞拉长变形并发生皱缩，说明HepG-2细胞的增殖受到了显著抑制，这与上述的MTT实验结果相一致，进一步从细胞形态上证明嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖组分EPS1和EPS2具有抑制癌细胞生长的作用。
3、胞外多糖对肝癌HepG-2细胞克隆形成能力的抑制作用
收集对数期人肝癌HepG-2细胞，调整细胞密度800个/孔，接种于24孔板培养24h，加入终浓度为100、500和1000μg/mL的EPS1和EPS2溶液处理细胞14d，同时设置空白对照。用免疫固定液覆盖细胞，室温固定20min，0.1％(m/v)结晶紫染液染色15min，烘干后显微镜下观察拍照。每孔中加入1％SDS(m/v)充分溶解细胞内结晶，对细胞克隆实验的结果进行量化分析，以未添加多糖的培养基作为对照组。
结果如图26和27所示，可以看出EPS1和EPS2对HepG-2细胞克隆形成能力具有明显的抑制作用，且具有剂量相关性，与对照组相比，当多EPS1糖浓度为100μg/mL时，HepG-2细胞的克隆形成数明显降低，EPS1和EPS2处理下的细胞克隆数分别降至对照组的45％和40％；当多糖浓度增加到为500μg/mL，EPS1和EPS2处理下的细胞克隆数分别降至对照组的14％和10％；当多糖浓度增加到为1000μg/mL，EPS1和EPS2处理下的HepG-2细胞近乎丧失增殖能力，无法形成克隆细胞团。可见，嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖组分EPS1和EPS2对HepG-2细胞克隆形成能力具有明显的抑制作用。
4、胞外多糖诱导肝癌HepG-2细胞凋亡
HepG-2细胞培养48h后，用不同浓度(100，500和1000μg/mL)的EPS1和EPS2孵育处理24h，参照细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒操作。
Annexin-VPI双染结果如图28所示，未经多糖样品处理的对照组HepG-2细胞也存在自然死亡现象，但凋亡率很低，仅为1.2％；而经不同浓度的EPS1和EPS2处理48h后，发生凋亡的细胞明显增多，且具有浓度依赖性。经100、500和1000μg/mL EPS1处理后，HepG-2细胞的凋亡率分别达到23.7％、38.1％和46.1％，经100、500和1000μg/mLEPS2处理后，HepG-2细胞的凋亡率分别达到25.5％、41.5％和49.6％。从而说明，嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖组分EPS1和EPS2可以显著诱导HepG-2细胞的调亡。
综上所述，本发明提供的嗜盐四联球菌SNTH-8能高产胞外多糖，其所产胞外多糖包含EPS1和EPS2两种组分。所述多糖组分EPS1和EPS2能显著抑制人肝癌HepG-2细胞的增殖，且抑制效果随多糖浓度的增大而增强。所述多糖组分EPS1和EPS2对HepG-2细胞克隆形成能力具有明显的抑制作用，当多糖浓度为1000μg/mL时，EPS1和EPS2处理下的HepG-2细胞近乎丧失增殖能力，无法形成克隆细胞团。所述多糖组分EPS1和EPS2还可以显著诱导HepG-2细胞的调亡。因此，嗜盐四联球菌SNTH-8产胞外多糖组分有望开发成抗肝癌天然药物，应用前景广阔。
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 一株嗜盐四联球菌及其在生产抗癌胞外多糖中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1458
<212> DNA
<213> 嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)
<400> 1
gcatgcggtg ctatacatgc agtcgaacgc tgcttaagaa gaaacttcgg ttttttctta 60
agcggagtgg cggacgggtg agtaacacgt ggggaaccta tccatcagcg ggggataaca 120
cttggaaaca ggtgctaata ccgcatacgg ctttttttca cctgaaagaa agctcaaagg 180
cgctttacag cgtcactgat ggctggtccc gcggtgcatt agccagttgg tgaggtaacg 240
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gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt 540
gggcgtaaag cgagcgcagg cggtgattta agtctgatgt gaaagccccc agctcaactg 600
gggagggtca ttggaaactg gatcacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccatgtg 660
tagcggtgaa atgcgtagat atatggagga acaccagtgg cgaaggcggc tctctggtct 720
gtaactgacg ctgaggctcg aaagcgtggg tagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780
cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgttg gagggtttcc gcccttcagt gctgcagtta 840
acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac 900
gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960
caggtcttga catcctttga ccgccctaga gatagggttt ccccttcggg ggcaaagtga 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgtaacg 1080
agcgcaaccc ttattgttag ttgccagcat tgagttgggc actctagcaa gactgccggt 1140
gacaaaccgg aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200
cacacgtgct acaatgggaa gtacaacgag caagccaagc cgcaaggcct agcgaatctc 1260
tgaaagcttc tctcagttcg gattgcaggc tgcaactcgc ctgcatgaag ccggaatcgc 1320
tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atccgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380
gtcacaccac gagagtttgt aacacccaaa gtcggtgcgg caacccttag gggagccagc 1440
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Claims (10)

1.一种嗜盐四联球菌，其特征在于，所述嗜盐四联球菌的保藏号为CGMCC No.23137。
2.权利要求1所述的嗜盐四联球菌在制备发酵食品、保健品或药品中的应用。
3.权利要求1所述的嗜盐四联球菌在胞外多糖生产中的应用。
4.一种胞外多糖的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括将权利要求1所述的嗜盐四联球菌接种于液体产糖培养基中进行发酵的步骤。
5.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述的生产方法包括如下步骤：
(1)将活化后的权利要求1所述嗜盐四联球菌按2％(v/v)的接种量接种到液体产糖培养基中，在30℃、160rpm条件下摇瓶培养48h，得种子液；
(2)将种子液接入50L发酵罐中，内有液体产糖培养基30L，在温度30℃，转速160rpm，空气流速比1:0.55,罐压0.12kg/cm2的条件下发酵72h，得发酵液；
(3)以转速10000×g离心20min去除发酵液中的菌体，得到发酵上清液；
(4)将发酵上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，4℃醇沉36h后，以转速10000×g离心20min收集沉淀；
(5)用去离子水充分溶解沉淀，向其中加入同等剂量的10％(m/v)三氯乙酸溶液，4℃放置过夜；以转速10000×g离心20min，得上清液；
(6)将得到的上清液再次醇沉过夜，离心收集沉淀；
(7)将沉淀用去离子水溶解后装入透析袋中，用去离子水透析去除小分子杂质，得到胞外多糖溶液；
(8)将胞外多糖溶液进行冷冻干燥，即得到粉末状胞外多糖。
6.如权利要求4或5所述的生产方法，其特征在于，所述的液体产糖培养基中各组分及其含量分别为：氯化钠150g/L、蛋白胨10g/L、乙酸钠(无水)3g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水合硫酸镁0.575g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、葡萄糖5g/L、蔗糖45g/L、柠檬酸三钠2.42g/L、酵母浸粉4g/L、牛肉浸膏8g/L、吐温80 1g/L。
7.如权利要求4或5所述的生产方法，其特征在于，所述的液体产糖培养基中各组分及其含量分别为：氯化钠150g/L、蛋白胨10g/L、乙酸钠(无水)3g/L、磷酸氢二钾3g/L、七水合硫酸镁0.575g/L、一水合硫酸锰0.25g/L、蔗糖50g/L、柠檬酸三钠2.42g/L、酵母浸粉4g/L、牛肉浸膏8g/L、吐温80 1g/L。
8.一种胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖是通过权利要求4-7任一所述的生产方法获得的。
9.权利要求8所述的胞外多糖在化妆品、食品、保健品或药品生产中的应用。
10.一种抗肝癌药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求8所述的胞外多糖。
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