CN115433695B - 一株干酪乳杆菌及其作为复合口腔益生元咀嚼片的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一株干酪乳杆菌A1及其作为复合口腔益生元咀嚼片的应用。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22654，分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus caseiA1，保藏日期为2021年06月04，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株可发酵乌参粉，并以此制得有别与乌参粉本身的多糖成分以及二萜类化合物，经过细胞实验其具有抗肿瘤细胞活性性能，并以此制备的复合口腔益生元咀嚼片经过动物实验证实具有抗氧化性能、醒脑和改善微循环等性能，具有广泛的药用或保健用产品应用前景。

Description

一株干酪乳杆菌及其作为复合口腔益生元咀嚼片的应用
技术领域
本申请涉及干酪乳杆菌技术领域，尤其涉及一株干酪乳杆菌及其作为复合口腔益生元咀嚼片的应用。
背景技术
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)为经典的益生菌之一，其具有较强的加工性能，并且在调节人体免疫系统，及调节人体肠道环境方而具有突出的功能一般可在以乳基质中，并分泌的胞外酶，分解酪蛋白，以产生多种对血管紧张素I具有抑制作用的各种多肽，在机体体内具有明显的降血压作用。干酪乳杆菌还具有抑制肠道病原微生物、调节肠道菌群平衡、增强免疫力的等多种功能。干酪乳杆菌在大量传统发酵乳制品中占据优势地位，因此具有广泛的来源。
然而，仅仅对干酪乳杆菌在乳制品等环境中进行发酵的菌株，远远不能满足现实需要，对其在功能性食品，如咀嚼片，功能性药物等等方面的应用研究仍然存在不足。
发明内容
有鉴于此，本申请实施例的目的在于拓宽对干酪乳杆菌的研究认知，以提供其在多领域的应用，甚至提供一株新型的干酪乳杆菌。
第一方面，本申请实施例公开了一株干酪乳杆菌A1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22654，分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei A1，保藏日期为2021年06月04，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
第二方面，本申请实施例公开了所述的干酪乳杆菌A1在发酵乌参中的应用。
在本申请实施例中，所述应用包括以下步骤：
配制种子培养液和发酵培养液，所述种子培养液包含2～8g/L乌参粉，所述发酵培养液包含8～15g/L乌参粉；
制备种子悬液，所述种子悬液由保藏的干酪乳杆菌A1进行菌种活化后，接种于所述种子培养液中进行培养得到；
获得发酵液，所述发酵液是将所述种子悬液转接至所述发酵培养液发酵得到；
得到干燥制品，所述干燥制品由所述发酵液进行纯化得到。
在本申请实施例中，所述应用还包括收集发酵液，对其中的菌体进行破碎后，分别纯化得到多糖冻干粉和二萜类冻干粉的步骤。
在本申请实施例中，菌体破碎步骤包括：将菌体用含溶菌酶的HEPES缓冲液重悬后，混匀后于30℃处理3h，使得菌体破裂，然后将溶液于4℃8000rpm离心10min，得到菌体的初酶液；向初酶液中加入硫酸铵至其饱和度为30％，并不断搅拌后，于4℃环境放置2h，于4℃9000rpm离心20min，取得上清液；
得到多糖冻干粉的步骤包括：取菌体破碎所得上清液与0.1g/mL氯化十六烷基吡啶溶液混合后，于室温下放置12h后，于4℃2000rpm离心3min得沉淀溶解于12.5mL V(4mol/LNaCL):V(乙醇)＝100:15溶液中，同时加入25mL体积分数95％乙醇溶液，4℃下静置12h后离心，沉淀以15mM NaH2PO4-Na2HPO4(pH6.25)缓冲液复溶，过阴离子交换柱，以苯酚-硫酸法检测各管中多糖含量，合并检测结果达到最高含量10％以及以上各收集管中的溶液，并以截留分子质量为8000～14000Da的透析袋透析处理，冻干，即可得到所述多糖冻干粉；
得到二萜类冻干粉的步骤包括：取菌体破碎所得上清液用乙酸乙酯萃取，室温下连续萃取3次，合并萃取液，后减压浓缩得到乙酸乙酯相浸膏，冻干，即可得到二萜冻干粉。
第三方面，本申请实施例还公开了所述的干酪乳杆菌A1在制备复合口腔益生元咀嚼片中的应用。
在本申请实施例中，所述复合口腔益生元咀嚼片具有醒脑、抗氧化和改善微循环中的至少一项功能。
在本申请实施例中，所述复合口腔益生元咀嚼片，按重量份数计，包含二萜冻干粉10～20份，多糖冻干粉20～40份，脱脂乳150～250份，木糖醇100～200份，硬脂酸镁1～5份。
在本申请实施例中，所述二萜冻干粉和所述多糖冻干粉由所述的干酪乳杆菌A1在发酵乌参制得。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请从自然发酵食品酸汤液中筛选得到一株干酪乳杆菌A1，发现其可发酵乌参粉，并具有抗氧化性能。本申请还对其发酵乌参粉后的菌体进行破碎和纯化，得到菌体多糖冻干粉和乙酸乙酯浸膏，经过分析证实了其多糖冻干粉含有区别于乌参粉本身的多糖成分，分子量在170kDa左右，经过细胞实验证实该多糖冻干粉具有抗肿瘤细胞活性性能；并发现其乙酸乙酯浸膏中含有二萜类成分。
另外，本申请还以发酵得到的菌体多糖冻干粉和乙酸乙酯浸膏为基础，制备得到了一种复合口腔益生元咀嚼片，经过动物实验证实了，该咀嚼片治疗组神经缺损症状显著减轻,局部脑血流量较对照组明显增加，血清抗自由基损伤能力得到提高，以此提升该复合口腔益生元咀嚼片，可能作为一种抑制自由基连锁反应、醒脑、改善微循环、提高机体耐缺氧能力的咀嚼片，以具有广泛的药用或保健用产品应用前景。
附图说明
图1为本申请实施例提供的初筛得到的平板菌落。
图2为本申请实施例提供的终筛得到的平板菌落。
图3为本申请实施例提供的16S rDNA鉴定过程中的电泳结果图；由左至右依次为Marker，以及不同浓度的扩增样品。
图4为本申请实施例提供的化合物1的结构示意图。
图5为本申请实施例提供的化合物2的结构示意图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
干酪乳杆菌A1的筛选
1、筛选样品来源
从自然发酵食品酸汤液，500mL，作为原始菌液。
2、初筛
将原始菌液用无菌水稀释成10-1～10-8的稀释度的溶液后，分别涂布于的MRS平板，每处理设3个平行，涂匀稀释液；于30℃恒温培养箱中倒置培养24h，于平板上喷涂1mol/L NaCO3溶液，若该菌株能产生β-葡萄糖苷酶则可以将对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(简称为PNPG)水解为PNP(对硝基苯酚)，PNP能够与NaCO3反应产生黄色的物质而使菌落周围出现黄色显色圈，将筛选出的产β-葡萄糖昔酶的菌株连续传代三次并重复点样于PNPG平板，筛选出显色圈较大、显色能力稳定的菌株。如图1所示。
3、复筛
将初步筛选得到的菌株分别接种于5mL MRS液体培养基中30℃巨温培养24h，3000r/min离心10min，弃去上清后将菌泥悬浮于5mL无菌生理盐水中，取1mL菌悬液加入9mL过滤除菌的pH为6.6的人工唾液(货号GL2542，百奥莱博公司)中，置30℃恒温培养3h以上，分别在0h和3h分别取样测定活菌数，用MRS琼脂培养基倾注平板，于30℃培养48h后进行计数，计算存活率，筛选存活率在80％及以上的菌株。其中，存活率(％)＝3h活菌数/0h活菌数×100％
4、终筛
将复筛得到的平板，挑取菌落，每10个菌落分散于10mL无菌水中，取2mL涂布于MRS平板上，置30℃恒温培养至菌落数为80～300个后，将MRS平板封口后，置于20W紫外灯下5℃m辐照5min，后置于30℃恒温培养30min后，再次置于30℃恒温培养，挑选平板上的菌落，得到四株菌株，分别命名为A1、A2、A3和A4。
5、乌参粉水解检测
将上述得到的A1、A2、A3和A4菌株分别挑取后溶于10mL无菌水中，涂布于含有0.05m/m％乌参粉(冷冻东海乌参，浙江宁波超星公司提供)的MRS平板上，置于30℃恒温培养，选取水解圈圈较大、显色能力稳定的菌株，如图2所示，其中，A1菌的水解圈最大，最为明显，故而选用。
6、抗氧化能力检测
6.1、菌液制备
将终筛的A1、A2、A3和A4菌株分别于含有0.022m/m％乌参粉的MRS液体培养基中，于30℃恒温培养48后，取发酵液，于4℃条件下以6 000r/min离心10min，弃上清液，菌体用PBS离心洗涤3次，浓度调节为1×109CFU/mL。
6.2、细胞培养
将HepG2细胞(尚恩生物)按常规方法复苏后，置于含有10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％L-谷氨酰胺和1％双抗的低糖DMEM培养液中，37℃、5％CO2的培养箱中进行培养，隔天更换一次培养液，待细胞贴壁融合率达80％左右时，用含0.02％EDTA的0.25％胰酶消化细胞，按1:3传代，取对数生长期细胞进行实验。
6.3、H2O2对HepG2细胞氧化损伤模型的建立及分组实验
将对数生长期中的HepG2细胞按照2×105个/mL接种到6孔板中，每孔200μL，37℃、5％CO2的培养箱中培养24h后，加入含H2O2终浓度分别为0.10mmol/L的DMEM培养液，作用2h，弃上清液，以MTT法检测细胞活力低于80％时，即表明并氧化损伤模型细胞建立成功。
向建立的模型细胞孔板中加入108CFU/mL菌悬液100μL和1.7mL DMEM培养液，作为处理组。对照组为含有200μL正常的HepG2细胞的孔板中加入1.8mL DMEM培养液。模型组为含有200μL经过H2O2处理的氧化损伤的HepG2细胞，同时向孔板中加入1.8mL DMEM培养液。各组细胞于7℃、5％CO2继续培养24h，测定细胞相比指标。
6.4、MTT法检测细胞存活率
在96孔板中每孔加入40μL 5g/L MTT(Abcam中国)，37℃、5％CO2孵育4h，吸出培养液，每孔加入150μL的104个/mL的DMSO细胞悬液，作为测试组；对照组加入200μL的104个/mL的DMSO细胞悬液，未加MTT溶液；分别于37℃培养箱中放置10min，酶标仪测定各孔在570nm波长处的吸光度。按下式计算细胞存活率，细胞存活率＝测试组的吸光度/对照组的吸光度×100％。
6.5、收集细胞
将上述分组实验的细胞继续培养24h后，吸取含有细胞的上清液10mL装入离心管，每孔用PBS洗涤3次，然后加入1mL 1％的Triton X-100用吸管充分吹匀，2000r/min离心15min，收集上清液即为细胞裂解液，按照试剂盒说明书进行T-AOC、SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、CAT活力、POD活力和MDA含量测定，相关试剂盒均购自南京森贝伽。
6.6、抗氧化能力检测结果
表1
表1列出了上述细胞实验的结果。由表1可知，模型组中，细胞裂解液中的T-AOC、SOD、GSH、GSH-Px和CAT含量均显著低于对照组，而POD和MDA含量均显著高度对照组，表明模型组中，HepG2细胞已表现为氧化应激状态，引起脂质过氧化损伤，导致细胞活性降低，也表明氧化应激模型细胞造模成功。
表1中，处理组中，A1菌悬液处理造模成功的氧化应激模型细胞后，其细胞裂解液中的T-AOC、SOD、GSH、GSH-Px和CAT含量均显著高于模型组，而POD和MDA含量均显著低于模型组，分别与对照组处于同一水平，表明A1菌悬液处理后，该氧化应激模型细胞恢复了正常的抗氧化功能。而处理组中其他A2\A3\A4菌悬液处理的氧化应激模型细胞后，其细胞裂解液中T-AOC、SOD、GSH、GSH-Px、CAT含量、POD和MDA含量仅有少部分恢复至于正常组相当的水平，由此说明，A2\A3\A4菌悬液并不能有效调节模型细胞相关抗氧化物质含量，不能起到有效保护HepG2免受双氧水的氧化损伤。
干酪乳杆菌A1的鉴定
由此，确定上述筛选的A1菌进行分析和鉴定。根据细菌基因组DNA提取试剂盒中说明书进行总DNA提取，并以此DNA为模板，进行16SrDNA扩增，加入通用引物进行PCR扩增，正向引物为27F:agagtttgatcctggctcag，如SEQ ID NO.1所示；反向引物为1495R:ctacggctaccttgttacga，如SEQ ID NO.2所示；PCR扩增体系为25μL:上下游引物各1μL，DNA模板1μL，ExTaq mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL，PCR的反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸2min，30次循环，最后72℃延伸5min。将PCR扩增产物委托上海生工生物工程股份有限公司测序，其16SrDNA测序结果如SEQ ID NO.3所示，在NCBI上用BLAST模块进行同源性比对。结果发现，本申请实施例筛选得到的A1均与Lactobacilluscasei subsp.casei ATCC 393有99.47％的同源性，因而命名为干酪乳杆菌Lactobacilluscasei A1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.22654，保藏日期为2021年06月04，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
干酪乳杆菌Lactobacillus casei A1发酵乌参
本申请实施例还公开了一种利用上述实施例公开的干酪乳杆菌A1发酵乌参发酵乌参粉的方法。该方法具体包括以下步骤：
1)配制种子培养液和发酵培养液，所述种子培养液包含2～8g/L乌参粉，所述发酵培养液包含8～15g/L乌参粉；
2)制备种子悬液，所述种子悬液由保藏的干酪乳杆菌A1进行菌种活化后，接种于所述种子培养液中进行培养得到；
3)获得发酵液，所述发酵液是将所述种子悬液转接至所述发酵培养液发酵得到；
4)得到干燥制品，所述干燥制品由所述发酵液进行纯化得到。
本申请实施例通过利用干酪乳杆菌A1发酵乌参粉，不仅充分利用乌参粉中自身含有的乌参蛋白和多糖作为养分，通过生物降解合成了具有抗氧化和醒脑功能的多肽。并由此通过该发酵方法得到了一种干燥制品。
1、具体发酵过程
具体的实施例1，将保存的菌种A1转移至转接至斜面培养基，30℃培养15h，转接至种子培养液，于30～32℃100～150rpm摇瓶培养12～18h。其中，种子培养液包含5.5g/L乌参粉、15g/L葡萄糖、5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、2g/L磷酸氢二钾、2g/L柠檬酸二铵、3g/L乙酸钠和0.1v/v％吐温80，种子培养液的pH为6.2～6.4(用磷酸氢二钾调节pH)。测定种子细胞悬浮液的吸光度OD660，不低于0.6，并且采用活菌计数法进行活菌检测，其活菌数不低于菌浓度大致为1×106CFU/mL。
具体的，将达到此要求的种子细胞悬液转接至发酵培养液中，于32～35℃，且在无菌空气流量0.5～1.5L/min及转速100～150r/min的通气搅拌下通气发酵，发酵36～72h。其中，发酵培养液包含12.5g/L乌参粉、13.5g/L葡萄糖、5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、2g/L磷酸氢二钾、2g/L柠檬酸二铵、3g/L乙酸钠、0.1v/v％吐温80、0.35g/L硫酸镁、0.05g/L柠檬酸钙和0.015g/L硫酸锰，发酵培养液的pH为6.2～6.4。
检测发酵液吸光度OD660，不低于0.8，采用活菌计数法进行活菌检测，发酵液活菌数不低于菌浓度大致为1×108CFU/mL时，即可停止发酵，收集发酵液进行纯化处理。
本申请还实施了对比例1，其步骤与上述实施例1相同，区别仅在于其发酵所用菌种为购自明舟生物公司的一般Lactobacillus casei菌株，货号为BMZ134814。并通过上述步骤，对发酵液进行浸提和超滤，亦得到一种干燥制品。
2、纯化
具体的实施例1的纯化处理步骤包括：
(1)收集发酵液：
收集发酵液500mL，2000rpm离心20min，得到438mL上清液和36.7g沉淀。
(2)菌体破碎
取36.7g沉淀，加入120mL HEPES缓冲液和30mL 20mg/mL的溶菌酶溶液(源叶生物)，混匀后于30℃处理3h,使得菌体破裂，然后将溶液于4℃8000rpm离心10min，得到菌体的初酶液；
向初酶液中加入硫酸铵至其饱和度为30％，并不断搅拌后，于4℃环境放置2h，于4℃9000rpm离心20min，得上清液137mL。
(3)菌体多糖成分
取一半上清液68.5mL，加入1.3mL 0.1g/mL氯化十六烷基吡啶溶液(CPC，购自上海生工生物工程有限公司)，于室温下放置12h后，于4℃2000rpm离心3min得沉淀溶解于12.5mL V(4mol/LNaCL):V(乙醇)＝100:15溶液中，同时加入25mL体积分数95％乙醇溶液，4℃下静置12h后离心，沉淀以15mM NaH2PO4-Na2HPO4(pH6.25)缓冲液复溶，上样于赛默飞D50阴离子交换填料(3.8cm×25cm)柱，以0～1.4mol/L NaCL进行线性梯度洗脱，流速3.5mL/min，利用分部收集器收集馏分，以苯酚-硫酸法检测各管中多糖含量，合并检测结果达到最高含量10％以及以上各收集管中的溶液，并以截留分子质量为8000～14000Da的透析袋透析6天，每天更换透析液(7wt％的NaCL溶液)冻干后，即可得到纯化的菌体多糖。
(4)菌体二萜类成分
取另一半上清液68.5mL，与205.5mL乙酸乙酯混合，室温下连续萃取3次，合并萃取液，后减压浓缩得到乙酸乙酯相浸膏，分析该浸膏中二萜类成分。
本申请对比例1采用与实施例1相同的纯化处理步骤，以分别得到的菌体多糖冻干粉和乙酸乙酯浸膏。
另外，本申请还直接使用乌参粉进行纯化处理，以作为对比例2，具体如下：
精确称量乌参粉5g，加入相应pH8.0的磷酸盐缓冲液40mL充分溶胀1h后，100℃保温10min，待烧杯冷却至55℃后，加入胰蛋白酶和碱性蛋白酶质量比为2:1的混合蛋白酶粉0.105g，酶解4h后100℃保温10min灭酶，9000rpm离心10min，取上清液；分为两部分，一部分采用与实施例1纯化步骤(3)相同的方法得到的多糖冻干粉，另一部分采用与实施例1纯化步骤(4)相同的方法得到的二萜浸膏。
3、菌体多糖成分分析：
(1)单糖组成测定
供试品溶液的制备：称取纯化的菌体多糖冻干粉1.0mg置于安瓶瓶中，加入0.5mL2M三氟乙酸溶液，充氮气封管，110℃下水解8h，冷却至室温，挥干，并以超纯水复溶，并以0.1M NaOH溶液调至pH中性，定容至1mL，即得供试品溶液。
柱前反应：取800μL供试品溶液加入80μL 2mM的乳糖溶液，加入900μL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)及900μL 0.3M NaOH，于70℃水浴反应30min，冷却后以900μL0.3MHCl中和，向反应液中加入2.5mL三氯甲烷进行萃取，取上层水相进行色谱分析。
色谱条件：色谱柱，C18分离柱(4.6mm×150mm，Thermo ScientificTMAcclaimTM120C18色谱柱)；流动相A:体积分数10％，乙睛+0.1M醋酸铵-醋酸缓冲液(pH5.5)；流动相B:体积分数25％，乙睛+0.1M醋酸铵-醋酸缓冲液(pH5.5)；时间梯度为0～40min，体积梯度为25％～100％B；0.8mL/min流速；进样体积，10μL。利用各单糖标准品进行定量。
(2)硫酸根含量测定
供试品溶液：取取纯化的菌体多糖冻干粉2.0mg于安瓶瓶中，加1mL2M TFA，充氮气封管，于110℃下水解l0h，后挥干TFA，以超纯水溶解并定容至25mL，制得供试品溶液。
色谱条件：ICS-2000离子色谱仪(赛默飞)；色谱柱为Ionpac ASRS ULTRA II(4mm×250mm)；抑制器为ASRS ULTRA II阴离子抑制器，抑制电流为90mA；柱温为30℃；淋洗液为20mM KOH；流速为1.2mL/min；进样体积为25μL；定量标准品为Na2SO4。
(3)分子质量测定
利用高效凝胶排阻色谱法(HPSEC)法测定分子量。色谱条件如下：色谱柱为TSK-gel G4000 PWxl(30.0cm×7.8mm i.d.)；柱温为40℃；检测器为示差检测器(RID)；流动相为0.2mol/L NaCL；流速为0.5mL/min。以各分子质量的右旋糖配系列标准品为标准品(Sigma)，利用Aglient GPC计算样品的分子质量。
(4)菌体多糖含量测定
标准曲线：根据上述测定，发现本申请实施例获得的菌体多糖分子量在150kDa左右，因此选用己知分子量的150kDa葡聚糖标准品(购自Sigma)，用超纯水溶解，分别配置成5.0、1.0、0.2、0.05和0.01mg/mL的标准溶液，采用0.45μm滤膜过滤后，进行HPLC检测，以标准品浓度和对应色谱峰面积，绘制标准曲线，拟合得到标准方程。
HPLC条件：色谱柱KS-804(日本Shodex SUGAR，货号F6700020)；购自流动相为超纯水；柱温80℃；流量0.5mL/min，进样量20μL，柱压18bar，检测器：示差检测器。
供试品为将上述制备的菌体多糖冻干粉溶于超纯水后得到，上样进行HPLC，根据色谱峰面积，代入标准方程即可得到其中菌体多糖的含量。
4、菌体二萜类成分
采用HT7600A型号高压制备液相色谱(苏州汇通)，填料为C18，用100％色谱甲醇以40mL/min的流速冲洗制备柱，然后用100％色谱水以15～45mL/min的梯度流速平衡系统，待平衡完毕打开紫外检测器。
称取2.5g乙酸乙酯浸膏，用乙酸乙酯：甲醇：水的体积比为75:20:5的混合溶剂溶解，过滤后上样；流动相流动相A为水，流动相B为甲醇:乙酸乙酯体积比为60:40的混合溶剂；流速为0.8mL/min；检测波长为254nm；柱温:25℃；按照以下梯度洗脱程序进行分析，洗脱程序：0～5min，5％B；5～45min，5～100％B；45～55min100％B；55～60min，100～5％B。根据文献记载(二维高通量色谱分离制备海参来源真菌Epicoccum sp.的化学成分，公开于“山东科学”杂志第28卷第4期2015年8月)收集出峰时间为33min和35min作用的尖峰流出液；减压浓缩，冻干后，再次利用上述色谱条件制备，获得两个二萜类化合物，化合物1获得了6.45mg，化合物2获得了3.36mg，结构式分别如图4和图5所示，实施例1制备的乙酸乙酯浸膏中二者的得率分别为0.258％和0.134％。
表1多糖成分
由表1可知的，实施例1制备的多糖冻干粉中含有分子量约为170kDa的多糖，该多糖还有甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖和的摩尔比为1:0.35:1.16:0.58:1.35，该多糖含有较高比例的硫酸根。有研究表明，硫酸根是组成硫酸软骨素以及岩藻聚糖硫酸酯的主要基团，而这两种成分具有降血脂、抗肿瘤、抗凝血、增强免疫力和抗血栓的多种生理活性。因而，实施例1相对于对比例1和2，制得了不同的高分子量多糖，且其含有多高含量的硫酸根，这表明其可能增强的生理活性。
表2
表2分别对实施例1、对比例1和2制备的多糖冻干粉和乙酸乙酯浸膏进行了分析，分析了其中的各自制得的多糖含量，以及化合物1和2的含量。结果发现，对比例2制得的多糖冻干粉中多糖含量显著低于实施例1和对比例1，对比例1和2制得的乙酸乙酯浸膏中化合物1和2并未检出(表2中，“-”表示未检出或制得)。
细胞实验
本申请将上述实施例1、对比例1和2分别制得的多糖冻干粉进行了细胞实验，具体如下：
1、材料与方法
模型肿瘤细胞：人肺癌细胞A549，购自上海匹拓生物公司，货号PT-1034。
细胞复苏：将A549冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中，不停地摇晃使其迅速融化，融化后，酒精消毒后，移入无菌超净工作台，转入离心管中，密封，1000r/min离心4min，弃上清液，利用RPMI1640完全培养基(Sigma-Aldrich)重悬细胞后，转移至培养瓶中，于温度为37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，每天观察细胞生长状况，待细胞生长密度达到80-90％开始传代。
细胞传代：将生长密度达到80～90％的细胞从培养箱取出，放置于无菌超净工作台，由于A549为贴壁细胞，吸出培养瓶中的培养基，采用PBS缓冲液冲洗细胞3次，再采用胰酶消化1min，轻轻吸出消化液，加入RPMI1640完全培养基终止消化，吹散均匀，分装，进行培养。
MTT法检测各实施例和对比例制备的多糖冻干粉对其A549细胞的影响：
利用RPMI1640完全培养基分别将实施例1、对比例1和对比例2制备的多糖冻干粉配置10、5、2、1、0.5、0.1mg/mL的溶液。取对数生长期的肺癌细胞A549，采用胰蛋白酶消化1min，吸出培养基，再用RPMI1640完全培养基终止消化，制成细胞悬液，利用计数板计数，加入RPMI1640完全培养基稀释，使其细胞数量为105个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，每组设6个复孔，于37℃、5％CO2培养箱培养24h，吸出培养基，分别于不同孔中加入配置好的不同浓度的实施例1、对比例1和对比例2多糖冻干粉溶液100μL，空白孔加入RPMI1640完全培养基100μL，阳性对照组加入100μL 5-氟尿嘧啶(阿拉丁)继续培养48h，再加入10.0mg/mL的MTT 20.0μL，继续培养4h。吸出上清液，加入150μLDMSO，充分振荡均匀，在波长490nm下，利用酶标仪测定其光密度值。通过与对照组细胞比较，得到各组相对增殖抑制率，抑制率(％)＝(1-(A1-A2)/(A0-A3))×100％；其中，A0为空白孔细胞培养吸光度值，A1为处理组细胞培养吸光度值，A2为处理组未加细胞培养的吸光度值，A3为空白孔未加细胞培养的吸光度值。以对肿瘤细胞A549生长抑制率为50％的浓度(IC50)来评判各多糖成分抗A549活性的优劣。
2、结果
表3
表3列出了处理组和阳性对照组对肺癌细胞A549的IC50值。由表3可知，实施例1提供的多糖成分对A549的IC50值最低，而对比例1、2提供的多糖成分对A549的IC50值远大于实施例1。由此可知，本申请实施例1提供的菌体多糖成分具有更好的抗肿瘤细胞活性。
动物实验
基于上述实施过程，本申请实施例提供了一种复合口腔益生元咀嚼片，为验证其实际的生理活性，本申请还进行了如下动物实验。其中，该复合口腔益生元咀嚼片，按重量份数计，包含二萜冻干粉10～20份，多糖冻干粉20～40份，脱脂乳150～250份，木糖醇100～200份，硬脂酸镁1～5份。其中，可将乙酸乙酯浸膏冻干后与上述原料混匀，再采用DP30单冲压片机(北京国药龙立科技有限公司)进行冲压，以形成该咀嚼片。本申请实施例提供的咀嚼片经过感官评分(参照高山红景天咀嚼片的制备工艺及质量标准[J].食品科学，2009,30(18):432-435)，评分超过60分，感官良好。
1、材料与方法
实验动物：SD大鼠，体重200±20g，由江苏艾菱菲提供，健康成年雄性，自由进水和食物，室温22～25℃，空调室内饲养。将SD大鼠随机分为假手术组、模型组和处理组。处理组吸嗅丁香酚，其余组吸嗅空气，预处理吸嗅1w，早晚各1h，手术前1天禁食禁水，术后吸嗅2w。
供试品：实施例1提供咀嚼片含3.55wt％含乙酸乙酯冻干粉，7.1wt％多糖冻干粉，53.38wt％脱脂乳，35.58wt％木糖醇和0.034wt％硬脂酸镁；取该咀嚼片2.5g，溶解于10mL0.75wt％生理盐水中，配制成0.25g/mL的实施例1供试品溶液。对比例1、2直接取其制得的多糖冻干粉2.5g，溶解于于10mL0.75wt％生理盐水中，分别作为的对比例1和2供试品溶液。
动物模型建立：采用线栓法建立局灶性脑缺血/再灌注模型大鼠。将SD大鼠称重后麻醉(10％水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射)，切开颈部皮肤暴露组织后，钝性分离并暴露右侧的血管和神经，分离出颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈外动脉(externalcarotid artery，ECA)和颈内动脉(external carotid artery，ICA)；结扎ECA和CCA的近心端，用动脉夹夹闭ICA，并在CCA上剪开一小口，插入线栓，松开夹住ICA的动脉夹，将线栓缓缓向颅内推进约1.8～2.0cm，结扎固定线栓和ICA，逐层缝合肌。缺血2h后，轻拉鱼线至ECA主干，恢复血供，大鼠术后单笼饲养，自由饮水和进食；即可建立模型组大鼠。假手术组大鼠：仅仅区别在线栓只插入1.0cm，其余步骤与模型组相同。
实验给药：于造模成功后给药，向模型大鼠灌胃250mg/200g体重的供试品溶于，每日1次，连续灌胃15天，以作为处理组。假手术组和对照组分别以等量生理盐水代替药物灌胃。
神经功能缺损评价：参照Bederson分级标准，对SD大鼠的神经功能缺损进行评定。正常级：无活动异常，大鼠被提尾时，两前肢向下伸直；将动物置于塑料板上，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约有10cm，手感左右推力相等。中度级：将大鼠尾部提起时，脑血管闭塞对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直等；其他基本同0级。严重级：检测方法同中等级，大鼠脑血管闭塞对侧侧向推动阻力明显降低。本组入选对照组大鼠和治疗组大鼠均于给药前及末次给药后评级。
血清MDA、GSH-PX、GSH水平的测定：于末次灌胃后1天后，将实验后的大鼠经腹主动脉取血静置，分离血清，采用对应的试剂盒检测MDA、GSH-PX、GSH含量，操作均按试剂盒说明书要求进行，试剂盒购自菲恩生物公司。
局部脑血流量(rCBF)测定：大鼠于末次用药后48h内测量，用10％水合氯醛麻醉后剪去头部皮肤，暴露颅骨，将大鼠固定在脑立体定位仪上，以前囱为原点，向右侧旁开2mm，向前3mm，钻开颅骨，剥去硬脑膜及软脑膜，将测量电极插入皮层，深2mm，参比电极置于颈后部皮下。同一组内所有动物脑血流的测量由同一根电极完成，电解时间为3s，由血流仪所带专用软件计算出结果。
实验数据采用Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和DunCan’s多重比较，并进行显著性差异标记。
2、结果
表4神经功能缺损评分
表4列出了本实验各组大鼠的神经功能缺损情况，每组大鼠均统计了20只大鼠。由表4可知，模型组大鼠中，正常级、中度级和严重级的大鼠数量相同，分布均匀，局灶性脑缺血/再灌注模型大鼠建立成功。处理组中，灌胃实施例1提供的咀嚼片后，大鼠正常级数量增多，而灌胃对比例1和2提供的咀嚼片后，大鼠严重级数量增多。由此表明，本申请实施例1提供的咀嚼片对于局灶性脑缺血/再灌注模型大鼠的神经功能缺损具有修复作用。
表5
表5列出了血清和局部脑血流路指标。由表5可知，模型组大鼠血清中MDA含量显著升高，GSH-PX和GSH含量显著降低，表明局灶性脑缺血/再灌注模型大鼠建立成功。处理组中，灌胃实施例1提供的咀嚼片后，大鼠血清中MDA含量显著降低，GSH-PX和GSH含量显著升高，均与假手术组相当；而灌胃对比例1和2提供的咀嚼片后，大鼠血清中3个指标并无明显改变。由此说明，本实施例提供的咀嚼片能够改善局灶性脑缺血/再灌注模型大鼠血清中自由基，提供其抗氧化应激损伤能力，减轻脑缺血再灌注损伤。
另外，由表5可知，模型组大鼠脑血流量相对于假手术组显著降低，说明造模成功。处理组中，灌胃实施例1提供的咀嚼片后，大鼠脑血流量显著升高至与假手术组相当的水平，而灌胃对比例1和2的咀嚼片并无，明显改变。由此说明，本申请提供的咀嚼片能够增加梗塞区以外的脑局部血流量。
综上所述，本申请从自然发酵食品酸汤液中筛选得到一株干酪乳杆菌A1，发现其可发酵乌参粉，并具有抗氧化性能。本申请还对其发酵乌参粉后的菌体进行破碎和纯化，得到菌体多糖冻干粉和乙酸乙酯浸膏，经过分析证实了其多糖冻干粉含有区别于乌参粉本身的多糖成分，分子量在170kDa左右，经过细胞实验证实该多糖冻干粉具有抗肿瘤细胞活性性能；并发现其乙酸乙酯浸膏中含有二萜类成分。
另外，本申请还以发酵得到的菌体多糖冻干粉和乙酸乙酯浸膏为基础，制备得到了一种复合口腔益生元咀嚼片，经过动物实验证实了，该咀嚼片治疗组神经缺损症状显著减轻,局部脑血流量较对照组明显增加，血清抗自由基损伤能力得到提高，以此提升该复合口腔益生元咀嚼片，可能作为一种抑制自由基连锁反应、醒脑、改善微循环、提高机体耐缺氧能力的咀嚼片，以具有广泛的药用或保健用产品应用前景。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）A1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22654，分类命名为干酪乳杆菌A1，保藏日期为2021年06月04，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）A1在发酵乌参中的应用。
3.根据权利要求2所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）A1发酵乌参的应用，包括以下步骤：
配制种子培养液和发酵培养液，所述种子培养液包含2~8 g/L乌参粉，所述发酵培养液包含8~15g/L乌参粉；
制备种子悬液，所述种子悬液由保藏的干酪乳杆菌A1进行菌种活化后，接种于所述种子培养液中进行培养得到；
获得发酵液，所述发酵液是将所述种子悬液转接至所述发酵培养液发酵得到；
得到干燥制品，所述干燥制品由所述发酵液进行纯化得到。
4.根据权利要求3所述的应用，所述应用还包括收集发酵液，对其中的菌体进行破碎后，分别纯化得到多糖冻干粉和二萜类冻干粉的步骤。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，
菌体破碎步骤包括：将菌体用含溶菌酶的HEPES缓冲液重悬后，混匀后于30℃处理3h，使得菌体破裂，然后将溶液于4℃ 8000rpm离心10min，得到菌体的初酶液；向初酶液中加入硫酸铵至其饱和度为30%，并不断搅拌后，于4℃环境放置2h，于4℃ 9000rpm离心20min，取得上清液；
得到多糖冻干粉的步骤包括：取菌体破碎所得上清液与0.1 g/mL氯化十六烷基吡啶溶液混合后，于室温下放置12h后，于4℃ 2000rpm离心3min得沉淀溶解于12.5 mL的NaCL溶液和乙醇的混合溶液中，其中所述NaCL溶液和乙醇的体积比为100:15，所述NaCL溶液的浓度为4 mol/L，同时加入25mL体积分数95%乙醇溶液，4℃下静置12 h后离心，沉淀以pH6.25的15 mM NaH2PO4-Na2HPO4 缓冲液复溶，过阴离子交换柱，以苯酚-硫酸法检测过柱所得洗脱液的收集管中多糖含量，合并检测结果达到最高含量10%以及所述各收集管中的溶液，并以截留分子质量为8000~14000Da的透析袋透析处理，冻干，即可得到所述多糖冻干粉；
得到二萜类冻干粉的步骤包括：取菌体破碎所得上清液用乙酸乙酯萃取，室温下连续萃取3次，合并萃取液，后减压浓缩得到乙酸乙酯相浸膏，冻干，即可得到二萜冻干粉。
6.权利要求5所述的应用得到的多糖冻干粉和二萜类冻干粉在制备复合口腔益生元咀嚼片中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述复合口腔益生元咀嚼片，按重量份数计，包含二萜冻干粉10~20份，多糖冻干粉20~40份，脱脂乳150~250份，木糖醇100~200份，硬脂酸镁1~5份。
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