CN110305816B - 一种嗜热链球菌imau20756及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种嗜热链球菌IMAU20756及其应用，涉及微生物技术领域。本发明所述嗜热链球菌IMAU20756的保藏编号为CGMCC No.18067。本发明所述IMAU20756菌株发酵液所产胞外多糖可分为两个主要的组分，一个中性多糖EPS‑1a和一个酸性多糖EPS‑3a，分子量分别为1.572×105Da和3.825×105Da，EPS‑1a主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖构成，占总糖量90％以上；EPS‑3a主要由甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖构成，占总糖量80.6％。使用所述IMAU20756菌株生产发酵乳，可改善发酵乳的组织状态，增加产品良好的口感。

Description

一种嗜热链球菌IMAU20756及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种嗜热链球菌IMAU20756及其应用。
背景技术
乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是通过发酵碳水化合物生成乳酸并以此命名的一种细菌，也是革兰氏阳性细菌的一种，在生物领域具有重要的研究价值。嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是乳酸菌的一种，也是链球菌中唯一的益生菌。
乳酸菌胞外多糖(Lactic acid bacteria extracellular polysaccharide，LABEPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外常渗于培养基的一类水溶性多糖，属于微生物胞外多糖的一种。其可以作为细胞结合的多糖附着到菌体表面，称为荚膜多糖(capsularpolysaccharide，CPS)，或者作为释放的胞外多糖分泌到周围的培养基中形成黏液，即称为黏液多糖(slim polysaccharide，SPS)。迄今为止报道的大多数产生EPS的菌株产生SPS，而一些LAB菌株可以同时产生CPS和SPS。由于EPS是乳酸菌的代谢产物之一，而许多乳酸菌又是天然的食品级工业生产菌种,所以乳酸菌所产的EPS比其他的多糖更为可靠，故可被广泛地应用在食品和医药领域，作为增稠剂和稳定剂来提高食品的质量。
近年来，随着乳酸菌EPS的生理活性逐渐被人们认识和接受，一些研究学者致力于乳酸菌产生EPS的研究，开始追求更多具有益生功能的EPS，发现部分菌株在发酵过程中可以产生大量的EPS。王荣平(王荣平，酸马奶源植物乳杆菌胞外多糖的制备、结构解析及抗氧化研究，内蒙古农业大学，2017)通过离心除菌体、终浓度4％(w/v)的TCA除蛋白、75％(v/v)的乙醇4℃沉淀多糖、透析、冻干等操作从MRS发酵液中得到L.plantarum NM18粗多糖，且得率为295.0mg/L(Wei L,et al.Structural elucidation and antioxidant activitiesofexopolysaccharides from Lactobacillus helveticus MB2-1.CarbohydratePolymers.2014,102(1):351-359)；Li等采用类似的方法用重构的乳清培养基发酵从L.helveticus MB2-1的粗EPS中分离得到三种胞外多糖组分EPS-1、EPS-2和EPS-3。但是目前的乳酸菌EPS得率依然较低，且得到的乳酸菌EPS中含糖量也不高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种嗜热链球菌IMAU20756及其应用，所述嗜热链球菌IMAU20756可高产EPS。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU20756，所述嗜热链球菌IMAU20756的保藏编号为CGMCC No.18067。
本发明还提供了所述嗜热链球菌IMAU20756在制备胞外多糖中的应用。
优选的，所述胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：(1)将活化后的所述嗜热链球菌IMAU20756接种于M17培养基中培养36h后，灭活菌株，冷却后离心，得第一上清液；所述M17培养基中包括以下浓度的原料：17.5g/L大豆蛋白胨、5g/L葡萄糖、0.5g/L抗坏血酸钠、19g/Lβ-甘油磷酸钠和0.25g/L硫酸镁；
(2)将所述第一上清液与体积浓度为80％的三氯乙酸溶液混合，至所述混合后的混合液中三氯乙酸溶液的终体积浓度为4％，静置后离心，得第二上清液；
(3)将所述第二上清液取与体积浓度为95％的乙醇溶液混合，静置后离心，得沉淀；
(4)用去离子水将所述沉淀复溶，透析后干燥，得胞外多糖。
优选的，步骤(1)所述活化为将所嗜热链球菌IMAU20756于活化培养基中传代3次；所述活化培养基中包括以下原料：重量百分含量为10％的脱脂粉乳粉培养基和酵母粉。
优选的，每次所述传代均为将所述嗜热链球菌IMAU20756按照2％的接种量接种于所述活化培养基上进行传代，所述传代的温度为34℃，所述传代的频率为36h/代。
优选的，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)所述离心的离心力均为12000g，所述离心的时间均为30min。
优选的，步骤(3)所述第二上清液与体积浓度为95％的乙醇溶液的体积比为1:3。
优选的，在步骤(4)得所述胞外多糖后，还包括分离纯化。
优选的，所述分离纯化包括依次进行的DEAE-Cellulose 52离子交换色谱分级纯化和Sepharose CL-6B凝胶柱层析纯化。
本发明还提供了所述嗜热链球菌IMAU20756或利用所述应用制备得到的胞外多糖中在发酵乳制品中的应用。
本发明提供了一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU20756，所述嗜热链球菌IMAU20756的保藏编号为CGMCC No18067。本发明所述IMAU20756菌株发酵液所产EPS经纯化后共分为两个主要的组分，一个中性多糖EPS-1a和一个酸性多糖EPS-3a，摩尔质量分别为1.572×105Da和3.825×105Da，经红外光谱检测二者均具有多糖的特征吸收峰，结果显示EPS-1a主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖构成，占总糖量90％以上；EPS-3a主要由甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖构成，占总糖量80.6％，另含有少量的木糖、鼠李糖等。
进一步的，使用所述IMAU20756菌株生产发酵乳，能赋予发酵乳产品具有更高的黏度、持水性及稳定性，可抑制发酵乳的凝胶断裂以及其乳清的析出，从而改善发酵乳的组织状态，增加产品良好的口感。
附图说明
图1为IMAU20756CEPS经DEAE-Cellulose 52离子交换色谱柱梯度洗脱曲线图；
图2为EPS-1(a)和EPS-3(b)经Sepharose CL-6B色谱柱的洗脱曲线图；
图3为EPS-1a(a)和EPS-3a(b)的GPC图谱；
图4为EPS-1a(a)和EPS-3a(b)的红外光谱图；
图5为EPS-1a(a,b,c)和EPS-3a(d,e,f)的扫描电镜图；
图6为单糖标准品的高效液相色谱图(A：甘露糖B：核糖C：鼠李糖D：葡萄糖醛酸E：半乳糖醛酸F：葡萄糖G：半乳糖H：木糖I：阿拉伯糖J：岩藻糖)；
图7为EPS-1a(a)和EPS-3a(b)的单糖组成分析图。
生物保藏信息
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU20756，保藏日期为2019年07月03日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18067。
具体实施方式
本发明提供了一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU20756，所述嗜热链球菌IMAU20756的保藏编号为CGMCC No18067。本发明所述嗜热链球菌IMAU20756分离采集自蒙古国牧民家庭自然发酵酸牛奶中。在本发明中，所述嗜热链球菌IMAU20756菌株在M17培养基上的形成的菌落为白色或微黄色，表面光滑，边缘整齐，无褶皱，呈针尖状，在显微镜下观测到细胞多为椭圆球状，初步鉴定该菌株为嗜热链球菌。采用16S rDNA序列分析方法对前面得到的嗜热链球菌进行了鉴定，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述的菌株与Streptococcus thermophilus具有99.9％的同源性，因此，将所述的菌株命名为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU20756。
本发明还提供了所述嗜热链球菌IMAU20756在制备胞外多糖中的应用。
在本发明中，所述胞外多糖的制备方法，优选包括以下步骤：(1)将活化后的所述嗜热链球菌IMAU20756接种于M17培养基中培养36h后，灭活菌株，冷却后离心，得第一上清液；所述M17培养基中包括以下浓度的原料：17.5g/L大豆蛋白胨、5g/L葡萄糖、0.5g/L抗坏血酸钠、19g/Lβ-甘油磷酸钠和0.25g/L硫酸镁；
(2)将所述第一上清液与体积浓度为80％的三氯乙酸溶液混合，至所述混合后的混合液中三氯乙酸溶液的终体积浓度为4％，静置后离心，得第二上清液；
(3)将所述第二上清液取与体积浓度为95％的乙醇溶液混合，静置后离心，得沉淀；
(4)用去离子水将所述沉淀复溶，透析后干燥，得胞外多糖。
本发明在制备所述胞外多糖时，将活化后的所述嗜热链球菌IMAU20756接种于M17培养基中培养36h后，灭活菌株，冷却后离心，得第一上清液；所述M17培养基中包括以下浓度的原料：17.5g/L大豆蛋白胨、5g/L葡萄糖、0.5g/L抗坏血酸钠、19g/Lβ-甘油磷酸钠和0.25g/L硫酸镁。本发明所述活化优选为将所嗜热链球菌IMAU20756于活化培养基中传代3次。在本发明中，每次所述传代均为将所述嗜热链球菌IMAU20756按照2％的接种量接种于所述活化培养基上进行传代，所述传代的温度为34℃，所述传代的频率为36h/代。本发明所述活化培养基中优选包括以下原料：重量百分含量为10％的脱脂粉乳粉培养基和酵母粉，所述酵母粉的重量优选为所述10％脱脂粉乳粉培养基质量的0.1％。在本发明中实施例中，所述重量百分含量为10％的脱脂粉乳粉培养基中包含10g脱脂粉乳粉和90g蒸馏水。本发明对所述脱脂粉乳粉培养基的来源并没有特殊限定，在本发明实施例中，选择由FonterraLTD,New Zealand公司销售的产品。本发明对所述酵母粉的来源并没有特殊限定，在本发明实施例中选择由BIOSHARP公司销售的酵母粉。本发明将所述活化培养基制备出来后，优选还包括在115℃下灭菌7min。本发明对所述灭菌所使用的设备来源并没有特殊限定，在本发明实施例中选择由KAQOSHIMASEISAKUSYOING(日本)公司生产销售的SX-500TOMY高压灭菌锅。在本发明中，活化培养3代，可使菌株活力达到最大。本发明对所述活化培养基传代培养所使用的设备来源并没有特殊限定，在本发明实施例中选择由上海申贤公司生产销售的DHP-9272电热恒温培养箱。
本发明将活化后的所述嗜热链球菌IMAU20756接种于M17培养基中培养36h后，所述接种的接种量优选为2％。本发明所述培养的温度为34℃。本发明在所述培养后灭活菌株，冷却后离心。本发明所述灭活优选为将所述培养后的发酵液在沸水浴中灭活30min，冷却至室温后离心，所述离心时离心力优选为12000g，离心的时间优选为30min。
得第一上清液后，本发明将所述第一上清液与体积浓度为80％的三氯乙酸溶液混合，至所述混合后的混合液中三氯乙酸溶液的终体积浓度为4％，静置后离心，得第二上清液。本发明所述静置的时间优选为10～14h。本发明所述离心时离心力优选为12000g，离心的时间优选为30min。
得第二上清液后，本发明将所述第二上清液取与体积浓度为95％的乙醇溶液混合，静置后离心，得沉淀。本发明所述第二上清液与体积浓度为95％的乙醇溶液的体积比优选为1:3。本发明所述静置的时间优选为24h。本发明所述离心时离心力优选为12000g，离心的时间优选为30min。
得沉淀后，本发明用去离子水将所述沉淀复溶，透析后干燥，得胞外多糖。本发明所述透析的时间优选为48h，在所述透析过程中每8h换一次水，透析液经冷冻干燥得胞外多糖。
在本发明中，将所述第一上清液通过加入80.0％三氯乙酸(TCA)溶液至终浓度为4.0％去除蛋白，取上清液利用3倍体积95％的冰乙醇沉淀多糖，透析48h后透析液经冷冻干燥得到的粗EPS去除蛋白及沉淀多糖效果最好，可用于下一步分离纯化；且TCA法除蛋白利用蛋白质在有机酸的作用下形成不可逆沉淀的原理而将其去除，此法操作简单，对蛋白的去除效果较好。
在本发明中，得所述胞外多糖后，优选还包括分离纯化，所述分离纯化优选包括依次进行的DEAE-Cellulose 52离子交换色谱分级纯化和Sepharose CL-6B凝胶柱层析纯化。本发明对所述DEAE-Cellulose 52离子交换色谱分级纯化和Sepharose CL-6B凝胶柱层析纯化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段即可。在本发明中，嗜热链球菌菌株IMAU20756由M17培养基发酵后提取的粗多糖经DEAE-52离子交换柱分离可得到4个不同的组分(EPS-1、EPS-2、EPS-3和EPS-4)。其中EPS-1和EPS-2是由去离子水洗脱得到的产物，说明二者不带电荷，为中性多糖；剩余两个组分是分别以不同浓度的NaCl为流动相的洗脱产物，即带有负电荷的酸性多糖或带有酸性基团的糖复合物(如图1所示)。本发明对收集到的两个组分(EPS-1、EPS-3)利用Sepharose CL-6B凝胶柱进一步分离纯化，分离后的两个组分均呈现单一对称峰，表明二者均为单一且相对分子量均一的组分，同时命名为EPS-1a和EPS-3a并冷冻干燥，计算得率分别为37.93％和38.46％(如图2所示)。
本发明还提供了所述嗜热链球菌IMAU20756或利用所述应用制备得到的胞外多糖中在发酵乳制品中的应用。本发明对所述发酵乳制品的制备方法并没有特殊限定。在本发明中，使用所述的高产胞外多糖嗜热链球菌菌株IMAU20756生产发酵乳，能赋予产品具有更高的黏度、持水性及稳定性，可抑制发酵乳的凝胶断裂以及其乳清的析出，从而改善发酵乳的组织状态，增加产品良好的口感。
下面结合实施例对本发明提供的嗜热链球菌IMAU20756及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
从蒙古国牧民家庭自然发酵酸牛奶中用灭菌移液器无菌采样2mL酸牛奶，在外界无污染的情况下放入带有胶塞的灭菌小试管中，封口，低温保存，以进行乳酸菌的分离鉴定。
样品直接画线于M17琼脂培养基上，在温度37℃与厌氧的条件下培养48h；待菌落形成后，接种于M17培养基，在温度37℃培养24h；再次画线于M17琼脂培养基上，确认为纯培养物后穿刺于M17半固体培养基，在温度4℃保存，观察记录纯培养物的菌落形态、革兰氏染色细胞形态特征。
该菌株在M17培养基上的形成的菌落为白色或微黄色，表面光滑，边缘整齐，无褶皱，呈针尖状，在显微镜下观测到细胞多为椭圆球状，初步鉴定该菌株为嗜热链球菌。
采用16S rDNA序列分析方法对前面得到的嗜热链球菌进行了鉴定，所述的菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，与Streptococcus thermophilus具有99.9％的同源性，因此，将所述的菌株命名为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU20756。
实施例2
本实施例所用培养基：
活化培养基：往10％的脱脂粉乳粉培养基中添加以重量计0.1％酵母粉，在温度115℃下灭菌7min。
M17液体培养基：由每升17.5g大豆蛋白胨、5g葡萄糖、0.5g抗坏血酸钠、19gβ-甘油磷酸钠、0.25g硫酸镁与1000mL蒸馏水组成，其pH 7.0～7.4。
所述的胞外多糖是采用下述方法制备得到的：
按照以活化培养基重量计2％的接种量，把在温度-80℃下冷冻保藏的是嗜热链球菌IMAU20756菌株接种于所述的活化培养基中，在温度34℃下培养，然后按照以M17液体培养基重量计2％的接种量，将活化嗜热链球菌IMAU20756菌株接种于M17液体培养基中，在温度34℃下继续培养36h，以同样方式进行活化培养3代，使菌株活力达到最大。
将活化3代后的IMAU20756按2％的接种量接种于8L M17培养基34℃培养36h，发酵液沸水浴灭活(30min)，冷却至室温；离心(12000×g，30min)以除去菌体和酶解蛋白等杂质；取上清液，边搅拌边加入80.0％三氯乙酸溶液至终浓度为4.0％，4℃静置过夜，离心(12000×g，30min)除去剩余的变性蛋白；取上清液边大力搅拌边加入3倍体积95％的冰乙醇，4℃静置24h，再次离心(12000×g，30min)取沉淀并用适当去离子水将其复溶；溶液透析48h，每8h换一次水，透析液经冷冻干燥得EPS粗品(CEPS)。
(1)DEAE-Cellulose 52离子交换色谱分级纯化
将100g室温浸泡过夜后经酸碱处理且去离子水反复清洗至pH呈中性的DEAE-Cellulose 52装填于规格为1.6cm×50cm的色谱柱中，去离子水充分平衡一天(流速1.0mL/min)。每一次称取100mg CEPS溶于5mL去离子水，0.45μm滤膜过滤后上样。分别用去离子水和0-1mol/LNaCl缓冲溶液线性洗脱(流速0.8mL/min)，每管8min。以苯酚－硫酸法(A490nm)检测各管的多糖含量并绘制洗脱曲线。根据峰型收集相同组分，流动的去离子水透析去除残留的NaCl和小分子物质，冷冻干燥，多次累积纯化得到初步的EPS纯化组分。
在本发明中，嗜热链球菌菌株IMAU20756由M17培养基发酵后提取的粗多糖经DEAE-52离子交换柱分离可得到4个不同的组分(EPS-1、EPS-2、EPS-3和EPS-4)。其中EPS-1和EPS-2是由去离子水洗脱得到的产物，说明二者不带电荷，为中性多糖；剩余两个组分是分别以不同浓度的NaCl为流动相的洗脱产物，即带有负电荷的酸性多糖或带有酸性基团的糖复合物(如图1所示)。
由于EPS-2和EPS-4在收集过程中糖含量太少很难回收，因此分别收集两个主要峰EPS-1和EPS-3对应的洗脱液，去离子水透析脱盐，冷冻干燥后二者的得率分别为15.10％和27.08％，说明初步纯化后的两个组分含有较多杂质，需密封冷冻保存进一步纯化。
(2)Sepharose CL-6B凝胶柱层析纯化
使用去离子水反复清洗Sepharose CL-6B，浸泡至其充分溶胀。将处理好的Sepharose CL-6B装入1.6cm×50cm色谱层析柱，去离子水充分平衡。分别称取已初步纯化的多糖单一组分30mg溶于3mL去离子水，0.22μm滤膜过滤后上样。去离子水洗脱(流速0.4mL/min)，分步收集(8min/管)。按(1)节中的方法逐管检测，分别合并收集单一峰组分，去离子水透析，真空冷冻干燥，得到纯化后的多糖组分。
在本发明中，将上一步收集到的两个组分(EPS-1、EPS-3)利用Sepharose CL-6B凝胶柱进一步分离纯化。分离后的两个组分均呈现单一对称峰，表明二者均为单一且相对分子量均一的组分，同时命名为EPS-1a和EPS-3a并冷冻干燥，计算得率分别为37.93％和38.46％(如图2所示)。
实施例3
嗜热链球菌IMAU20756EPS分子质量测定
凝胶色谱仪：打开仪器电源，待仪器各部分自检完成后设定各参数。将溶解的多糖样品经0.22μm滤膜过滤，上机检测。
凝胶色谱仪检测条件：检测器为激光检测器(LS)和示差检测器(dRI)；流动相为0.2/1000的叠氮化钠；色谱柱为Shodex OHpak系列SB-806与SB-803串联；流速为1mL/min；柱温为40℃；进样量为500μL。
在本发明中，多糖组分EPS-1a(图3中a)和EPS-3a(图3中b)经凝胶色谱仪的双检测器(LS和dRI)检测后均呈现单一对称峰，该结果与Sepharose CL-6B凝胶柱层析的纯化结果相一致，进一步说明两个多糖组分均为单一多糖。
上述两个多糖组分的分子量分别为1.572×105Da和3.825×105Da，且前者的多分散性系数PDI＝2.902，说明其分子量分布范围更广，大多分布于2.6×104-5.0×104Da和5.0×104-2.6×105Da，分别为55.0％和33.2％，其余大分子多糖占11.8％；相比前者，EPS-3a的PDI值为1.727，更接近1，说明该组分分子量分布更为均一，分布范围较窄。
实施例4
EPS各组分红外光谱分析
取各EPS组分纯品2mg，加入200mg干燥后的KBr粉末，利用“KBr压片法”在400cm-1～4000cm-1范围内进行红外扫描，扫描分辨率为4cm-1。
在本发明中，EPS-1a在3329.98cm-1处出现的强而宽的吸收峰为羟基的O-H伸缩振动；在2940.43cm-1处是烷基C-H键的伸缩振动吸收，即表明EPS-1a是多糖类物质；
根据1648.84cm-1处出现的吸收峰是羧基C＝O键的非对称伸缩振动；在1400cm-1和1300cm-1之间的弱吸收峰是羧基C＝O键的对称伸缩振动，说明EPS-1a含有羧基基团；
另外在在本发明中，1145.51cm-1-1028.36cm-1间存在的三个吸收峰是吡喃糖环的特征吸收峰，与多糖骨架C-O-H和C-O-C的伸缩振动相对应；858.17cm-1处的吸收峰是吡喃环的α-型端基的C-H变角振动，说明EPS-1a含有吡喃糖环残基和α-型糖苷键；且在931.45cm-1处出现了D-葡萄吡喃糖C-O-C的非对称伸缩振动吸收峰(图4中a)。
在本发明中，EPS-3a在3335.77cm-1处出现的强而宽的吸收峰是由羟基的O-H键伸缩振动而引起；在2942.84cm-1处的峰是烷基C-H键的伸缩振动吸收，即表明EPS-3a是多糖类物质；
在1400cm-1左右为C-H的弯曲振动吸收峰；在1500cm-1左右的吸收峰为C-O键伸缩振动的结果；在1643.05cm-1处出现的强吸收峰是羧基的C＝O键的非对称伸缩振动；在1300cm-1处出现的弱吸收峰是羧基的C＝O键的对称伸缩振动，说明EPS-3a也含有羧基基团；
本发明中1200cm-1-1000cm-1范围内出现了吡喃糖环的三个特征吸收峰；1126.38cm-1和1058.73cm-1是吡喃糖苷的特征吸收峰，这两处的吸收是C-O-C结构中C-O键或C-O-H的弯曲振动；813.81cm-1处出现的峰可能为α-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰(图4中b)。
实施例5
EPS各组分扫描电镜观察
取纯化后EPS组分各1mg，以片状形式均匀粘于含有导电胶的样品铜台上，置于真空喷锻仪内镀一层导电金，取出后采用扫描电镜在不同倍数下观察多糖各组分结构。
在本发明中，分别在三个不同倍数的扫描电镜下看到的EPS-1a组分，聚集状态呈现出松散的多孔网状且高度分支结构，该结构可通过形成水化聚合物一致矩阵来改善产品的理化特性如粘度、持水力等，同时分布杂乱无章具有不规则性，形态似树枝的枯叶与枯干，这可能与多糖内部分子量排布、一级结构和性质有关(图5中a,b,c)。
在本发明中，EPS-3a多糖组分相比EPS-1a，表面光滑且有光泽，是制备可塑性膜材料所需要具备的特点，二者形态特征也有所不同，该组分由多个含有圆滑小球的细长的杆组成，总体结构以光滑的片状连接，即使增加放大倍数，其微观结构表面仍光滑，形态均一，分布规整(图5中d,e,f)。
实施例6
EPS各组分单糖组成分析
分别称取一定量纯化后多糖组分，加水30mL，缓慢加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各5mL，再次加水至80mL，室温振荡1h，离心，干燥滤纸过滤，定容至100mL。分别取适量样品加入4mol/L三氟乙酸(TFA)0.5mL，在120℃条件下水解2h，氮气吹干，再分别加入0.3mol/L NaOH和0.5mol/L PMP(甲醇溶解)各0.5mL，70℃水浴60min，冷却至室温，然后加入0.3mol/L HCl 0.5mL后，0.5mL三氯甲烷，振荡摇匀后静置20分钟，弃去下层氯仿层，萃取三次，将水层经0.45μm滤膜过滤以除去不溶物，进行高效液相色谱分析。
高效液相色谱分析条件：
仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪，
检测波长：245nm
色谱柱：SHISEIDO C18(4.6mm×250mm×5um)
检测器：紫外检测器
流速：1.0mL/min
柱温：25℃；
进样量：10μL；
在本发明中，经过与单糖标准品高效液相色谱图比较发现(图6)，EPS-1a主要由葡萄糖(RT＝27.830)、甘露糖(RT＝13.431)和半乳糖(RT＝31.771)构成，占总糖90％以上，三者的摩尔比为3.62：1：2.99(图7中a)；EPS-3a主要由甘露糖(RT＝13.349)、半乳糖(RT＝31.771)和阿拉伯糖(RT＝34.691)构成，占总糖量80.6％，其摩尔比为1.19：1：1.08，另含有少量的木糖、鼠李糖等(图7中b)。
实施例7
制备发酵乳
实施步骤如下：
A、制备活化培养基
往10％脱脂粉乳粉培养基中添加以重量计0.1％酵母粉，在温度115℃下灭菌7min，得到一种活化培养基；
B、制备全脂乳粉培养基
往11.5％全脂乳粉培养基中添加以重量计6.5％蔗糖，然后在温度60℃与20MPa的条件下进行均质，接着在温度95℃下灭菌10min，得到一种发酵培养基；
C、菌种活化
按照以活化培养基重量计2％的接种量，把在温度-80℃下冷冻保藏的嗜热链球菌IMAU20756菌株接种于所述的活化培养基中，在温度37℃下培养24h，然后按照以M17液体培养基重量计2％的接种量，将活化嗜热链球菌IMAU20756菌株接种于M17液体培养基中，在温度37℃下继续培养20h，以同样方式传代培养2～3次，经计数得到的活菌数为108CFU/g以上；
D、发酵
按照5×106CFU/mL接种量把步骤C活化的嗜热链球菌IMAU20756接种于所述的发酵培养基中，在温度42℃下发酵直到发酵乳的pH值降低到4.5时，停止发酵，得到所述的发酵乳。
所述的发酵乳在温度4℃下贮藏1d后，所述发酵乳的黏度、持水性以及稳定性优于其他菌株。
所述的发酵乳在温度4℃下贮藏1d后，能够更好地抑制发酵乳的凝胶断裂及其乳清的析出，从而改善发酵乳的组织状态，增加产品良好的口感。
实施例8
制备发酵乳
步骤如下：
A、制备活化培养基
往10％脱脂粉乳粉培养基中添加以重量计0.1％酵母粉，在温度115℃下灭菌7min，得到一种活化培养基；
B、制备全脂乳粉培养基
往11.5％全脂乳粉培养基中添加以重量计6.5％蔗糖，然后在温度60℃与20MPa的条件下进行均质，接着在温度95℃下灭菌10min，得到一种发酵培养基；
C、菌种活化
按照以活化培养基重量计2％的接种量，把在温度-80℃下冷冻保藏的嗜热链球菌IMAU20756菌株接种于所述的活化培养基中，在温度37℃下培养24h，然后按照以M17液体培养基重量计2％的接种量，将活化嗜热链球菌IMAU20756菌株接种于M17液体培养基中，在温度37℃下继续培养20h，以同样方式传代培养2～3次，经计数得到的活菌数为108CFU/g以上；
D、发酵
按照5×106CFU/mL接种量把步骤C活化的嗜热链球菌IMAU20756接种于所述的发酵培养基中，在温度42℃下发酵直到发酵乳的pH值降低到4.5时，停止发酵，得到所述的发酵乳。
所述的发酵乳在温度4℃下贮藏7d后，所述发酵乳的黏度、持水性以及稳定性优于其他菌株。
所述的发酵乳在温度4℃下贮藏7d后，能够更好地抑制发酵乳的凝胶断裂及其乳清的析出，从而改善发酵乳的组织状态，增加产品良好的口感。
对实施例7和实施例8中制备得到的发酵乳进行口感测定，结果如表1所示：
表1
Figure BDA0002145024430000141
本发明提供了一种高产胞外多糖嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU20756，该菌株可产生的胞外多糖中，中性多糖组分EPS-1a和酸性多糖EPS-3a的分子质量分别为1.572×105Da和3.825×105Da；且液相色谱图表明EPS-1a主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖构成，占总糖90％以上；EPS-3a主要由甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖构成，占总糖量80.6％，另含有少量的木糖、鼠李糖等。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 内蒙古农业大学
<120> 一种嗜热链球菌IMAU20756及其应用
<141> 2019-07-22
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1432
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 1
tgcagtcgta cgcttctttt tccaccggag cttgctccac cggaaaaaga ggagtggcga 60
acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc atcagaaggg gataacactt ggaaacaggt 120
gctaataccg tataacaatc gaaaccgcat ggttttgatt tgaaaggcgc tttcgggtgt 180
cgctgatgga tggacccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcc 240
acgatgcata gccgacctga gagggtgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa 300
ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt cggcaatgga cgaaagtctg accgagcaac 360
gccgcgtgag tgaagaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttagaga agaacaagga 420
tgagagtaac tgttcatccc ttgacggtat ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc 480
cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga 540
gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg 600
gaaactggga gacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg 660
cgtagatata tggaggaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgta actgacgctg 720
aggctcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780
atgagtgcta agtgttggag ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagcac 840
tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900
agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 960
cctttgacca ctctagagat agagcttccc cttcgggggc aaagtgacag gtggtgcatg 1020
gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta 1080
ttgttagttg ccatcattca gttgggcact ctagcaagac tgccggtgac aaaccggagg 1140
aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200
atgggaagta caacgagttg cgaagtcgcg aggctaagct aatctcttaa agcttctctc 1260
agttcggatt gcaggctgca actcgcctgc atgaagccgg aatcgctagt aatcgcggat 1320
cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380
gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttggagc cagccgccta ag 1432

Claims (5)

1.一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU20756在制备胞外多糖中的应用；
所述嗜热链球菌IMAU20756的保藏编号为CGMCC No.18067；所述IMAU20756菌株在M17培养基中所产胞外多糖EPS经纯化后包括两个主要组分：EPS-1a和EPS-3a，摩尔质量分别为1.572×105Da和3.825×105Da；且所述EPS-1a主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖构成，占EPS-1a质量的90％以上；所述EPS-3a主要由甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖构成，占EPS-3a质量的80.6％；
所述IMAU20756菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示；
所述胞外多糖的制备方法，由以下步骤组成：(1)将活化后的所述嗜热链球菌IMAU20756接种于M17培养基中培养36h后，灭活菌株，冷却后离心，得第一上清液；所述M17培养基中包括以下浓度的原料：17.5g/L大豆蛋白胨、5g/L葡萄糖、0.5g/L抗坏血酸钠、19g/Lβ-甘油磷酸钠和0.25g/L硫酸镁；
(2)将所述第一上清液与体积浓度为80％的三氯乙酸溶液混合，至所述混合后的混合液中三氯乙酸溶液的终体积浓度为4％，静置后离心，得第二上清液；
(3)将所述第二上清液取与体积浓度为95％的乙醇溶液混合，静置后离心，得沉淀；
(4)用去离子水将所述沉淀复溶，透析后干燥，得胞外多糖；
所述接种，按照以M17液体培养基重量计2％的接种量接种；
所述EPS-1a中葡萄糖、甘露糖和半乳糖三者的摩尔比为3.62：1：2.99；
所述EPS-3a中甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖三者的摩尔比为1.19：1：1.08；
所述EPS-1a和EPS-3a的糖环形式均为吡喃糖环且糖苷键构型为α型；
步骤(1)所述活化为将所述嗜热链球菌IMAU20756于活化培养基中传代3次；所述活化培养基中包括以下原料：重量百分含量为10％的脱脂粉乳粉培养基和酵母粉；
所述分离纯化包括依次进行的DEAE-Cellulose 52离子交换色谱分级纯化和Sepharose CL-6B凝胶柱层析纯化。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，每次所述传代均为将所述嗜热链球菌IMAU20756按照2％的接种量接种于所述活化培养基上进行传代，所述传代的温度为34℃，所述传代的培养时间为36h。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)所述离心的离心力均为12000g，所述离心的时间均为30min。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，步骤(3)所述第二上清液与体积浓度为95％的乙醇溶液的体积比为1:3。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，在步骤(4)得所述胞外多糖后，还包括分离纯化。
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