CN101333519A - 乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶与胞外多糖的提取方法 - Google Patents
乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶与胞外多糖的提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101333519A CN101333519A CNA200710123108XA CN200710123108A CN101333519A CN 101333519 A CN101333519 A CN 101333519A CN A200710123108X A CNA200710123108X A CN A200710123108XA CN 200710123108 A CN200710123108 A CN 200710123108A CN 101333519 A CN101333519 A CN 101333519A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bile salt
- salt hydrolase
- eps
- exocellular polysaccharide
- polysaccharide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010000231 Choloylglycine hydrolase Proteins 0.000 title claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 title claims abstract description 12
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 title claims abstract description 5
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 title claims abstract description 5
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 title description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 66
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 66
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 65
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 241000194041 Lactococcus lactis subsp. lactis Species 0.000 claims abstract description 27
- 235000014969 Streptococcus diacetilactis Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 63
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 41
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 38
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 26
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 25
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 7
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 claims description 6
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 claims description 6
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 2
- -1 distilled water polysaccharide Chemical class 0.000 claims 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 18
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 abstract description 9
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 abstract description 9
- 239000012043 crude product Substances 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 abstract description 3
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 abstract description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 9
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 5
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 5
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 5
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 3
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 235000012204 lemonade/lime carbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- NCXMLFZGDNKEPB-FFPOYIOWSA-N natamycin Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C[C@@H](C)OC(=O)/C=C/[C@H]2O[C@@H]2C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 NCXMLFZGDNKEPB-FFPOYIOWSA-N 0.000 description 3
- 229960003255 natamycin Drugs 0.000 description 3
- 229940054441 o-phthalaldehyde Drugs 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 210000000697 sensory organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 2
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- YXVFQADLFFNVDS-UHFFFAOYSA-N diammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(C(=O)O)CC([O-])=O YXVFQADLFFNVDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 235000021262 sour milk Nutrition 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 1
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 1
- 241000852860 Lactobacillus casei BD-II Species 0.000 description 1
- 241000186605 Lactobacillus paracasei Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 201000010538 Lactose Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000004567 concrete Substances 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000015140 cultured milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000015250 liver sausages Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 108010046845 tryptones Proteins 0.000 description 1
- 238000003805 vibration mixing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明名称为乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶(BSH)和胞外多糖(EPS)的提取方法，适用于功能性乳制品中BSH、EPS作为功能因子及EPS作为天然稳定剂，开发生产新型的功能食品。本发明利用高产BSH和EPS的乳酸乳球菌乳酸亚种KS4(CGMCC №1807)、嗜热链球菌Tx(CGMCC №1810)，通过优化发酵条件和提取方法得到乳酸菌胆盐水解酶和胞外多糖粗品。采用适宜的超声波细胞破碎提取方法，解决了胞内胆盐水解酶较难提取的问题；通过优化EPS的提取条件，提高了EPS的提取率。本发明制得BSH和EPS的发酵工艺与提取方法简单，发酵周期较短，对设备要求低，成本较低，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶(Bile Salt Hydrolase，BSH)和胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)的提取方法，适用于功能性乳制品中BSH、EPS作为功能因子及EPS作为天然稳定剂，开发生产新型的功能食品。
背景技术
益生菌(Probiotics)是指一类通过肠道定殖作用改善宿主特定部位微生态平衡并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它们通过改善肠道微生物生态平衡，控制肠道感染，降低血清胆固醇水平，提高乳糖不耐症人对乳糖的利用，并能刺激特异性或非特异性免疫反应，具有免疫增强的作用。益生菌制品的活菌应该代谢稳定，活性较强，通过消化道后大量存活，进入肠道后发挥益生菌作用。目前用于生产益生菌剂的优良菌种有双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属中的乳酸乳球菌乳酸亚种等。
早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或者双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血清胆固醇的含量。迄今，国内外研究者对于乳酸菌降低胆固醇的作用机理尚存在不同观点，主要集中于以下三点：(1)乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇；(2)乳酸菌的胆盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作用；(3)其他理论，如吸收同化与共沉淀联合作用。胆盐水解酶(BSH)是乳酸菌产生的代谢产物。该酶能在人体肝肠循环中将结合态胆盐降解产生氨基酸与溶解度较低的游离态胆盐。后者能与胆固醇结合形成沉淀复合物而排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。
有文献报道乳酸菌在亚优化生长条件下，出于对自身的保护作用，可分泌胞外多糖(EPS)。Whitfield等研究表明胞外多糖的形成有利于微生物抵抗不良环境因素，如干燥、渗透压条件、抗生素或毒物作用、巨噬细胞或噬菌体的侵袭等。自1982年日本学者Shiomi等人报道乳酸菌EPS具有抗肿瘤作用以来，引起了许多学者的注意。从报道的研究结果看，乳酸菌EPS主要有以下几个方面的功能：改善发酵乳制品组织状态，控制酸奶的脱水收缩，防止乳清析出；改善菌株对肠道黏膜的非特异性粘附，增强菌株对肠道的定殖作用；抗肿瘤作用；调节免疫系统作用；对细胞体具有保护作用；抑制肠道腐败菌的繁殖，防治结肠癌的作用。目前认为乳酸菌EPS抗肿瘤作用的机理有以下几个方面：(1)影响血液供应，鉴于细菌素能引起肿瘤细胞组织缺血性坏死，曾经设想多糖的抗肿瘤作用可能影响肿瘤的血液供应；(2)刺激某种器官或组织，分泌一种物质攻击肿瘤细胞；(3)细胞膜接触抑制作用。肿瘤细胞表面具有很强的负电荷，而有些多糖可以结合这些电荷，使细胞表面被“中和”从而有利于细胞接受信号终止分裂。
国内关于干酪乳杆菌的研究主要是其降血脂、抗高血压、治疗过敏性疾病等保健功效上，如上海光明乳业股份有限公司申请的“干酪乳杆菌Bd-II菌株及其在降低血脂方面的应用”，专利申请号为：CN03128995.9；干酪乳杆菌LC2W菌株及其在抗高血压方面的应用专利申请号为：CN03129450.2两项专利；景岳生物科技股份有限公司申请的：新的微生物株类干酪乳杆菌GM-080及其治疗过敏相关疾病的用途，专利申请号为：CN200410038566.X。
虽然国外关于干酪乳杆菌降低血清胆固醇功效的研究也有一项专利报道：Lactobacillus casei bd-II stain and used to reduce blood cholesterol(20060127380)，但是，目前国外几乎无关于乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌等菌株产胆盐水解酶和胞外多糖的专利报道。国内虽然有“一种干酪乳杆菌胆盐水解酶及其生产方法与专用生产菌株(200610112696.2)”、“一种双歧杆菌胞外多糖及其生产方法与专用生产菌株(200510105465.4)”、“干酪乳杆菌胞外多糖及其粗品、制备方法和应用(200510028970.3)”三项专利报道，而国内尚无乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌中胆盐水解酶和胞外多糖的提取方法的相关文章报道和专利报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供两种具有高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌。
本发明所提供的乳酸菌是：乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx，已于2006年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏号分别为：CGMCC№1807(菌株KS4)，CGMCC№1810(菌株Tx)。
乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx，分离筛选自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)。
在含有碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基上，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx菌株的菌落大小为1～2mm，表面光滑，边缘整齐，呈圆形，无光泽，凸起，灰白色，半透明，菌落周围有溶解CaCO3的透明圈，菌落有较高黏性。个体形态呈球形或卵圆形，一般成对或链状排列，G+兼性厌氧菌。
上述方法得到的用于生产胆盐水解酶和胞外多糖的两种具有高效降低胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌属于本发明保护范围。
本发明的第二个目的是提供两种乳酸菌胆盐水解酶及其提取方法。
本发明所提供乳酸菌胆盐水解酶的提取方法是由乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx得到的胆盐水解酶。
(1)乳酸菌发酵液以10000r/min，4℃离心10min，收集沉淀菌泥；
(2)用生理盐水离心洗涤菌体沉淀2次(条件同上)；
(3)加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)至发酵液原体积，细胞悬浮液于冰浴中进行超声波破碎10min(功率400～450w，工作5s，间歇3s)；
(4)以10000r/min，4℃离心10min除去细胞碎片，收集含酶上清液。
(5)上清液用70％～75％饱和浓度的硫酸铵于4℃盐析24h，以10000r/min，4℃离心15～20min，收集沉淀的蛋白物质；
(6)用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解蛋白物质，再以预处理的透析袋于4℃透析至透析液经BaCl2检验无沉淀为止，透析液即为胆盐水解酶提取液。
(7)将50mL或100mL的胆盐水解酶提取液注入500mL无菌冻干瓶内，在-25℃条件下预冻至冻结状态(16～24h)，在LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)上于0.22～0.24mBar真空度、冷阱温度为-55℃条件下升华干燥36～72h，其干燥物即为乳酸菌胆盐水解酶粗品。
上述方法得到乳酸菌胆盐水解酶及其专用生产菌株也属本发明保护范围。
本发明的第三个目的是提供两种乳酸菌胞外多糖的提取方法。
本发明所提供胞外多糖的提取方法是由嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Tx，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4得到的胞外多糖。
(1)乳酸菌发酵液以8000r/min，4℃离心10min，收集上清液；
(2)上清液加入1/5体积pH5.0的10％三氯乙酸于4℃振荡处理30min；
(3)处理液以10000r/min，4℃离心10～15min，收集上清液；
(4)上清液加入3倍体积的95％冷乙醇于4℃处理11～12h，离心(条件同上)，收集沉淀的多糖物质；
(5)多糖物质以蒸馏水溶解，脱脂棉过滤除去不溶物，再以预处理的透析袋于4℃透析过夜，透析液即为多糖提取液。
(6)将50mL或100mL多糖提取液注入500mL无菌冻干瓶内，在-25℃条件下预冻至冻结状态，在LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)上于0.16～0.18mBar真空度、冷阱温度为-55℃条件下升华干燥36～72h，其干燥物即为乳酸菌胞外多糖粗品。干燥后的胞外多糖呈白色(或略带浅黄)结晶状态。
上述方法得到乳酸菌胞外多糖及其专用生产菌株与优化提取方法也属于本发明保护范围。
乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx分离筛选于东北普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)，具有可靠的安全性。其产生的胆盐水解酶水解结合态胆盐的产物为游离态胆盐和氨基酸，对人体无害。本发明用此两种乳酸菌株提取的胆盐水解酶和胞外多糖，其原料来源方便，提取工艺简单，发酵周期短，操作简单，成本较低，对设备要求低，适于工业化生产。
附图说明
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积百分含量。
实施例1、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx的筛选与鉴定
1、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶菌株的筛选
取藏灵菇滤液5mL注入带玻璃珠的45mL无菌生理盐水中，充分振荡30min，制成菌悬液，而后10倍梯度稀释成10-4～10-6的稀释菌液。以稀释倾注法接种平板，倒入含碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基，37℃培养24h，挑取有溶解圈的单菌落划线接种于MRS斜面培养基中，于37℃培养24h。革兰氏染色，视其个体形态和纯度。转接种于MRS液体培养基中，37℃增菌培养2～3代，再以1％～2％接种量转接入含胆固醇的I号培养基，37℃培养20h后，以邻苯二甲醛比色法测定I号培养基中发酵前后胆固醇的含量，并计算胆固醇降低率(％)。根据胆固醇降低率确定高效降胆固醇的菌株。具体测定方法：取0.4mL培养前后的发酵液于比色管中，加入0.2mL邻苯二甲醛(1mg/mL)和4mL混合酸(冰醋酸、浓硫酸等量混合)，充分混合后室温静置10min，以不含胆固醇的I号培养基为空白调0，于550nm测定吸光值(A)，在胆固醇-吸光值标准曲线上查得发酵前后胆固醇的含量(结果见表1)。
表1不同乳酸菌株降低胆固醇的初筛试验结果
研究表明，采用高通量筛选技术和邻苯二甲醛法获得高效降低胆固醇的乳酸菌是KS4和Tx菌株。其中，KS4菌株降低胆固醇能力最强。它们在有关文献报道中属于降低胆固醇能力较强菌株。
将初筛后获得的具有高效降胆固醇的菌株，在含0.1％胆固醇和0.3％牛黄胆酸钠的MRS培养基平板上(分别以含0.1％胆固醇的MRS培养基、0.3％牛黄胆酸钠的MRS培养基作为对照)，对称放置牛津杯，加入0.1mL MRS培养菌液，于37℃厌氧培养3～4d后，观察牛津杯周围是否有银色沉淀现象，其结果见表2。阳性者以茚三酮法检测银色沉淀物中是否有胆盐的水解产物——氨基酸存在，根据蓝紫色反应初步确定菌株是否产生胆盐水解酶。将茚三酮反应阳性菌株划线接种于MRS斜面试管，培养后保存备用。
由表1和表2结果显示，沉淀圈的大小与胆盐水解酶的活力和降低胆固醇的百分率成正比。复筛试验总体比较，菌株KS4和Tx能够高产胆盐水解酶，其中菌株KS4产酶能力最强。高效降低胆固醇的乳酸菌株源于其产生多量或高活力的胆盐水解酶。故可利用KS4菌株大量提取胆盐水解酶，并利用这些高产胆盐水解酶的乳酸菌株进一步开发研制高效降胆固醇的功能性酸奶。
表2产胆盐水解酶乳酸菌株复筛试验结果
注：“+”表示牛津杯周围有不同程度的银色沉淀现象；“-”表示无沉淀现象。
2、高产胞外多糖菌株的筛选
取藏灵菇滤液5mL注入带玻璃珠的45mL无菌生理盐水中，充分振荡30min，制成菌悬液，而后10倍梯度稀释成10-4～10-6。以稀释倾注法接种平板，倒入含碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基，37℃培养24h，挑取有溶解圈、黏性较高的单菌落划线接种于MRS斜面培养基中，于37℃培养24h。革兰氏染色，视其个体形态和纯度。转接种于MRS液体培养基中，37℃增菌培养2～3代，再以1％～2％接种量转接入MRS液体培养基中，37℃培养12h后，以苯酚-硫酸比色法测定培养液中EPS的含量。将测得样品吸光度y值代入标准曲线公式y＝0.8649x(R2＝0.9991)即得到EPS浓度x值(100mg/L)，其结果见表3。根据MRS培养基中的EPS含量，确定产胞外多糖的菌株。将产胞外多糖的菌株划线接种于MRS斜面试管，培养后保存备用。
表3分离菌株产胞外多糖测试结果
研究表明，采用高通量筛选技术和苯酚-硫酸法获得较高合成EPS的乳酸菌是KS4和Tx菌株。其中KS4菌株EPS的产量最高。它们在有关文献报道中均属于产EPS能力较强的菌株。
3、筛选菌株发酵性能鉴定
将筛选的KS4和Tx菌株培养物转接入灭菌脱脂乳中连续传代活化2～3代，37℃培养过夜至牛乳凝固。再以1％接种量转接入盛脱脂乳的三角瓶中，于37℃培养过夜至牛乳凝固后，再冷藏后熟过夜，测定发酵剂的活力(包括凝乳时间、酸度、黏度、还原韧天青时间，乳酸菌活菌数量)。分别于37℃、40℃、43℃培养过夜至牛乳凝固后，进行感官综合评定，其结果见表4。
表4筛选乳酸菌株的发酵性能测试结果
研究表明，菌株KS4和Tx均具有良好的发酵性能。其中由Tx菌株制备发酵剂的黏度最高，凝乳时间最短，感官综合评分最高，其次是KS4菌株。故可利用Tx菌株大量提取EPS，并利用这些产EPS的乳酸菌株进一步开发研制具有抗癌作用的功能性酸奶。
根据发酵剂的活力和感官综合评定分数高低，确定发酵性能优良的菌株。将筛选产胆盐水解酶、胞外多糖和发酵性能优良的MRS斜面菌株，接种于各种理化鉴定培养基中，37℃培养进行鉴定。
4、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖菌株的鉴定
常规生理生化试验鉴定：糖醇类发酵试验，耐盐试验(7.5％NaCl)，不同温度试验(10℃、40℃)。Biolog全自动微生物鉴定仪鉴定：挑取MRS平板上的目的单菌落划线接种于BUA+B平板上(含5％无菌脱纤维绵羊血)，37℃培养得到单菌落后，以Biolog的专用接种液调整菌悬液的浊度至65±2％T，接种于AN微量鉴定板中，35～37℃厌氧培养24～48h后，于鉴定仪上读取鉴定结果。鉴定结果如表5所示。鉴定菌株KS4为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)，菌株Tx为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
表5菌株KS4、Tx的鉴定项目与结果
注：“+”95％以上的菌株为阳性；“-”95％以上的菌株为阴性。
实施例2、利用乳酸乳球菌乳酸亚种KS4、嗜热链球菌Tx提取胆盐水解酶
1、高产胆盐水解酶的发酵工艺条件
用于培养乳酸乳球菌乳酸亚种KS4、嗜热链球菌Tx高产胆盐水解酶的培养基成分(w/v)：葡萄糖2％，大豆蛋白胨2％，MnSO40.025％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，吐温800.1％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸二铵0.2％，硫酸镁0.058％，蒸馏水1000mL，0.07MPa灭菌20min。
高产胆盐水解酶的发酵工艺条件：发酵温度37℃，发酵时间12h，培养基的初始pH值6.0，接种量2％。
在此发酵条件下，乳酸乳球菌乳酸亚种KS4的酶活力是优化前的11.84倍。
2、发酵液中胆盐水解酶的提取方法与酶活力测定
(1)胆盐水解酶的提取方法胆盐水解酶的分离纯化目的是将该目的胞内酶提取出来，经过纯化使之达到要求的纯度。提取的关键技术是选择破碎细胞的有效方法。将在上述发酵条件下得到的乳酸菌发酵液以10000r/min，4℃离心10min，弃上清液，菌体用无菌生理盐水离心洗涤2次(条件同上)，弃上清液，加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)至发酵液原体积，细胞悬浮液于冰浴中进行超声波破碎10min(功率400～450w，工作5s，间歇3s)，以10000r/min，4℃离心10min，除去细胞碎片，收集含胆盐水解酶的上清液；上清液用70％～75％饱和浓度的硫酸铵于4℃盐析24h，以10000r/min，4℃离心15～20min，收集沉淀的蛋白物质；以0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解蛋白物质(加缓冲液的量为初始发酵液体积的一半)，用预处理的透析袋于4℃透析至透析液经BaCl2检验无沉淀为止，即透析完全(期间每隔12h换一次无菌磷酸盐缓冲液)，透析液即为胆盐水解酶提取液。上述采用适宜的超声波破碎细胞的提取方法，解决了胞内胆盐水解酶较难提取的问题。
(2)酶活力测定取0.1mL胆盐水解酶提取液，加入1.8mL0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)和0.1mL的结合胆盐(6mmol/L牛黄胆酸钠)，于旋涡混合器上振荡混匀1min，将混合液于37℃振荡酶解40min。酶反应完毕，立即加入80％三氯乙酸(加量与酶液等体积)，混匀，中止酶反应1min后离心(条件同上)，上清液即为酶反应液。
胆盐水解酶活力的测定是通过结合胆盐降解后释放的氨基酸量的多少来衡量。即该酶活力与氨基酸的生成量成正比。可采用茚三酮显色法测定氨基酸的含量。取2mL酶反应液，加入茚三酮显色剂1mL，混匀后于沸水浴中加热16min，自来水冷却，加入5mL稀释液，摇匀，同上操作以2mL蒸馏水替代酶反应液作为空白对照调0，于570nm测吸光值A(生成的颜色在60min内稳定，最好在30min之内完成)。胆盐水解酶于每分钟生成1μmol的氨基酸定义为一个酶活力单位。
(3)胆盐水解酶的真空冷冻干燥将50mL或100mL的胆盐水解酶提取液注入500mL无菌冻干瓶内，在-25℃条件下预冻至冻结状态(16～24h)，在LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)上于0.22～0.24mBar真空度、冷阱温度为-55℃条件下升华干燥36～72h，其干燥物即为乳酸菌胆盐水解酶粗品。
实施例3、利用嗜热链球菌Tx、乳酸乳球菌乳酸亚种KS4提取胞外多糖
1、高产胞外多糖的发酵工艺条件
用于培养嗜热链球菌Tx、乳酸乳球菌乳酸亚种KS4高产胞外多糖的培养基成分(w/v)：蔗糖6％，胰蛋白胨3％，硫酸锰0.025％，牛肉膏1.0％，酵母粉0.50％，吐温800.10％，磷酸氢二钾0.20％，乙酸钠0.50％，柠檬酸二铵0.20％，硫酸镁0.058％，蒸馏水1000mL，0.07MPa灭菌20min。
高产胞外多糖的发酵条件：发酵温度32℃，发酵时间16h，培养基的初始pH值6.5，接种量3％。
在此发酵条件下，嗜热链球菌Tx胞外多糖的产量是优化前的2.6倍。
2、发酵液中胞外多糖的提取方法与浓度测定
(1)胞外多糖的提取方法乳酸菌发酵液以8000r/min，4℃离心10min，收集上清液，加入1/5体积pH5.0的10％三氯乙酸于4℃振荡处理30min(优化提取条件)，再以10000r/min，4℃离心10～15min，收集上清液，加入3倍体积的95％冷乙醇于4℃处理11～12h，离心(条件同上)，收集沉淀的多糖物质。多糖物质以无菌蒸馏水溶解(加蒸馏水的量为初始发酵液体积的一半)，无菌脱脂棉过滤除去不溶物，再以预处理的透析袋(先用50％乙醇煮沸10min，而后用含2％碳酸氢钠的1mmol/L EDTA溶液煮沸10min，再以蒸馏水煮沸3次，每次换水煮沸1min)于4℃透析过夜(期间换无菌蒸馏水3～4次)，透析液即为多糖提取液。同时以pH0.5的10％三氯乙酸处理为普通提取条件作对照。
(2)胞外多糖浓度测定取少量多糖提取液用苯酚-硫酸比色法测定其在490nm处的吸光值，根据标准曲线计算EPS浓度。若EPS的浓度较高，可适当稀释2倍。在计算优化提取条件下EPS浓度时，在标准曲线上查得结果乘以2。
准确称取标准葡萄糖100mg于500mL容量瓶中，加水至刻度。各种试剂按表6所示的量在比色管中均匀混合操作，室温放置20min后于490nm测定EPS吸光值(以2.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白调0)。以葡萄糖含量(100mg/L)为横坐标，吸光度(A490nm)为纵坐标绘制标准曲线。将测得样品吸光度y值代入标准曲线公式y＝0.380x(R2＝0.9555)即得到EPS浓度x值(100mg/L)。其优化提取条件与普通提取条件EPS产量对比试验结果见表7。
表6苯酚-硫酸法测多糖标准曲线参数表
(3)胞外多糖的真空冷冻干燥将50mL或100mL多糖提取液注入500mL无菌冻干瓶内，胶塞密封，在-25℃条件下预冻至冻结状态(24h)。冷冻干燥机使用前检查内部有无积水并检查封闭性，确定有无积水和漏气点并关闭通气阀后开启。待LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)内部温度降低到-40℃以下时真空泵开始工作，其内部真空度降低到0.200mBar以下时开始上样。上样时应迅速将冻干瓶从低温冰柜中取出，将胶塞与冻干机接口套紧以确保封闭性，打开通气阀。当整个封闭系统真空度降至0.180mBar时冻干开始。于真空度为0.16～0.18mBar、冷阱温度为-55℃条件下升华干燥。50ml初始液需要冻干36h，100ml初始液需要冻干72h。当冻干瓶的内部水分完全升华后关闭通气阀，将冻干瓶取下并缓慢释放冻干机内负压，待其恢复常压后，先关闭真空泵，再关闭冷冻干燥机。将冻干瓶内干燥物质移入灭菌三角瓶中，称重。干燥后的胞外多糖粗品呈白色(或略带浅黄)结晶状态。
表7优化提取条件与普通提取条件对比试验结果
研究表明，优化提取条件比普通提取条件的多糖浓度提高5.2倍。以1600mL发酵液经冷冻干燥后得到1.76g粗多糖为例，其胞外多糖提取率为91.3％。说明采用优化的提取条件，可明显提高胞外多糖的提取率。
本专利所属项目：北京市自然科学基金“藏灵菇益生菌产生物活性物质及生理功能的研究”
项目编号：5062006
项目起止时间：2006.01-2008.12
项目负责人：刘慧
Claims (4)
1、乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶和胞外多糖的提取方法，其技术特征在于：从藏灵菇中筛选获得两种高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌，且它们均具有高效降低胆固醇和良好的发酵性能。利用两种乳酸菌提取胆盐水解酶，并采用适宜的超声波破碎细胞的提取方法，解决了胞内胆盐水解酶较难提取的问题。同时采用优化的胞外多糖提取条件，提高了多糖的提取率。
2、根据权利要求1所述的用于生产胆盐水解酶和胞外多糖的两种具有高效降低胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌属于本发明保护范围。这两种乳酸菌的分类命名是：菌株KS4为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)(CGMCC №1807)，菌株Tx为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(CGMCC №1810)。
3、根据权利要求1所述的利用两种乳酸菌提取的胆盐水解酶及其专用生产菌株与超声波破碎细胞的提取方法也属于本发明保护的范围。胆盐水解酶提取方法：乳酸菌发酵液以10000r/min，4℃离心10min，收集沉淀菌泥；用生理盐水离心洗涤菌体沉淀2次(条件同上)；加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)至发酵液原体积，细胞悬浮液于冰浴中进行超声波破碎10min(功率400～450w，工作5s，间歇3s)；以10000r/min，4℃离心10min，除去细胞碎片，收集含胆盐水解酶的上清液；上清液用70％～75％饱和浓度的硫酸铵于4℃盐析24h，以10000r/min，4℃离心15～20min，收集沉淀的蛋白物质；以0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解蛋白物质，用预处理的透析袋于4℃透析至透析液经BaCl2检验无沉淀为止，透析液即为胆盐水解酶提取液。将50mL或100mL的胆盐水解酶提取液注入500mL无菌冻干瓶内，在-25℃条件下预冻至冻结状态(16～24h)，在LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)上于0.22～0.24mBar真空度、冷阱温度为-55℃条件下升华干燥36～72h，其干燥物即为乳酸菌胆盐水解酶粗制品。
4、根据权利要求1所述的利用两种乳酸菌提取的胞外多糖及其专用生产菌株与优化提取方法也属于本发明保护的范围。胞外多糖提取方法：乳酸菌发酵液以8000r/min，4℃离心10min，收集上清液；加入1/5体积pH5.0的10％三氯乙酸于4℃振荡处理30min；以10000r/min，4℃离心10～15min，收集上清液；加入3倍体积的95％冷乙醇于4℃处理11～12h，离心(条件同上)，收集沉淀的多糖物质；以蒸馏水溶解多糖物质，脱脂棉过滤除去不溶物，再以预处理的透析袋于4℃透析过夜，透析液即为胞外多糖提取液。将50mL或100mL胞外多糖提取液注入500mL无菌冻干瓶内，在-25℃条件下预冻至冻结状态，在LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)上于0.16～0.18mBar真空度、冷阱温度为-55℃条件下升华干燥36～72h，其干燥物即为乳酸菌胞外多糖粗制品。干燥后的胞外多糖呈白色(或略带浅黄)结晶状态。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200710123108XA CN101333519B (zh) | 2007-06-28 | 2007-06-28 | 乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶与胞外多糖的提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200710123108XA CN101333519B (zh) | 2007-06-28 | 2007-06-28 | 乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶与胞外多糖的提取方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010101859508A Division CN101892205B (zh) | 2007-06-28 | 2007-06-28 | 乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶的提取方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101333519A true CN101333519A (zh) | 2008-12-31 |
| CN101333519B CN101333519B (zh) | 2010-09-15 |
Family
ID=40196400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200710123108XA Expired - Fee Related CN101333519B (zh) | 2007-06-28 | 2007-06-28 | 乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶与胞外多糖的提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101333519B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101580550B (zh) * | 2009-06-04 | 2011-06-15 | 大连交通大学 | 一株好氧罗氏菌属菌株代谢产物胞外多糖、制法和用途 |
| CN102220276A (zh) * | 2011-05-10 | 2011-10-19 | 江南大学 | 一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN102559705A (zh) * | 2010-10-28 | 2012-07-11 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 一种EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD |
| CN101642274B (zh) * | 2009-08-21 | 2012-08-01 | 北京农学院 | 利用产胆盐水解酶的乳酸菌、酵母菌制备降胆固醇蛋乳发酵饮料的方法 |
| CN102702372A (zh) * | 2010-10-28 | 2012-10-03 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 一种嗜热链球菌胞外多糖及其制备和检测方法 |
| CN102965318A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-03-13 | 吉林省农业科学院 | 一株产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用 |
| CN104489085A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-04-08 | 临沂格瑞食品有限公司 | 一种富含β-葡聚糖的发酵乳及其制备工艺 |
| CN110305816A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-10-08 | 内蒙古农业大学 | 一种嗜热链球菌imau20756及其应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103865910A (zh) * | 2014-04-09 | 2014-06-18 | 青岛博之源生物技术有限公司 | 一种发酵唾液乳酸杆菌提取胆盐水解酶的方法 |
-
2007
- 2007-06-28 CN CN200710123108XA patent/CN101333519B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101580550B (zh) * | 2009-06-04 | 2011-06-15 | 大连交通大学 | 一株好氧罗氏菌属菌株代谢产物胞外多糖、制法和用途 |
| CN101642274B (zh) * | 2009-08-21 | 2012-08-01 | 北京农学院 | 利用产胆盐水解酶的乳酸菌、酵母菌制备降胆固醇蛋乳发酵饮料的方法 |
| CN102559705A (zh) * | 2010-10-28 | 2012-07-11 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 一种EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD |
| CN102702372A (zh) * | 2010-10-28 | 2012-10-03 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 一种嗜热链球菌胞外多糖及其制备和检测方法 |
| CN102702372B (zh) * | 2010-10-28 | 2013-11-27 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 一种嗜热链球菌胞外多糖及其制备和检测方法 |
| CN102220276A (zh) * | 2011-05-10 | 2011-10-19 | 江南大学 | 一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN102220276B (zh) * | 2011-05-10 | 2013-07-10 | 江南大学 | 一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN102965318A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-03-13 | 吉林省农业科学院 | 一株产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用 |
| CN104489085A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-04-08 | 临沂格瑞食品有限公司 | 一种富含β-葡聚糖的发酵乳及其制备工艺 |
| CN110305816A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-10-08 | 内蒙古农业大学 | 一种嗜热链球菌imau20756及其应用 |
| CN110305816B (zh) * | 2019-07-26 | 2021-06-29 | 内蒙古农业大学 | 一种嗜热链球菌imau20756及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101333519B (zh) | 2010-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101333519B (zh) | 乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶与胞外多糖的提取方法 | |
| CN101331900B (zh) | 四种产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌及其功能性酸奶生产技术 | |
| CN102533588B (zh) | 一株产胞外多糖的短乳杆菌及其应用 | |
| CN101139557B (zh) | 一种干酪乳杆菌及其在改善血脂代谢和免疫调节中的应用 | |
| CN101338283B (zh) | 一种干酪乳杆菌及其在固态发酵中的应用 | |
| CN105132318A (zh) | 植物乳杆菌Grx16及其应用 | |
| CN105368738A (zh) | 一种副干酪乳杆菌及其应用 | |
| CN100513552C (zh) | 一种胆盐水解酶及其生产方法与专用生产菌株 | |
| CN105533544A (zh) | 一种天然果蔬酵素产品 | |
| CN104651268A (zh) | 一种植物乳杆菌及其应用 | |
| CN106754619A (zh) | 一种在谷物培养基中添加中药组分促进益生菌生长的方法 | |
| CN116676225B (zh) | 一株具有安神助眠功效的鼠李糖乳杆菌lr-28菌株、发酵产物、嘉眠菌群组合剂及应用 | |
| CN103421704A (zh) | 一株淡水鱼发酵制品用的植物乳杆菌及应用 | |
| CN103054036A (zh) | 一种含干酪乳杆菌的发酵牡蛎粉 | |
| CN102031248A (zh) | 一种微生物活菌制剂及其制备方法和应用 | |
| CN102524794B (zh) | 一种降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的制备方法 | |
| CN107974421A (zh) | 一种嗜酸乳杆菌及其筛选方法和应用、一种菌剂 | |
| CN103229831A (zh) | 一种含ace抑制肽的植物乳杆菌发酵的高钙酸羊奶的制备方法 | |
| CN101392223A (zh) | 一种微生物饲料添加剂菌种的选育方法 | |
| CN101642274A (zh) | 利用产胆盐水解酶的乳酸菌、酵母菌制备降胆固醇蛋乳发酵饮料的方法 | |
| CN108220201A (zh) | 嗜热链球菌Streptococcus thermophilus Benshit | |
| CN104745501A (zh) | 一种表皮葡萄球菌及其应用 | |
| CN101139558A (zh) | 一种嗜酸乳杆菌及其在改善血脂代谢和免疫调节中的应用 | |
| CN101892205B (zh) | 乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶的提取方法 | |
| CN109097308A (zh) | 高产酸性蛋白酶的诱变菌株及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100915 |