CN105368738A - 一种副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于微生物新资源及微生物应用技术领域的一种副干酪乳杆菌及其应用。所述的副干酪乳杆菌菌株为H9，分类命名为Lactobacillus？paracasei，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC？NO.4780。所述的副干酪乳杆菌从开菲尔粒分离筛选得到，是一株新的副干酪乳杆菌，该副干酪乳杆菌对胃肠有较好的耐受性和粘附性，能够产胞外黏多糖，并且具有抑菌、降胆固醇、降血压和抗氧化活性等生物活性。本发明的副干酪乳杆菌H9，其功能性和发酵性能良好，可以应用到发酵剂、生物保鲜剂、功能食品添加剂以及益生菌制剂等诸多领域，具有广阔的应用前景。

Description

一种副干酪乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物新资源及微生物应用技术领域，特别涉及一种副干酪乳杆菌及其应用。

背景技术

益生菌的菌株必须是公认来源安全的微生物，无致病性；具有一定的耐酸和胆盐的性能，同时具有一定的粘附性，并且能在人的胃肠道存活一段时间；能够对宿主产生一种或多种益生功效等。开发高活性益生菌菌株及其相关产品，是食品工业界的研究热点之一。

研究表明，益生菌在发酵过程中通过其胞外蛋白酶、肽酶(羧肽酶、氨肽酶)的水解作用，将食物蛋白如乳蛋白中具有降压活性的肽片段即ACE抑制肽释放出来，从而具有降血压活性。同时某些益生菌也可以催化L-谷氨酸脱羧产生γ-氨基丁酸，从而达到降血压的目的。此外，某些益生菌的细胞壁成分也有降血压活性。

氧化作用对于许多生命体来说是必需的，但伴随着氧化作用也会产生一些对机体有害的物质，这些物质与机体的衰老和疾病的产生有着密切的联系。许多研究表明，益生菌可以通过产生超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶来清除羟基自由基和过氧化氢，并且某些乳酸菌的无细胞提取物具有清除脂质过氧化物的能力。因此，利用益生菌的抗氧化活性来生产对人们有益的延缓氧化的产品具有很大意义。

生物防腐剂，一般来源于植物、动物及微生物，与化学防腐剂相比，具有天然、高效、无毒或低毒等特点，并且不会破坏食品的原有风味。乳酸菌被公认为安全的食品级微生物，并且由于它能产生乳酸、过氧化氢、双乙酰、细菌素等代谢物质或因营养竞争机制等而具有抑菌作用，所以常用于生物保鲜。因此，利用菌株的抑菌活性来使食品保鲜和预防腐败是非常绿色安全的办法。

血清胆固醇水平偏高是引发心血管疾病的主要危险因素。大量的实验表明，许多不同种类的乳酸菌具有降低胆固醇的功效。积极开发具有降胆固醇活性的菌株并将其运用到工业化生产，对于人类健康来说颇具意义。

本发明针对上述问题，成功从开菲尔粒中分离得到一株副干酪乳杆菌H9，实验表明，该菌株具有一定的胃肠耐受性和粘附性，并在抑菌、降胆固醇、降血压和抗氧化等方面均有功效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9。

本发明的目的也在于提供副干酪乳杆菌及其活性成分的应用。

所述副干酪乳杆菌菌株为H9，分类命名为Lactobacillusparacasei，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCCNo.4780。

所述副干酪乳杆菌的16SrDNA基因序列如SEQIDNo.1所示。

所述副干酪乳杆菌的生物学特性为：菌株在MRS琼脂培养基上37℃培养48h，菌株生长良好，菌落为乳白色圆形，菌落直径为0.5～1.0mm，菌落边缘整齐、有凸起；菌株革兰氏染色呈阳性，显微镜下细胞形态多为短杆状，且倾向于成链，无鞭毛，不运动。

所述副干酪乳杆菌能够产生胞外黏多糖。

所述的副干酪乳杆菌及其自产的胞外黏多糖在抗氧化方面的应用。

所述的副干酪乳杆菌及其自产的胞外黏多糖在易氧化食品、保健品、发酵饮料、宠物食品中提高其抗氧化作用的应用。

所述副干酪乳杆菌在作为益生菌方面的应用。

所述副干酪乳杆菌单独或与其他益生菌株复合在制备益生菌胶囊、益生菌菌片、益生菌冲剂、益生菌发酵制品方面的应用。

所述的其他益生菌株为保加利亚乳杆菌、嗜热乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌中的一种及一种以上

所述益生菌发酵制品为益生菌酸奶及其饮料、益生菌豆奶及其饮料。

所述副干酪乳杆菌在抑菌作用方面的应用。

所述副干酪乳杆菌在制备生物保鲜剂、天然食品防腐剂和饲料添加剂中的应用。

所述的副干酪乳杆菌的综合应用为，将所述副干酪乳杆菌的抑菌、抗氧化活性和作为益生菌中的两种或两种以上在食品、药物组合物、保健品、发酵剂、发酵饮料、动物饲料、宠物食品中的应用。

本发明的有益效果为：获得的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9为一株新的副干酪乳杆菌。该副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9表现出良好的产黏多糖的能力，而黏多糖被认为具有抗癌功能，并增加酸奶的粘稠度；对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌能进行有效抑制；具有良好的热稳定性、降胆固醇活性、降血压活性和抗氧化活性。

生物材料保藏说明

分类命名：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)；菌株编号：H9

保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2011年4月26日

保藏中心登记入册编号：CGMCCNO.4780。

附图说明

图1.副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9的显微镜图。

图2.葡萄糖标准曲线图。

图3.H9菌株对不同胆盐浓度肠液的耐受性曲线图。

图4.不同孵育时间对H9菌株黏附Caco-2细胞数量的影响柱状图。

图5.胆固醇标准曲线图。

图6.不同时间下副干酪乳杆菌H9对胆固醇降解率的曲线图。

图7.肽浓度与ACE抑制率关系曲线图。

图8.不同浓度下，副干酪乳杆菌H9自产的胞外黏多糖清除DPPH自由基能力曲线图。

图9.副干酪乳杆菌H9和ATCC4356菌株清除DPPH自由基能力柱状图。其中，A:H9菌株菌悬液，B:H9菌株无细胞提取液，C:ATCC4356菌悬液，D:ATCC4356无细胞提取液，E:煮沸5min后的H9菌株菌悬液，F:煮沸5min后的ATCC4356菌株菌悬液；图中柱状图上方不同字母表示组间有显著性差异(p<0.05)。

图10.副干酪乳杆菌H9和ATCC4356菌株抑制脂质过氧化能力柱状图。其中，A:H9菌株菌悬液，B:H9菌株无细胞提取液，C:ATCC4356菌悬液，D:ATCC4356无细胞提取液，E:煮沸5min后的H9菌株菌悬液，F:煮沸5min后的ATCC4356菌株菌悬液；图中柱状图上方不同字母表示组间有显著性差异(p<0.05)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9的分离与菌株鉴定。1、开菲尔粒的活化

以10％(w/v)的全脂灭菌乳为培养基，接入5％(w/v)的开菲尔粒，在30℃下静置培养18h后，把开菲尔粒从发酵液中过滤出来，再接入新鲜的全脂灭菌乳中。如此重复培养两到三次。

2、产胞外多糖乳酸菌的分离和筛选

分别称取活化好的三株开菲尔粒约1.0g，采用常规梯度稀释涂布分离，用MRS培养基(含那他霉素)在37℃培养48h。观察平板上的菌落，挑取形态较好并且典型的单菌落，进行革兰氏染色，镜检，将得到的革兰氏阳性菌株进行斜面保存；分别挑取一环保存的革兰氏阳性菌接入5mL灭菌脱脂乳中，30℃下静置培养，凝乳后再将其接入95mL灭菌乳中进行扩大培养，观察凝乳时间和发酵乳的状态和气味，得到典型菌株；通过形态学和16SrDNA序列分析鉴定，发现该菌株为为副干酪乳杆菌，属于乳杆菌属，命名为H9。H9菌株的16SrDNA序列长度为1535kp，全长序列如SEQIDNO.1所示。

实施例2：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9产胞外黏多糖能力的测定

1、胞外黏多糖的提取分离

在20mL的发酵乳中加入10mL2％(w/v)的氯化钠溶液，混合均匀。用高速冷冻离心机离心，离心条件为：离心力15,000×g，温度4℃，时间20min；取上清液，向上清液中加入15％(m/v)的三氯乙酸，静置10min左右离心，离心条件为：离心力25000×g，温度4℃，时间20min；弃去沉淀，将上清液pH调为中性，向上清液中加入两倍体积无水乙醇，并将该混合液置于4℃静置过夜离心，离心条件为：离心力6,000×g，温度4℃，时间30min，此时得到的沉淀即为粗多糖。使用真空干燥机-40℃下干燥至恒重。将提取的粗多糖用去离子水溶解并定容至100ml，待测。

2、采用苯酚-硫酸比色法对胞外黏多糖产量的测定

葡萄糖标准曲线的绘制：准确称取葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，稀释定容至刻度。分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml葡萄糖母液，各以水补至2.0ml，然后加入6％苯酚1ml及浓硫酸5ml，静置10min，摇匀，室温放置20min，在490nm下测定其吸光值。2.0ml水按同样显色操作为空白，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，得到葡萄糖标准曲线，如图2所示。采用二元线性回归法得线性回归方程：y＝13.5981x+0.0048，相关系数R²＝0.9996。

样品测定：吸取样品1.0ml，按上述步骤操作，测定吸光值，根据标准曲线来计算样品中多糖的产量。测定结果表明H9菌株的胞外黏多糖产量达到583mg/L，属于产胞外黏多糖能力较强的菌株。

实施例3：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9肠胃耐受性检测

1、模拟肠胃液的配置(模拟胃肠液要现用现配)

模拟胃液的配置：首先用浓盐酸将0.5％NaCl(w/v)盐水pH值调至2.0，灭菌后将3.0g/l胃蛋白酶溶解到盐水中。

模拟肠液的配置：首先用0.1mol/lNaOH将含有0.3％(w/v)胆盐的0.5％NaCl(w/v)盐水pH值调至8.0，灭菌后将1.0g/l胰酶溶解到盐水中。

2、H9菌株对不同pH值胃液的耐受性

将培养16h的H9菌液60ml于4℃、转速8000rpm/min下离心10min，用灭菌的生理盐水洗涤两次，再用生理盐水重悬至30ml，并测定初始菌数。分别将5ml菌液加到25ml37℃pH值为2.0、3.0、4.0的模拟胃液中，充分混合10s，37℃培养。1、60、90、180min分别取1ml混合液测定H9菌数，以自然pH值胃蛋白酶溶液为对照，每个实验重复三次取算数平均值。H9菌株对不同pH值胃液的耐受性如表1所示。

表1H9菌株对不同pH值胃液的耐受性

注：标**表示同一时间点与对照组相比具有极显著性差异(P<0.01)

结果表明，当胃液pH值达到3.0以上时，H9菌株的活菌计数与对照相比没有显著性差异，并且随着消化时间的延长活菌数也没有显著性变化(P>0.05)。说明H9菌株可以耐受pH3.0以上的胃液环境，而在pH2.0的低酸环境下该菌株仍表现出了一定的耐受性。

3、H9菌株对不同胆盐浓度肠液的耐受性

将培养16h的H9菌液60ml于4℃、转速8000rpm/min下离心10min，用灭菌的生理盐水洗涤两次，再用生理盐水重悬至30ml，并测定初始菌数。

分别将5ml菌液加到25ml37℃胆盐浓度为0.1％、0.3％、0.5％的肠液中，充分混合10s，37℃培养。分别在1、60、120、240min取1ml混合液测定菌数，以不加胆盐肠液为对照，每个实验重复三次取算数平均值。测定结果如图3所示。

结果表明，当胆盐浓度为0.1％，消化1h时活菌数和对照相比略有降低，而后随着消化时间的延长，菌数并未出现显著减少。当胆盐浓度为0.3％和0.5％，消化1h时菌株存活率和对照相比有显著降低(P<0.05)，并且随着时间的延长，活菌数仍在继续减少，在4h消化结束时，胆盐浓度为0.3％和0.5％的肠液中的活菌数对数值分别为6.69和5.54，和对照相比分别减少了约1.8和3.0个对数值。说明，H9菌株对胆盐具有较好的耐受性。

实施例4：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9体外黏附Caco-2细胞特性研究

1、菌悬液的制备

H9菌株冻干菌粉菌悬液制备：将1.0g冻干菌粉(2.0×10¹¹CFU/g)重悬于100mlPBS溶液(pH7.2)中，充分摇匀，得10⁹CFU/ml的菌悬液。

2、Caco-2细胞的培养

Caco-2细胞在完全DMEM培养液中培养，于37℃，5％CO₂，95％湿度的二氧化碳培养箱中孵育培养，隔天更换培养液，每3d传代1次。单层Caco-2细胞以1×10⁵/ml的接种密度(1ml)接入加有灭菌载玻片的24孔细胞培养板中，于37℃，5％CO₂，95％湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞培养约14天后分化，这期间隔天换液。

3、不同孵育时间对H9菌株黏附Caco-2细胞的影响

黏附试验开始前1h，给单层细胞换不完全DMEM培养液(无双抗)，37℃培养1h后将不完全DMEM培养液吸出，用PBS溶液将贴壁细胞洗涤两次，然后加入0.5ml制备好的H9菌悬液和0.5ml不完全DMEM培养液(无双抗)，与Caco-2细胞37℃共培养0.5、1、1.5、2、2.5h后，用PBS溶液洗涤5次，用甲醇在室温下固定20min，去除甲醇后用PBS缓冲液洗3遍，自然风干，革兰氏染色，显微镜下随机选取20个视野，使用油镜观察，计数细胞上黏附的H9菌数，每个处理平行3孔，结果以每100个细胞上所黏附的细菌数表示，如图4所示。

结果表明，在1.5h内，随着与Caco-2细胞作用时间的延长，细胞上黏附的H9菌株数呈显著增加(P<0.05)，在1.5h后黏附的细菌数量则趋于稳定。表明H9菌株对Caco-2细胞的黏附作用在一定范围内存在着时间依赖关系，但在1.5h后基本达到平衡状态。说明H9菌株通过与Caco-2细胞表面受体结合，在一定时间和菌量条件下这种特异性结合达到饱和，从而使黏附趋于稳定。

4、不同外源物质对H9菌株黏附Caco-2细胞的影响

将在37℃培养16h的60mlH9菌液于4℃、转速8000rpm/min下离心10min，用PBS溶液(pH7.2)洗涤两次，然后用相同体积含有0.1、0.5、1.0、2.0mg/mlH9菌株胞外多糖的PBS缓冲液和8.5％脱脂乳重悬，得10⁹CFU/ml的菌悬液。用以上菌悬液进行黏附试验，以用PBS重悬的H9菌株液作为对照，同时检测H9菌株冻干粉中菌的黏附性，每个处理3个平行，结果如表2所示。

表2外源物质对H9菌株黏附Caco-2细胞的影响

注：标**表示对照组相比具有极显著性差异(P<0.01)

结果表明，当添加胞外多糖的浓度高于0.5mg/ml时，菌对细胞的黏附性随着多糖的浓度的升高而逐渐升高(P<0.01)，呈现出一定的量效关系，添加2.0mg/ml多糖时，和对照相比菌株的黏附性大约提高了2.2倍，说明本H9菌株具有一定黏附Caco-2细胞的能力。通过对冻干H9菌株菌粉的黏附性进行研究，发现冻干粉中菌体的黏附性与对照相比没有显著差异(P>0.05)，冻干并没有对菌体细胞表面造成重大伤害，表明H9菌株能够开发为发酵剂或益生菌制剂

实施例5：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9抑菌活性的检测

1、菌株的活化

将5％(v/v)的H9菌液、嗜酸乳杆菌ATCC4356菌液分别接入至MRS液体培养基和添加有碳酸钙的液体培养基中，将5％(v/v)的各指示菌菌液(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)接入营养琼脂液体培养基中，在37℃下静置培养18h。再将培养后的各菌液按上述体积比，重新接入新鲜培养基中。如此重复培养两到三次，将各菌株充分活化。

2、H9菌株的抑菌活性检测

取无菌平板并分为A、B、C三组，每板加入7mL45-50℃的MRS固体培养基，待凝固后，A、B组中各加3μL活化好的已知菌浓度(10⁹CFU/mL)的H9菌液和嗜酸乳杆菌ATCC4356菌液，涂成直径8mm的接种点，每板2个点；C组中加等量的经高压灭菌处理的MRS液体培养基并做同样的处理，待自然晾干后，将三组平板放入37℃恒温培养箱，培养24h使其长出菌斑。将200μL活化后的各指示菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌)加入7mL、45-50℃的营养琼脂固体培养基中，使其终浓度为10⁸CFU/mL，混匀后倒入上述已培养24h的平板上，37℃培养24h后，观察抑菌圈并记录和拍照。每个实验重复三次取算数平均值，结果如表3所示。

表3H9菌株对各指示菌的抑菌作用

注：表中数据为平均值±标准偏差，单位为cm。

结果表明，H9菌株和嗜酸乳杆菌ATCC4356对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有抑制作用，且H9菌株的抑制活性显著高于嗜酸乳杆菌ATCC4356，说明H9菌株的抑菌作用比较强烈。且H9菌株不产生细菌素，这表明其抑菌活性源于乳酸和菌体本身。

实施例6：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9降胆固醇的活性检测

1、胆固醇标准曲线的绘制

精确称量1mg胆固醇标品，用乙醇溶解，配成1mg/mL的胆固醇母液。再将母液稀释，得到0.1mg/mL的胆固醇标准溶液。分别取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL的胆固醇标准溶液置于10mL试管中，60℃水浴挥发尽溶剂后，加入2mL的显示剂(0.5mg/mL的邻苯二甲醛—冰醋酸溶液)，室温静置10min后，缓慢加入1mL浓硫酸，混匀，于90min内用可见光分光光度计测定其在550nm波长处的吸光值，用蒸馏水调零。以OD₅₅₀值为横坐标，胆固醇标准溶液的浓度为纵坐标，得到胆固醇标准曲线，如图5所示。

2、H9菌株降胆固醇的活性检测

将过夜培养的H9菌液以1％(v/v)的比例接入MRS液体培养基中，37℃培养18h后，8000g×10min×4℃离心，菌体用灭菌的生理盐水洗涤三次，并重悬于其中，121℃灭菌15min。再将灭菌后的死菌体与过夜培养的H9活菌体分别以1％的比例接入含终浓度为100ug/mL胆固醇的MRS液体培养基中，37℃培养24、48、72h后，8000g×10min×4℃离心，得上清液。以不添加菌体的含胆固醇的MRS液体培养基作阴性对照。

取4mL上清液于25mL的试管中，加入3mL无水乙醇和0.3mL33％(w/v)的氢氧化钾溶液，混匀，60℃水浴15min；冷却后，加入5mL正己烷，混匀，再加入3mL蒸馏水，混匀。静置15min，使溶液分层，取1mL正己烷层于10mL试管中，60℃水浴挥发尽溶剂，加显色剂2mL，静置10min后，加1mL浓硫酸，振荡混匀，10-90min内用可见光分光光度计测定其在550nm波长处的吸光值，以单独加显色剂和浓硫酸的处理组调零。测定结果如图6所示。

结果表明，无论是死菌体还是活菌体都有移除培养基中胆固醇的能力。显著性分析表明，活菌比死菌对胆固醇的降解率更高(p<0.05)。这表明，H9菌株可能是通过吸附或共沉淀机理来降解培养基中的胆固醇。

实施例7：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9降血压的活性检测

1、发酵上清液的制备：

将H9菌液以1％(v/v)的接种量转接到灭菌的10％(w/v)的脱脂乳中活化2-3次。然后再以4％(v/v)的接种量接入到10％(w/v)的脱脂乳中，37℃发酵24h得到发酵乳。制备好的发酵乳，在7000g×4℃的条件下离心10min，获得上清液，用5mol/L的NaOH调上清液的pH值为8.3，再在7000g×4℃的条件下离心15min，得上清液，将上清液冻干，得到含菌株代谢产物的上清液冻干粉。

2、菌株代谢产物的活性检测

精确称量适量的上清液冻干粉，并分别配成25、20、15、10、5mg/mL的样品溶液。将10μL样液(无抑制的反应中以蒸馏水代替)与100μL5mM的HHL溶液(用pH为8.3的硼酸缓冲溶液配制)混合，37℃共育10min，然后加入20μL0.1U的ACE酶液(用pH为8.3的硼酸缓冲溶液配制)，振荡混匀后置于37℃恒温水浴锅中反应1h，然后加入125μL1M的HCL溶液终止酶反应。将反应后的混合液过0.22μm的滤膜，再上HPLC的C18柱。洗脱程序为：20％的乙腈和80％的0.08％的乙酸溶液，等度洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为228nm，洗脱时间为15min，进样量为25μL。ACE抑制活性的计算公式为：

ACE抑制率(％)＝[(a-b)/a]×100，

式中，a表示以蒸馏水代替样品无抑制反应的峰面积；b表示添加了样品后的峰面积，测定结果如图7所示。结果表明，ACE抑制活性随菌株代谢产物浓度的增加而增高，经计算得菌株代谢产物ACE活性的IC₅₀值为11.667mg/mL。

实施例8：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9抗氧化的活性检测

1、完整细胞菌悬液和无细胞提取液的制备

称取1.0g副干酪乳杆菌H9冻干菌粉(实验室-20℃保存)接种到100mLMRS液体培养基中37℃培养12h，再以2％(v/v)的接种量接种活化一代(37℃培养6h)。活化两代后的菌液再以2％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，分为A、B两组，37℃静置培养14h。取A组培养液140mL，4400g×4℃离心10min后去除上清液，用PBS(0.85％NaCl，2.68mMKCl，10mMNa₂HPO₄,1.76mMKH₂PO₄)洗涤沉淀，用同样的条件离心，洗涤三次。得到的菌体分别悬浮至10⁹CFU/mL、10⁸CFU/mL、10⁷CFU/mL的浓度并振荡均匀即得到菌悬液。

取B组培养液140mL，4400g×4℃离心10min收获菌体，然后用去离子水洗涤细胞两次，超声破碎细胞(200W，20s每次，间隔时间10s，重复20次)。细胞碎片在10000g×4℃离心10min后除去，得到的上清液即为无细胞提取液。在制备细胞提取液之前，细胞总数分别调整到10⁹CFU/mL、10⁸CFU/mL、10⁷CFU/mL。

采取同样的方法处理标准菌株ATCC4356，得到ATCC4356菌株的不同浓度的菌悬液和无细胞提取液。并对两株菌的上述各浓度下的菌悬液分成两组，一组加热煮沸5min作灭活处理，另一组不处理，分别用于抗氧化能力测定。

2、胞外黏多糖的提取

20mL发酵乳中添加10mlL2％(w/v)的氯化钠溶液，混合均匀，15000g×4℃离心20min，取上清液，加入15％(m/v)三氯乙酸除残余蛋白质，静置10min左右，25000g×4℃离心20min；弃去沉淀，将上清液pH值调为中性，加入两倍体积无水乙醇，并将该混合液置于4℃静置过夜，6000g×4℃离心30min，此时得到的沉淀即为粗多糖。再使用真空干燥机-40℃下干燥，到恒重为止。精确称量，将其配成浓度为25,50,100,150,200mg/L溶液，用以测定DPPH自由基清除能力。

3、抗氧化活性测定

(1)DPPH自由基清除试验

取500μL完整细胞菌悬液和500μL无细胞提取液分别与500μL99.5％的乙醇、125μL含有0.02％DPPH的99.5％的乙醇混合均匀。混合物在黑暗中反应60min后，在8000g×4℃下离心5min得上清液，在517nm的波长下测定其吸光值，采用BHT(0.2mM)作为阳性对照。自由基清除率的计算方法如下：

DPPH自由基清除率(％)＝(A对照+A空白-A样品)/A对照×100％

对照组：500μL去离子水+500μL99.5％的乙醇和125μL含有0.02％DPPH的99.5％的乙醇。

样品组：500μL待测样品+500μL99.5％的乙醇和125μL含有0.02％DPPH的99.5％的乙醇。

空白组：500μL待测样品(完整细胞菌悬液和无细胞提取液)+500μL99.5％的乙醇和125μL99.5％的乙醇。

H9菌株自产的胞外多糖清除DPPH自由基能力的测定结果如图8所示。结果表明，H9菌株自产的胞外多糖清除DPPH自由基的能力随着胞外黏多糖浓度的升高呈上升趋势。VC和胞外多糖的浓度为200mg/L时，二者清除率分别达到70.8±0.6％和62.6±1.6％。

H9和ATCC4356菌株清除DPPH自由基能力的测定结果如图9所示。结果表明，H9菌株清除DPPH自由基的能力随着菌株浓度的升高而显著升高(p<0.05)。H9菌悬液和无细胞提取液在浓度为10⁹CFU/mL时对DPPH的清除能力达到最高，分别为55.0±1.7％和47.5±1.8％。同时煮沸后的菌株仍具有一定的抗氧化性。

(2)亚油酸氧化体系中抗氧化能力的测定

1.5mL的0.1M的钠盐磷酸缓冲液(pH7.0)和1.5mL的50mM亚油酸(溶于99.5％的乙醇)混合后加入2.0mL待测样品(完整细胞菌悬液和无细胞提取液)。BHT(0.2mM溶于甲醇)代替待测样品作为阳性对照。混合液在60℃下避光反应，时隔24h用硫氰酸铁法测定亚油酸的氧化程度。100μL反应液和4.5mL75％乙醇混合，然后加入30％的硫氰酸铵100μL，1M的HCl200μL、20mM的FeCl₂溶液(溶于3.5％的HCl)100μL，总反应液5mL，反应5min后颜色发生变化，说明亚油酸被氧化，8000g×4℃离心5min得上清液，在500nm波长下测定其吸光值。以磷酸缓冲液代替待测样品作为空白对照。

脂质过氧化抑制率＝(1－A₅₀₀样品/A₅₀₀空白)×100％

H9和ATCC4356菌株抑制脂质过氧化能力的测定结果如图10所示。结果表明，H9菌株抑制脂质过氧化的能力都随着菌液浓度的升高而显著升高(p<0.05)。H9菌悬液和无细胞提取液在浓度为10⁹CFU/mL时，抑制脂质过氧化的能力达到最高，分别为76.2±1.1％和70.0±0.4％。同时煮沸后的菌株后仍具有一定的抗氧化性。

实施例9：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9作为发酵剂在豆奶和牛奶混合发酵乳中发酵力和品质指标的研究

1、菌株的活化

称取1.0gH9冻干菌粉(实验室-20℃保存)接种到100ml灭菌的脱脂乳培养基中37℃培养至凝乳，再以2％的接种量接种活化下一代(37℃培养)，重复活化3次后得到活力稳定的H9菌株。

2、豆奶的制作

选取颗粒饱满表面光泽无霉变的大豆，用清水洗净，然后用去离子水浸泡(选取的大豆与去离子水的质量体积比为1:8，室温下浸泡10h)，然后用0.25％的NaHCO₃溶液浸泡3h，以钝化大豆中的脂肪酶，减轻豆腥味，将浸泡好的大豆磨浆去渣(采用90℃热水以防止脂肪氧化酶在氧气的存在下发生作用，但也要防止蛋白质变性)，收集大豆与水的质量比为1:8的豆浆，100℃煮沸10min(可以钝化脂肪酶，去除豆腥味)，然后在25Mpa的压力下均质两次，然后在95℃灭菌10min，将其冷却至37℃左右，水浴37℃保温，备用。

3、牛奶和豆奶混合发酵乳的制备

灭菌过的全脂牛奶，进行分装，在分装好的牛奶中分别添加0％、10％、20％、30％、40％、50％的灭菌过的豆奶，5％的接种量无菌接种H9菌株，置于37℃的恒温培养箱中发酵，监测发酵产品pH达到4.6时结束，取出后4℃冰箱放置24h后熟后测定产品的pH、滴定酸度、抑制脂质过氧化能力、产品中总活菌数、黏度、持水力，并且进行对六组产品进行感官评价作对比。

结果表明，随着豆乳添加量的增加酸乳的pH升高，可滴定酸度降低，说明豆乳的添加有效降低后熟过程中的酸化现象；添加量为30％时酸乳黏度最高，此时酸乳持水力最好，且产品具有良好的质地口感，并产生了令人愉悦的豆香味。

实施例10：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)H9作为生物保鲜剂在鱼肉保鲜中的应用

将鲜购的35条活鱼敲死后，去鳞、鳃、内脏，洗净沥干。沿脊椎剖为两半，取鱼背脊部肌肉切成8.0×6.0cm的鱼段，每段60.0±2.0g。将80片鱼段均分为以下五组，C组：不做任何处理，H组：涂抹H9菌体，M组：海藻酸钠单独涂膜处理，HM组：涂抹H9菌体后再用海藻酸钠涂膜处理，HSM组：涂抹含有H9菌体的发酵液(pH3.70)后再用海藻酸钠涂膜处理。上述五组中，涂抹的H9菌体浓度为10⁷CFU/g，处理2min。涂膜处理，先在1％(m/v)的海藻酸钠溶液中浸泡1min，然后在1％(m/v)的CaCl₂溶液中胶化2min，捞出，用灭菌水清洗残留CaCl₂，沥干。所有的样品都单独装入塑料保鲜袋中，密封，置于4℃恒温箱中贮藏，在贮藏的0，3，7，11，15d时，每组中随机取三片鱼段对感官品质、TVB-N含量、pH值、TAB值、菌落总数各指标进行分析。

结果表明，先涂抹H9菌株后用海藻酸钠涂膜处理的鱼肉比单一涂膜组鱼肉的前期保鲜效果要好。其在感官、菌落总数、TBA等指标上显著优于对照组。先涂抹含有H9菌体的发酵液(pH3.70)再用海藻酸钠涂膜处理鱼肉的保鲜效果最好。其各鲜度指标除TBA值外皆要显著优于对照组和M组，其保鲜期可长达7d，比对照组延长4d，且其TVB-N值一直属于一级鲜度范围。这是因为H9菌株及其发酵所产生的乳酸具有抑菌作用，而且Ca²⁺与海藻酸钠可以形成薄膜起到隔绝作用。

Claims (13)

1.一种副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌菌株为H9，分类命名为Lactobacillusparacasei，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCCNo.4780。

2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌的16SrDNA基因序列如SEQIDNo.1所示。

3.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，生物学特性为：菌株在MRS琼脂培养基上37℃培养48h，菌株生长良好，菌落为乳白色圆形，菌落直径为0.5～1.0mm，菌落边缘整齐、有凸起；该菌株革兰氏染色呈阳性，显微镜下细胞形态多为短杆状，且倾向于成链，无鞭毛，不运动。

4.根据权利要求1-3任意一项所述副干酪乳杆菌，其特征在于，所述的副干酪乳杆菌能够产生胞外黏多糖。

5.权利要求4所述的副干酪乳杆菌及其自产的胞外黏多糖在抗氧化方面的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的副干酪乳杆菌及其自产的胞外黏多糖在易氧化食品、保健品、发酵饮料、宠物食品中提高其抗氧化作用的应用。

7.权利要求1-3任意一项所述副干酪乳杆菌在作为益生菌方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述副干酪乳杆菌单独或与其他益生菌株复合在制备益生菌胶囊、益生菌菌片、益生菌冲剂、益生菌发酵制品方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的其他益生菌为保加利亚乳杆菌、嗜热乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌中的一种及一种以上。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述益生菌发酵制品为益生菌酸奶及其饮料、益生菌豆奶及其饮料。

11.权利要求1-3任意一项所述副干酪乳杆菌在抑菌作用方面的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述副干酪乳杆菌在制备生物保鲜剂、天然食品防腐剂和饲料添加剂中的应用。

13.权利要求1-3任意一项所述的副干酪乳杆菌的综合应用，其特征在于，将所述的副干酪乳杆菌的抑菌、抗氧化活性和作为益生菌中的两种或两种以上在食品、药物组合物、保健品、发酵剂、发酵饮料、动物饲料、宠物食品中的应用。