CN114929852A - 新颖的乳酸菌菌株、由所述菌株产生的抗菌肽和相关药物组合物 - Google Patents

新颖的乳酸菌菌株、由所述菌株产生的抗菌肽和相关药物组合物 Download PDF

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CN114929852A CN202080050702.4A CN202080050702A CN114929852A CN 114929852 A CN114929852 A CN 114929852A CN 202080050702 A CN202080050702 A CN 202080050702A CN 114929852 A CN114929852 A CN 114929852A
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Abstract

本发明涉及以保藏号CNCM I‑5369保藏在CNCM的副干酪乳杆菌菌株。本发明还涉及具有以下序列的肽的混合物：(SEQ ID NO 1)、(SEQ ID NO 2)、(SEQ ID NO 3)、(SEQ ID NO 4)和(SEQ ID NO 5)以及涉及上述肽之一与至少一种选自以下的组分的组合：‑精油，特别是薄荷精油、百里香精油、松树精油、薄荷醇、百里酚、蒎烯‑维生素C、甲酸、丙酸、柠檬酸、山梨酸和乳酸和/或‑可以负载活性成分的纳米颗粒。

Description

新颖的乳酸菌菌株、由所述菌株产生的抗菌肽和相关药物组 合物
技术领域
本发明涉及新颖的乳酸菌菌株和5种新颖的肽，这些新颖的肽具有抗生素/抗微生物特性，更特别地，具有针对大肠杆菌(E.coli)甚至针对大肠杆菌(E.coli)的粘菌素抗性菌株的抗微生物特性。
背景技术
称为抗菌素耐药性(AMR)的抗生素抗性已成为世界公认的危机。因此，尽快地且绝对地需要替代衰退和老化的抗生素的替代品。世界范围内动物生产中的抗生素消费正在稳步增长。最近，WHO建议合理使用“最不重要”的抗生素，以限制对人类健康的所谓“至关重要”的抗生素抗性的发展。此外，在2017年10月编辑的WHO报告中，为预防和减轻抗生素抗性的蔓延，向农业部门提出了以下建议：只能在兽医控制下对动物施用抗生素；抗生素不应用作生长促进剂或预防动物疾病；必须对动物进行疫苗接种，以减少对抗生素的需求，并使用这些药物的替代品(如果存在)；在动植物食品生产和加工的每个阶段推广和应用良好实践；通过改善动物卫生和健康来增加农场的生物安全，以避免感染。
目前考虑的替代方法包括更好地管理现有抗生素、改良其结构以提高活性以及寻找新的抗生素分子，例如所有生物体都会产生的抗微生物肽(AMP)(Nes,I.F.(2011).History,Current Knowledge,and Future Directions on Bacteriocin Research ofLactic Acid Bacteria[乳酸菌细菌素研究的历史、当前知识和未来方向].在DjamelDrider,Sylvie Rebuffat.编辑的Prokaryotic Antimicrobial Peptides:From Genes toApplication[原核抗微生物肽：从基因到应用].Springer[斯普林格].NY:3-12中)。由单细胞生物(尤其是细菌)产生的AMP包括脂肽(脂肽是非核糖体合成的次级代谢产物)以及由革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌以及在较低程度上由古细菌经核糖体合成的细菌素。乳酸菌产生的细菌素(LAB-细菌素)在很宽的pH值范围内具有热稳定性和活性。它们主要针对在系统发育上与产生细菌素的菌株相关的菌株有活性。然而，针对系统发育远距离菌株具有活性的LAB细菌素很少。值得注意的是，可产生具有针对革兰氏阴性杆菌(GNB)的活性的新细菌素的新菌株LAB(乳酸菌)的发现对于学术成就和见解是开创性的，对工业和生物医学应用具有重要意义。
由于缺乏治疗由多重药物抗性GNB引起的感染的治疗选择，使得粘菌素成为人类医学需要的终极手段型抗生素。然而，这种抗生素已大量用于兽药，来治疗造成重大经济损失的大肠杆菌病腹泻。粘菌素的使用是人类医学面临的一个主要问题，就像养殖中的兽医实践一样。尽管如此，细菌对粘菌素的抗性的鉴定，包括发现了第一个可转移的粘菌素抗性机制(mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4以及之后的mcr-5)(见Borowiak,M.,Fischer,J.,Hammerl,J.A.,Hendriksen,R.S.,Szabo,I.,Malorny,B.(2017)。然后，新颖的转座子相关磷酸乙醇胺转移酶基因mcr-5(其在d-酒石酸发酵肠沙门氏菌肠亚种乙型副伤寒血清变种(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Paratyphi B)中赋予粘菌素抗性)的鉴定(J Antimicrob Chemother[抗微生物化疗杂志].2017年12月1日；72(12):3317-3324.doi:10.1093/jac/dkx327)已引导欧洲机构重新评估粘菌素的风险状况。对此，欧洲疾病预防和控制中心(ECDC)最近发表了一份报告，建议限制动物部门使用粘菌素。进而，ANSES在其2016年10月的报告(n°2016-SA-0160)中建议加强抗生素的关键替代品，特别是在动物部门中用于治疗和/或群体预防的粘菌素的关键替代品。
US 8 470 583披露了保藏号为NRRL B-50314的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)菌株，其分泌细菌素。这种细菌素对一系列革兰氏阳性细菌具有抗细菌活性，包括但不限于单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和其他乳杆菌属物种。此外，这种细菌素对甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌具有活性。
开发抗生素分子以控制由GNB例如大肠杆菌(E.coli)引起的新发感染是人类医学和兽医学都非常关注的主题。
本发明的一个目的是提供新的乳酸菌菌株，该菌株能够产生具有满足细菌素标准的蛋白质性质的五种抗细菌/抗微生物肽。
本发明的另一个目的是提供能够防止或限制细菌粘附的新细菌菌株，粘附特别是大肠杆菌粘附在真核细胞上，真核细胞特别是人和/或猪的肠细胞。
本发明的一个目的是提供针对GNB菌株，特别是针对大肠杆菌菌株使用的新的抗细菌/抗微生物化合物。
本发明的另一个目的是提供可与粘菌素组合使用以减少施用的粘菌素的量或增强粘菌素的抗细菌活性的新化合物。
本发明的另一个目的是提供甚至针对粘菌素抗性菌株，特别是粘菌素抗性大肠杆菌菌株有效的新抗细菌化合物。
本发明的另一个目的是提供活性药物组合物以及具有非pH依赖性活性的药物。
本发明的另一个目的是提供药物组合物或新的抗细菌/抗微生物化合物，其产生细菌抗性的可能性很小。
本发明的另一个目的是提供没有细胞毒性，特别是对人和/或猪肠细胞没有细胞毒性的抗细菌化合物。
发明概要
本发明涉及以保藏号为CNCM I-5369的保藏在CNCM的副干酪乳杆菌ICVB411菌株及其变体和突变体，该副干酪乳杆菌ICVB411菌株及其变体和突变体能够产生至少一种根据权利要求2所述的肽。
副干酪乳杆菌ICVB411菌株在下文中也称为副干酪乳杆菌CNCM I-5369。
副干酪乳杆菌ICVB411(副干酪乳杆菌CNCM I-5369)能够产生五种新颖的细菌素。这些新颖的细菌素被合成并在培养物上清液中出现。它们被部分纯化并成功地针对一组大肠杆菌菌株，包括携带mcr-1基因的大肠杆菌进行了测试。此处提供的数据强调了LAB细菌素作为可用于治疗猪(特别是仔猪)大肠杆菌感染的分子的潜力。本发明将提供一个机会，以从集约化养殖中限制甚至消除抗生素(特别是粘菌素)，以及用由副干酪乳杆菌CNCM I-5369产生的细菌素替代它们。
发明内容
本发明还涉及选自以下的分离的肽：
-具有以下序列的肽：
Figure GDA0003624297090000041
Figure GDA0003624297090000042
和
-与上述序列SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 5具有至少90％(特别是至少95％)同一性并且具有抗细菌活性(特别是对大肠杆菌菌株的抗细菌活性)的肽。
根据本发明的肽的抗细菌/抗微生物机制尚不清楚。然而，大多数肽具有抗细菌/抗微生物活性，因为它们与细菌/微生物外膜的磷脂发生化学反应。换句话说，它们会破坏微生物/细菌的外膜。由于肽在进入微生物/细菌的外膜之前与微生物/细菌的外膜发生化学相互作用，因此它们不涉及微生物/细菌抗性。因此，本发明的肽和包含所述肽的药物组合物产生细菌/微生物抗性的可能性低。
本发明还涉及如上所述的分离的肽，其作为药物使用，特别是作为抗细菌或抗微生物药物使用，更特别是在有需要的哺乳动物中治疗大肠杆菌感染(特别是粘菌素抗性大肠杆菌菌株感染)中使用，所述哺乳动物特别选自猪、仔猪、家禽、牛、绵羊、山羊动物和人。
优选地，本发明涉及上述五种肽的混合物，其作为药物使用，特别是作为抗细菌或抗微生物药物使用，更特别是在有需要的哺乳动物中治疗大肠杆菌感染(特别是粘菌素抗性大肠杆菌菌株感染)中使用，所述哺乳动物特别选自猪、仔猪、家禽、牛、绵羊、山羊动物和人。
本发明还涉及药物组合物，其包含作为活性成分的至少一种根据权利要求2所述的肽，特别是具有序列SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 5的五种肽和/或根据权利要求1所述的菌株，和药学上可接受的赋形剂。
药学上可接受的赋形剂可以选自纯化水、乙醇、丙二醇、甘油、植物油、乳糖、山梨糖醇、淀粉、聚合物或在Handbook of Pharmaceutical Excipients[药物赋形剂手册]的第7版中描述的任何其他赋形剂(伦敦制药出版社(London Pharmaceutical Press)2012年)及其混合物。
有利地，赋形剂是水或水溶液。
有利地，药物组合物包含上述五种肽和至少一种上述赋形剂。
根据可与上述任一实施例组合的一个具体实施例，药物组合物包含作为活性成分的根据权利要求1所述的菌株的培养物的上清液或包含在所述上清液中，所述上清液任选地为经纯化的。上清液可以通过色谱法纯化，例如，特别是可以在反相C18上纯化并用含有20％体积乙腈的乙腈水溶液洗脱。上清液优选为无细胞上清液。它可以通过在24至30小时期间在37℃在培养基(例如MRS)中培养根据权利要求1所述的菌株而获得。
根据可与上述任一实施例组合的另一实施例，所述药物组合物的pH等于或大于4，或等于或小于5，特别地等于4.5。本发明的肽在如上所述的pH作为抗细菌剂或抗微生物剂并且特别针对抗大肠杆菌和粘菌素抗性大肠杆菌菌株是特别有效的。
根据可与上述任一实施例组合的另一实施例，本发明的药物组合物进一步包含作为活性成分的粘菌素和/或至少一种选自以下的组分：精油(特别是选自薄荷精油、百里香精油、松树精油、薄荷醇、百里酚、蒎烯)、维生素C、甲酸、丙酸、柠檬酸、山梨酸和乳酸。
本发明的五种肽中的每一种以及本发明的五种肽的混合物与粘菌素组合具有协同抗细菌作用。使用本发明的一种或多种肽与粘菌素(作为混合物)能够降低粘菌素的有效剂量。与不含粘菌素情况下单独使用本发明一种或多种肽的药理学活性剂量相比，粘菌素和至少一种本发明的肽(特别是本发明的五种肽)的混合物能够降低所述混合物的药理学活性剂量。
精油和酸也具有抗细菌活性，可用于提高上述药物组合物的抗细菌或抗微生物活性，或与至少一种本发明的肽(优选本发明的五种肽的混合物)，或者与粘菌素和至少一种本发明的肽(优选本发明的五种肽)的混合物获得协同效应。
根据可与上述任一实施例组合的另一实施例，本发明的药物组合物进一步包含纳米颗粒。使用纳米颗粒能够减少本发明的药物组合物的一种或多种活性成分的量。此外，发明人已经表明，无论药物组合物的pH值如何，负载有至少一种本发明的肽或有利地负载有本发明的五种肽的混合物的纳米颗粒作为抗细菌剂是有效的，尤其针对大肠杆菌菌株(甚至粘菌素抗性大肠杆菌菌株)是有效的。此外，纳米颗粒，特别是海藻酸钠纳米颗粒可以抵抗消化；因此，可以口服施用包含负载有至少一种本发明的肽并且优选负载有本发明的五种肽的混合物(例如上述上清液)的纳米颗粒的药物组合物。
当本发明的五种肽的混合物(有利地是根据权利要求1所述的菌株的培养物的上清液)和如上所述的组分和/或粘菌素，特别是乳酸和/或百里酚和/或薄荷醇，负载在纳米颗粒(特别是海藻酸钠纳米颗粒)上时，情况亦是如此。
根据本发明，纳米颗粒不受限制。根据纳米颗粒的一个实施例，它们至少包含海藻酸盐纳米颗粒，特别是海藻酸钠纳米颗粒。优选地，包含在药物中的所有纳米颗粒都是海藻酸盐纳米颗粒，更特别是海藻酸钠纳米颗粒。
根据可与上述实施例组合的纳米颗粒的特定实施例，所述纳米颗粒的平均尺寸等于或大于115nm且等于或小于126nm，特别是等于118nm、120nm或124nm。纳米颗粒的这些尺寸使负载有活性成分的纳米颗粒作为抗细菌剂或抗微生物剂特别有活性。
根据一个实施例，所述纳米颗粒负载有根据权利要求2的所述五种肽中的至少一种，优选负载有所述五种肽的混合物，特别是负载有根据权利要求1所述的菌株的培养物的上清液。根据变形，纳米颗粒仅负载有作为药物活性成分的所述一种或多种肽。负载的纳米颗粒是药物活性成分。
根据另一个实施例，所述纳米颗粒负载有混合物，该混合物包含：
i)根据权利要求的所述五种肽中的至少一种，优选所述五种肽的混合物，特别是根据权利要求1所述的菌株的培养物的上清液；以及
ii)粘菌素和/或
iii)至少一种选自以下的组分：精油(特别是薄荷精油、百里香精油、松树精油、薄荷醇、百里酚、蒎烯)、维生素C、甲酸、丙酸、柠檬酸、山梨酸和乳酸。
无论药物组合物的pH值如何，负载有所述五种肽的混合物(优选如上所述的上清液)和如上所述的组分的纳米颗粒作为抗细菌剂是有效的。当如上所述的组分和/或粘菌素也负载在所述纳米颗粒中时，情况尤其如此。此外，这些负载的纳米颗粒抗消化，因此可以口服施用。这些类型的负载的纳米颗粒作为抗微生物剂或抗细菌剂是有效的，特别是针对大肠杆菌甚至粘菌素抗性大肠杆菌菌株是有效的。
药物组合物进一步可包含仅负载粘菌素和/或选自薄荷精油、百里香精油、松树精油、薄荷醇、百里酚、蒎烯、维生素C、甲酸、丙酸、柠檬酸、山梨酸和乳酸的组分作为药物活性化合物的纳米颗粒。未负载本发明的肽的纳米颗粒可以进一步提高本发明的药物组合物的效率。
纳米颗粒也可以负载有根据本发明的药物组合物。
在上述所有实施例中，所述纳米颗粒的负载重量等于或小于所述纳米颗粒重量的12.2％，特别是等于12％。
根据一个特定的实施例，药物组合物包含60μg/mL的所述至少一种肽，特别是60μg/mL的五种肽的混合物，特别是如上所述的上清液。
根据可与前述实施例组合的另一实施例，药物组合物包含粘菌素和至少一种本发明的肽的混合物。该混合物包含至少按重量计80％(包括80％)的至少一种本发明的肽，特别是五种肽(优选上清液)和20％的粘菌素。根据一个具体实施例，粘菌素和所述一种或多种肽的混合物包含例如至少99％和99.2％的一种或多种肽(优选上清液)和1％或更少的粘菌素，优选0.8％的粘菌素。
根据另一个实施例，药物组合物按重量计含有0.2％-2％(包括0.2％和2％)的所述组分，其与所述一种或多种肽的量有关，特别是关于乳酸(1μg/mL)、薄荷醇(10μg/mL)或百里酚(10μg/mL)。优选组合如下：10μg/mL薄荷醇与50μg/mL的五种肽的混合物(所述上清液)组合；乳酸1μg/mL与60μg/mL的五种肽的混合物(即所述上清液)。这些值对大肠杆菌菌株产生了良好的结果。
根据可与前述实施例中的任一个组合的另一实施例，药物组合物包含负载有其重量的12％的所述五种肽的混合物(特别是所述上清液)或所述五种肽和所述组分的混合物的纳米颗粒。根据另一个实施例，纳米颗粒负载有按重量计12％的所述上清液的混合物和等于其重量的0.1％或0.2％的所述组分。关于乳酸，其量例如可以是纳米颗粒重量的0.2％。关于薄荷醇和百里酚，它们各自的量可以是按重量计从0.2％到6％(包括0.2％和6％)，特别是2％或4％。百里酚和薄荷醇的混合物可以以按重量计4％的量使用，以获得良好的抗细菌结果。在所有情况下，纳米颗粒优选为海藻酸盐纳米颗粒，更优选为海藻酸钠纳米颗粒。
根据本发明的药物组合物中活性成分的量取决于要治疗的哺乳动物和要杀死的菌株。本领域技术人员能够确定本发明的药物组合物中所含活性成分的有效量。
根据可具有上述特征的特定实施例，本发明涉及药物组合物，其包含以下物质作为活性成分：选自具有以下序列的肽的分离的肽：
Figure GDA0003624297090000081
Figure GDA0003624297090000082
和至少一种选自以下的组分：
-精油，特别是薄荷精油、百里香精油、松树精油、薄荷醇、百里酚、蒎烯，
-维生素C、甲酸、丙酸、柠檬酸、山梨酸和乳酸；和/或
-可以负载所述活性成分的纳米颗粒。
根据该特定实施例，纳米颗粒可以至少包含海藻酸盐纳米颗粒，特别是海藻酸钠纳米颗粒，或者所述纳米颗粒由海藻酸钠纳米颗粒组成。
根据该实施例，所述纳米颗粒的平均尺寸等于或大于115nm且等于或小于126nm，特别是等于118nm、120nm或124nm。
进一步地，根据该实施例，所述纳米颗粒的负载重量等于或小于所述纳米颗粒重量的12.2％，特别是等于12％。
本发明还涉及以保藏号CNCM I-5369保藏在CNCM的副干酪乳杆菌ICVB411，其作为药物使用。
本发明还涉及以保藏号CNCM I-5369保藏在CNCM的副干酪乳杆菌ICVB411，其作为抗氧化剂在治疗患有选自以下的疾病的患者中使用：急性和慢性病理病症，如心血管疾病、急性和慢性肾脏疾病、神经退行性疾病、黄斑变性、慢性阻塞性肺疾病、胆道疾病、糖尿病、癌症和衰老。
本发明还涉及以保藏号CNCM I-5369保藏在CNCM的副干酪乳杆菌ICVB411，其在治疗高胆固醇血症中使用，特别是在预防例如以下疾病中使用：中风、高血压、动脉粥样硬化、心血管疾病、黄瘤、癌症、肥胖症、糖尿病、神经退行性疾病、非酒精性脂肪肝疾病。
本发明还涉及以保藏号CNCM I-5369保藏在CNCM的副干酪乳杆菌ICVB411作为抗氧化剂的用途。本发明还涉及含有以保藏号CNCM I-5369保藏在CNCM的副干酪乳杆菌ICVB411或由其组成的防腐剂。例如，防腐剂可以是食品防腐剂、化妆品防腐剂、药物防腐剂或涂料防腐剂。
本发明还涉及一种产品，特别是含有以保藏号CNCM I-5369保藏在CNCM的副干酪乳杆菌ICVB411的液体产品。例如，该产品可以是食品、饮料、药物、化妆品、木材、生物样品或涂料。
药物组合物可以是溶液、凝胶、粉末、片剂或胶囊。优选配制成口服施用。然而，它也可以配制用于粘膜(例如，舌下或通过吸入)、局部、皮内、静脉内或肌肉内施用。
定义
术语“粘菌素抗性大肠杆菌菌株”是指具有最小抑制浓度(MIC)>2μg/mL和/或携带与粘菌素抗性有关的基因的大肠杆菌菌株，特别是指携带mrc-1基因的菌株。
术语“治疗”是指预防性和治疗性治疗。
术语“抗细菌”特别与针对GNB菌株的抗细菌活性有关。
术语“负载有……的纳米颗粒”或“X负载在纳米颗粒中”是指包含吸附在其外表面上的化合物或化合物的混合物的纳米颗粒。然而，例如，当所述纳米颗粒是多孔的时，化合物或混合物也可以吸附在纳米颗粒的内表面上。
术语“本发明的肽的混合物”优选是指如上所述的上清液，更优选是指纯化的上清液(E20也称为E20级分)。
术语“……％同一性”涉及在要比较的序列中相对于参考序列相同的氨基酸残基的百分比。要比较的序列相对于参考序列可以包括缺失、取代和/或插入。
附图说明
图1显示了副干酪乳杆菌CNCM I-5369培养上清液中抗大肠杆菌活性的动力学，以AU/mL表示(任意单位直方图)，其中在600nm处监测细菌生长的OD(灰色区域)；
图2显示了用E20级分处理的几种选择的大肠杆菌菌株的杀伤曲线(或存活曲线)；
图3显示了副干酪乳杆菌CNCM I-5369和E20级分对IPEC-1细胞的细胞毒性；
图4是Alg NP(海藻酸钠纳米颗粒)的SEM图像。
图5a和5b显示了水中Alg NP(500μg.mL-1)的DLS(尺寸大小分布)和ζ电位分布测量值；
图6描绘了Alg NP的热行为，显示了根据温度(℃)的不同重量损失；
图7显示了吸附在海藻酸盐纳米颗粒(500μg/mL)上/内的粘菌素量(μg/mL)的量化(粘菌素μg/mL相比于粘菌素质量/海藻酸盐纳米颗粒质量×100)；
图8至图11显示了关于Alg NP对几种细胞系的细胞毒性的结果；术语“肽”是指E20级分，“海藻酸盐”是指Alg NP；
图12显示了通过用Bagel 3在线软件获得的通过对副干酪乳杆菌CNCM I-5369基因组分析的可能编码细菌素的开放阅读框(orf：Open Reading Frame)；
图13显示了仔猪体外消化模型的静态过程不同隔室中副干酪乳杆菌CNCM I-5369细胞的数量：在口腔(初始接种物/对照)、胃和十二指肠中，每个隔室中pH值变化的影响(黑条)或pH值变化与酶和胆汁相组合的影响(在模拟十二指肠隔室中添加了胆汁)(深灰色条)。在消化的每个步骤中取样，并在琼脂培养基上测定CFU/mL的数值。数据以倾倒在Caco-2汇合单层细胞上的总酵母细胞的百分比表示。值是一式三份的平均值±SD。使用XL-STAT软件进行统计分析。使用带有Tukey事后分析的单向ANOVA，具有不同字母的柱具有显著差异(P<0.05)；
图14显示了Caco-2在用几种乳杆菌菌株以1/10或1/100(Caco2/乳杆菌)细胞比例的MOI和稀释的E20级分处理24小时后的存活百分比。在类似条件下，使用0.01％的TritonX100洗涤剂作为阳性测试。值是三个独立测量值的平均值±SD。使用XL-STAT软件进行统计分析。使用带有Tukey事后分析的单向ANOVA，具有不同字母的柱具有显著差异(P<0.05)；以及
图15显示了大肠杆菌184菌株对以下的粘附百分比：A)Caco-2单层细胞；B)IPEC-1单层细胞；单独(白色)，或在存在副干酪乳杆菌CNCM I-5369(bac+)菌株(黑色)或存在副干酪乳杆菌FB1(bac-)菌株(灰色)的情况下的竞争和排除测定。值是三个独立测量值的平均值±SD。使用XL-STAT软件进行统计分析。使用带有Tukey事后分析的单向ANOVA，具有不同字母的柱具有显著差异(P<0.05)。
实验结果
1.Alatig奶酪中乳酸菌的分离和纯化
菌株干酪乳杆菌ICVB411(以保藏号CNCM I-5369保藏在CNCM)是从名为Alatig奶酪的传统阿尔及利亚乳制品中分离出来的。首先，该菌株通过产生具有蛋白质性质的一种或多种抑制性化合物显示出针对大肠杆菌菌株的拮抗作用。将干酪乳杆菌CNCM I-5369在MRS培养基上生长后，再通过离心(8,000g，4℃，10分钟)获得的培养物上清液中发现这种/这些抑制性化合物(de Man等人1960)。尽管如此，这种抗大肠杆菌活性仅在低pH值下，包括在4和5之间观察到。
将10g手工干酪“Alatig”溶解并均匀分散在90mL消过毒的无菌生理盐水中。然后，从这种稀释的奶酪中取出一滴，并在MRS琼脂(利飞驰公司(Liofilchem)，意大利)上表面接种，然后在30℃孵育48小时。该步骤进行了两次。第一次使用调节至pH 6.5的MRS琼脂(利飞驰公司，意大利)，第二次使用经0.1M HCl调节至pH 5.4的MRS琼脂。
分离的菌株的纯化是通过在MRS琼脂上连续继代培养菌落来完成的。在30℃将孵育进行48小时。这些菌株的纯度通过琼脂上具有相同形态(包括相同外观、相同颜色、相同大小和相同形状)的质地均匀的菌落的存在来确认。使用革兰氏染色确认分离的菌株的纯度。没有过氧化氢酶活性的革兰氏阳性菌被推定为LAB。它们在4℃储存在MRS液体培养基(博尔卡公司(Biokar)，法国)中。
2.分离的菌株的抗细菌活性
针对不同的目标生物(其中有大肠杆菌)，对从Alatig干酪中分离的菌株的抗细菌活性进行了测试。因此，在9mL MRS液体培养基中接种1mL的测试菌株18小时新鲜培养物，并在37℃孵育18小时。然后，用2％的该预培养物(含有108CFU/mL)接种250mL MRS液体培养基，并在37℃孵育18小时。通过离心(12000g，30分钟，4℃)去除细胞。所得上清液通过0.22μm硝酸纤维素膜(密理博公司(Millipore Corp.),贝德福德(Bedford),马萨诸塞州,美国)过滤除菌。
用孔扩散法在Muller Hinton琼脂(默克公司(Merck))上测试粗上清液的抗细菌活性(Batdorj,B.,Dalgalarrondo,M.,Choiset,Y.,Pedroche,J.,Métro,F.,Prévost,H.,Chobert,J.M.,Haertlé,T.(2006).“Purification and characterization of twobacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from Mongolian airag[从蒙古airag中分离的乳酸菌产生的两种细菌素的纯化和鉴定]”Journal of AppliedChemistry[应用化学杂志]https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2006.02966.x)。由此，皮氏培养皿以107CFU/mL接种目标菌株(大肠杆菌或金黄色葡萄球菌)的24小时培养物。皮氏培养皿在室温干燥15分钟。然后，在琼脂中制作直径为6mm、深为4mm的孔。接下来，将100μL天然pH(pH 4.5)和中性pH(用1M NaOH溶液中和至pH 7.0)的粗上清液放置在孔中。将经调节至相同pH值并通过过滤除菌的100μL MRS培养基的等分试样用作阴性对照。将培养皿在4℃预孵育2小时以停止目标菌株的生长并允许抑制剂在琼脂中扩散，然后在37℃孵育24小时。在这段孵育期后，通过测量孔周围抑菌圈的直径来评估抗细菌活性。
在天然pH值，所有测试菌株都具有针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株的抗细菌活性，表现出不同直径的抑菌圈。记录的最高抑菌圈是直径约17mm的晕圈，选择负责该活性的菌株并进一步鉴定。
重要的是，当上清液被中和时没有检测到抗细菌活性，表明有机酸可能在这种拮抗作用中起作用。在这方面，不同的研究报告了乳杆菌通过有机酸以外的一种或多种抑制性化合物的抑制潜力，最常见的是具有蛋白质性质的抑制性化合物，并且从pH 2到pH 6观察到其稳定性(Drider,D.,Rebuffat,S.(2011).“Prokaryotic Antimicrobial Peptides:From Genes to Application[原核抗菌肽：从基因到应用]”编辑.斯普林格.纽约第451页))。其他研究表明LAB(乳酸菌)能够产生抑制性化合物，其具有蛋白质性质并且具有在酸性pH的完全活性，在中性pH的部分活性(Mortvedt-Abildgaa,C.,Nissen-Meyer,J.,Jelle,B.,Grenov,B.,Skaugen,M.,Nes,I.F.(1995).“Production and pH-DependentBactericidal Activity of Lactocin S,a Lantibiotic from Lactobacillus sake L45[来自清酒乳杆菌L45的羊毛硫细菌素Lactocin S的生产和pH依赖性杀细菌活性]”；Houlihan AJ1,Mantovani HC,Russell JB.(2004).“Effect of pH on the activity ofbovicin HC5,a bacteriocin from Streptococcus bovis HC5[pH对来自牛链球菌HC5的细菌素bovicin HC5活性的影响]”FEMS Microbiol Lett.[FEMS微生物学通讯]2004)。上清液在中性pH的抗细菌活性的丧失并不排除有机酸以外的其他活性物质的存在，并且其在酸性pH具有活性。该假设通过测试用5M HCl调整到与上清液(pH 4.5)相同的pH的MRS培养基得到证实。事实上，没有针对大肠杆菌的抗细菌活性记录。
3最高拮抗性LAB菌株的表型鉴定
使用制造商的建议，通过
Figure GDA0003624297090000131
50CHL套组(bioMérieux,Marcy l'Etoile,法国)鉴定了最具活性的菌株。制备来自生产菌株的在MRS琼脂上在37℃培养24小时后的几个相同菌落的细菌悬浮液并且在“API 50CHL培养基”中稀释，直到在600nm处达到0.45(不透明度等于2McFarland)的吸光度。均匀化后，接种的API 50CHL培养基分布在套组的小管中。必要时用无菌石蜡油覆盖杯子以避免可能的气体释放。套组在37℃孵育48小时。孵育后，使用ApiWebTM在线软件(https://apiweb.biomerieux.com)分析获得的生化谱。
分析了表现最佳的菌株对构成API 50CHL套组的49种碳水化合物的发酵能力。阳性结果对应于pH指示剂的黄色转变：溴甲酚紫色(由于测试的糖的发酵导致培养基酸化)，七叶甙小管除外，如果结果为阳性，它会变成黑色。
该谱通过Identax细菌鉴定系统软件(www.identax.org)进行分析。基于该分析，获得的结果表明生产菌株与副干酪乳杆菌具有99.52％的同源性。
4.蛋白酶和脂肪酶对抗细菌活性的影响
在最佳条件下测试不同酶对上清液的抗细菌活性的影响。因此，将上清液的100μL等分试样与100μL酶溶液混合然后通过过滤除菌，该酶溶液在0.05M缓冲液中以2mg/mL的浓度并以每种酶的适当pH制备。使用的酶及其操作条件列于下表1中。表1显示了使用的酶及其操作条件。
表1
Figure GDA0003624297090000141
在37℃孵育2小时后，将样品在水浴中煮3分钟然后立即冷却至4℃，以灭活酶。通过孔扩散法测试这些样品(调节至pH 5(使用1M NaOH或1M HCl)，过滤除菌并浓缩至约100μL)对大肠杆菌ATCC8739和大肠杆菌184的残留抗细菌活性。在类似条件下处理的无菌MRS液体培养基样品用作阴性对照。
LAB菌株产生的一种或多种活性抗细菌化合物的性质是通过孔扩散法得到的酶处理后的剩余活性而确定的。与未处理的对照显示的抑菌圈直径(17mm)相比，如果蛋白水解酶诱导相关活性的丧失，则抗细菌活性归因于蛋白质化合物。观察到用胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶处理的上清液的部分活性丧失；用这些酶处理的样品的抑菌圈直径减小，平均抑菌圈分别等于8.16、10.16和8.83mm，从而揭示了这种活性丧失。此外，用木瓜蛋白酶和蛋白酶K处理后抗细菌活性完全丧失。这些结果表明抗细菌活性不是由于过氧化氢或任何脂质或多糖性质的物质，而是很可能归因于蛋白质物质(见表2)。事实上，与副干酪乳杆菌相关的抗细菌活性至少是但不全是细菌素。该菌株在巴斯德培养物保藏中心以保藏号CNCM I-5369注册并保藏。表2显示了酶和pH值对副干酪乳杆菌CNCM I-5369培养上清液的抗大肠杆菌活性的影响。
表2
Figure GDA0003624297090000151
5.副干酪乳杆菌I-CNCM 5369(LAB菌株)产生的一种或多种细菌素在热处理和储存过程后的稳定性
通过离心(8000g，4℃，10分钟)从副干酪乳杆菌I-CNCM 5369的新鲜培养物中获得的上清液在80℃、90℃和100℃热处理5、10、15、20、30、60和120分钟。通过孔扩散法测定的抗细菌活性在80℃和90℃热处理5分钟后保持不变，但在100℃下则没有保持不变。其次，影响似乎是温度依赖性的，并且活性随着时间的推移而降低(表3)。表3显示了经热处理的副干酪乳杆菌CNCM I-5369培养物上清液的活性的结果。
表3
Figure GDA0003624297090000152
Figure GDA0003624297090000161
-：无抑制；+/-：0至1mm；+：1至3mm；++：3至6mm；+++：>6mm
在冷藏、冷冻和冻干条件下评估了副干酪乳杆菌I-CNCM 5369抗细菌活性(抗大肠杆菌)的稳定性。在4℃储存对干酪乳杆菌I-CNCM 5369的抗大肠杆菌活性几乎没有影响，因为以任意单位/mL(AU/mL)记录的总活性与新鲜制备的上清液相似。值得注意的是，该活性在4℃保持稳定，无论储存时间如何。然而，冷冻和冻干条件显著改变了这种活性，如表4所示。表4描述了副干酪乳杆菌I-CNCM 5369培养上清液在不同储存条件下的活性的结果。
表4
Figure GDA0003624297090000162
6.副干酪乳杆菌CNCM I-5369对推定的一种或多种抗大肠杆菌细菌素的生产的动力学
使用任意单位/mL(AU/mL)，在产细菌素菌株在37℃在MRS培养基中生长72小时后，评估了副干酪乳杆菌I-CNCM 5369对具有抗大肠杆菌活性的推定的一种或多种细菌素的生产的动力学。每隔一小时收集一次培养上清液，按照以下稀释比例在MRS培养基中连续稀释：1/2、1/4、1/8、1/16、1/32和1/64。将这些稀释的上清液中的每一个的50μL上样于半固体脑心浸液(BHI)培养基(含有1％琼脂)上，该培养基预先接种有指示菌株大肠杆菌184，其携带负责粘菌素抗性的mcr-1基因。皮氏培养皿在4℃孵育1小时，然后在37℃孵育18小时。然后以任意单位/毫升培养基(AU/mL)确定抗细菌活性。
同时，在相同的实验时间间隔内，使用分光光度计在600nm监测培养物的光密度，无菌MRS培养基作为空白。根据图1中描述的数据，推定的一种或多种细菌素的生产似乎与产细菌素菌株的细菌生长相关，因此在48小时的生长过程中逐渐增加。
7.从副干酪乳杆菌I-CNCM 5369的培养物上清液中纯化活性提取物E20级分
无细胞上清液(CFS)通过对副干酪乳杆菌I-CNCM 5369在MRS培养基中非振荡条件下在37℃培养24至30小时的培养物离心(8000g，10min，4℃)来获得。然后将40mL的获得的CFS加载到反相C18(安捷伦公司，美国)柱上。然后，用10％(v/v)乙腈进行洗涤步骤，再用40mL 20％(v/v)乙腈溶液洗脱，以洗脱活性级分。将活性级分使用SpeedVac干燥并以1:10重新悬浮在初始体积的超纯水中。所得活性溶液在全文中被指定为E20级分(或E20％，特别是在图中)。E20级分储存在4℃，用于不同的测试，以鉴定抗大肠杆菌活性。值得注意的是，针对一组具有不同基因型的大肠杆菌菌株测试了E20级分，以检查它们对包含在该级分中的推定的一种或多种细菌素的敏感性。该评估通过确定最小抑制浓度(MIC)值进行，该值范围为250至2000μg/mL(表5)。有趣的是，大肠杆菌184和ATCC8739菌株表现出相同的E20级分MIC值，而与参考菌株大肠杆菌ATCC8739相比，大肠杆菌184菌株的粘菌素MIC高四倍。表5显示了可归因于从副干酪乳杆菌I-CNCM 5369的培养物上清液中获得的E20级分针对一组大肠杆菌菌株的MIC值。
表5
Figure GDA0003624297090000171
Figure GDA0003624297090000181
8.杀细菌活性和杀伤曲线分析
测定了对三种大肠杆菌菌株的杀伤曲线，它们对粘菌素具有抗性或敏感性。这些菌株是大肠杆菌184(mcr-1)、对粘菌素具有抗性的大肠杆菌E4A4变体，以及对粘菌素敏感的参考菌株大肠杆菌ATCC8739(表5)。将这些菌株接种在含有抑制浓度的E20级分的半纯化级分的BHI(脑心浸液)培养基中。还测试了用抑制浓度的粘菌素(16μg/mL)处理的未经E20级分处理的大肠杆菌ATCC8739对照。将各种样品中培养基的pH调至4.5-5，样品在37℃孵育8小时。每隔一定时间，取样以确定在每个测试条件下菌落形成单位数量/mL(CFU/mL)。
如图2所示，孵育1小时后，用E20级分处理的菌株的CFU数量/mL迅速减少，没有可见的生长(0CFU/mL)。然而，大肠杆菌184在孵育2小时后表现出类似的行为。对于用粘菌素(16μg/mL)处理的大肠杆菌ATCC8739，在孵育1小时后获得了类似的数据。值得注意的是，用作对照的未经处理的菌株正如预期的那样，在整个实验过程中表现出正常的生长曲线(见图2)。
9.粘菌素和E20级分之间的协同相互作用
由副干酪乳杆菌I-CNCM 5369制备的E20级分在BHI培养基中进行一半稀释并与浓度范围为1至128μg/mL的粘菌素混合。所得配制品针对携带mcr-1基因的大肠杆菌184以及其他大肠杆菌菌株进行了测试(表6)。在37℃孵育过夜后，通过分光光度法在OD600nm检查大肠杆菌菌株的生长，并确定粘菌素/E20级分的新MIC值。重要的是，与单独使用粘菌素获得的MIC相比，E20级分与粘菌素的组合降低了MIC值至少四倍。事实上，在E20级分存在的情况下，从8μg/mL下降到2μg/mL。对于其他大肠杆菌菌株，也观察到了这种协同相互作用，其中MIC值对于大肠杆菌E4A4WT而言降低了两倍，对于大肠杆菌289而言降低了4倍，对于大肠杆菌E4A4变体而言降低了8倍。应该注意的是，大肠杆菌菌株ATCC8739、SBS36和TOP10没有显示抗生素的MIC值的任何降低(见表6)。表6显示了在不同大肠杆菌菌株上粘菌素单独和与E20级分组合获得的MIC值。E20级分+粘菌素的混合物的重量组成在MIC值旁边的括号中表示。第一个值是指以μg/mL为单位的粘菌素的量，而括号中的第二个值是指以μg/mL为单位的E20级分的量。
表6
Figure GDA0003624297090000191
根据表6的结果，含有至少99％的E20级分和1％的粘菌素的混合物在几种菌株甚至粘菌素抗性菌株中与单独使用粘菌素一样有效。此外，E20级分与粘菌素的组合能够减少E20级分的量和减少E20级分+粘菌素本身的混合物的量。
10.细胞毒性测定
E20级分的细胞毒性在体外对猪肠上皮细胞(IPEC-1)进行评估。因此，如下进行细胞毒性测定：使用在96孔组织培养板上在37℃、5％CO2环境下培养48至72小时的IPEC-1细胞，直到在每个孔的底部形成汇合的细胞培养物。从在MRS培养基中24至30小时的培养物收获的副干酪乳杆菌细胞I-CNCM 5369和半纯化的E20级分在不含抗生素和血清的DMEM(杜氏改良伊戈尔(Dulbecco′s Modified Eagle′s)培养基)培养基中分别稀释一百零四倍后进行测试。测试不含抗生素或血清的DMEM培养基作为对照。将含有用如前所述稀释的CFS和E20级分样品处理的IPEC-1细胞的培养板在37℃、5％CO2环境中孵育24小时。基于活性线粒体对四唑盐的还原的CCK-8测定(同仁分子技术公司(Dojindo Molecular Technologies)，日本)用于评估经处理的IPEC-1细胞的细胞生存力。每孔添加含7.5μL CCK-8试剂的150μLDMEM，并且将细胞孵育2小时。在酶标仪分光光度计(Xenius,萨法斯(Safas),摩纳哥(Monaco))中在450nm处读取培养板。结果以未处理的细胞观察到的基础生长的百分比表示(参见图3)。图3中的结果表明E20级分对猪肠上皮细胞(IPEC-1)没有毒性，因为用E20级分处理的IPEC-1细胞的存活％等于150％。
11.在海藻酸盐纳米颗粒上负载E20级分(Alg NP/E20)
A.海藻酸盐纳米颗粒(Alg NP)的制备及其鉴定
制备
使用具有成本效益的技术通过行星式球磨制备Alg NP。在该技术中，使用散装粉末海藻酸钠(西格玛奥德里奇公司，W201502)样品制备Alg NP。在室温在聚四氟乙烯(PTFE)小瓶(体积＝50mL)中使用2g海藻酸钠和13个硬化钢球(总重量＝112g；10个直径为10mm的球+3个直径为20mm的球)进行研磨。研磨过程持续10小时，转速为440rpm。在研磨过程结束时，将Alg NP收集并在25℃超声处理(BRANSON 2800，频率：40KHz)1小时后溶解在Milli-Q水(0.5mg/mL)中。
海藻酸盐纳米颗粒(0.5mg/mL)在+4℃可稳定超过3个月，没有任何明显的沉淀或聚集。
海藻酸盐纳米颗粒(Alg NP)的鉴定
使用不同的技术对Alg NP进行鉴定，例如动态光散射(DLS)、扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外(FTIR)光谱和热重分析(TGA)测量。
扫描电子显微镜(SEM)
通过ULTRA 55(蔡司公司(Zeiss)，法国)扫描电子显微镜(SEM)检查样品的形态。用于SEM分析的样品是通过以下来制备：将几滴Alg NP(500μg.mL-1)的水溶液上样于干净的硅基板上，然后在100℃蒸发1小时。结果如图4所示。
SEM分析显示纳米颗粒具有广泛的尺寸分布(50-200nm)。
动态光散射(DLS)测量
使用动态光散射原理(马尔文公司(Malvern)Zetasizer，NanoZS)在25℃测定合成的纳米复合物的流体动力学尺寸和表面电荷。溶液是在分析前新鲜制备的，报告的数据是三个独立测量的平均值。图5a中所示的DLS测量显示平均尺寸为118nm的纳米颗粒，其中在pH 7.2时的ζ电位为-32mV(在pH 5时，ζ电位为-12mV)(见图5b)，表明Alg NP带负电。
热重分析(TGA)
热重分析(TGA/DTG)在TG/DTG NETZSCH TG 209F3仪器上进行。通过加载10mg海藻酸盐纳米颗粒并使样品在氮气环境下以10℃/min的加热速率从30℃至980℃来记录热谱图。
图6描绘了Alg NP的热行为，显示了不同重量损失。第一次重量损失(<100℃)对应于纳米颗粒表面的水解吸。第二次急剧的重量损失发生在200℃到250℃之间，这可以归因于纳米颗粒的聚合物链的分解。此后，观察到稳定和连续的重量损失，在980℃时剩余质量<15％。
傅里叶变换红外(FTIR)光谱
傅里叶变换红外光谱(FTIR)在赛默飞世尔公司(Thermo Fisher Inc),Nicolet380上进行。样品以压片形式在IR辐射中进行分析，压片形式是通过将1mg Alg NP与100mg溴化钾(KBr)混合制成的。然后将混合物适当研磨以确保在KBr基质中均匀分布。最后，通过施加约7至9吨的压力，将研磨后的混合物在液压机中进行压制。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)进一步评估了Alg NP的化学组成。海藻酸钠前体的FTIR光谱包含羟基、醚和羧基官能团的特征振动带。3431cm-1处的宽而强的振动峰被指定为O-H键的伸缩振动。在2920和2850cm-1处观察到脂肪族C-H基团的伸缩振动。1625和1414cm-1处的带分别归因于羧酸盐离子的不对称和对称伸缩振动。1032cm-1处的峰归因于C-O振动。
Alg NP的FTIR光谱由相似的带组成，表明在使用球磨工艺形成纳米颗粒期间，海藻酸盐前体的化学组成和结构没有改变(结果未显示)。
海藻酸盐纳米颗粒/E20级分(Alg NP/E20)的鉴定
如表7所示，将E20级分负载到海藻酸盐纳米颗粒上对其尺寸没有太大影响。实际上，DLS测量结果显示，pH 7时Alg NP的平均尺寸为118nm，与pH 5时记录的120nm相当。在Alg NP上负载E20级分后观察到尺寸略有增加(4nm)，这是纳米颗粒表面上肽吸附的良好指示。结果由ζ电位测量证实。Alg NP的表面带负电(pH 7时为-32mV)和(pH 5时为-12mV)并在E20级分负载后变为中性。表7显示了在其表面负载E20级分之前和之后Alg NP的尺寸和表面电荷。
表7
尺寸(nm) 电荷(mV)
Alg-NP，pH 7 118 -32
Alg-NP，pH 5 120 -12
Alg-NP+E20，pH 5 124 -0.5
Alg-NP+E20，pH 5.4 124 0.0
确定Alg NP对E20级分的吸附能力
可以负载到Alg NP上的最大E20级分的量的确定是区分游离E20级分的活性与吸附在Alg NP上的E20级分的活性的重要参数。这已经根据在Alg NP上负载粘菌素获得的结果完成。使用HPLC评估吸附在Alg NP上的粘菌素的量。通过将Alg NP(以500μg/mL存在于水中)与粘菌素(20、40、50、60、80和100μg/mL)混合，并在室温超声处理60分钟，制备了AlgNP/粘菌素的不同溶液。每种混合物在室温使用8kDa膜透析24小时(每6小时更换一次水)，溶液中粘菌素的量通过HPLC确定。从图8中，我们可以得出结论，可吸附在500μg/mL Alg NP上的粘菌素最大值为60μg。这对应于按重量计12％。在整个研究中，我们使用总量为60μg的E20级分或E20级分+小分子(以下称为“组分”)和500μg/mL的Alg NP来研究不同配制品的抗细菌活性。
细胞毒性研究
体外评估了不同配制品(Alg NP、AlgNP+E20级分、Alg NP+E20级分+小分子)对人结肠癌(HT-29)和猪肠上皮细胞(IPEC-1)的细胞毒性。因此，如下进行细胞毒性测定：使用在96孔组织培养板上在37℃、5％CO2环境下培养48至72小时的HT-29和IPEC-1细胞系，直到在每个孔的底部形成汇合的细胞培养物。在不含抗生素和血清的DMEM(杜氏改良伊戈尔培养基)培养基中测试了不同的配制品和半纯化的E20级分。测试不含抗生素或血清的DMEM培养基作为对照。含有用如前所述的不同配制品处理的HT-29和IPEC-1细胞的培养板在37℃、5％CO2环境中孵育24小时。基于活性线粒体对四唑盐的还原的CCK-8测定(同仁分子技术公司，日本)用于评估经处理的HT-29或IPEC-1细胞的细胞生存力。每孔添加含7.5μL CCK-8试剂的150μL DMEM，并且将细胞孵育2小时。在酶标仪分光光度计(Xenius,萨法斯(Safas),摩纳哥(Monaco))中在450nm处读取培养板。结果以未处理的细胞观察到的基础生长的百分比表示(图8-11)。
图8-11中的结果表明，Alg NP对所研究的细胞系没有表现出任何明显的细胞毒性。同样，游离的E20级分(12％)以及负载在Alg纳米颗粒上的E20级分和E20级分+小分子对HT-29和IPEC-1细胞系没有明显的细胞毒性作用。
Alg NP与E20级分的组合的生物活性
海藻酸盐纳米颗粒(Alg Np)通过从粗到细的工艺(球磨)获得，并以500μg/mL的浓度使用。E20级分以60μg/mL的浓度与该悬浮液混合，这对应于所用Alg NP浓度的12％。通过添加乙酸将该混合物的pH调至5，并针对表8中列出的目标菌株进行测试。从表8中的结果可以看出，与单独使用E20级分所获得的活性相比，活性显著增加。为了深入了解海藻酸盐纳米颗粒的影响，还将粘菌素负载到Alg NP上，并针对相同的目标大肠杆菌菌株测试了所得配制品(粘菌素-Alg NP)。因此，与单独使用粘菌素相比，MIC值显著降低；这种影响对于表现出对粘菌素的抗性的大肠杆菌184和289菌株尤为显著(表8)。
此外，我们测试了乳酸以及薄荷醇和百里酚(精油)在2％的低浓度时的影响。关于MIC值，我们得出结论，包括有机酸和精油在内的这些分子可能是有意义的，并且它们与E20级分和粘菌素的组合值得研究。表8显示了基于Alg NP和不同分子的组合的不同配制品对大肠杆菌菌株的影响的结果。
表8
Figure GDA0003624297090000231
Figure GDA0003624297090000241
重要的是，归因于由副干酪乳杆菌I-CNCM 5369产生的E20级分的抗大肠杆菌活性是pH密切依赖性的。实际上，仅在pH 4.5至pH 5观察到活性。这种受限制的pH活性对于任何应用都会造成严重影响，因为在猪(主要是在断奶后的仔猪)的胃肠隔室中会遇到不同的pH值。
因此，在不同的pH值下测试了基于Alg NP/抗微生物剂单独或与精油或乳酸组合的配制品。
实际上，不同的配制品在pH值6和7进行测试，然后在pH 2孵育2小时，并在pH 5和pH 7再次测试，这对应于通过食道、胃和十二指肠期间遇到的pH值。其后显示出，当pH值高于pH 5时，测试的不同配制品的活性降低，其中在pH 6和7时的MIC值分别为16μg/mL和32μg/mL，而不是在pH值为5时的4μg/mL。然而，与按重量计0.2％的乳酸或按重量计2％或4％的薄荷醇精油或百里酚精油的组合允许将MIC值保持在2至4μg/mL，与pH值无关(见表9)。表9显示了pH对与E20级分和乳酸或精油联合的Alg NP对大肠杆菌184(mcr-1)菌株的拮抗活性的影响的结果。
表9
Figure GDA0003624297090000251
含有E20级分和与2％或4％精油(薄荷醇或百里酚)或0.2％乳酸联合的Alg NP的配制品在断奶后仔猪消化道中遇到的消化酶的连续作用。第一次孵育在存在胃蛋白酶(15U/mL)、pH 3、伴随振荡(140rpm)、39℃的条件下进行30min，然后在pH 6在类似温度和搅拌条件下进行第二次孵育，并且最后添加胰凝乳蛋白酶(5U/mL)和胰蛋白酶(40U/μL)，然后根据Zhong等人(参见Zhong,R.Z.,Xia,J.Q.,Sun,H.,Qin,G.X.(2017).Effects ofdifferent sources of protein on the growth performance,blood chemistry andpolypeptide profiles in the gastrointestinal tract digesta of newly weanedpiglets[不同来源蛋白质对新断奶仔猪的生长性能、血液化学和胃肠道消化物中多肽谱的影响].J Anim Physiol Anim Nutr[动物生理与动物营养杂志](Berl).2017年10月；101(5):e312-e322.doi:10.1111/jpn.12607)描述的条件在pH 6、伴随振荡(140rpm)、39℃下孵育2小时。
在pH 3且胃蛋白酶存在下进行的第一次孵育期间，Alg NP/E20级分和与乳酸联合的Alg NP/E20级分的MIC值分别从16μg/mL增加到32μg/mL和从2μg/mL增加到4μg/mL(表10)。然而，在存在按重量计2％或4％的精油时，记录的MIC值与未用酶处理但在类似的温度、搅拌和pH条件下孵育的配制品记录的值没有区别。
这些结果突出表明，E20级分、Alg NP和精油和/或乳酸的组合足够稳健地抵抗恶劣的模拟的仔猪胃肠环境，其特点是仔猪胃和小肠第一段中剧烈的pH条件、温度和消化酶的存在。表10总结了关于消化酶对基于与乳酸或精油联合的海藻酸盐纳米颗粒/E20级分的配制品针对大肠杆菌184(mcr-1)的拮抗活性的影响的结果。
表10
Figure GDA0003624297090000261
*孵育：39℃，140rpm；胃蛋白酶15U/mL；胰蛋白酶40U/μL；胰凝乳蛋白酶5U/mL
12.副干酪乳杆菌I-CNCM 5369基因组的计算机模拟分析
使用Bagel 3在线分析软件(bagel.molgenrug.nl)对副干酪乳杆菌I-CNCM 5369的基因组的计算机模拟分析鉴定了几个可能编码细菌素样蛋白的开放阅读框(图12)。使用Jpred软件(www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/)对从这些基因翻译的氨基酸序列进行进一步分析，可以鉴定预测大小为约3.2至12KDa的五种肽(表11)。
第一个鉴定的推定的细菌素的预测大小为3,199Da，有29个氨基酸，并具有II类细菌素的特征和5.17的pI。第二个和第三个推定的细菌素的预测大小为6,300和6,582Da，分别具有60和63个氨基酸。这两个肽的pI估计值分别为4.86和8.25，并且也属于II类细菌素。两个最大的开放阅读框可能编码大于10kDa的肽，其大于10,395和12,252Da，分别具有101和111个氨基酸。计算出的pI分别为8.62和6。这最后两个预测的肽也属于II类细菌素(表11显示了与由在线Bagel 3软件鉴定的开放阅读框(ORF)对应的潜在细菌素的氨基酸序列)。
表11
Figure GDA0003624297090000271
将编码推定的细菌素的每个orf克隆到适用于大肠杆菌感受态细胞的表达载体中。每个orf都克隆在诱导型T7启动子的控制下，并且His-标签(6His)尾位于N末端或C末端部分。在N末端或C末端位置具有His标签尾的每个orf的克隆产生了10个重组质粒。这些重组质粒中的每一个都被引入到大肠杆菌BL21(DE3)(plysS)感受态细胞中。成功转化的大肠杆菌在SOC培养基中在37℃下伴随160rpm振荡再生1小时，然后在补充了氨苄青霉素(100μgmL-1)和氯霉素(30μg mL-1)的Luria-Bertani(LB)琼脂培养基(西格玛奥德里奇公司)上选择。在37℃孵育过夜后，使用特异引物通过PCR检查在含有抗生素的LB琼脂培养基上获得的菌落中是否存在含有适当克隆的orf的重组质粒。
将含有每个重组质粒的大肠杆菌菌株BL21(DE3)(pLysS)的过夜培养物在含有氨苄青霉素(100μg mL-1)和氯霉素(30μg mL-1)的LB培养基中稀释至1％(vol/vol)，然后在37℃有氧生长。当在600nm的光密度达到0.8时，通过添加浓度为1mM的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(西格玛公司(Sigma))诱导基因表达。细胞再生长5小时，通过离心(8,000×g，10min，4℃)收获样品，并且在PBS缓冲液中洗涤后保留获得的细胞沉淀。然后将细胞沉淀重新悬浮在含有10mM咪唑(西格玛公司)的PBS缓冲液(pH 7.9)中。将细菌悬浮液超声处理5次，每次2分钟以干扰和裂解细胞。通过离心(14,000×g，15min，4℃)将细胞质可溶性部分(CSF)与细胞质不溶性部分和细胞碎片分离。CSF被过滤(0.45-μm孔径过滤器)，然后直接加载到1-mL镍His-Trap螯合柱(阿默沙姆生物科学公司(Amersham Biosciences))上。加载后，用含有30mM咪唑的PBS(pH 7.9)连续洗涤柱。用含有250mM咪唑的2mL PBS(pH 7.9)洗脱由克隆的带有His-标签的orf编码的肽。
然后使用乙酸将所得溶液的pH调节至5，然后评估其针对大肠杆菌粘菌素抗性菌株的活性(AU/mL)，如前所述。
结果表明，Ni-NTA柱上的所有重组纯化肽的浓度为约400至800AU/mL。有趣的是，N末端his标记的重组肽orf-38表现出比其C末端his标记的对应物更好的活性，分别为800和400AU/mL。
表12显示了通过在大肠杆菌BL21(DE3)(pLysS)中异源表达合成的重组肽的抗大肠杆菌活性(AU/mL)的结果。
表12
Figure GDA0003624297090000281
13.抗微生物琼脂扩散测试
通过琼脂扩散测试评估了针对一组革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抗细菌活性(表1)。用于抗细菌活性的无细胞上清液(CFS)是通过在MRS液体培养基中于37℃生长18-24小时的副干酪乳杆菌CNCM I-5369(8000g，10min，4℃)的过夜培养物的离心来获得。在42℃将指示菌株以1％(v/v)接种在融化的软1％BHI琼脂中后，将培养基倒入皮氏培养皿中并在层流罩下放置20min。然后在固化的BHI软琼脂中打孔，将50μl的调节至pH 4.5-5的CFS或E20级分倒入孔中。皮氏培养皿在室温、无菌条件下放置1小时，然后在适当温度孵育18小时。在这段时间之后，通过测量含有CFS或E20级分的孔周围的抑菌圈来检测抗细菌活性。
表13显示了来自副干酪乳杆菌I-CNCM 596的无细胞上清液(CFS)和E20级分的抗微生物活性。
表13
Figure GDA0003624297090000291
抑菌圈宽度“-：无活性；±：0到1mm；+：1到3mm；++：3到6mm”。
*ICV：法国里尔大学查尔斯维奥莱特研究所(Institut Charles Viollette,Universitéde Lille,France)
如表13所示，大多数革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌受到E20级分的影响，如明显的抑菌圈所示。CFS活性较低，但是测试的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌菌株明显被抑制，抑菌圈为1至3mm。
14.重组肽的抗微生物活性的量化
确定纯化的重组肽的抗微生物活性并以任意单位/毫升(AU/mL)表示。通过加入等体积(100μl)的每种肽并涡旋来获得重组肽的混合物。简而言之，将活性样品在超纯水中根据以下稀释比例连续稀释：1/2、1/4、1/8、1/16、1/32和1/64，并使用乙酸将其pH调节至pH4.5-5。之后，将10μL的稀释的上清液上样于预先接种有用作指示菌株(mcr-1+)的大肠杆菌184的1％BHI培养基琼脂上。将板在4℃孵育1小时，然后在37℃孵育18小时。以AU/mL表示的抗细菌活性定义为导致指示菌株被抑制的最高稀释度的倒数(2n)。AU/mL定义为2n×100μL/上样体积(μL)。
表14显示了联合重组肽针对大肠杆菌184的抗微生物活性。
表14
Figure GDA0003624297090000301
每种纯化的重组肽均显示出200至400AU/ml的抗微生物活性，而五种重组肽的混合物表现出的抗微生物活性为800AU/ml。
15.副干酪乳杆菌CNCM I-5369对仔猪中模拟胃肠道条件的抗性
仔猪的静态体外消化模型用于评估副干酪乳杆菌CNCM I-5369的针对这样的条件的生存力。
实际上，该模型再现了参与仔猪胃肠道(GI)环境消化过程的参数，例如温度、pH、胆汁盐浓度和酶。值得注意的是，还平行研究了pH变化的影响。使用模拟每个步骤和隔室的生理条件的流体来模拟消化的口腔、胃和小肠步骤。在37℃在MRS培养基中培养18至24小时后，通过离心(8,000g，4℃，10min)收集乳杆菌细胞。细胞沉淀在体积足够的PBS缓冲液中洗涤两次。口腔步骤再现口腔条件，其中将pH调整为6.8至7，在140rpm、39℃下搅拌5分钟。之后，通过添加含有15U/mL猪胃蛋白酶(西格玛奥德里奇公司)的胃液(pH 3-3.5)模拟胃步骤。这个30min的步骤是在与前一步骤类似的温度和搅拌条件下进行的(39℃，140rpm)。然后，将1M NaOH溶液添加到这批样品中以将溶液pH升高至pH 6，停止胃蛋白酶消化并模拟从胃到十二指肠隔室的过程。十二指肠阶段包括添加胰酶(胰蛋白酶40U/μL；胰凝乳蛋白酶5U/mL)(西格玛奥德里奇公司)和胆汁(60g/L)(西格玛奥德里奇公司)。然后在pH 6(39℃，140rpm)进行肠道消化过程超过2小时。在该模拟消化过程的每个步骤之后，收集乳杆菌细胞样品并在盐水缓冲液中稀释。然后将100μL的足够的稀释液铺在MRS琼脂板上，并在37℃孵育18至24小时以使其充分生长。确定菌落形成单位(CFU)的数量/毫升。统计分析.数据表示为经三个独立实验计算的平均值±标准误差。使用单向ANOVA和事后Tukey检验(P<0.05)使用XL-STAT(Addinsoft公司,波尔多(Bordeaux),法国)进行统计显著性分析。
得到的结果如图13所示。总的来说，这些数据表明副干酪乳杆菌CNCM I-5369对仔猪模拟消化过程中发生的条件具有良好的抵抗力。消化过程开始时为约1010CFU/mL的活细菌细胞初始数量减少了2到3个对数。这种减少很可能归因于pH变化。这在胃隔室中是值得注意的。
16.细胞毒性测定
副干酪乳杆菌CNCM I-5369的安全性和E20级分的安全性使用结晶紫(西格玛奥德里奇公司)染色测定对Caco-2细胞人结直肠腺癌细胞进行体外评估。Caco-2细胞以6×104个细胞/孔的密度接种在96孔细胞培养板中，并预孵育7天。在PBS中制备过夜乳杆菌培养物和E20级分，然后针对Caco-2/乳杆菌和稀释的E20级分4×和8×(×＝倍)以MOI(感染复数)1:10和1:100的比例施加到汇合的Caco-2单层细胞上。孵育后，去除培养基并用PBS洗涤细胞2次，再与150μL 0.5％(w/v)的结晶紫染料一起在室温下振荡孵育20min。去除染料并用去离子水洗涤后，将培养板干燥，通过在孔中加入200μL甲醇溶解剩余的染料。然后使用酶标仪(Xenius SAFAS公司,摩纳哥,法国)基于570nm处的吸光度计算相对生存力(％)。结果表示为与未处理的对照细胞的生存力相比的增殖百分比。Triton X100去污剂(西格玛奥德里奇公司)以0.01％(v/v)用作细胞毒性的阳性对照。结果如图14所示。图14的数据显示Caco-2的存活率>90％，因此支持副干酪乳杆菌CNCM I-5369在测试的两个MOI都没有细胞毒性的安全性，并且对于稀释的E20级分亦是如此。值得注意的是，猪肠上皮IPEC-1细胞获得了类似的结果。
17.乳杆菌菌株抑制大肠杆菌184对Caco-2和IPEC-1细胞的粘附
使用人结直肠腺癌Caco-2细胞和猪肠上皮IPEC-1细胞来建立粘附和抑制测定。具体而言，细胞在5％(v/v)CO2存在下在37℃在含有4.5g/L葡萄糖并补充有L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、10％热灭活胎牛血清(FBS)和1％(v/v)非必需氨基酸的杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM)中生长。然后使用24孔组织培养板制备Caco-2和IPEC-1的单层细胞。孔中每孔接种4×104个Caco-2/IPEC-1细胞，并将培养板孵育7天。使用两种不同的方案来区分细菌素生产菌株副干酪乳杆菌CNCM I-5369和不生产细菌素的副干酪乳杆菌FB1对大肠杆菌184的竞争/排除。
对于排除测试，乳杆菌菌株(约108CFU/mL)用1mL PBS洗涤，并重新悬浮在不含抗生素的DMEM中。然后，将它们添加到Caco-2/IPEC-1单层细胞中，并在37℃(5％CO2)孵育90min。然后，通过用PBS洗涤两次去除未粘附的乳杆菌菌株。并用与乳酸杆菌菌株相同的方式准备大肠杆菌184(约107CFU/mL)。添加它们并在37℃再孵育2小时。
对于竞争测试，将按上述制备的乳杆菌(108CFU/mL)和病原体(107CFU/mL)菌株混合并添加到Caco-2/IPEC-1单层细胞并在37℃孵育2小时。Caco-2/IPEC-1单层细胞用500μLPBS洗涤2次，并与200μL胰蛋白酶/EDTA一起孵育15min，以去除带有粘附细菌的Caco-2/IPEC-1细胞。
在排除和竞争测试之后，用曙红亚甲蓝(EMB)进行了粘附大肠杆菌184细胞的计数。与代表100％粘附的对照(含有病原体且无乳杆菌菌株的孔)相比，确定了病原体粘附率。所得结果示于图15(15A和15B)。如图15所示，很明显，产细菌素的副干酪乳杆菌CNCM I-5369(bac+)使Caco-2和IPEC-1单层细胞上粘附大肠杆菌184的数量与对照测定(未经处理)相比减少了80％至90％。值得注意的是，不产细菌素的副干酪乳杆菌FB1(bac-)菌株不影响大肠杆菌184对仔猪IPEC-1单层细胞的粘附。然而，与未处理的对照相比，该菌株能够将人Caco-2单层细胞上粘附的大肠杆菌的数量减少约60％-70％。这仍然显著低于副干酪乳杆菌CNCM I-5369获得的结果。
18.完整细胞和细胞内无细胞提取物的DPPH自由基清除活性：
乳杆菌细胞在MRS培养基中在37℃生长18小时，然后通过离心(8000g在4℃10min)收获细胞。细胞用PBS(10mM，pH 7,2)洗涤3次，并以110CFU/mL重悬于PBS中，从而获得完整的细胞。此外，为了制备细胞内无细胞提取物，将细胞沉淀用去离子水快速洗涤2次，并以110CFU/mL重新悬浮在同一溶液中，然后转移到
Figure GDA0003624297090000331
B型珠管(Macherey-Nagel)。使用FastPrep-24 5G(MP生物医药公司(MP Biomedicals))将管均质3个循环，每个循环30秒，每个循环之间在冰浴上冷却5min。通过离心(8000g，4℃，10min)去除细胞碎片，所得上清液即为细胞内无细胞提取物。DPPH的清除如下进行分析：使用0.8ml的完整细胞和细胞内无细胞提取物与1mL新鲜制备的DPPH溶液(0.004％w/v于甲醇中)混合，并在黑暗条件下孵育30min。空白样品含有PBS或去离子水。然后通过测量515nm处吸光度的降低来监测清除的DPPH。清除能力按以下公式定义并报告在表15中。
清除％＝[1-A515(样品)/A515(空白)]100％。
这些结果表明副干酪乳杆菌CNCM I-5369具有抗氧化作用。
19.体外降低胆固醇
通过测量补充有0.3％(w/v)胆汁盐的MRS液体培养基中的残留胆固醇，研究了副干酪乳杆菌CNCM I-5369在体外对胆固醇的降低。简而言之，将10mg的纯胆固醇溶解在500μL乙醇(西格玛奥德里奇公司)中，并添加到补充有0.3％(w/v)猪胆汁(西格玛奥德里奇公司)的100mL MRS液体培养基中。培养基用乳杆菌菌株接种并在37℃孵育24小时(测试培养基)。在这段孵育期后，通过离心(8,000g，4℃，10min)收获细胞，并且将无细胞上清液用于胆固醇定量。未接种的液体培养基被视为对照(对照培养基)。向1mL培养上清液中添加3mL95％(v/v)乙醇，然后添加2mL 50％(w/v)氢氧化钾(KOH，西格玛奥德里奇公司)，添加各组分后混合内容物。将管在60℃加热10min。冷却后，将5mL己烷(西格玛奥德里奇公司)分配到所有管中并涡旋5min，然后添加3mL水并充分混合。使管在30℃静置20min以进行相分离。然后将体积为2.5mL的己烷层转移到新管中并使其完全干燥；添加1.5mL氯化铁试剂(西格玛奥德里奇公司)，并且让管静置10min。从管的侧面添加1mL浓硫酸(西格玛奥德里奇公司)。将混合物涡旋并在30℃静置45min。在540nm处测量吸光度。胆固醇标准图是使用纯胆固醇(西格玛奥德里奇公司)建立的，并且用于确定胆固醇浓度。然后使用以下公式计算同化百分比：
Figure GDA0003624297090000341
结果报告在表15中。
表15
Figure GDA0003624297090000342
如表15所示，显示完整副干酪乳杆菌CNCM I-5369的DPPH清除活性和胆固醇同化分别达到了32％和78％的有意比率。
Figure GDA0003624297090000351
序列表
<110> 里尔大学
法国国家科研中心
法国英科工大
法国滨海大学
阿图瓦大学
法国综合理工大学
里尔研究中心
<120> 新颖的乳酸菌菌株、由所述菌株产生的抗菌肽和相关药物组合物
<130> SATT AMIPEP EP1
<150> 19178926.2
<151> 2019-06-07
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 60
<212> PRT
<213> 副干酪乳杆菌 ( Lactobacillus paracasei)
<400> 1
Met Tyr Thr Met Thr Asn Leu Lys Asp Lys Glu Leu Ser Gln Ile Thr
1 5 10 15
Gly Gly Phe Ala Phe Val Ile Pro Val Ala Ala Ile Leu Gly Phe Leu
20 25 30
Ala Ser Asp Ala Trp Ser His Ala Asp Glu Ile Ala Gly Gly Ala Thr
35 40 45
Ser Gly Trp Ser Leu Ala Asp Lys Ser His Ser Leu
50 55 60
<210> 2
<211> 62
<212> PRT
<213> 副干酪乳杆菌 ( Lactobacillus paracasei)
<400> 2
Met Gln Gln Phe Met Thr Leu Asp Asn Ser Ser Leu Glu Lys Ile Ala
1 5 10 15
Gly Gly Glu Asn Gly Gly Leu Trp Ser Ile Ile Gly Phe Gly Leu Gly
20 25 30
Phe Ser Ala Arg Ser Val Leu Thr Gly Ser Leu Phe Val Pro Ser Arg
35 40 45
Gly Pro Val Ile Asp Leu Val Lys Gln Leu Thr Pro Lys Asn
50 55 60
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> 副干酪乳杆菌 ( Lactobacillus paracasei)
<400> 3
Met Leu Ile Leu Gly Leu Ile Ala Ile Asp Ala Trp Ser His Thr Asp
1 5 10 15
Gln Ile Ile Ala Gly Phe Leu Lys Gly Trp Gln Gly Met
20 25
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 副干酪乳杆菌 ( Lactobacillus paracasei)
<400> 4
Met Thr Asp Lys Arg Glu Thr Leu Met Ser Met Leu Ser Lys Ala Tyr
1 5 10 15
Ala Asn Pro Thr Ile Lys Ala Glu Pro Ala Leu Arg Ala Leu Ile Glu
20 25 30
Thr Asn Ala Lys Lys Val Asp Glu Gly Asp Asp Glu Lys Ala Tyr Val
35 40 45
Thr Ala Val Thr Gln Leu Ser His Asp Ile Ser Lys Tyr Tyr Leu Ile
50 55 60
His His Ala Val Pro Glu Glu Leu Val Ala Val Phe Asn Tyr Ile Lys
65 70 75 80
Lys Asp Val Pro Ala Ala Asp Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Arg Ala Gln
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Gly Leu Val Ala Ile Pro Ile Val Trp Gly His
100 105 110
<210> 5
<211> 101
<212> PRT
<213> 副干酪乳杆菌 ( Lactobacillus paracasei)
<400> 5
Met Tyr Val Lys Asp Ser Lys Val Asp Leu Thr Gln Asn Asn Leu Leu
1 5 10 15
Pro Phe Glu Glu Lys Arg Lys Ile Met Ser Tyr Asn Tyr Arg Gln Leu
20 25 30
Asp Asp Phe Gln Leu Ser Gly Val Ser Gly Gly Lys Lys Lys Phe Asp
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Phe Val Thr Gly Ile Thr Ala Gly Ile Gly Ser Gly
50 55 60
Thr Ile Thr Gly Leu Ala Gly Gly Pro Phe Gly Ile Ile Gly Gly Ala
65 70 75 80
Val Val Gly Gly Asn Leu Gly Ala Val Gly Ser Ala Ile Lys Cys Leu
85 90 95
Gly Asp Gly Met Gln
100
PCT/RO/134表
Figure 000001

Claims (17)

1.一种副干酪乳杆菌菌株ICVB411，以保藏号CNCM I-5369保藏在CNCM。
2.一种药物组合物，其包含作为活性成分的具有序列SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 5的五种肽和/或根据权利要求1所述的菌株，和药学上可接受的赋形剂。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含根据权利要求1所述的菌株的培养物的上清液作为活性成分，或者在于该药物组合物由所述上清液组成，所述上清液任选地经纯化。
4.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物进一步包含作为活性成分的粘菌素和/或至少一种选自以下的组分：
-精油，特别是薄荷精油、百里香精油、松树精油、薄荷醇、百里酚、蒎烯，
-维生素C、甲酸、丙酸、柠檬酸、山梨酸和乳酸。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物具有等于或大于4或者等于或小于5以及特别地等于4.5的pH。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物进一步包含纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述纳米颗粒至少包含海藻酸盐纳米颗粒，特别是海藻酸钠纳米颗粒，或者在于所述纳米颗粒由海藻酸钠纳米颗粒组成。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述纳米颗粒的平均尺寸等于或大于115nm且等于或小于126nm，特别是等于118nm、120nm或124nm。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述纳米颗粒负载有所述五种肽的混合物，特别是负载有根据权利要求1所述的菌株的培养物的上清液。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述纳米颗粒是药物活性成分，并且在于所述纳米颗粒负载有混合物，该混合物包含：
i)具有序列SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 5的所述五种肽，特别是根据权利要求1所述的菌株的培养物的上清液；以及
至少一种选自精油、维生素C、甲酸、丙酸、柠檬酸、山梨酸和乳酸的组分，精油特别是选自薄荷精油、百里香精油、松树精油、薄荷醇、百里酚、蒎烯。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于所述纳米颗粒负载有混合物，该混合物包含以下组分或由以下组分组成：
i)所述五种肽的混合物，特别是根据权利要求1所述的菌株的培养物的上清液；以及
ii)至少一种选自精油、维生素C、甲酸、丙酸、柠檬酸、山梨酸和乳酸的组分，精油特别是选自薄荷精油、百里香精油、松树精油、薄荷醇、百里酚、蒎烯。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物进一步包含仅负载粘菌素和/或选自薄荷精油、百里香精油、松树精油、薄荷醇、百里酚、蒎烯、维生素C、甲酸、丙酸、柠檬酸、山梨酸和乳酸的组分作为药物活性化合物的纳米颗粒。
13.根据权利要求2至12中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述纳米颗粒的负载重量等于或小于所述纳米颗粒重量的12.2％，特别是等于12％。
14.一种药物组合物，该药物组合物包含以下物质作为活性成分：选自具有以下序列的肽的分离的肽：
MYTMTNLKDKELSQITGGFAFVIPVAAILGFLASDAWSHADEIAGGATSGWSLADKSHSL(SEQ ID NO1)
MQQFMTLDNSSLEKIAGGENGGLWSIIGFGLGFSARSVLTGSLFVPSRGPVIDLVKQLTPKN(SEQ IDNO2)
MLILGLIAIDAWSHTDQIIAGFLKGWQGM(SEQ ID NO3)
MTDKRETLMSMLSKAYANPTIKAEPALRALIETNAKKVDEGDDEKAYVTAVTQLSHDISKYYLIHHAVPEELVAVFNYIKKDVPAADIDAARYRAQALAAGLVAIPIVWGH(SEQ ID NO4)
MYVKDSKVDLTQNNLLPFEEKRKIMSYNYRQLDDFQLSGVSGGKKKFDCAATFVTGITAGIGSGTITGLAGGPFGIIGGAVVGGNLGAVGSAIKCLGDGMQ(SEQ ID NO5)和至少一种选自以下的组分：
-精油，特别是薄荷精油、百里香精油、松树精油、薄荷醇、百里酚、蒎烯，
-维生素C、甲酸、丙酸、柠檬酸、山梨酸和乳酸，和/或
-可以负载所述活性成分的纳米颗粒。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于所述纳米颗粒至少包含海藻酸盐纳米颗粒，特别是海藻酸钠纳米颗粒，或者在于所述纳米颗粒由海藻酸钠纳米颗粒组成。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述纳米颗粒的平均尺寸等于或大于115nm且等于或小于126nm，特别是等于118nm、120nm或124nm。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述纳米颗粒的负载重量等于或小于所述纳米颗粒重量的12.2％，特别是等于12％。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112516283A (zh) * 2020-12-25 2021-03-19 威海长青海洋科技股份有限公司 季铵化鲍鱼抗菌肽凝胶剂及其制备方法和应用
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CN116063380A (zh) * 2022-09-30 2023-05-05 内蒙古农业大学 一种分离自副干酪乳杆菌的抗真菌肽及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105368738A (zh) * 2015-10-23 2016-03-02 中国农业大学 一种副干酪乳杆菌及其应用
CN105400727A (zh) * 2015-12-21 2016-03-16 南昌大学 一株具有抗氧化活性的副干酪乳杆菌及其应用
CN108348559A (zh) * 2015-07-07 2018-07-31 阿尔法西格玛有限公司 用于生产共轭亚油酸的副干酪乳杆菌、含有其的营养制剂和药物制剂及其用途

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108348559A (zh) * 2015-07-07 2018-07-31 阿尔法西格玛有限公司 用于生产共轭亚油酸的副干酪乳杆菌、含有其的营养制剂和药物制剂及其用途
CN105368738A (zh) * 2015-10-23 2016-03-02 中国农业大学 一种副干酪乳杆菌及其应用
CN105400727A (zh) * 2015-12-21 2016-03-16 南昌大学 一株具有抗氧化活性的副干酪乳杆菌及其应用

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