JP2022535926A - 新規の乳酸菌株‐上記株によって産生される抗菌ペプチド、及び関連する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、参照番号ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９としてＣＮＣＭに寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ株に関する。本発明はまた、以下の配列：（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）、（配列番号５）を有するペプチドの混合物、並びに上述のペプチドのうちの１つと、以下：‐精油、特にハッカの精油、タイムの精油、マツの精油、メンソール、チモール、ピネン、‐ビタミンＣ、ギ酸、プロピオン酸、クエン酸、ソルビン酸、乳酸；及び／又は‐上記有効成分が添加され得るナノ粒子から選択される少なくとも１つの成分との組み合わせに関する。

Description

本発明は新規の乳酸菌株に関し、また抗菌／抗微生物特性を有する、より詳細にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ． ｃｏｌｉ）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ． ｃｏｌｉ）のコリスチン耐性株に対して抗微生物特性を有する、５つの新規のペプチドに関する。

抗微生物耐性（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ：ＡＭＲ）と呼ばれる抗生物質に対する耐性は、世界中でよく認識された危機となった。従って、効果が弱まり古くなった抗生物質に代わる代替物が、適時に、また絶対的に必要である。動物の生産における抗生物質の消費は、世界中で着実に増加している。最近、ＷＨＯは、ヒトの健康のために、抗生物質に対するいわゆる「極めて重要な（ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ）」耐性ができることを制限するために、「最も重要でない（ｌｅａｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ）」抗生物質の合理的な使用を勧告した。更に２０１７年１０月に編集されたＷＨＯの報告書では、抗生物質耐性の広がりを防止及び軽減するために、農業部門に以下の勧告がなされた：抗生物質は、獣医の管理下でのみ動物に投与されなければならない；抗生物質は、成長促進剤として、又は動物の疾患を予防するために使用するべきではない；抗生物質の必要性を減らすために、及びこれらの薬剤の代替物が存在する場合にはそれを使用するために、動物のワクチン接種を実施しなければならない；動物性及び植物性食品の生産及び加工の全ての段階において、良好な実践を促進し、適用する；動物の衛生及び福祉を改善することにより感染症を回避するために、飼養場のバイオセキュリティを向上させる。

現在検討されている代替的なアプローチとしては、既存の抗生物質のより良好な管理、既存の抗生物質の活性を向上させるためのこれらの構造の改変、及びあらゆる生物によって産生される抗微生物ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ：ＡＭＰ）等の新規の抗生物質分子の探索が挙げられる（非特許文献１）。単細胞生物（特に細菌）によって産生されるＡＭＰとしては：非リボソーム合成二次代謝物であるリポペプチド；グラム陰性菌及びグラム陽性菌によって、並びに比較的少ないが古細菌によってリボソーム合成される、バクテリオシンが挙げられる。乳酸菌によって産生されるバクテリオシン（ＬＡＢ‐バクテリオシン）は、熱安定性であり、広範囲のｐＨ値にわたって活性を有する。これらは主に、バクテリオシン産生株に系統学的に関連する株に対して活性を有する。しかしながら、系統学的に遠い株に対して活性を有するＬＡＢ－バクテリオシンは少ない。注目すべきことに、グラム陰性桿菌（Ｇｒａｍ‐ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｉｌｌｉ：ＧＮＢ）に対する活性を有する新規のバクテリオシンを産生するＬＡＢ（乳酸菌）の新規の株の発見は、学術的な成績及び洞察の根源であり、産業的及び生物医学的応用に関して重要である。

多剤耐性ＧＮＢによって引き起こされる感染症を治療するための治療選択肢の不足により、ヒト用医薬に必要な最後の手段の抗生物質としてコリスチンが復帰することになった。しかしながら、この抗生物質は、大腸菌症による下痢を治療するための動物用医薬に大量に使用されており、これは結果的に大きな経済的損失の原因となる。コリスチンの使用は、飼育における獣医学的慣習にとってと同様にヒト用医薬にとっても主要な問題である。にもかかわらず、コリスチンに対する耐性の最初の伝達機構（ｍｃｒ‐１、ｍｃｒ‐２、ｍｃｒ‐３、ｍｃｒ‐４及び続いてｍｃｒ‐５）の発見（非特許文献２、続いて非特許文献３を参照）を含むコリスチンに対する細菌の耐性の同定は、コリスチンのリスクプロファイルを再評価するために、欧州で行われた。これに対して、欧州疾病予防管理センター（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＥＣＤＣ）は最近、動物部門におけるコリスチンの使用の制限を提案する報告書を公開した。そしてＡＮＳＥＳは、２０１６年１０月の報告書（Ｎｏ．２０１６‐ＳＡ‐０１６０）において、動物部門における治療及び／又は発症予防（ｍｅｔａｐｈｙｌａｘｉｓ）のための、抗生物質、特にコリスチンの重要な代替物を強化するよう勧告した。

特許文献１は、バクテリオシンを分泌する、ＮＲＲＬ Ｂ‐５０３１４として寄託されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ株を開示している。このバクテリオシンは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ及び他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種を含むがこれらに限定されないある範囲のグラム陽性菌に対する抗菌活性を有する。更に、このバクテリオシンは、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対する活性を有する。

米国特許第８４７０５８３号

Ｎｅｓ，Ｉ．Ｆ．（２０１１）．Ｈｉｓｔｏｒｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｉｎ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄｊａｍｅｌ Ｄｒｉｄｅｒ，Ｓｙｌｖｉｅ Ｒｅｂｕｆｆａｔ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ＮＹ：３‐１２ Ｂｏｒｏｗｉａｋ，Ｍ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．，Ｈａｍｍｅｒｌ，Ｊ．Ａ．，Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｓｚａｂｏ，Ｉ．，Ｍａｌｏｒｎｙ，Ｂ．（２０１７） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ，ｍｃｒ‐５，ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｃｏｌｉｓｔｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｄ‐ｔａｒｔｒａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ｂ． Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１７ Ｄｅｃ １；７２（１２）：３３１７‐３３２４．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊａｃ／ｄｋｘ３２７

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ． ｃｏｌｉ）等のＧＮＢによって引き起こされる感染症の発症を制御するための抗生物質分子の開発は、ヒト用医薬及び動物用医薬の両方にとって大きな関心の対象である。

本発明の１つの目的は、バクテリオシンの基準を満たすタンパク質性の５つの抗菌／抗微生物ペプチドを産生できる、新規の乳酸菌株を提供することである。

本発明の別の目的は、真核細胞、特にヒト腸細胞及び／又はブタ腸細胞に対する細菌接着、特にＥ． ｃｏｌｉ接着を防止又は制限できる、新規の細菌株を提供することである。

本発明の１つの目的は、ＧＮＢ株、特にＥ． ｃｏｌｉ株に対して有用な、新規の抗菌／抗微生物化合物を提供することである。

本発明の別の目的は、投与されるコリスチンの量を低減するため又はコリスチンの抗菌活性を増強するためにコリスチンと併用できる、新規の化合物を提供することである。

本発明の別の目的は、コリスチン耐性株、特にコリスチン耐性Ｅ． ｃｏｌｉ株に対しても有効な新規の抗菌化合物を提供することである。

本発明の別の目的は、活性医薬組成物、及び更にｐＨ非依存性活性を有する医薬品を提供することである。

本発明の別の目的は、細菌の耐性が生じる確率が低い医薬組成物又は新規の抗菌／抗微生物化合物を提供することである。

本発明の別の目的は、細胞傷害性でない、特にヒト腸細胞及び／又はブタ腸細胞に対して細胞傷害性でない、抗菌化合物を提供することである。

本発明は、請求項２に記載の少なくとも１つのペプチドを産生できる、参照番号ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９としてＣＮＣＭに寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＩＣＶＢ４１１株、並びにその多様体及び変異体に関する。

これ以降、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＩＣＶＢ４１１株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９とも呼ばれる。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＩＣＶＢ４１１（Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９）は、５つの新規のバクテリオシンを産生できる。これらの新規のバクテリオシンは、合成され、培養上清中に出現する。これらを部分的に精製して、ｍｃｒ‐１遺伝子を有するＥ． ｃｏｌｉを含むＥ． ｃｏｌｉ株のパネルに対して首尾よく試験した。ここで提供されたデータは、ブタ、特に子ブタの大腸菌症感染を治療するために潜在的に使用可能な分子としての、ＬＡＢ‐バクテリオシンの可能性をはっきりと示している。本発明は、集中的な飼養から抗生物質（特にコリスチン）を制限、それどころか排除する機会、及び上記抗生物質の、Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９によって産生されるバクテリオシンによる置き換えを提供する。

本発明はまた：
‐以下の配列：
ＭＹＴＭＴＮＬＫＤＫＥＬＳＱＩＴＧＧＦＡＦＶＩＰＶＡＡＩＬＧＦＬＡＳＤＡＷＳＨＡＤＥＩＡＧＧＡＴＳＧＷＳＬＡＤＫＳＨＳＬ（配列番号１）；
ＭＱＱＦＭＴＬＤＮＳＳＬＥＫＩＡＧＧＥＮＧＧＬＷＳＩＩＧＦＧＬＧＦＳＡＲＳＶＬＴＧＳＬＦＶＰＳＲＧＰＶＩＤＬＶＫＱＬＴＰＫＮ（配列番号２）；
ＭＬＩＬＧＬＩＡＩＤＡＷＳＨＴＤＱＩＩＡＧＦＬＫＧＷＱＧＭ（配列番号３）；
ＭＴＤＫＲＥＴＬＭＳＭＬＳＫＡＹＡＮＰＴＩＫＡＥＰＡＬＲＡＬＩＥＴＮＡＫＫＶＤＥＧＤＤＥＫＡＹＶＴＡＶＴＱＬＳＨＤＩＳＫＹＹＬＩＨＨＡＶＰＥＥＬＶＡＶＦＮＹＩＫＫＤＶＰＡＡＤＩＤＡＡＲＹＲＡＱＡＬＡＡＧＬＶＡＩＰＩＶＷＧＨ（配列番号４）；
ＭＹＶＫＤＳＫＶＤＬＴＱＮＮＬＬＰＦＥＥＫＲＫＩＭＳＹＮＹＲＱＬＤＤＦＱＬＳＧＶＳＧＧＫＫＫＦＤＣＡＡＴＦＶＴＧＩＴＡＧＩＧＳＧＴＩＴＧＬＡＧＧＰＦＧＩＩＧＧＡＶＶＧＧＮＬＧＡＶＧＳＡＩＫＣＬＧＤＧＭＱ（配列番号５）
を有するペプチド、並びに
‐上述の配列番号１～配列番号５の配列と少なくとも９０％、特に少なくとも９５％の同一性を有し、かつ抗菌活性、特にＥ． ｃｏｌｉ株に対する抗菌活性を有する、ペプチド
から選択される、単離ペプチドに関する。

本発明によるペプチドの抗菌／抗微生物機序は公知でない。しかしながら、ペプチドの大半は、細菌／微生物外膜のリン脂質と化学的に反応するため、抗菌／抗微生物活性を有する。換言すると、これらは、微生物／細菌外膜を破壊する。ペプチドは、微生物／細菌の外膜に入る前に微生物／細菌の外膜と化学的に相互作用するため、これらは微生物／細菌の耐性に関与しない。従って、本発明のペプチド及び上記ペプチドを含む医薬組成物は、細菌／微生物耐性を生じる確率が低い。

本発明はまた、薬品、特に抗菌又は抗微生物薬として使用するための、より詳細には治療必要がある哺乳動物におけるＥ． ｃｏｌｉ感染症、特にコリスチン耐性Ｅ． ｃｏｌｉ株感染症の治療に使用するための、上述のような単離ペプチドに関し、上記哺乳動物は特に、ブタ、子ブタ、家禽、ウシ、ヒツジ、ヤギ亜科、及びヒトから選択される。

好ましくは、本発明は、薬品、特に抗菌又は抗微生物薬として使用するための、より詳細には治療の必要がある哺乳動物におけるＥ． ｃｏｌｉ感染症、特にコリスチン耐性Ｅ． ｃｏｌｉ株感染症の治療に使用するための、５つの上述のペプチドの混合物に関し、上記哺乳動物は特に、ブタ、子ブタ、家禽、ウシ、ヒツジ、ヤギ亜科、及びヒトから選択される。

本発明はまた、有効成分として請求項２に記載の少なくとも１つのペプチド、特に配列番号１～配列番号５の配列を有する上記５つのペプチド及び／又は請求項１に記載の株、並びに薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物に関する。

上記薬学的に許容可能な賦形剤は、精製水、エチルアルコール、プロピレングリコール、グリセリン、植物油、ラクトース、ソルビトール、デンプン、ポリマー、又はＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｌｏｎｄｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ２０１２）の第７版に記載されているいずれの他の賦形剤、及びこれらの混合物から選択してよい。
す。

有利には、上記賦形剤は、水又は水溶液である。

有利には、上記医薬組成物は、上述の５つのペプチド、及び上述のような少なくとも１つの賦形剤を含む。

上述の実施形態のうちのいずれの１つと組み合わせることができる、ある特定の実施形態によると、上記医薬組成物は、請求項１に記載の株の培養液の上清を有効成分として含むか、又は上記上清からなり、上記上清は任意に精製される。上記上清はクロマトグラフィで精製でき、例えば特に逆相Ｃ１８上で精製して、２０体積％のアセトニトリルを含有するアセトニトリルの水溶液で溶出できる。上記上清は好ましくは、無細胞上清である。これは、請求項１の株を３７℃の培地（例えばＭＲＳ）中で２４～３０時間培養することにより、得ることができる。

上述の実施形態のうちのいずれの１つと組み合わせることができる別の実施形態によると、上記医薬組成物のｐＨは、４以上および５以下であり、特に４．５に等しい。本発明のペプチドは特に上述のようなｐＨにおいて、抗菌剤又は抗微生物剤として、特にＥ． ｃｏｌｉ及びコリスチン耐性Ｅ． ｃｏｌｉ株に対して有効である。

上述の実施形態のうちのいずれの１つと組み合わせることができる別の実施形態によると、本発明の医薬組成物は更に、有効成分として、コリスチン、並びに／又は精油、特にハッカの精油、タイムの精油、マツの精油、メンソール、チモール、ピネン、ビタミンＣ、ギ酸、プロピオン酸、クエン酸、ソルビン酸、及び乳酸から選択される少なくとも１つの成分を含む。

本発明の５つのペプチドのそれぞれ、及び本発明の５つのペプチドの混合物は、コリスチンとの相乗的な抗菌効果を有する。本発明の１つ以上のペプチドをコリスチンと共に（混合物として）使用することにより、コリスチンの有効投与量を低減できる。コリスチンと、本発明のペプチド、特に本発明の上記５つのペプチドのうちの少なくとも１つとの混合物により、コリスチンを使用せずに単独で使用した場合の本発明の１つ以上のペプチドの薬学的有効量に比べて、上記混合物の薬学的有効量の低減が可能となる。

精油及び酸もまた抗菌活性を有し、上述のような医薬組成物の抗菌活性若しくは抗微生物活性を改善するために、又は本発明の少なくとも１つのペプチド、好ましくは本発明の５つのペプチドとの混合物、若しくはコリスチンと本発明の少なくとも１つのペプチド、好ましくは本発明の５つのペプチドとの混合物との相乗効果を得るために、使用できる。

上述の実施形態のうちのいずれの１つと組み合わせることができる別の実施形態によると、本発明の医薬組成物は更に、ナノ粒子を含む。ナノ粒子の使用により、本発明の医薬組成物の１つ以上の有効成分の量を低減できる。更に本発明者らは、本発明の少なくとも１つのペプチド、又は有利には本発明の５つのペプチドの混合物が添加されたナノ粒子が、上記医薬組成物のｐＨがどのようなものであっても、抗菌剤として有効であり、特にＥ． ｃｏｌｉ株に対して（更にはコリスチン耐性Ｅ． ｃｏｌｉ株に対して）有効であることを示した。更に、ナノ粒子及び特にアルギン酸ナトリウムナノ粒子は消化に耐えられるため、本発明の少なくとも１つのペプチド、好ましくは本発明の５つのペプチドの混合物（例えば上述のような上清）が添加されたこのようなナノ粒子を含む上記医薬組成物は、経口投与できる。

これは、本発明の５つのペプチドの混合物（有利には請求項１に記載の株の培養上清）と、上述のような成分及び／又はコリスチン、特に乳酸及び／又はチモール及び／又はメンソールとを、ナノ粒子、特にアルギン酸ナトリウムナノ粒子に添加する場合にも当てはまる。

ナノ粒子は、本発明によるものに限定されない。ナノ粒子の一実施形態によると、これらは少なくともアルギン酸ナノ粒子、特にアルギン酸ナトリウムナノ粒子を含む。好ましくは、上記医薬組成物中に含有される全てのナノ粒子は、アルギン酸ナノ粒子、より詳細にはアルギン酸ナトリウムナノ粒子である。

上述の実施形態と組み合わせることができるナノ粒子のある特定の実施形態によると、上記ナノ粒子は、１１５ｎｍ以上１２６ｎｍ以下、特に１１８ｎｍ、１２０ｎｍ又は１２４ｎｍに等しい平均粒径を有する。ナノ粒子のこのような粒径により、有効成分が添加されたナノ粒子を、特に抗菌剤又は抗微生物剤として活性を有するものとすることができる。

一実施形態によると、上記ナノ粒子には、請求項２に記載の上記５つのペプチドのうちの少なくとも１つ、好ましくは上記５つのペプチドの混合物、特に請求項１に記載の株の培養液の上清が添加される。ある変形例によると、上記ナノ粒子には、薬学的有効成分として上記１つ以上のペプチドのみが添加される。添加済みの上記ナノ粒子は薬学的有効成分である。

別の実施形態によると、上記ナノ粒子には：
ｉ）請求項２に記載の上記５つのペプチドのうちの少なくとも１つ、好ましくは上記５つのペプチドの混合物、特に請求項１に記載の株の培養液の上清；並びに
ｉｉ）コリスチン；及び／又は
ｉｉｉ）精油、特にハッカの精油、タイムの精油、マツの精油、メンソール、チモール、ピネン、ビタミンＣ、ギ酸、プロピオン酸、クエン酸、ソルビン酸、及び乳酸から選択される少なくとも１つの成分
を含む、混合物が添加される。

上記５つのペプチドの混合物（好ましくは上述のような上清）、及び上述のような成分が添加されたナノ粒子は、上記医薬組成物のｐＨがどのようなものであっても、抗菌剤として有効である。これは特に、上述のような成分及び／又はコリスチンも上記ナノ粒子に添加される場合にも当てはまる。更に、これらの添加済みのナノ粒子は消化に耐えられるため、経口投与できる。このようなタイプの添加済みのナノ粒子は、抗菌剤又は抗微生物剤として有効であり、特にＥ． ｃｏｌｉ、更にはコリスチン耐性Ｅ． ｃｏｌｉ株に対して有効である。

上記医薬組成物は更に、コリスチンのみ、並びに／又はハッカの精油、タイムの精油、マツの精油、メンソール、チモール、ピネン、ビタミンＣ、ギ酸、プロピオン酸、クエン酸、ソルビン酸、及び乳酸中から選択される成分が、薬学的活性化合物として添加された、ナノ粒子を含んでよい。本発明のペプチドが添加されていない上記ナノ粒子は更に、本発明の医薬組成物の効果を高めることができる。

上記ナノ粒子には、本発明による医薬組成物を添加することもできる。

全ての上述の実施形態において、上記ナノ粒子への添加重量は、上記ナノ粒子の重量の１２．２％以下であり、特に１２％に等しい。

ある特定の実施形態によると、上記医薬組成物は、６０μｇ／ｍＬの上記少なくとも１つのペプチド、特に６０μｇ／ｍＬの上記５つのペプチドの上記混合物、特に上述のような上清を含む。

上述の実施形態と組み合わせることができる別の実施形態によると、上記医薬組成物は、コリスチンと本発明の少なくとも１つのペプチドとの混合物を含む。この混合物は、重量で、少なくとも８０％（８０％を含む）の本発明の少なくとも１つのペプチド、特に上記５つのペプチド（好ましくは上清）と、２０％のコリスチンとを含む。ある特定の実施形態によると、コリスチンと上記１つ以上のペプチドとの混合物は、例えば少なくとも９９％及び９９．２％の１つ以上のペプチド（好ましくは上清）と、１％以下のコリスチン、好ましくは０．８％のコリスチンとを含む。

別の実施形態によると、上記医薬組成物は、重量で、特に乳酸（１μｇ／ｍＬ）、メンソール（１０μｇ／ｍＬ）又はチモール（１０μｇ／ｍＬ）に関しては、上記量の１つ以上のペプチドに対して０．２～２％（０．２及び２％を含む）の上記成分を含有する。好ましい組み合わせは以下の通りである：１０μｇ／ｍＬのメンソールと５０μｇ／ｍＬの上記５つのペプチド（上記上清）の上記混合物との組み合わせ；１μｇ／ｍＬの乳酸と６０μｇ／ｍＬの５つのペプチド（即ち上記上清）の混合物との組み合わせ。これらの値はＥ． ｃｏｌｉ株に対して良好な結果を提供する。

上述の実施形態のうちのいずれの１つと組み合わせることができる別の実施形態によると、上記医薬組成物は、上記５つのペプチドの混合物（特に上記上清）、又は上記５つのペプチドの混合物及び上記成分がその重量の１２％だけ添加されたナノ粒子を含む。別の実施形態によると、ナノ粒子には、１２重量％の上記上清と、その重量の０．１％又は０．２％に等しい量の上記成分との混合物を含む。乳酸に関して、その量は例えば、ナノ粒子の重量の０．２％とすることができる。メンソール及びチモールに関して、これらの量はそれぞれ、重量で、０．２％から６％（０．２及び６％を含む）、特に２％又は４％とすることができる。チモールとメンソールとの混合物を４重量％の量で使用して、良好な抗菌結果を得ることができる。上記ナノ粒子は、全ての場合において、好ましくはアルギン酸ナノ粒子、より好ましくはアルギン酸ナトリウムナノ粒子である。

本発明による医薬組成物中の有効成分の量は、治療対象の哺乳動物及び殺滅対象の株に依存する。当業者は、本発明の医薬組成物中に含有される有効成分の有効量を判断できる。

上述の特性を有し得るある特定の実施形態によると、本発明は、有効成分として、以下の配列：
ＭＹＴＭＴＮＬＫＤＫＥＬＳＱＩＴＧＧＦＡＦＶＩＰＶＡＡＩＬＧＦＬＡＳＤＡＷＳＨＡＤＥＩＡＧＧＡＴＳＧＷＳＬＡＤＫＳＨＳＬ（配列番号１）；
ＭＱＱＦＭＴＬＤＮＳＳＬＥＫＩＡＧＧＥＮＧＧＬＷＳＩＩＧＦＧＬＧＦＳＡＲＳＶＬＴＧＳＬＦＶＰＳＲＧＰＶＩＤＬＶＫＱＬＴＰＫＮ（配列番号２）；
ＭＬＩＬＧＬＩＡＩＤＡＷＳＨＴＤＱＩＩＡＧＦＬＫＧＷＱＧＭ（配列番号３）；
ＭＴＤＫＲＥＴＬＭＳＭＬＳＫＡＹＡＮＰＴＩＫＡＥＰＡＬＲＡＬＩＥＴＮＡＫＫＶＤＥＧＤＤＥＫＡＹＶＴＡＶＴＱＬＳＨＤＩＳＫＹＹＬＩＨＨＡＶＰＥＥＬＶＡＶＦＮＹＩＫＫＤＶＰＡＡＤＩＤＡＡＲＹＲＡＱＡＬＡＡＧＬＶＡＩＰＩＶＷＧＨ（配列番号４）；
ＭＹＶＫＤＳＫＶＤＬＴＱＮＮＬＬＰＦＥＥＫＲＫＩＭＳＹＮＹＲＱＬＤＤＦＱＬＳＧＶＳＧＧＫＫＫＦＤＣＡＡＴＦＶＴＧＩＴＡＧＩＧＳＧＴＩＴＧＬＡＧＧＰＦＧＩＩＧＧＡＶＶＧＧＮＬＧＡＶＧＳＡＩＫＣＬＧＤＧＭＱ（配列番号５）
を有するペプチドから選択される単離ペプチド；並びに
‐精油、特にハッカの精油、タイムの精油、マツの精油、メンソール、チモール、ピネン、
‐ビタミンＣ、ギ酸、プロピオン酸、クエン酸、ソルビン酸、乳酸；及び／又は
‐上記有効成分が添加され得るナノ粒子
から選択される、少なくとも１つの成分
を含む、医薬組成物に関する。

この特定の実施形態によると、上記ナノ粒子は、少なくともアルギン酸ナノ粒子、特にアルギン酸ナトリウムナノ粒子を含んでよく、又は上記ナノ粒子はアルギン酸ナトリウムナノ粒子からなってよい。

この実施形態によると、上記ナノ粒子は、１１５ｎｍ以上１２６ｎｍ以下、特に１１８ｎｍ、１２０ｎｍ又は１２４ｎｍに等しい平均粒径を有する。

更に、この実施形態によると、上記ナノ粒子への添加重量は、上記ナノ粒子の重量の１２．２％以下であり、特に１２％に等しい。

本発明はまた、薬品として使用するための、参照番号ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９としてＣＮＣＭに寄託されているＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＩＣＶＢ４１１株に関する。

本発明はまた、心血管疾患、急性及び慢性腎疾患、神経変性疾患、黄斑変性、慢性閉塞性肺疾患、胆道疾患、糖尿病、癌、老化といった急性及び慢性の病的状態から選択される疾患に罹患した患者の治療において、抗酸化剤として使用するための、参照番号ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９としてＣＮＣＭに寄託されているＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＩＣＶＢ４１１に関する。

本発明はまた、高コレステロール血症の治療、特に脳卒中、高血圧、アテローム性動脈硬化、心血管疾患、黄色腫、癌、肥満、糖尿病、神経変性疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患といった疾患の予防において使用するための、参照番号ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９としてＣＮＣＭに寄託されているＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＩＣＶＢ４１１に関する。

本発明はまた、参照番号ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９としてＣＮＣＭに寄託されているＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＩＣＶＢ４１１の、抗酸化剤としての使用に関する。本発明はまた、参照番号ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９としてＣＮＣＭに寄託されているＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＩＣＶＢ４１１を含有するか、又はこれからなる防腐剤に関する。上記防腐剤は例えば、食品防腐剤、化粧品防腐剤、薬剤防腐剤、又は塗料防腐剤であってよい。

本発明はまた、参照番号ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９としてＣＮＣＭに寄託されているＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＩＣＶＢ４１１を含有する製品、特に液体製品に関する。上記製品は例えば、食品製品、飲料、薬剤、化粧品、木材、生物学的試料、又は塗料であってよい。

上記医薬組成物は、溶液、ゲル、粉末、錠剤、又はカプセルとすることができる。これは好ましくは経口投与されるよう処方される。しかしながら、粘膜（例えば舌下若しくは吸入による）、局所、皮内、静脈内、又は筋肉内投与のために処方することもできる。

定義
用語「コリスチン耐性Ｅ． ｃｏｌｉ株（ｃｏｌｉｓｔｉｎ‐ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ）」は、最小発育阻止濃度（ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＭＩＣ）が＞２μｇ／ｍＬである、及び／又はコリスチン耐性に関与する遺伝子を有するＥ． ｃｏｌｉ株を指し、特にｍｒｃ‐１遺伝子を有する株を指す。

用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、予防的治療及び治癒的治療を指す。

用語「抗菌（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ）」は特に、ＧＮＢ株に対する抗菌活性に関する。

用語「…が添加されたナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ．．．）」又は「ナノ粒子に添加されたＸ（Ｘ ｌｏａｄｅｄ ｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」は、ナノ粒子の外面に吸着された化合物又は化合物の混合物を含むナノ粒子を指す。しかしながら、例えば上記ナノ粒子が多孔質である場合、化合物又は混合物はナノ粒子の内面に吸着される場合もある。

用語「本発明のペプチドの混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」は、好ましくは上述のような上清、より好ましくは精製された上清（Ｅ２０、Ｅ２０画分（Ｅ２０ ｆｒａｃｔｉｏｎ）とも呼ばれる）を指す。

用語「…％の同一性（％ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、比較対象の配列において参照配列と同一のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。比較対象の配列は、参照配列に対する欠失、置換及び／又は挿入を含み得る。

図１は、ＡＵ／ｍＬ（任意単位ヒストグラム）で表される、Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９の培養上清中の抗Ｅ． ｃｏｌｉ活性の動態を、６００ｎｍにおける細菌増殖のＯＤ（灰色の領域）のモニタリングと共に示す。 図２は、Ｅ２０画分で処理された複数の選択されたＥ． ｃｏｌｉ株の殺滅曲線（又は生存曲線）を示す。 図３は、ＩＰＥＣ‐１細胞に対するＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９及びＥ２０画分の細胞傷害性を示す。 図４は、Ａｌｇ ＮＰ（アルギン酸ナトリウムナノ粒子）のＳＥＭ画像である。 図５ａ、５ｂは、水中のＡｌｇ ＮＰ（５００ μｇ．ｍＬ^－１）のＤＬＳ（体積による粒径分布）及びゼータ電位分布測定を示す。 図６は、温度（℃）に応じて異なる重量損失を示す、Ａｌｇ ＮＰの熱挙動を示す。 図７は、アルギン酸ナノ粒子（５００μｇ／ｍＬ）上／中に吸着されるコリスチンの量（μｇ／ｍＬ）の定量化（コリスチンμｇ／ｍＬ対コリスチンの質量／アルギン酸ナノ粒子の質量×１００）を示す。 図８～図１１は、複数の細胞株に対するＡｌｇ ＮＰの細胞傷害性に関する結果を示し；用語「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」はＥ２０画分を指し、「アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）」はＡｌｇ ＮＰを指す。 図８～図１１は、複数の細胞株に対するＡｌｇ ＮＰの細胞傷害性に関する結果を示し；用語「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」はＥ２０画分を指し、「アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）」はＡｌｇ ＮＰを指す。 図８～図１１は、複数の細胞株に対するＡｌｇ ＮＰの細胞傷害性に関する結果を示し；用語「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」はＥ２０画分を指し、「アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）」はＡｌｇ ＮＰを指す。 図８～図１１は、複数の細胞株に対するＡｌｇ ＮＰの細胞傷害性に関する結果を示し；用語「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」はＥ２０画分を指し、「アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）」はＡｌｇ ＮＰを指す。 図１２は、Ｂａｇｅｌ ３オンラインソフトウェアを用いて得られたＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９ゲノム解析による、バクテリオシンを潜在的にコードするオープンリーディングフレーム（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ：ｏｒｆ）を示す。 図１３は、消化の子ブタインビトロモデルの静的プロセスの異なる複数の区画、即ち：口内（最初の接種／対照）、胃、及び十二指腸内の、各区画におけるｐＨ変動の影響（黒色のバー）又は酵素及び胆汁（胆汁は十二指腸シミュレーション区画に添加された）と組み合わされたｐＨ変動の影響（暗灰色のバー）による、Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９細胞の数を示す。試料は消化の各ステップにおいて採取され、ＣＦＵ／ｍＬの数が寒天培地上で決定された。データは、Ｃａｃｏ‐２のコンフルエントな単層上に注がれた全酵母細胞のパーセンテージで表現された。値±ＳＤは３回の平均である。統計分析はＸＬ‐ＳＴＡＴソフトウェアを用いて行われた。Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ解析による一元配置分散分析（ｏｎｅ‐ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いると、異なる文字が付されたバーは大きく異なっている（Ｐ＜０．０５）。 図１４は、細胞比１／１０又は１／１００（Ｃａｃｏ２／Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）のＭＯＩで２４時間にわたる、複数のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株による処理及び希釈されたＥ２０画分による処理後の、Ｃａｃｏ‐２の生存率を示す。０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００界面活性剤を、同様の条件下で陽性試験として使用した。値は、３回の独立した測定の平均±ＳＤである。Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ解析による一元配置分散分析（ｏｎｅ‐ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いると、異なる文字が付されたバーは大きく異なっている（Ｐ＜０．０５）。 図１５は、単独（白色）の、又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９（ｂａｃ＋）株の存在下（黒色）での、若しくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＦＢ１ （ｂａｃ－）株の存在下（灰色）での競合アッセイ及び排除アッセイ中の、Ａ）Ｃａｃｏ‐２単層細胞；Ｂ）ＩＰＥＣ‐１単層細胞に対するＥ． ｃｏｌｉ １８４株の接着のパーセンテージを示す。値は、３回の独立した測定の平均±ＳＤである。Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ解析による一元配置分散分析（ｏｎｅ‐ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いると、異なる文字が付されたバーは大きく異なっている（Ｐ＜０．０５）。

実験結果
１．Ａｌａｔｉｇチーズからの乳酸菌の単離及び精製
（参照番号ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９としてＣＮＣＭに寄託されている）株Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＩＣＶＢ４１１を、Ａｌａｔｉｇチーズという名称の伝統的なアルジェリアの乳製品から単離した。最初の例では、この株は、タンパク質性の１つ以上の阻害化合物の産生により、Ｅ． ｃｏｌｉ株に対する拮抗作用を示した。上記１つ以上の阻害化合物は、ＭＲＳ培地上でＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９を増殖させた後に遠心分離（８，０００ｇ、４℃、１０分）によって得られた培養上清に出現した（ｄｅ Ｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９６０）。にもかかわらず、この抗Ｅ． ｃｏｌｉ活性は、４～５の低いｐＨ値においてのみ観察された。

職人によって製造されたチーズ「Ａｌａｔｉｇ」１０ｇを、９０ｍＬの無菌生理食塩水中で溶解及び均質化した。続いて、この希釈されたチーズから少量を採取し、ＭＲＳ寒天（Ｌｉｏｆｉｌｃｈｅｍ、イタリア）上に表面播種し、その後３０℃で４８時間にわたりインキュベートした。このステップを２回実施した。ＭＲＳ寒天（Ｌｉｏｆｉｌｃｈｅｍ、イタリア）を用いた１回目はｐＨ６．５に調整され、ＭＲＳ寒天を用いた２回目は０．１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ５．４５に調整された。

単離株の精製は、ＭＲＳ寒天上のコロニーの連続的な継代培養によって実施した。インキュベーションは３０℃で４８時間実施した。これらの株の純度を、同一の外観、同一の色、同一のサイズ、及び同一の形状を含む同一の形態を有する均質なコロニーの寒天上での存在によって確認した。グラム染色を用いて、単離株の純度を確認した。カタラーゼ活性を有しないグラム陽性菌を、ＬＡＢであるものと推定した。これらをＭＲＳブイヨン（Ｂｉｏｋａｒ、フランス）中で４℃で保管した。

２．単離株の抗菌活性
Ａｌａｔｉｇチーズから単離された株の抗菌活性を、Ｅ． ｃｏｌｉ種の様々な標的生物に対して試験した。従って、９ｍＬのＭＲＳブイヨンを、１ｍＬの標的株の１８時間の新鮮な培養液と共に播種し、３７℃で１８時間インキュベートした。続いて、２５０ｍＬのＭＲＳブイヨンに、１０^８ＣＦＵ／ｍＬを含有する２％のこの予備培養液を接種し、３７℃で１８時間インキュベートした。細胞を遠心分離（１２０００ｇ、３０分、４℃）によって除去した。得られた上清を０．２２μｍのニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、ベッドフォード、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）によるろ過によって、殺菌した。

粗上清の抗菌活性を、ウェル拡散法（Ｂａｔｄｏｒｊ， Ｂ．， Ｄａｌｇａｌａｒｒｏｎｄｏ， Ｍ．， Ｃｈｏｉｓｅｔ， Ｙ．， Ｐｅｄｒｏｃｈｅ， Ｊ．， Ｍｅｔｒｏ， Ｆ．， Ｐｒｅｖｏｓｔ， Ｈ．， Ｃｈｏｂｅｒｔ， Ｊ．Ｍ．， Ｈａｅｒｔｌｅ， Ｔ． （２００６） “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ ａｉｒａｇ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１３６５‐２６７２．２００６．０２９６６．ｘ）によってミューラーヒントン寒天（Ｍｕｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ａｇａｒ）（Ｍｅｒｃｋ）上で試験した。従って、ペトリ皿に、標的株（Ｅ． ｃｏｌｉ ｏｒ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）の２４時間培養液を、１０^７ＣＦＵ／ｍＬで接種した。ペトリ皿を室温で１５分間乾燥させた。続いて、直径６ｍｍ、深さ４ｍｍのウェルを、寒天に作製した。次に、未処理状態のｐＨ（ｐＨ４．５）及び（１Ｍ ＮａＯＨ溶液によってｐＨ７．０に中和された）中性ｐＨの１００μＬの粗上清を、ウェルの中に堆積させた。同一のｐＨ値に調整され、ろ過によって殺菌された１００μＬのＭＲＳ培地のアリコートを、陰性対照として使用した。皿を４℃で２時間プレインキュベートすることにより、標的株の増殖を停止させ、寒天中に阻害剤を拡散させた後、３７℃で２４時間インキュベートした。このインキュベーションの期間後、抗菌活性を、ウェルの周りの阻害区域の直径を測定することにより、評価した。

未処理状態のｐＨにおいて、試験された全ての株はＥ． ｃｏｌｉ 及びＳ． ａｕｒｅｕｓ株に対する抗菌活性を発揮し、様々な直径の複数の阻害区域を呈した。記録された最大の阻害区域は直径約１７ｍｍのハロのものであり、この活性の原因となる株を選択し、更に特性決定した。

重要なことに、上清が中性化された場合には、抗菌活性は検出されなかった。これは、この拮抗作用における有機酸の可能な役割を示している。これに関して、様々な研究により、有機酸以外の、ほとんどがタンパク質性である１つ以上の阻害化合物による、乳酸桿菌の阻害能力が報告されており、その安定性はｐＨ２からｐＨ６まで観察された（Ｄｒｉｄｅｒ， Ｄ．， Ｒｅｂｕｆｆａｔ， Ｓ． （２０１１）． “Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ” Ｅｄｉｔｏｒ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ． ＮＹ ４５１ｐｐ））。他の研究は、ＬＡＢ（乳酸菌）が、酸性ｐＨにおいて完全に活性であり、中性ｐＨにおいて部分的に活性である、タンパク質性の阻害化合物を産生できることを示唆している（Ｍｏｒｔｖｅｄｔ‐Ａｂｉｌｄｇａａ， Ｃ．， Ｎｉｓｓｅｎ‐Ｍｅｙｅｒ， Ｊ．， Ｊｅｌｌｅ， Ｂ．， Ｇｒｅｎｏｖ， Ｂ．， Ｓｋａｕｇｅｎ， Ｍ．， Ｎｅｓ， Ｉ．Ｆ． （１９９５）． “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐＨ‐Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｉｎ Ｓ， ａ Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｆｒｏｍ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅ Ｌ４５”； Ｈｏｕｌｉｈａｎ ＡＪ１， Ｍａｎｔｏｖａｎｉ ＨＣ， Ｒｕｓｓｅｌｌ ＪＢ． （２００４）． “Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｏｖｉｃｉｎ ＨＣ５， ａ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ ＨＣ５” ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ２００４）。中性ｐＨにおける上清の抗菌活性の喪失は、酸性ｐＨで活性を有する有機酸以外の活性物質の存在を排除するものではない。この仮説を、５Ｍ ＨＣｌを用いて上清と同一のｐＨ値（ｐＨ４．５）に調整されたＭＲＳ培地によって確認した。実際に、Ｅ． ｃｏｌｉに対する抗菌活性は記録されなかった。

３．最高の拮抗性を有するＬＡＢ株の表現型同定
最も高い活性を有する株を、メーカーの推奨事項を用いて、ＡＰＩ（登録商標）５０ ＣＨＬギャラリー（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、マルシーレトワール、フランス）で同定した。寒天上での３７℃での２４時間の培養後の産生株の複数の同一のコロニー由来の細菌懸濁液を調製し、６００_ｎｍにおいて０．４５の吸光度（２マクファーランドに等しい不透明度）に到達するまで、「ＡＰＩ ５０ ＣＨＬ培地（ＡＰＩ ５０ ＣＨＬ ｍｅｄｉｕｍ）」中で希釈した。

均質化後、接種済みのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ培地をギャラリーの細管中で希釈した。必要に応じて、カップを無菌パラフィン油で覆い、起こり得るガスの放出を回避した。ギャラリーを３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、得られた生化学プロファイルを、ＡｐｉＷｅｂ（商標）ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ａｐｉｗｅｂ．ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ．ｃｏｍ）で分析した。

優良株をそのＡＰＩ ５０ ＣＨＬギャラリーを構成する４９個の炭水化物に対する発酵能力に関して分析した。正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の結果は、結果が正である場合に黒色になるエスクリンの細管を除いて、ｐＨインジケータ：ブロモクレゾールパープルの黄色への変化に相当する（試験された糖の発酵による培地の酸性化）。

このプロファイルをＩｄｅｎｔａｘ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ同定システムソフトウェア（ｗｗｗ．ｉｄｅｎｔａｘ．ｏｒｇ）によって分析した。この分析に基づくと、得られた結果により、この産生株がＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉと９９．５２％の相同性を有することが明らかになった。

４．抗菌活性に対するプロテアーゼ及びリパーゼの影響
上清の抗菌活性に対する様々な酵素の影響を、最適条件下で試験した。従って、上清の１００μＬのアリコートを、各酵素に適したｐＨにおいて０．０５Ｍの緩衝液中で２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製された１００μＬの酵素溶液と混合した後、ろ過によって殺菌した。使用した酵素及びそれらの操作条件を以下の表１に提示する。表１は、使用した酵素及びそれらの操作条件を示す。

３７℃で２時間のインキュベーション後、試料を水浴中で３分間沸騰させ、直ちに４℃まで冷却して酵素を不活性化した。（１Ｍ ＮａＯＨ又は１Ｍ ＨＣｌを用いて）ｐＨ５に調整され、ろ過によって殺菌され、おおよそ１００μＬまで濃縮された、これらの試料の残った抗菌活性を、ウェル拡散法によってＥ． ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９及びＥ． ｃｏｌｉ １８４に対して試験した。同様の条件下で処理された無菌ＭＲＳブイヨンの試料を陰性対照として使用した。

ＬＡＢ株によって産生された１つ以上の活性抗菌化合物の性質を、酵素処理後に残った活性に関して、ウェル拡散法によって決定した。タンパク質分解酵素が、未処理の対照によって呈される阻害区域の直径（１７ｍｍ）と比較して、関連する活性の喪失を誘発する場合、抗菌活性はタンパク質性化合物に起因していた。活性の部分的な喪失は、ペプシン、トリプシン、及びα‐キモトリプシンで処理された上清に関して観察され；この喪失はこれらの酵素で処理された試料の阻害区域直径の減少によって明らかになり、平均阻害区域はそれぞれ８．１６、１０．１６、８．８３ｍｍに等しかった。更に、抗菌活性は、パパイン及びプロテイナーゼＫによる処理後に完全に失われた。これらの結果は、抗菌活性が、過酸化水素、又は脂質若しくは多糖類の性質のいずれの物質によるものではなく、タンパク質性物質に起因する可能性が極めて高かったことを示唆している（表２を参照）。実際のところ、Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉに関連する抗菌活性は、他にも例があるものの少なくともバクテリオシンである。この株を、参照番号ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９としてＰａｓｔｅｕｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに登録及び寄託した。表２は、Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９培養上清の抗Ｅ． ｃｏｌｉ活性に対する酵素及びｐＨの影響を示す。

５．加熱処理及び保管プロセス後のＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ ５３６９（ＬＡＢ株）によって産生された１つ以上のバクテリオシンの安定性
Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ ５３６９の新鮮な培養液から遠心分離（８０００ｇ、４℃、１０分）によって得られた上清を、５、１０、１５、２０、３０、６０、及び１２０分にわたって、８０℃、９０℃、及び１００℃で加熱処理した。ウェル拡散法によって決定された抗菌活性は、８０℃及び９０℃での加熱処理の５分後には変化しないままであったが、１００℃ではそうではなかった。そして、効果は温度依存性であるように見え、活性は時間と共に低下した（表３）。表３は、加熱処理されたＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９培養上清の活性の結果を示す。

Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ ５３６９ 抗菌活性（抗Ｅ． ｃｏｌｉ）の安定性を、冷蔵、冷凍及び凍結乾燥条件下で評価した。４℃での保管は、Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ ５３６９の抗Ｅ． ｃｏｌｉ活性にほとんど影響を及ぼさなかった。というのは、任意単位／ｍＬ（ＡＵ／ｍＬ）で記録された総活性は、調製されたばかりの上清のものと同様であったためである。注目すべきことに、この活性は、保管時間がどのようなものであっても、４℃において安定したままだった。にもかかわらず、表４に示すように、冷凍及び凍結乾燥条件により、この活性は大幅に変化した。表４は、様々な保管条件下でのＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ ５３６９培養上清の活性を示す。

６．Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９による１つ以上の推定抗Ｅ． ｃｏｌｉバクテリオシンの産生の動態
Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ ５３６９による抗Ｅ． ｃｏｌｉ活性を有する１つ以上の推定バクテリオシンの産生の動態を、ＭＲＳ培地中での３７℃で７２時間にわたるバクテリオシン産生株の増殖時に、１ｍＬあたりの任意単位（ＡＵ／ｍＬ）を用いて評価した。１時間間隔で回収された培養上清を、以下の希釈比：１／２、１／４、１／８、１／１６、１／３２、及び１／６４に従って、ＭＲＳ培地中で連続的に希釈した。５０μＬの各希釈済み上清画分を、指示株、即ちコリスチン耐性の原因となるｍｃｒ‐１遺伝子を有するＥ． ｃｏｌｉ １８４を事前に接種した、（寒天を１％含有する）半固体ブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ：ＢＨＩ）培地上に堆積させた。ペトリ皿を、４℃で１時間、その後３７℃で１８時間インキュベートした。続いて、抗菌活性を培地１ミリリットルあたりの任意単位（ＡＵ／ｍＬ）で決定した。

同時に、無菌ＭＲＳ培地をブランクとして用いて、培養液の６００ｎｍにおける光学密度を、分光光度計で同一の実験期間中に監視した。図１に示したデータに基づくと、１つ以上の推定バクテリオシンの産生は、バクテリオシン産生株の細菌増殖と相関していると思われ、従って増殖の４８時間の間に徐々に増えている。

７．Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ５３６９の培養上清からの活性抽出物Ｅ２０画分の精製
ＭＲＳ培地上で振盪させることなく３７℃で２４～３０時間増殖させたＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ５３６９の培養液の遠心分離（８０００ｇ、１０分、４℃）によって、無細胞上清（ＣＦＳ）を得た。続いて、得られた４０ｍＬのＣＦＳを逆相Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ、アメリカ合衆国）カートリッジ上に装填した。その後、１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用いて洗浄ステップを実施し、続いて４０ｍＬの２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液を用いた溶出を実施して、活性画分を溶出させた。ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて活性画分を乾燥させ、初期体積１０の超純水中に１の割合で再懸濁させた。得られた活性溶液を、本文全体を通して画分Ｅ２０（又は特に図中ではＥ２０％）と呼ぶ。画分Ｅ２０を４℃で保管し、抗Ｅ． ｃｏｌｉ活性を特性決定するために様々な試験に使用した。注目すべきことには、Ｅ２０画分を、様々な遺伝子型を有するＥ． ｃｏｌｉ株のパネルに対して試験し、この画分に含まれる１つ以上の推定バクテリオシンに対するこれらの株の感受性を調査した。この評価は、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値（これらは２５０～２０００μｇ／ｍＬ（表５）であった）の決定により実施した。興味深いことに、Ｅ． ｃｏｌｉ １８４株及びＡＴＣＣ８７３９株は、同じＥ２０画分ＭＩＣ値を示し、コリスチンＭＩＣは、参照株Ｅ． ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９と比較して、Ｅ． ｃｏｌｉ １８４株に関して４倍高かった。表５は、Ｅ． ｃｏｌｉ株のパネルに対するＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ ５３６９の培養上清から得られたＥ２０画分に起因し得るＭＩＣ値を示す。

８．殺菌活性及び殺滅曲線分析
コリスチンに対する３つのＥ． ｃｏｌｉ株の耐性又は感受性を理由として、これらについて殺滅曲線を決定した。これらの株は、Ｅ． ｃｏｌｉ １８４（ｍｃｒ‐１）、コリスチンに対する耐性を有するＥ． ｃｏｌｉ Ｅ４Ａ４多様体、及びＥ． ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９コリスチン感受性参照株（表５）であった。これらの株を、Ｅ２０画分の半精製画分を阻害濃度で含有するＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）培地に接種した。阻害濃度のコリスチン（１６μｇ／ｍＬ）で処理された未処理のＥ． ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９対照も試験した。これらの様々な試料において培地のｐＨを４．５～５に調整し、３７℃で８時間インキュベートした。規則的な時間間隔で試料を採取して、各試験条件下の１ｍＬあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）の数を決定した。

図２に示されるように、１時間のインキュベーション後、Ｅ２０画分で処理された株のＣＦＵ／ｍＬの数は急速に減少し、目に見える増殖はなかった（０ＣＦＵ／ｍＬ）。しかしながら、Ｅ． ｃｏｌｉ １８４は２時間のインキュベーション後に同様の挙動を示した。コリスチン（１６μｇ／ｍＬ）で処理されたＥ． ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９に関しては、１時間のインキュベーション後に同様のデータが得られた。なお、対照として使用した未処理の株は、予期した通り、実験の間に通常発生する増殖曲線を示した（図２を参照）。

９．コリスチンとＥ２０画分との間の相乗的な相互作用
Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ ５３６９から調製されたＥ２０画分を半希釈し、ＢＨＩ培地中で、１～１２８μｇ／ｍＬの濃度のコリスチンと混合した。得られた調合物を、ｍｃｒ‐１遺伝子を有するＥ． ｃｏｌｉ １８４、及び他のＥ． ｃｏｌｉ株に対して試験した（表６）。３７℃での一晩のインキュベーションの後、Ｅ． ｃｏｌｉ株の増殖をＯＤ_{６００ｎｍ}における分光光度測定によって確認し、コリスチン／Ｅ２０の新規のＭＩＣ値を決定した。重要なことに、Ｅ２０画分とコリスチンとの組み合わせは、コリスチン単独により得られたＭＩＣに比べて、ＭＩＣ値を少なくとも４倍低下させた。実際に、Ｅ２０画分の存在下では、上記ＭＩＣ値は８μｇ／ｍＬから２μｇ／ｍＬまで減少した。この相乗的な相互作用は他のＥ． ｃｏｌｉ株に関しても同様に観察され、ＭＩＣ値は、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｅ４Ａ４ＷＴに関して２倍、Ｅ． ｃｏｌｉ ２８９に関して４倍、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｅ４Ａ４多様体に関して８倍低下した。Ｅ． ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ８７３９、ＳＢＳ３６及びＴＯＰ１０は、抗生物質に対するＭＩＣ値のいかなる低減も示さなかったことに留意されたい（表６を参照）。表６は、様々なＥ． ｃｏｌｉ株に対して、コリスチン単独で得られたＭＩＣ値、及びＥ２０画分と組み合わせて得られたＭＩＣ値を示す。Ｅ２０画分＋コリスチンの混合物の重量組成は、ＭＩＣ値の隣の丸括弧内に示されている。最初の値はコリスチンの量（μｇ／ｍＬ）を指し、丸括弧の中のその次の値はＥ２０画分の量（μｇ／ｍＬ）を指す。

表６の結果によると、少なくとも９９％のＥ２０及び１％のコリスチンを含有する混合物は、複数の株において、また更にはコリスチン耐性株において、コリスチン単独と同等の効果を有し得る。更に、Ｅ２０とコリスチンとの組み合わせにより、Ｅ２０の量の低減及び混合物Ｅ２０＋コリスチン自体の量の低減が可能となる。

１０．細胞傷害性アッセイ
Ｅ２０画分の細胞傷害性を、ブタ腸管上皮細胞（ＩＰＥＣ‐１）に対してインビトロで評価した。従って、各ウェルの底部でコンフルエントな細胞培養液が形成されるまで、５％ＣＯ_２雰囲気下の９６ウェル組織培養プレート上で３７℃で４８～７２時間培養された、ＩＰＥＣ‐１細胞を用いて、細胞傷害性アッセイを実施した。ＭＲＳ培地中の２４～３０時間経過した培養液から採取されたＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ ５３６９の細胞と、半精製Ｅ２０画分とを、抗生物質及び血清を含まないＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグル培地））培地中で、それぞれ１００倍及び４倍に希釈した後で、試験した。抗生物質及び血清を含まないＤＭＥＭ培地を、対照として試験した。上述したように、希釈済みのＣＦＳ試料及びＥ２０試料で処理されたＩＰＥＣ‐１細胞を含むプレートを、５％ＣＯ_２雰囲気中で、３７℃で２４時間インキュベートした。活性ミトコンドリアによるテトラゾリウム塩の還元に基づいたＣＣＫ‐８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、日本）を用いて、処理済みのＩＰＥＣ‐１細胞の細胞生存率を評価した。７．５μＬのＣＣＫ‐８試薬を含む１５０μＬのＤＭＥＭを各ウェルに添加し、細胞を２時間インキュベートした。プレートを、マイクロプレートリーダー分光光度計（Ｘｅｎｉｕｓ、Ｓａｆａｓ、モナコ）において４５０ｎｍで読み取った。結果は、処理されていない細胞（図３を参照）を用いて観察された基底増殖の％で表現した。図３の結果は、Ｅ２０画分がブタ腸管上皮細胞（ＩＰＥＣ‐１）に対して毒性でないことを示している。というのは、生存の％がＥ２０画分で処理されたＩＰＥＣ‐１細胞に関して１５０％に等しいためである。

１１．アルギン酸ナノ粒子（Ａｌｇ ＮＰ／Ｅ２０）に対するＥ２０画分の添加
Ａ．アルギン酸ナノ粒子（Ａｌｇ ＮＰ）の調製及びその特性決定
Ａｌｇ ＮＰを、遊星ボールミルによる費用対効果が高い技法を用いて調製した。この技法で、バルク粉末アルギン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｗ２０１５０２）試料を用いて、Ａｌｇ ＮＰを調製した。２ｇのアルギン酸ナトリウムと１３個の焼入鋼ボール（総重量＝１１２ｇ；直径１０ｍｍのボールが１０個＋直径２０ｍｍのボールが３個）とを用いて、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）バイアル（容積＝５０ｍＬ）中でミリングを室温で実施した。ミリングプロセスは、４４０ｒｐｍの回転速度を用いて１０時間続けた。ミリングプロセスの終了時にＡｌｇ ＮＰを回収し、２５℃で１時間の超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ２８００、周波数：４０ＫＨｚ）によりＭｉｌｌｉ‐Ｑ水（０．５ｍｇ／ｍＬ）に溶解させた。

アルギン酸ナノ粒子（０．５ｍｇ／ｍＬ）は、いずれの明らかな沈殿又は凝集もなしに、＋４℃で３ヶ月にわたって安定である。

アルギン酸ナノ粒子（Ａｌｇ ＮＰ）の特性決定
動的光散乱法（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ：ＤＬＳ）、走査電子顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ：ＳＥＭ）、フーリエ変換赤外（Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ：ＦＴＩＲ）分光法、及び熱重量分析（ｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＴＧＡ）測定といった様々な技法を用いて、Ａｌｇ ＮＰを特性決定した。

走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）
試料の形態を、ＵＬＴＲＡ５５（Ｚｅｉｓｓ、フランス）走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって検査した。Ａｌｇ ＮＰの水溶液（５００μｇ．ｍＬ^－１）を清潔なシリコン基板上に数滴堆積させ、その後１００℃で１時間にわたり水分を蒸発させることにより、ＳＥＭ分析の試料を調製した。結果は図４に示されている。

ＳＥＭ分析は、ナノ粒子が広範な粒径分布（５０～２００ｎｍ）を有することを示している。

動的光散乱法（ＤＬＳ）測定
合成されたナノ複合体の流体力学的サイズ及び表面電荷を、２５℃で、動的光散乱法原理（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ、ＮａｎｏＺＳ）を用いて決定した。溶液は分析前に新たに調製したものであり、報告されたデータは３つの独立した測定の平均である。図５ａに示されているＤＬＳ測定により、平均粒径１１８ｎｍのナノ粒子のゼータ電位がｐＨ７．２において３２ｍＶである（ｐＨ５ではゼータ電位は１２ｍＶである）ことが明らかになった（図５ｂを参照）。これはＡｌｇ ＮＰが負の電荷を帯びていることを示す。

熱重量分析（ＴＧＡ）
熱重量分析（ＴＧＡ／ＤＴＧ）を、ＴＧ／ＤＴＧ ＮＥＴＺＳＣＨ ＴＧ ２０９ Ｆ３機器上で実施した。１０ｍｇのアルギン酸ナノ粒子を添加し、試料を窒素雰囲気下で加熱速度１０℃／分で３０℃から９８０℃に加熱することにより、サーモグラムを記録した。

図６は、様々な重量損失を示す、Ａｌｇ ＮＰの熱挙動を示す。最初の重量損失（＜１００℃）は、ナノ粒子表面からの水分の脱離に相当する。次の急な重量損失は、２００～２５０℃の間に発生し、これはナノ粒子のポリマー鎖の分解に対応する可能性がある。その後、安定した連続的な重量損失が観察され、残った質量は９８０℃において＜１５％である。

フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｉｎｃ，製Ｎｉｃｏｌｅｔ ３８０上で実施した。試料を、１ｍｇのＡｌｇ ＮＰを１００ｍｇの臭化カリウム（ＫＢｒ）と混合することにより作製されたパレット（ｐａｌｌｅｔ）形態で、ＩＲ照射で分析した。その後、混合物を適切に粉砕して、ＫＢｒベース中での均一な分布を保証した。最後に、粉砕した混合物を、～７～９トンの圧力を印加することによる水圧プレスでプレスした。更に、Ａｌｇ ＮＰの化学組成を、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）によって評価した。アルギン酸ナトリウム前駆物質のＦＴＩＲスペクトルは、ヒドロキシル、エーテル及びカルボキシ官能基の特徴的な振動バンドを含む。３４３１ｃｍ^－１の幅広く強力な振動ピークは、Ｏ‐Ｈ結合の伸縮振動に対応する。脂肪族Ｃ‐Ｈ基の伸縮振動は、２９２０及び２８５０ｃｍ^－１において観察された。１６２５及び１４１４ｃｍ^－１におけるバンドはそれぞれ、カルボン酸塩イオンの非対称な伸縮振動及び対称な伸縮振動によるものである。１０３２ｃｍ^－１におけるピークは、Ｃ‐Ｏ振動によるものである。

Ａｌｇ ＮＰのＦＴＩＲスペクトルは同様のバンドからなり、これは、アルギン酸前駆物質の化学組成及び構造が、ボールミリングプロセスを用いたナノ粒子の形成中に変化しなかったことを示す（結果は図示せず）。

アルギン酸ナノ粒子／Ｅ２０画分（Ａｌｇ ＮＰ／Ｅ２０）の特性決定
アルギン酸ナノ粒子へのＥ２０の添加は、表７に示されているように、アルギン酸ナノ粒子の粒径に大きな影響を及ぼさなかった。実際に、ＤＬＳ測定により、ｐＨ７におけるＡｌｇ ＮＰの平均粒径が１１８ｎｍであり、ｐＨ５において記録された１２０ｎｍに匹敵するものであることが明らかになった。Ａｌｇ ＮＰにＥ２０画分を添加すると、わずかな粒径の増大（４ｎｍ）が観察され、これは、ナノ粒子の表面にペプチドが吸着されたことの良好な指標となる。結果は、ゼータ電位測定によって裏付けられる。Ａｌｇ ＮＰの表面は、負の電荷を帯びており（ｐＨ７において－３２ｍＶ）、（ｐＨ５において－１２ｍＶ）、Ｅ２０を添加すると中性になる。表７は、Ｅ２０画分をＡｌｇ ＮＰの表面に添加する前及び後の、Ａｌｇ ＮＰの粒径及び表面電荷を示す。

Ｅ２０画分に対するＡｌｇ ＮＰの吸着キャパシティの決定
Ａｌｇ ＮＰ上に添加できるＥ２０の最大量の決定は、遊離Ｅ２０画分の活性と、Ａｌｇ ＮＰ上に吸着されたものの活性とを区別するための、重要なパラメータである。これは、Ａｌｇ ＮＰへのコリスチンの添加に関して得られた結果に基づいて行った。Ａｌｇ ＮＰ上に吸着されたコリスチンの量を、ＨＰＬＣを用いて評価した。Ａｌｇ ＮＰ（５００μｇ／ｍＬ、水中）をコリスチン（２０、４０、５０、６０、８０、及び１００μｇ／ｍＬ）と混合し、室温で６０分間の超音波処理に供することにより、Ａｌｇ ＮＰ／コリスチンの様々な溶液を調製した。各混合物を、８ｋＤａ膜を用いて室温で２４時間透析し（水は６時間ごとに交換した）、溶液中のコリスチンの量をＨＰＬＣによって決定した。図８から、５００μｇ／ｍＬのＡｌｇ ＮＰ上に吸着できるコリスチンの最大量は６０μｇであると結論づけることができた。これは１２重量％に相当する。研究全体において、本発明者らは、様々な調合物の抗菌活性を調査するために、Ｅ２０又はＥ２０＋小分子（以下「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」という）及び５００μｇ／ｍＬのＡｌｇ ＮＰの合計量を６０μｇとした。

細胞傷害性の研究
様々な調合物（Ａｌｇ ＮＰ、Ａｌｇ ＮＰ＋Ｅ２０、Ａｌｇ ＮＰ＋Ｅ２０＋小分子）の細胞傷害性を、ヒト結腸癌（ＨＴ‐２９）及びブタ腸管上皮細胞（ＩＰＥＣ‐１）に対してインビトロで評価した。従って、各ウェルの底部でコンフルエントな細胞培養液が形成されるまで、５％ＣＯ_２雰囲気下の９６ウェル組織培養プレート上で３７℃で４８～７２時間培養された、ＨＴ‐２９及びＩＰＥＣ‐１細胞株を用いて、細胞傷害性アッセイを実施した。様々な調合物と、半精製Ｅ２０画分とを、抗生物質及び血清を含まないＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグル培地））培地中で試験した。抗生物質及び血清を含まないＤＭＥＭ培地を、対照として試験した。上述したように様々な調合物で処理されたＨＴ‐２９及びＩＰＥＣ‐１細胞を含むプレートを、５％ＣＯ_２雰囲気中で、３７℃で２４時間インキュベートした。活性ミトコンドリアによるテトラゾリウム塩の還元に基づいたＣＣＫ‐８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、日本）を用いて、処理済みのＨＴ‐２９又はＩＰＥＣ‐１細胞の細胞生存率を評価した。７．５μＬのＣＣＫ‐８試薬を含む１５０μＬのＤＭＥＭを各ウェルに添加し、細胞を２時間インキュベートした。プレートを、マイクロプレートリーダー分光光度計（Ｘｅｎｉｕｓ、 Ｓａｆａｓ、モナコ）において４５０ｎｍで読み取った。結果は、処理されていない細胞（図８～１１）を用いて観察された基底増殖の％で表現した。

図８～１１の結果は、Ａｌｇ ＮＰが、調査された細胞株に対するいかなる明らかな細胞傷害性も呈さないことを明らかにしている。同様に、Ａｌｇナノ粒子に添加された遊離Ｅ２０（１２％）、並びにＥ２０及びＥ２０＋小分子は、ＨＴ‐２９及びＩＰＥＣ‐１細胞株に対して明らかな細胞傷害性効果を有しない。

Ａｌｇ ＮＰとＥ２０との組み合わせの生物学的活性
アルギン酸ナノ粒子（Ａｌｇ ＮＰ）をトップダウンプロセス（ボールミリング）によって得て、濃度５００μｇ／ｍＬで使用した。Ｅ２０画分を、使用されるＡｌｇ ＮＰの濃度の１２％に相当する濃度６０μｇ／ｍＬで、この懸濁液と混合した。この混合物を酢酸の添加によりｐＨ５に調整し、表８に列挙されている標的株に対して試験した。表８の結果から、活性は、Ｅ２０画分単独で得られた活性と比較して大幅に増大した。アルギン酸ナノ粒子の影響に対する見識を得るために、コリスチンもＡｌｇ ＮＰ上に添加し、得られた調合物（コリスチン‐Ａｌｇ ＮＰ）を同一の標的Ｅ． ｃｏｌｉ株に対して試験した。結果として、ＭＩＣ値は、コリスチン単独で得られたＭＩＣ値と比較して大幅に低下した。この効果は特に、コリスチンに対する耐性を示すＥ． ｃｏｌｉ １８４及び２８９株に対して顕著であった（表８）。

更に、本発明者らは、２％という低い濃度における乳酸の効果並びにメンソール及びチモール（精油）の効果を試験した。ＭＩＣ値に関して、本発明者らは、有機酸及び精油を含むこれらの分子は、関心の対象となり得、これらのＥ２０画分及びコリスチンとの組み合わせは調査する価値があると結論づけた。表８は、Ａｌｇ ＮＰと様々な分子との組み合わせに基づいた様々な調合物の、Ｅ． ｃｏｌｉ株に対する効果に関する結果を示す。

重要なことに、Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ５３６９によって産生されるＥ２０画分に起因する抗Ｅ． ｃｏｌｉ活性は、大いにｐＨ依存性である。実際に、活性はｐＨ４．５～ｐＨ５においてのみ観察された。この制限されたｐＨ活性は、ブタ、主に離乳後の子ブタの胃腸区画で遭遇する様々なｐＨ値によっていずれの用途にも無力となり得る。

従って、単独の又は精油若しくは乳酸と組み合わせたＡｌｇ ＮＰ／抗菌剤をベースとする調合物を、様々なｐＨ値において試験した。

実際には、様々な調合物をｐＨ値６及び７において試験し、その後ｐＨ２において２時間インキュベートし、食道、胃、及び十二指腸を通過する間に遭遇するｐＨ値に相当するｐＨ５及びｐＨ７において、再び試験した。すると、試験した様々な調合物の活性は、ｐＨがｐＨ５より高い場合に低下するように思われ、ＭＩＣ値は、ｐＨ５において４μｇ／ｍＬであったが、ｐＨ６及び７においてそれぞれ１６μｇ／ｍＬ及び３２μｇ／ｍＬであった。しかしながら、０．２重量％の乳酸又は２若しくは４重量％の精油、即ちメンソール若しくはチモールとの組み合わせにより、ｐＨ値に関係なく、ＭＩＣ値２～４μｇ／ｍＬを維持できた（表９を参照）。表９は、Ｅ２０及び乳酸又は精油を伴うＡｌｇ ＮＰのＥ． ｃｏｌｉ １８４（ｍｃｒ‐１）株に対するアンタゴニスト活性へのｐＨの影響に関する結果を示す。

２％若しくは４％の精油（メンソール若しくはチモール）又は０．２％の乳酸を伴う、Ｅ２０画分及びＡｌｇ ＮＰを含有する調合物を、離乳後の子ブタの消化管で遭遇する消化酵素の連続的な作用に供した。Ｚｈｏｎｇら（Ｚｈｏｎｇ， Ｒ．Ｚ．， Ｘｉａ、 Ｊ．Ｑ．， Ｓｕｎ， Ｈ．， Ｑｉｎ， Ｇ．Ｘ． （２０１７） Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， ｂｌｏｏｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ ｄｉｇｅｓｔａ ｏｆ ｎｅｗｌｙ ｗｅａｎｅｄ ｐｉｇｌｅｔｓ． Ｊ Ａｎｉｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ａｎｉｍ Ｎｕｔｒ （Ｂｅｒｌ）． ２０１７ Ｏｃｔ；１０１（５）：ｅ３１２‐ｅ３２２． ｄｏｉ： １０．１１１１／ｊｐｎ．１２６０７）によって記載された条件に従って、第１のインキュベーションを３９℃で３０分間実施し、ペプシン（１５Ｕ／ｍＬ）の存在下でｐＨ３において振盪させ（１４０ｒｐｍ）、その後、同様の温度条件及び撹拌条件下でｐＨ６において第２のインキュベーションを実施し、最後にキモトリプシン（５Ｕ／ｍＬ）及びトリプシン（４０Ｕ／μＬ）を添加してから、ｐＨ６において振盪（１４０ｒｐｍ）させながら３９℃で２時間のインキュベーションを実施した。

ｐＨ３のペプシンの存在下で実施された第１のインキュベーションの間、画分Ａｌｇ ＮＰ／Ｅ２０及び乳酸を伴うＡｌｇ ＮＰ／Ｅ２０のＭＩＣ値はそれぞれ、１６μｇ／ｍＬから３２μｇ／ｍＬへ、及び２μｇ／ｍＬから４μｇ／ｍＬへと増加した（表１０）。にもかかわらず、２％又は４重量％の精油の存在下において、記録されたＭＩＣ値は、酵素で処理されていないものの同様の温度、撹拌、及びｐＨ条件下でインキュベートされた調合物に関して記録されたＭＩＣ値と違わなかった。

これらの結果は、Ｅ２０画分、Ａｌｇ ＮＰ並びに精油及び／又は乳酸の組み合わせが、子ブタの胃及び小腸の第１のセグメントにおける猛烈なｐＨ条件、温度、及び消化酵素の存在を特色とする、子ブタの胃腸環境の過酷なシミュレーションに対する耐性を有するために、十分ロバストなものであることを強調している。表１０は、乳酸又は精油を伴うアルギン酸ナノ粒子／Ｅ２０画分をベースとする調合物の、Ｅ． ｃｏｌｉ １８４（ｍｃｒ‐１）に対する拮抗活性に対する、消化酵素の影響に関する結果をまとめたものである。

１２．Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ５３６９のゲノムのインシリコ解析
Ｂａｇｅｌ ３オンライン解析ソフトウェア（ｂａｇｅｌ．ｍｏｌｇｅｎｒｕｇ．ｎｌ）を用いたＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ５３６９のゲノムのインシリコ解析により、バクテリオシン様タンパク質を潜在的にコードする複数のオープンリーディングフレーム（図１２）を同定した。更に、Ｊｐｒｅｄソフトウェア（ｗｗｗ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／ｊｐｒｅｄ／）を用いた、これらの遺伝子から翻訳されたアミノ酸配列の分析により、１２ＫＤａにおいておおよそ３．２の予測サイズを有する５つのペプチドの特性決定が可能となった（表１１）。

最初に同定された推定バクテリオシンの予測サイズは、３，１９９Ｄａであり、２９個のアミノ酸を有し、クラスＩＩバクテリオシンの特性及び５．１７のｐＩを有する。第２及び第３の推定バクテリオシンの予測サイズは６，３００及び６，５８２Ｄａであり、これらはそれぞれ６０個及び６３個のアミノ酸を有する。これらの２つのペプチドはそれぞれ、４．８６及び８．２５の推定ｐＩ値を有し、これらもまたクラスＩＩバクテリオシンに属する。２つの最大のオープンリーディングフレームは、１０ｋＤａより大きい、それぞれ１０、３９５Ｄａ超及び１２，２５２Ｄａ超の、１０１個及び１１１個のアミノ酸を有するペプチドを潜在的にコードする。計算されたｐＩはそれぞれ８．６２及び６である。最後の２つの予測されるペプチドも、クラスＩＩバクテリオシンに属する（表１１は、Ｂａｇｅｌ ３ソフトウェアによって同定されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に相当する、可能性のあるバクテリオシンのアミノ酸配列を示す）。

推定バクテリオシンのためのｏｒｆコード化をそれぞれ、Ｅ． ｃｏｌｉコンピテント細胞に適した発現ベクターにおいてクローニングした。各ｏｒｆを、誘導性Ｔ７プロモータの制御下でクローニングし、ここでＨｉｓタグ（６Ｈｉｓ）テールはＮ末端又はＣ末端部分に位置する。ＨｉｓタグテールのＮ末端又はＣ末端位置における各ｏｒｆのクローニングは、１０個の組換えプラスミドをもたらした。各上記組換えプラスミドをＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐｌｙｓＳ）コンピテント細胞に導入した。首尾よく形質転換されたＥ． ｃｏｌｉを、ＳＯＣ培地中で１６０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で１時間にわたり再生し、その後アンピシリン（１００μｇ ｍＬ^－１）及びクロラムフェニコール（３０μｇｍＬ^－１）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＬｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天に対して選択した。３７℃における一晩のインキュベーションの後、抗生物質を含むＬＢ寒天上で得られたコロニーを、特定のプライマーを用いたＰＣＲによって、適切にクローニングされたｏｒｆを含有する組換えプラスミドの存在に関して確認した。

各組換えプラスミドを有するＥ． ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）の一晩の培養液を、アンピシリン（１００μｇｍＬ^－１）及びクロラムフェニコール（３０μｇｍＬ^－１）を含有するＬＢ培地中で１％（体積／体積）に希釈し、その後３７℃で好気的に増殖させた。光学密度が６００ｎｍにおいて０．８に達したとき、濃度１ｍＭのイソプロピル‐β‐ｄ‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ）の添加によって、遺伝子発現を誘導した。細胞を更に５時間増殖させ、遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）によって試料を採取し、細胞ペレットをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に保持した。続いて、細胞ペレットを、１０ｍＭのイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）を含有するｐＨ７．９のＰＢＳ緩衝液中で再懸濁した。細菌懸濁液を２分間にわたり５回超音波処理して、細胞を撹乱し、溶解した。細胞質不溶性画分及び細胞残屑からの細胞質可溶性画分（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＣＳＦ）の分離を、遠心分離（１４，０００×ｇ、１５分、４℃）によって実施した。ＣＳＦをろ過（０．４５μｍ孔径フィルタ）し、その後１ｍＬニッケルＨｉｓ‐Ｔｒａｐキレートカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に直接装填した。装填後、カラムを、３０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．９）を含有するＰＢＳで連続的に洗浄した。Ｈｉｓタグを有するクローニングされたｏｒｆによってコードされたペプチドを、２５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．９）を含有する２ｍＬのＰＢＳで溶出した。続いて、得られた溶液を、酢酸を用いてｐＨ５に調整した後、上述したように、Ｅ． ｃｏｌｉコリスチン耐性株に対する活性（ＡＵ／ｍＬ）を評価した。

結果は、Ｎｉ‐ＮＴＡカラム上の全ての精製された組換えペプチドが約４００～８００ＡＵ／ｍＬを有することを示した。興味深いことに、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付き組換えペプチドｏｒｆ‐３８は、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きの対応物の活性である４００ＡＵ／ｍＬよりも良好な、８００ＡＵ／ｍＬの活性を示した。

表１２は、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）における異種発現によって合成される組換えペプチドの抗Ｅ． ｃｏｌｉ活性（ＡＵ／ｍＬ）の結果を示す。

１３．抗微生物剤の寒天拡散試験
寒天拡散試験により、抗菌活性をグラム陰性菌及びグラム陽性菌のセット（表１）に対して評価した。ＭＲＳブイヨン上で３７℃で１８～２４時間増殖させたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９（８０００ｇ、１０分、４℃）の一晩の培養液を遠心分離することによって、抗菌活性のために使用する無細胞上清（ＣＦＳ）を得た。４２℃の溶解した１％ＢＨＩ軟寒天に指示株を１％（ｖ／ｖ）で接種した後、培地をペトリ皿に注ぎ、クリーンベンチ下で２０分間放置した。続いて、ウェルを凝固ＢＨＩ軟寒天内に作製し、ｐＨ４．５～５に調整された５０μｌのＣＦＳ又はＥ２０画分をウェルに注いだ。ペトリ皿を無菌条件で室温で１時間放置した後、十分な温度で１８時間にわたってインキュベートした。この期間後、ＣＦＳ又はＥ２０画分を含むウェルの周りの阻害区域を検出することにより、抗菌活性を決定した。

表１３は、Ｌｂ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ‐ＣＮＣＭ ５９６由来の無細胞上清（ＣＦＳ）及びＥ２０画分の抗微生物活性を示す。

表１３に示されているように、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の大半は、明白な阻害区域によってマークされているように、Ｅ２０画分による影響を受けた。ＣＦＳの活性は低かったが、試験したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ａｎｄ Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は明らかに阻害され、１～３ｍｍの阻害区域を呈した。

１４．組換えペプチドの抗微生物活性の定量化
精製組換えペプチドの抗微生物活性を決定し、ミリリットルあたりの任意単位（ＡＵ／ｍＬ）で表した。組換えペプチドの混合物は、等しい体積（１００μｌ）の各ペプチドを添加して撹拌することにより得られた。簡潔に述べると、活性試料を超純水中で順次希釈し、活性試料のｐＨを、以下の希釈比：１／２、１／４、１／８、１／１６、１／３２、及び１／６４に従って酢酸を用いて、ｐＨ４．５～５に調整した。その後、１０μＬの各希釈済み上清を、指示株（ｍｃｒ‐１^＋）として使用されるＥ． ｃｏｌｉ １８４を予め接種した１％ＢＨＩ培地寒天上に堆積させた。プレートを４℃で１時間インキュベートし、その後３７℃で１８時間インキュベートした。ＡＵ／ｍＬで表される抗菌活性は、指示株の阻害をもたらす最も高い希釈の逆数（２^ｎ）として定義される。ＡＵ／ｍＬは２^ｎ×１００μＬ／堆積させた体積（μＬ）として定義される。

表１４は、Ｅ． ｃｏｌｉ １８４に対する融合組換えペプチドの抗微生物活性を示す。

各精製組換えペプチドは、２００～４００ＡＵ／ｍｌの抗微生物活性を示したが、５つの組換えペプチドの混合物に関して登録された抗微生物活性は８００ＡＵ／ｍｌであった。

１５．子ブタの胃腸シミュレーション条件に対するＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９の耐性
子ブタの静的インビトロ消化モデルを用いて、このような条件に対するＬ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９の生存率を評価した。

実際には、このモデルは、温度、ｐＨ、胆汁塩濃度、及び酵素といった、子ブタ胃腸（ＧＩ）環境の消化プロセスに関与するパラメータを再現する。なお、ｐＨ変動のみの影響も、並行して研究した。消化の口、胃、及び小腸段階を、各段階及び区画の生理学的条件を模倣した流体を用いてシミュレートした。３７℃のＭＲＳ培地中での１８～２４時間の培養後、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を遠心分離（８，０００ｇ、４℃、１０分）によって回収した。細胞ペレットを、十分な量のＰＢＳ緩衝液中で２回洗浄した。口段階は、１４０ｒｐｍにおける３９℃での５分間の撹拌下で、６．８～７に調整されたｐＨを有する頬条件を再現した。その後、１５Ｕ／ｍＬのブタペプシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（ｐＨ３～３．５）を含有する胃液を添加することにより、胃段階をシミュレートした。この３０分の段階を、前の段階（３９℃、１４０ｒｐｍ）と同様の温度及び撹拌条件で実施した。続いて１Ｍ ＮａＯＨ溶液をバッチに添加して、ｐＨ溶液をｐＨ６まで上昇させて、ペプシン消化を停止させ、胃から十二指腸区画への通過を模倣する。十二指腸段階は、膵酵素（トリプシン４０Ｕ／μＬ；キモトリプシン５Ｕ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及び胆汁（６０ｇ／Ｌ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加を含んでいた。続いて、腸消化プロセスをｐＨ６において２時間にわたって実施した（３９℃、１４０ｒｐｍ）。この消化シミュレーションプロセスの各段階後に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞の試料を回収し、生理食塩水緩衝液中で希釈した。その後、１００μＬの十分な希釈液をＭＲＳ寒天プレートにプレーティングして、３７℃で１８～２４時間インキュベートし、十分に増殖させた。１ミリリットルあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を決定した。統計分析。３つの独立した実験に対して計算された標準誤差（ｍｅａｎ ± ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ）としてデータを表現した。統計学的有意性の解析を、ＸＬ‐ＳＴＡＴ（Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ、ボルドー、フランス）を用いた一元配置分散分析及びｐｏｓｔ‐ｈｏｃ Ｔｕｋｅｙ試験（Ｐ＜０．０５）を用いて行った。

得られた結果は図１３に示されている。これらのデータは全体として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９が、子ブタの消化シミュレーションプロセス中に発生する条件に対して良好な耐性を有することを示す。消化プロセスの開始時に～１０^１０ＣＦＵ／ｍＬであった生存細菌細胞の当初の個数は、対数で２～３だけ減少した。この現象は、ｐＨ変動によるものである可能性が極めて高い。これは注目すべきことに胃区画内であった。

１６．細胞傷害性アッセイ
ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９及びＥ２０画分の安全性をクリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）染色アッセイを用いてＣａｃｏ‐２細胞ヒト結腸直腸腺癌細胞に対してインビトロで評価した。Ｃａｃｏ‐２細胞を、９６ウェル細胞培養プレートに６×１０^４細胞／ウェルの密度で播種して、７日間プレインキュベートした。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの一晩の培養液及びＥ２０画分をＰＢＳ中で調製し、その後コンフルエントなＣａｃｏ‐２細胞単層上に、Ｃａｃｏ‐２／Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ並びに希釈済みＥ２０画分に関するＭＯＩ（感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ））が１：１０及び１：１００の比となるように、４Ｘ及び８Ｘ（Ｘ＝回）塗布した。インキュベーション後、培地を除去して細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．５％（ｗ／ｖ）の１５０μＬのクリスタルバイオレット染料を用いてインキュベートし、振盪させながら室温で２０分間インキュベートした。染料を除去して脱イオン水で洗浄し、プレートを乾燥させて、残った染料を、ウェルに２００μＬのメタノールを添加することにより可溶化した。続いて、マイクロプレートリーダー（Ｘｅｎｉｕｓ ＳＡＦＡＳ、モナコ、フランス）を用いて、５７０ｎｍにおける吸光度に基づいて、相対生存率（％）を計算した。結果を、未処理の対照細胞の生存率と比較した増殖のパーセンテージとして表した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００界面活性剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、細胞傷害性の陽性対照として０．０１％（ｖ／ｖ）で使用した。結果は図１４に示されている。図１４のデータは、Ｃａｃｏ‐２＞９０％の生存率を示しており、従ってこれは、試験した両方のＭＯＩにおけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９について、及び希釈済みＥ２０画分について、細胞傷害性がなく安全であることを示唆している。なお、ブタ腸上皮ＩＰＥＣ‐１細胞でも同様の結果が得られた。

１７．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株による、Ｃａｃｏ‐２細胞及びＩＰＥＣ‐１細胞へのＥ． ｃｏｌｉ １８４の接着の阻害
ヒト結腸直腸腺癌Ｃａｃｏ‐２細胞及びブタ腸上皮ＩＰＥＣ‐１細胞を用いて、接着及び阻害アッセイを確立した。これに関して、４．５ｇ／Ｌのぶどう糖を含有し、Ｌ‐グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、１０％の熱失活させたウシ胎児血清（ｈｅａｔ‐ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、及び１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、細胞を、３７℃で、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の存在下で増殖させた。続いて、２４ウェル組織培養プレートを用いて、単層のＣａｃｏ‐２細胞及びＩＰＥＣ‐１細胞を調製した。ウェルに、１ウェルあたり４．１０^４個のＣａｃｏ‐２／ＩＰＥＣ‐１細胞を接種し、全てのプレートを７日間インキュベートした。２つの異なるプロトコルを用いて、バクテリオシン産生株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９、及びバクテリオシンを産生しないＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＦＢ１による、Ｅ． ｃｏｌｉ １８４の競争／排除を区別した。

排除試験のために、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株（～１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）を１ｍＬのＰＢＳで洗浄して、ＤＭＥＭ血清中で再懸濁し、抗生物質を含まないものとした。続いて、これらをＣａｃｏ‐２／ＩＰＥＣ‐１細胞単層に添加し、３７℃で９０分間（５％ＣＯ_２）インキュベートした。その後、非接着性Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を、ＰＢＳで２回洗浄することにより除去し、Ｅ． ｃｏｌｉ １８４（～１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株と同じ方法で調製した。これらを添加して、３７℃で更に２時間インキュベートした。

競争試験のために、上で示したように調製されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株（１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）と病原体株（１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）とを混合し、Ｃａｃｏ‐２／ＩＰＥＣ‐１単層に添加して、３７℃で２時間インキュベートした。Ｃａｃｏ‐２／ＩＰＥＣ‐１単層を５００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、２００μＬのトリプシン／ＥＤＴＡを用いて１５分間インキュベートして、接着性細菌を有するＣａｃｏ‐２／ＩＰＥＣ‐１細胞を除去した。

排除及び競争試験の後、接着性Ｅ． ｃｏｌｉ １８４細胞の計数を、エオシンメチレンブルー（Ｅｏｓｉｎｅ Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｂｌｕｅ：ＥＭＢ）で実施した。病原体接着率を、１００％の接着を示す対照（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を含まない病原体を含有するウェル）と比較して決定した。得られた結果は図１５（１５Ａ及び１５Ｂ）に示されている。図１５に示されているように、バクテリオシン産生性のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９（ｂａｃ＋）が、Ｃａｃｏ‐２単層及びＩＰＥＣ‐１単層上の接着性Ｅ． ｃｏｌｉ １８４の数を、対照アッセイ（処理していない）に比べて８０～９０％だけ減少させたことが明らかである。なお、バクテリオシンを産生しないＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＦＢ１（ｂａｃ－）株は、子ブタＩＰＥＣ‐１単層に対するＥ． ｃｏｌｉ １８４の接着に影響を与えなかった。しかしながら、この株は、未処理の対照に比べて、ヒトＣａｃｏ‐２単層細胞上の接着性Ｅ． ｃｏｌｉの数を～６０～７０％減少させることができた。これは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９に関して得られたものよりも大幅に低いままである。

１８．インタクト細胞及び細胞内無細胞抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性：
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ細胞をＭＲＳ培地中で３７℃で１８時間増殖させ、細胞を遠心分離（８０００ｇ、４℃で１０分間）によって採取した。細胞をＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７、２）で３回洗浄し、ＰＢＳ中に１^１０ＣＦＵ／ｍＬで再懸濁することにより、インタクト細胞を得ることができた。更に、細胞内無細胞抽出物を調製するために、細胞ペレットを脱イオン水で２回すばやく洗浄し、同一の溶液中に１^１０ＣＦＵ／ｍＬで再懸濁した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｂｅａｄ Ｔｕｂｅｓ Ｔｙｐｅ Ｂ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ‐Ｎａｇｅｌ）に移した。これらのチューブを、ＦａｓｔＰｒｅｐ‐２４ ５Ｇ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いてそれぞれ３０秒の３サイクルで均質化し、各サイクルの間に５分間の氷浴上での冷却を行った。細胞残屑を遠心分離（８０００ｇ、４℃、１０分）によって除去した。得られた上清は細胞内無細胞抽出物に相当する。１ｍＬの新たに調製したＤＰＰＨ溶液（０．００４％、メタノール中でのｗ／ｖ）と混合され、暗所条件で３０分間インキュベートされた、０．８ｍｌのインタクト細胞及び細胞内無細胞抽出物を用いて、ＤＰＰＨの消去を分析した。ブランク試料はＰＢＳ又は脱イオン水を含んでいた。続いて、５１５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、消去されたＤＰＰＨを監視した。消去能力は、以下の式によって定義され、表１５で報告されている。

％消去＝［１－Ａ_５１５（試料）／Ａ_５１５（ブランク）］１００％。

これらの結果は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９が抗酸化効果を有することを示す。

１９．インビトロコレステロール低下
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９によるインビトロのコレステロール低下を、０．３％（ｗ／ｖ）胆汁塩を補充したＭＲＳブイヨン中の残存コレステロールを測定することによって調査した。簡潔に述べると、１０ｍｇの純粋なコレステロールを５００μＬのエタノール（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）中に溶解し、これを、０．３％（ｗ／ｖ）のブタ胆汁（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した１００ｍＬのＭＲＳブイヨンに添加した。培地にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を接種し、３７℃で２４時間インキュベートした（試験培地）。このインキュベーションの期間の後、細胞を遠心分離（８，０００ｇ、４℃、１０分）によって採取し、無細胞上清をコレステロール定量化のために使用した。非接種ブイヨンを対照（対照培地）と見なした。１ｍＬの培養上清に、３ｍＬの９５％（ｖ／ｖ）エタノールを添加し、その後２ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）水酸化カリウム（ＫＯＨ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、各成分の添加後に内容物を混合した。チューブを６０℃で１０分間加熱した。冷却後、５ｍＬのヘキサン（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）を全てのチューブに分注し、５分間撹拌した後、３ｍＬの水を追加して徹底的に混合した。チューブを３０℃で２０分間静置して、相分離させた。続いて、体積が２．５ｍＬのヘキサン層を新たなチューブに移し、完全に乾燥させて；１．５ｍＬの塩化第二鉄試薬（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、チューブを１０分間静置した。１ｍＬの濃硫酸（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）を試験管の側部から添加した。混合物を撹拌して、３０℃で４５分間静置した。吸光度を５４０ｎｍにおいて測定した。コレステロール標準グラフを、純粋なコレステロール（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて確立し、コレステロール濃度を決定するために使用した。続いて、同化のパーセンテージを以下の式を用いて計算した。

結果は表１５で報告されている。

表１５に示されているように、インタクトＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９のＤＰＰＨ消去活性及びコレステロール同化は、それぞれ３２％及び７８％と興味深い割合に達したようである。

Claims (17)

1. 参照番号ＣＮＣＭ Ｉ‐５３６９としてＣＮＣＭに寄託されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ株ＩＣＶＢ４１１。
2. 有効成分として配列番号１～配列番号５の配列を有する５つのペプチド及び／又は請求項１に記載の株、並びに薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
3. 前記医薬組成物は、請求項１に記載の株の培養液の上清を有効成分として含むこと、又は前記医薬組成物は前記上清からなり、前記上清は任意に精製されることを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 前記医薬組成物は更に、有効成分として、コリスチン、並びに／又は：
   ‐精油、特にハッカの精油、タイムの精油、マツの精油、メンソール、チモール、ピネン；
   ‐ビタミンＣ、ギ酸、プロピオン酸、クエン酸、ソルビン酸、及び乳酸
   から選択される、少なくとも１つの成分を含む、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
5. 前記医薬組成物のｐＨは、４以上又は５以下であり、特に４．５に等しいことを特徴とする、請求項２～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 前記医薬組成物は更に、ナノ粒子を含むことを特徴とする、請求項２～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. 前記ナノ粒子は、少なくともアルギン酸ナノ粒子、特にアルギン酸ナトリウムナノ粒子を含むこと、又は前記ナノ粒子は、アルギン酸ナトリウムナノ粒子からなることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 前記ナノ粒子は、１１５ｎｍ以上１２６ｎｍ以下、特に１１８ｎｍ、１２０ｎｍ又は１２４ｎｍに等しい平均粒径を有することを特徴とする、請求項６又は７に記載の医薬組成物。
9. 前記ナノ粒子には、前記５つのペプチドの混合物、特に請求項１に記載の株の培養液の上清が添加されることを特徴とする、請求項６～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 前記ナノ粒子は薬学的有効成分であること、並びに前記ナノ粒子には：
    ｉ）配列番号１～配列番号５を有する前記５つのペプチド、特に請求項１に記載の株の培養液の上清；並びに
    ｉｉ）精油、特にハッカの精油、タイムの精油、マツの精油、メンソール、チモール、ピネン、ビタミンＣ、ギ酸、プロピオン酸、クエン酸、ソルビン酸、及び乳酸から選択される少なくとも１つの成分
    を含む、混合物が添加されることを特徴とする、請求項６～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 前記ナノ粒子には：
    ｉ）前記５つのペプチドの混合物、特に請求項１に記載の株の培養液の上清；並びに
    ｉｉ）精油、特にハッカの精油、タイムの精油、マツの精油、メンソール、チモール、ピネン、ビタミンＣ、ギ酸、プロピオン酸、クエン酸、ソルビン酸、及び乳酸から選択される少なくとも１つの成分
    を含む、又はからなる、混合物が添加されることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記医薬組成物は更に、コリスチンのみ、並びに／又はハッカの精油、タイムの精油、マツの精油、メンソール、チモール、ピネン、ビタミンＣ、ギ酸、プロピオン酸、クエン酸、ソルビン酸、及び乳酸中から選択される成分が、薬学的活性化合物として添加された、ナノ粒子を含むことを特徴とする、請求項６～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. 前記ナノ粒子への添加重量は、前記ナノ粒子の重量の１２．２％以下であり、特に１２％に等しいことを特徴とする、請求項２～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. 有効成分として、以下の配列：
    ＭＹＴＭＴＮＬＫＤＫＥＬＳＱＩＴＧＧＦＡＦＶＩＰＶＡＡＩＬＧＦＬＡＳＤＡＷＳＨＡＤＥＩＡＧＧＡＴＳＧＷＳＬＡＤＫＳＨＳＬ（配列番号１）；
    ＭＱＱＦＭＴＬＤＮＳＳＬＥＫＩＡＧＧＥＮＧＧＬＷＳＩＩＧＦＧＬＧＦＳＡＲＳＶＬＴＧＳＬＦＶＰＳＲＧＰＶＩＤＬＶＫＱＬＴＰＫＮ（配列番号２）；
    ＭＬＩＬＧＬＩＡＩＤＡＷＳＨＴＤＱＩＩＡＧＦＬＫＧＷＱＧＭ（配列番号３）；
    ＭＴＤＫＲＥＴＬＭＳＭＬＳＫＡＹＡＮＰＴＩＫＡＥＰＡＬＲＡＬＩＥＴＮＡＫＫＶＤＥＧＤＤＥＫＡＹＶＴＡＶＴＱＬＳＨＤＩＳＫＹＹＬＩＨＨＡＶＰＥＥＬＶＡＶＦＮＹＩＫＫＤＶＰＡＡＤＩＤＡＡＲＹＲＡＱＡＬＡＡＧＬＶＡＩＰＩＶＷＧＨ（配列番号４）；
    ＭＹＶＫＤＳＫＶＤＬＴＱＮＮＬＬＰＦＥＥＫＲＫＩＭＳＹＮＹＲＱＬＤＤＦＱＬＳＧＶＳＧＧＫＫＫＦＤＣＡＡＴＦＶＴＧＩＴＡＧＩＧＳＧＴＩＴＧＬＡＧＧＰＦＧＩＩＧＧＡＶＶＧＧＮＬＧＡＶＧＳＡＩＫＣＬＧＤＧＭＱ（配列番号５）
    を有するペプチドから選択される単離ペプチド；並びに
    ‐精油、特にハッカの精油、タイムの精油、マツの精油、メンソール、チモール、ピネン、
    ‐ビタミンＣ、ギ酸、プロピオン酸、クエン酸、ソルビン酸、乳酸；及び／又は
    ‐前記有効成分が添加され得るナノ粒子
    から選択される、少なくとも１つの成分
    を含む、医薬組成物。
15. 前記ナノ粒子は、少なくともアルギン酸ナノ粒子、特にアルギン酸ナトリウムナノ粒子を含むこと、又は前記ナノ粒子はアルギン酸ナトリウムナノ粒子からなることを特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 前記ナノ粒子は、１１５ｎｍ以上１２６ｎｍ以下、特に１１８ｎｍ、１２０ｎｍ又は１２４ｎｍに等しい平均粒径を有することを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。
17. 前記ナノ粒子への添加重量は、前記ナノ粒子の重量の１２．２％以下であり、特に１２％に等しいことを特徴とする、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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