CN110305821A - 副干酪乳杆菌配合car-t细胞治疗应用 - Google Patents

副干酪乳杆菌配合car-t细胞治疗应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株副干酪乳杆菌配合CAR‑T细胞治疗应用，属于微生物技术领域，具体公开了一种副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei，MIT‑16）及其在犬肿瘤免疫治疗过程中的应用。从小鼠肠道中分离、筛选到1株产酸能力较高的副干酪乳杆菌MIT‑16，该菌具有较好的耐酸性能和较强的抑菌能力，并且具有显著的免疫调节功能，尤其对肿瘤治疗中的免疫反应调节具有重要作用。所述菌株可用作免疫调节生物治疗剂。

Description

副干酪乳杆菌配合CAR-T细胞治疗应用
技术领域
本发明涉及一株副干酪乳杆菌配合CAR-T细胞治疗应用，尤其涉及一株性能优良的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei，MIT-16）及其配合CAR-T细胞技术应用，其属于微生物技术领域。
背景技术
近年来，犬肿瘤性疾病在临床上有日益增多的趋势，成为严危害宠物犬和工作犬最主要的疾病之一。目前关于犬肿瘤的治疗尚无有效的特异性免疫疗法。抗体(antibody)和过继细胞治疗(doptive cell therapy，ACT)是肿瘤免疫治疗目前最受关注的两个方向。CAR-T，即表达嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）修饰的T细胞，属于过继细胞治疗一种。和传统治疗方法相比，CAR-T免疫细胞治疗显示出更好的疗效和更低的副作用，可以作为犬肿瘤治疗的新途径。另外，研究犬的原发性肿瘤可以作为研究人类肿瘤极好的模型，利用犬的肿瘤来评估新的探索性疗法的有效性。然而，CAR-T细胞治疗在小动物临床应用过程中，仍需要解决细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）等不良反应，主要是指大量细胞因子IFN-r、IL-6、IL-2、IL-8、TNF-α的释放。
乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是能发酵葡萄糖或可利用的碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称，在发酵食品中具有重要的应用。近些年，乳酸菌对人体免疫系统的调节作用成为研究热点之一。乳酸菌对机体细胞免疫的作用主要通过激活巨噬细胞、NK细胞和B淋巴细胞的活性，促进白介素和干扰素等细胞因子的产生而实现的，维持机体的免疫平衡。开发免疫调节相关乳酸菌制品，具有重要意义。
然而，上述研究很少探讨益生菌株是否可应用于肿瘤治疗后的免疫调节，尤其是CAR-T免疫治疗后CRS全身性炎症反应，也未提出益生菌株可能涉及的调控机制。
有鉴于此，亟需提供一种益生菌株在提供配合CAR-T免疫治疗的新用途，以开发益生菌株的其它应用面。
另外，本发明的其他方面提供了副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei，MIT-16）在抑制条件性致病菌，维持肠道菌群方面进行研究。
发明内容
本发明针对上述现有技术中存在的不足，提供一株副干酪乳杆菌及其应用。
本发明副干酪乳杆菌MIT-16配合CAR-T细胞治疗应用于制备免疫调节药物中。
所述副干酪乳杆菌是从动物源中分离出来，得到新的副干酪乳杆菌，菌株命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei，MIT-16），该菌株纯培养物于2019年07月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.18077。
所述副干酪乳杆菌MIT-16以CaCO3-MRS培养基为筛选培养基，从小鼠肠道不同部位中分离筛选到55株单菌落，根据革兰氏染色以及全自动微生物鉴定系统实验结果，结合耐酸耐胆碱盐实验，粘附实验，筛选出一株具有耐酸耐胆碱及高黏附性的副干酪乳杆菌MIT-16
本发明的另一个目的是提供一株副干酪乳杆菌MIT-16在肠道具有较强定植能力的应用。
本发明的另一个目的是提供了一株副干酪乳杆菌MIT-16在抑制条件性致病菌，维持肠道菌群平衡的应用。
本发明的另一个目的是提供了一株副干酪乳杆菌MIT-16用于制备免疫调节剂。
所述副干酪乳杆菌MIT-16的生物学特性，该菌株革兰氏阳性，具有较强的黏附性和耐酸耐胆碱能力。
所述副干酪乳杆菌MIT-16在肠道各部位具有较强的粘附性及定植率，粘附率高，且能稳定定植。
所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16配合CAR-T细胞治疗技术，克服临床上的不良反应，增强肿瘤治疗过程中的免疫功能。
所述免疫调节降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-2的产生，改善Th1/Th2平衡，应用于制备抗炎生物制剂中。
所述副干酪乳杆菌MIT-16，该菌株具有较强的耐酸耐胆碱能力、免疫调节活性，可以抑制炎症性细胞因子TNF-α的分泌，增强IL-10等免疫因子的表达，具有免疫调节功能；该菌株具有较强的黏附性，在肠道内进行定植，用于维持肠道菌群平衡。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16，分离自健康动物肠道组织中，来源比较安全；2、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16，具有较强的免疫调节活性，增强免疫功能，刺激免疫细胞产生免疫因子，维持机体的免疫平衡，调控炎症反应；3、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16可以抑制条件性致病菌大肠杆菌、沙门氏菌等，调节肠道菌群平衡；4、本发明所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16配合CAR-T细胞治疗技术，克服临床上的不良反应，增强肿瘤治疗过程中的免疫功能。
附图说明
图1是副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16溶钙圈法筛选乳酸菌菌落示意图。
图2是副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16革兰氏染色光学显微镜照片示意图。
图3是副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16对HT-29细胞的粘附能力示意图。
图4是副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16对沙门氏菌抑菌效果的示意图。其中，A，副干酪乳杆菌MIT-16的浓度为108CFU/mL；B，副干酪乳杆菌MIT-16的浓度为107CFU/mL；C，副干酪乳杆菌MIT-16的浓度为106CFU/mL；D，副干酪乳杆菌MIT-16的浓度为105CFU/mL。
图5是流式细胞术分析副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16对小鼠免疫细胞Th1的影响示意图。其中A为对照组。
图6是流式细胞术分析副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16对小鼠免疫细胞Th1的影响示意图。其中B为副干酪乳杆菌组。
图7是流式细胞术分析副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16对小鼠免疫细胞Th1的影响示意图。其中C为CAR-T组。
图8是流式细胞术分析副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16对小鼠免疫细胞Th1的影响示意图。其中D为CAR-T+副干酪乳杆菌组。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明副干酪乳杆菌MIT-16配合CAR-T细胞治疗应用于制备免疫调节药物中。
所述副干酪乳杆菌是从动物源中分离出来，得到新的副干酪乳杆菌，菌株命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei，MIT-16），该菌株纯培养物于2019年07月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.18077。
所述副干酪乳杆菌MIT-16以CaCO3-MRS培养基为筛选培养基，从小鼠肠道不同部位中分离筛选到55株单菌落，根据革兰氏染色以及全自动微生物鉴定系统实验结果，结合耐酸耐胆碱盐实验，粘附实验，筛选出一株具有耐酸耐胆碱及高黏附性的副干酪乳杆菌MIT-16。
本发明的另一个目的是提供一株副干酪乳杆菌MIT-16在肠道具有较强定植能力的应用。
本发明的另一个目的是提供了一株副干酪乳杆菌MIT-16在抑制条件性致病菌，维持肠道菌群平衡的应用。
本发明的另一个目的是提供了一株副干酪乳杆菌MIT-16用于制备免疫调节剂。
所述副干酪乳杆菌MIT-16的生物学特性，该菌株革兰氏阳性，具有较强的黏附性和耐酸耐胆碱能力。
所述副干酪乳杆菌MIT-16在肠道各部位具有较强的粘附性及定植率，粘附率高，且能稳定定植。
所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16配合CAR-T细胞治疗技术，克服临床上的不良反应，增强肿瘤治疗过程中的免疫功能。
所述免疫调节降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-2的产生，改善Th1/Th2平衡，应用于制备抗炎生物制剂中。
所述副干酪乳杆菌MIT-16，该菌株具有较强的耐酸耐胆碱能力、免疫调节活性，可以抑制炎症性细胞因子TNF-α的分泌，增强IL-10等免疫因子的表达，具有免疫调节功能；该菌株具有较强的黏附性，在肠道内进行定植，用于维持肠道菌群平衡。
实施例1
副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16的分离、纯化与鉴定
1、副干酪乳杆菌菌株分离纯化
取小鼠肠道内容物，10倍系列稀释至10-6，每个稀释浓度取200μL涂布于含1% CaCO3的MRS乳酸菌筛选培养基上，37℃厌氧罐中培养72h，挑取平板上具有溶钙圈的单菌落，继续在MRS固体培养基上划线纯化，37℃厌氧罐中培养48h，获得较纯的菌落。MRS培养基筛选菌落见图1。本发明菌株在含CaCO3的MRS培养基上菌落直径1-2mm，白色，凸起，菌落周围透明圈为溶钙圈。对纯化后菌落进行革兰氏染色鉴定。菌体革兰氏染色特性见图2。该菌株革兰氏阳性，长杆状。
2、菌株筛选鉴定
对获得的菌株MIT-16利用微生物鉴定系统（梅里埃，VITEK 2）进行鉴定。微生物系统鉴定结果见表1。结合微生物系统鉴定，MIT-16为一株副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌MIT-16。该株菌可以分解D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖等，具有苯丙氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶、吡咯烷基芳胺酶等活性，不能水解D-纤维二糖、D-木糖、蔗糖等。
表1副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16全自动微生物鉴定结果
实施例2：
副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16粘附性能的测定
人结肠癌细胞系HT-29用含10%血清的DMEM培养基，5% CO2，37℃环境条件下培养过夜。收集细胞，接种于6孔板中，每孔1×105个细胞，培养过夜至单层细胞。PBS洗三次，取副干酪乳杆菌重悬液，DMEM培养基调整浓度至1×108CFU/mL，取200μL菌液和1800μL DMEM培养液加入至6孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养2h。无菌PBS清洗三次，每孔加入0.25%胰酶500μL消化2min，然后加入含10% 胎牛血清的DMEM溶液终止消化。取出6孔板中的细胞玻片，进行革兰氏染色，显微镜下进行观察，随机选取50个视野，对视野中的细胞上粘附的细菌总数和细胞数进行计数，计算粘附指数，实验结果见图3，MIT-16对人结肠癌细胞系HT-29粘附指数为5.08，具有较强的细胞粘附能力，表明在肠道中具有较强的定植能力。
实施例3：
副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16对条件性致病菌的抑菌效果
活化副干酪乳杆菌MIT-16菌株于MRS固体培养基，37℃厌氧培养48h。挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养过夜，测OD600值，稀释菌液至105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL。培养副干酪乳杆菌MIT-16的同时，活化沙门氏菌于LB液体培养基中，37℃培养12h，测OD600值，稀释菌液至105CFU/mL。将沙门氏菌菌液涂布在LB固体培养基上，37℃过夜培养。采用牛津杯法，进行副干酪乳杆菌抑菌实验。取200μL副干酪乳杆菌MIT-16菌液于牛津杯中，37℃过夜培养，测定抑菌圈大小。
如图4所示，副干酪乳杆菌MIT-16菌株对沙门氏菌有明显的抑菌作用，随着副干酪乳杆菌MIT-16菌液浓度升高，抑菌圈增大，抑菌效果增强。
实施例4：
副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MIT-16对小鼠免疫功能的调节作用
选取4～5周龄BALB/C小鼠作为动物模型，建立皮下乳腺癌荷瘤小鼠。当肿瘤生长至体积为300~350mm3时，实验分为四组，每组5只小鼠。空白对照组：从试验开始至结束喂服500μL无菌PBS；CAR-T治疗组：小鼠尾静脉注射5×106个病毒感染后的CAR-T细胞；副干酪乳杆菌组：灌服500μL菌悬液（5×109CFU/mL），连续灌服10天；CAR-T+副干酪乳杆菌组：小鼠尾静脉注射5×106个病毒感染后的CAR-T细胞，同时每天灌服500μL菌悬液（5×109CFU/mL），连续灌服10天。10天后，小鼠在超净工作台中分离脾脏，200目钢丝滤布进行研磨，一边研磨一边加入8ml含有1%血清的 PBS，细胞悬液1700rpm、4℃离心10min，去上清。加入2ml红细胞裂解液(NH4Cl 7.7g/L，Tris 2.06g/L，HCl调pH至7.2，定容至1000ml)，充分吹打混匀后4℃放置10min，1700rpm、4℃离心10min，PBS洗涤2次，直至细胞变成白色沉淀。细胞计数。Percp-Cy5.5-CD3、FITC-CD4、PE-IFN-γ抗体进行标记，室温下避光孵育30分钟。1700r/min离心10分钟，去上清液。500μL PBS重悬细胞，30min内使用流式细胞仪进行Th1细胞表达检测。
如图5至图8所示，CAR-T治疗后可诱导小鼠产生Th1型细胞的表达，Th1细胞主要分泌炎症型细胞因子IL-2，IFN-γ,TNF-α等。当副干酪乳杆菌与CAR-T细胞联用后，可以抑制Th1细胞的表达，抑制炎症性因子的表达。说明副干酪乳杆菌配合CAR-T细胞技术治疗，具有免疫调节功能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 副干酪乳杆菌配合CAR-T细胞治疗应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 936
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 2
gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagccct cggcttaacc gaggaagcgc 60
atcggaaact gggaaacttg agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt gtagcggtga 120
aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctggtc tgtaactgac 180
gctgaggctc gaaagcatgg gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta 240
aacgatgaat gctaggtgtt ggagggtttc cgcccttcag tgccgcagct aacgcattaa 300
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cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 420
acatcttttg atcacctgag agatcaggtt tccccttcgg gggcaaaatg acaggtggtg 480
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gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc 660
tacaatggat ggtacaacga gttgcgagac cgcgaggtca agctaatctc ttaaagccat 720
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gagagtttgt aacacccgaa gccggtggcg taaccctttt agggagcgag ccgtctaagg 900
tgggacaaat gattagggtg aagtcgtaac aagagc 936

Claims (11)

1.一株副干酪乳杆菌，其特征在于，副干酪乳杆菌是从动物源中分离出来，得到新的副干酪乳杆菌，菌株命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei，MIT-16），该菌株纯培养物于2019年07月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.18077。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16以CaCO3-MRS培养基为筛选培养基，从小鼠肠道不同部位中分离筛选到55株单菌落，根据革兰氏染色以及全自动微生物鉴定系统实验结果，结合耐酸耐胆碱盐实验，粘附实验，筛选出一株具有耐酸耐胆碱及高黏附性的副干酪乳杆菌MIT-16。
3.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16有效物为菌株活体细胞、菌株非活体细胞以及菌株的培养物、浓缩物、冷冻干燥物、液状物、稀释物、破碎物中的至少一种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16配合CAR-T细胞治疗应用于制备免疫调节药物中。
5.一种菌剂，其特征在于，活性成分中含有权利要求1-3中任一项所述的副干酪乳杆菌MIT-16。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂制成药物，药物的剂型选自片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂或者乳剂中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16应用于抑制条件性致病菌，维持肠道菌群平衡。
8.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16应用于肠道定植能力，调节肠道微生态。
9.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16应用于制备免疫调节剂中。
10.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述免疫调节降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-2的产生，改善Th1/Th2平衡，应用于制备抗炎生物制剂中。
11.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16的浓度大于等于106CFU/g。
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