CN110408577A - 一株控制蔬菜细菌性软腐病的干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株控制蔬菜细菌性软腐病的干酪乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了保藏编号为CGMCC No.17710的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WX322，菌体及其代谢物具有广谱抗菌活性，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(包括致病菌和腐败菌)均展现出强抑菌能力，可用于制备抗菌或/和防腐产品，应用于医疗、食品等领域以控制细菌性病原菌或腐败菌；还能够高效抑制软腐病菌果胶杆菌的生长，可用于制备防治蔬菜细菌性软腐病的产品，控制采前、采后由果胶杆菌引起的蔬菜腐烂，能有效解决农药防治带来的农业残留和环境污染问题，在蔬菜细菌性软腐病的生物防治方面具有良好的应用潜力，同时也为研发微生物农药提供了优良的基础菌株。

Description

一株控制蔬菜细菌性软腐病的干酪乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株控制蔬菜细菌性软腐病的干酪乳杆菌及其应用。
背景技术
软腐病为蔬菜毁灭性病害，存在于全世界范围，可发生在种植、贮藏、运输、销售过程，引起的损失比任何其他细菌性病害更严重，采后损失达到15-30％。受污染蔬菜表现为软、黏滑、水浸状，并伴随恶臭。大部分蔬菜软腐病都是由欧文氏菌(Erwinia)引起的，且以果胶杆菌(Pectobacterium)为主。果胶杆菌是植物十大细菌性致病菌之一，其中，研究报道最多的是胡萝卜软腐病果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)。果胶杆菌具有广泛的寄主范围，包括茄科、十字花科、葫芦科、菊科、百合科和其他科(甜菜、魔芋、秋葵等)，且容易在寄主间传播，在我国部分地区辣椒中果胶杆菌检出率高达20％。
然而，目前还没有有效的药剂专门用来控制果胶杆菌。农业通常使用抗生素(硫酸链霉素为主)和化学农药(如氢氧化铜)来控制果胶杆菌软腐病。但是，随着耐药性的出现和传播，硫酸链霉素的作用效果越来越弱。此外，由于抗生素抗性的发展和环境污染，我国乃至全球已控制或者停止抗生素的使用。同时，随着人们安全意识的增强，越来越排斥蔬菜中农药残留。因此，开发一种安全、健康、有效的生物控制手段来控制蔬菜细菌性软腐病具有重大的应用价值。
生物防控是利用微生物或者微生物代谢物来抑制病原菌生长的一种手段。拮抗微生物主要包括拮抗酵母和拮抗细菌。其中，乳酸菌是目前开发较少但应用潜力巨大的一种拮抗菌。乳酸菌被FDA认为是具有GRAS安全等级的微生物，广泛分布于自然界中，包括动植物体表、乳制品、发酵食品等中。乳酸菌能产生有利于食物保藏的代谢物，如CO2、双乙酰、过氧化氢、脂肪酸、乳酸、苯甲酸、细菌素、环二肽等。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株乳酸菌，菌体本身及其代谢物具有广谱抗菌活性；目的之二在于提供该乳酸菌的抗菌代谢物的制备方法；目的之三在于提供该乳酸菌及其抗菌代谢物的用途。
经研究，本发明提供如下技术方案：
1.干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WX322，保藏编号为CGMCC No.17710。
本发明的干酪乳杆菌WX322是从家庭自制传统发酵的泡菜水中分离获得，于2019年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.17710，分类命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
2.干酪乳杆菌WX322或其菌悬液或其发酵液或其代谢物在制备抗菌或/和防腐产品中的应用。
进一步，所述抗菌或/和防腐产品同时抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
进一步，所述抗菌或/和防腐产品抑制果胶杆菌(Pectobacterium)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella)、阪崎克罗诺肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)中的任一种或多种。
其中，果胶杆菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、阪崎克罗诺肠杆菌为革兰氏阴性菌，单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌为革兰氏阳性菌。
3.干酪乳杆菌WX322或其菌悬液或其发酵液或其代谢物在制备防治蔬菜细菌性软腐病的产品中的应用。
进一步，所述细菌性软腐病由果胶杆菌(Pectobacterium)所引起。
4.干酪乳杆菌WX322代谢产生的蛋白提取物。
5.所述蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤：将干酪乳杆菌WX322接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养不低于42h，提取发酵液中的蛋白，即得蛋白提取物。
进一步，所述蛋白提取物的制备方法，包括以下步骤：将干酪乳杆菌WX322种子菌以0.1wt％的接种量接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养72h，所得发酵液用盐析法沉淀提取蛋白，即得蛋白提取物。
6.所述蛋白提取物在制备抗菌或/和防腐产品中的应用。
进一步，所述抗菌或/和防腐产品同时抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
进一步，所述抗菌或/和防腐产品抑制果胶杆菌(Pectobacterium)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella)、阪崎克罗诺肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)中的任一种或多种。
7.所述蛋白提取物在制备防治蔬菜细菌性软腐病的产品中的应用。
进一步，所述细菌性软腐病由果胶杆菌(Pectobacterium)所引起。
本发明的有益效果在于：本发明公开了保藏编号为CGMCC No.17710的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WX322，菌体及其代谢物具有广谱抗菌活性，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(包括致病菌和腐败菌)展现出强抑菌能力，可用于制备抗菌或/和防腐产品，应用于医疗、食品等领域以控制细菌性病原菌或腐败菌；还能够高效抑制软腐病菌果胶杆菌(Pectobacterium)的生长，可用于制备防治蔬菜细菌性软腐病的产品，控制采前、采后由果胶杆菌引起的蔬菜腐烂。本发明的干酪乳杆菌WX322来源于泡菜(蔬菜制品)，将其应用于蔬菜及其制品安全性高，能有效解决农药防治所带来的农业残留和环境污染问题，在蔬菜细菌性软腐病的生物防治方面具有良好的应用潜力，同时也为研制和开发微生物农药提供了优良的基础菌株。
附图说明
图1为干酪乳杆菌WX322菌体的革兰氏染色镜检。
图2为干酪乳杆菌WX322菌体对革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌的抑制活性。
图3为干酪乳杆菌WX322菌体对胡萝卜软腐病果胶杆菌的抑制活性。
图4为干酪乳杆菌WX322菌体对青椒细菌性软腐病的控制，其中a为对照组，b为干酪乳杆菌WX322处理组。
图5为干酪乳杆菌WX322的生长曲线和发酵液的pH值变化。
图6为干酪乳杆菌WX322发酵过程中代谢物对胡萝卜软腐病果胶杆菌的抑制活性变化，其中A为抑菌圈直径随发酵时间的变化，B为牛津杯法测定抑菌圈直径。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1：抗菌乳酸菌的筛选与鉴定
(1)微生物菌株的分离
用灭菌生理盐水以10倍的稀释梯度对泡菜水样品进行稀释。分别取100μL 10-2、10-3、10-4、10-5稀释度的泡菜水稀释液涂布到MRS固体培养基上，37℃恒温培养48h。挑取乳酸菌单菌落，进一步采用划线分离法对特征菌落进行反复地分离纯化，记录各菌落的形态特征并采用革兰氏染色镜检，观察。
所述MRS固体培养基按质量百分含量计由以下成分组成：葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、乙酸钠0.5％、吐温80 0.1％、柠檬酸氢二胺0.1％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.005％、琼脂粉1.5％、余量为蒸馏水。
WX322菌株菌落形态特征：在MRS琼脂平板上菌落形状为圆形、表面光滑且稍微凸起，菌落颜色为浅乳白色。
WX322菌株个体形态特征如图1所示，为革兰氏阳性(G+)，短杆状，多成对排列，无芽孢，无鞭毛。
(2)抗菌乳酸菌的筛选
使用双层划线法进行抗菌乳酸菌的筛选。将乳酸菌接种到MRS液体培养基中培养至OD600nm＝0.8，用接种环将菌悬液划线到MRS琼脂平板上(2条平行线，长度约2cm)，37℃恒温培养12h。将10mL含有106CFU/mL指示菌(金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、阪崎克罗诺肠杆菌)的LB琼脂培养基(0.7wt％琼脂)倾注到上述MRS培养基表面，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈大小。
结果如图2所示，WX322菌株对测定的3株革兰氏阳性致病菌和4株革兰氏阴性致病菌均展现出强抑菌圈，具有广谱抗菌活性。
(3)微生物菌株的鉴定：
将WX322菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养12h。按 Genomic DNAMini Kit(Invitrogen,USA)试剂盒说明书方法提取乳酸菌基因组DNA。以乳酸菌基因组DNA为模板，27F(SEQ ID No.1)和1495R(SEQ ID No.2)为引物进行16s rDNA扩增，并对PCR扩增产物进行测序分析。
获得的WX322菌株的16s rDNA序列如SEQ ID No.3所示，在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，结果显示，WX322菌株与干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的Identity＝99％(>97％)。因此，WX322菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，将其命名为WX322，于2019年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.17710。
实施例2：干酪乳杆菌WX322对胡萝卜软腐病果胶杆菌的生物拮抗活性
(1)离体活性
将干酪乳杆菌WX322在MRS液体培养基中培养至OD600nm＝0.8，用接种环将菌悬液划线到MRS琼脂平板上(2条平行线，长度约2cm)，37℃恒温培养12h，将15mL含有2wt％琼脂的LB培养基倾注到MRS平板表面以覆盖干酪乳杆菌WX322。将胡萝卜软腐病果胶杆菌活化后接种于LB液体培养基中，37℃、150rpm培养至OD600nm＝1，使用新鲜的LB培养基稀释1000倍，吸取100μL菌悬液，用无菌涂布器均匀地将其分散在前述倾注到MRS平板表面的LB培养基表面，37℃静置培养24h，观察抑菌圈大小。
结果如图3所示，干酪乳杆菌WX322菌体周围有较大的抑菌圈，对胡萝卜软腐病果胶杆菌表现出良好的抑菌活性。
(2)体内活性
将干酪乳杆菌WX322接种于MRS培养基中，37℃、120rpm培养24h，得到对数期拮抗菌。将胡萝卜软腐病果胶杆菌接种于LB培养基中，37℃、120rpm培养至OD600nm＝0.1。从本地超市购买新鲜青椒，使用无菌打孔器在青椒表面打孔(直径0.3cm，深度0.3cm)，每个小孔中加入15μL胡萝卜软腐病果胶杆菌菌悬液，温室下放置，待菌悬液完全被吸收后，在每个小孔中继续加入30μL干酪乳杆菌WX322菌悬液，以等体积的无菌水替代干酪乳杆菌WX322菌悬液作为对照。将处理后的青椒用果袋包裹严实后，室温下放置，观察发病情况。
结果如图4所示，对照组青椒在果胶杆菌作用下已经完全发生病变，组织腐烂，青椒最外层皮与内部组织分离，青椒表面布满粘液，并伴随恶臭味(图4a)；而干酪乳杆菌WX322处理组青椒形态完好，并未发生病变，表面打孔处仅出现干疤(图4b)。由此可见，干酪乳杆菌WX322能够有效控制由胡萝卜软腐病果胶杆菌引起的青椒软腐病。
实施例3：干酪乳杆菌WX322代谢物的抗菌活性
(1)干酪乳杆菌WX322的生长曲线
挑取干酪乳杆菌WX322单菌落接种于10mL MRS液体培养基中，37℃、150rpm过夜培养，作为种子菌。以0.1wt％的接种量将种子菌接种到3L MRS液体培养基中，30℃静置培养78h。培养期间，每隔6h取样100mL，测定菌悬液的pH值，同时使用分光光度计测定OD600nm吸光值。
结果如图5所示，干酪乳杆菌WX322具有典型的生长曲线，在前12h处于延迟期，18-54h处于对数生长期，54h以后进入稳定期；在整个发酵过程中，发酵液的pH值逐步降低，最后稳定在pH 4以下。
(2)蛋白提取物的抑菌活性
将前述(1)中每隔6h取样的菌悬液分别离心(8000rpm、15min、4℃)，所得上清液使用硫酸铵沉淀提取蛋白。将所得蛋白提取物溶解于pH6.0的PBS缓冲液中，用牛津杯法测定其对胡萝卜软腐病果胶杆菌的抗菌活性。
牛津杯法步骤如下：将5mL 2wt％无菌琼脂倒入无菌平皿中使其覆盖平皿底部，待凝固后，将3个灭菌后的牛津杯用镊子等距离放到琼脂平板上。将培养至对数期的果胶杆菌用新鲜的LB液体培养基调节菌体浓度至108CFU/mL左右，取1mL菌悬液，加入到冷却至45℃左右的100mL含有0.7wt％琼脂的LB培养基中，混合均匀后，取20mL倒入琼脂平板中(不要倒入到牛津杯的孔里)，待完全凝固后，小心地用无菌镊子夹出牛津杯，在琼脂平板上的3个小孔中分别加入测试样品100μL，然后将平板置4℃下2h使样品充分扩散，再转移到37℃下培养12h，观察抑菌现象，并测量抑菌圈直径。
结果如图6所示，干酪乳杆菌WX322生长到第42h，代谢产生的蛋白提取物出现抑制果胶杆菌的活性，且随着发酵时间的延长，抑菌活性逐渐增强。
78h后最终剩余的菌悬液全部使用硫酸铵提取蛋白，并且使用牛津杯法测定蛋白提取物对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、阪崎克罗诺肠杆菌的抑菌活性。结果显示，蛋白提取物对7种致病菌均展现抑菌活性，牛津杯法测定时，抑菌圈大小在11-22mm之间。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一株控制蔬菜细菌性软腐病的干酪乳杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctacggctac cttgttacga 20
<210> 3
<211> 1091
<212> DNA
<213> 干酪乳杆菌WX322(Lactobacillus casei WX322)
<400> 3
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cgcgagaacc ttaccaggtc ttgacatctt ttgatcactg agagatcagt tcccctcggg 1020
gcaaatgaca gtgtgcatgc gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgtgggtt aagtcccgca 1080
cggcgcaacc c 1091

Claims (10)

1.干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WX322，保藏编号为CGMCC No.17710。
2.权利要求1所述的干酪乳杆菌WX322或其菌悬液或其发酵液或其代谢物在制备抗菌或/和防腐产品中的应用。
3.权利要求1所述的干酪乳杆菌WX322或其菌悬液或其发酵液或其代谢物在制备防治蔬菜细菌性软腐病的产品中的应用。
4.权利要求1所述干酪乳杆菌WX322代谢产生的蛋白提取物。
5.权利要求4所述蛋白提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将干酪乳杆菌WX322接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养不低于42h，提取发酵液中的蛋白，即得蛋白提取物。
6.权利要求4所述蛋白提取物在制备抗菌或/和防腐产品中的应用。
7.权利要求4所述蛋白提取物在制备防治蔬菜细菌性软腐病的产品中的应用。
8.如权利要求2或6所述的应用，其特征在于，所述抗菌或/和防腐产品同时抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗菌或/和防腐产品抑制果胶杆菌(Pectobacterium)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella)、阪崎克罗诺肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)中的任一种或多种。
10.如权利要求3或7所述的应用，其特征在于，所述细菌性软腐病由果胶杆菌(Pectobacterium)所引起。
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