CN116218710A - 一种干酪乳杆菌及其发酵蔬菜尾菜制备高膳食纤维的方法 - Google Patents
一种干酪乳杆菌及其发酵蔬菜尾菜制备高膳食纤维的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3及其应用，具体是将干酪乳杆菌发酵蔬菜尾菜高膳食纤维的制备方法及其应用，通过利用复合微生物发酵技术处理蔬菜尾菜，解决当前农村蔬菜尾菜处理方式的局限性和不科学性，充分地将蔬菜尾菜转变成可利用的物质，提高蔬菜尾菜的饲用价值，本申请的发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料产品，能够提高反刍动物的生长性能、屠宰性能及肉品质，可以提高反刍动物机体的抗氧化性能和免疫性能，降低生产成本，提高养殖效益，同时可以提高蔬菜尾菜的资源化利用率，提高蔬菜种植的经济效益，提高尾菜的营养价值。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体是一种干酪乳杆菌及其发酵蔬菜尾菜制备高膳食纤维的方法。
背景技术
我国是农业大国，蔬菜作物的种植面积和产量位居世界前列。随着人们物质生活水平的不断提高，人们对蔬菜质量的要求也在不断上升，这就意味着蔬菜废弃物即尾菜的产生量也在逐年增长。尾菜水分含量高，极易滋生细菌且会造成严重的环境污染。由于当前我国农村大部分地区仍然采取倾倒、填埋、堆积等非常不科学的方式处理尾菜，已经引发农业生态环境污染，造成病虫害传播，影响蔬菜安全以及标准化生产。但是尾菜中含有丰富的有机质及矿质微量元素，同时富含类胡萝卜素、维生素和纤维素的尾菜具有抗氧化、抗糖尿病的特性。因此，若采用微生物发酵技术对尾菜进行合理加工生产高膳食纤维饲料产品，将会大大提高尾菜的资源利用率，增加其饲用价值。
发明内容
本发明研究的目的在于通过利用复合微生物发酵技术处理蔬菜尾菜，解决当前农村蔬菜尾菜处理方式的局限性和不科学性，充分地将蔬菜尾菜转变成可利用的物质，提高蔬菜尾菜的饲用价值，避免废弃蔬菜尾菜对环境造成污染，旨在提供一种工艺简单、操作方便、废物再利用、高效环保的一种干酪乳杆菌及其制备发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料的方法及其应用。
本发明提供了一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3，保藏编号为CGMCC No.20432。
本发明还提供的一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3在抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副伤寒沙门菌或鸡白痢沙门菌中的应用。
本发明还提供的一种发酵蔬菜尾菜制备高膳食纤维的方法，包括以下步骤：
步骤1制备发酵底物，所述发酵底物包括蔬菜尾菜；所述蔬菜尾菜包括白菜、菠菜、小白菜或娃娃菜；
步骤2制备复合微生物菌液，混合均匀，备用，其中，复合微生物菌液配比为植物乳杆菌BFC190204、干酪乳杆菌BFEC2002G3的菌种份数比为：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝(1-6)：(6-10)。
步骤3接种发酵，按发酵底物的1-1.2％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28-30℃，水分含量15-30％，发酵时间为3-5天，得到发酵蔬菜尾菜高膳食纤维。
本发明还提供的一种利用蔬菜尾菜制备高膳食纤维发酵反刍饲料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1制备发酵底物，所述发酵底物包括蔬菜尾菜；所述蔬菜尾菜包括白菜、菠菜、小白菜或娃娃菜；
步骤2制备复合微生物菌液，混合均匀，备用，其中，复合微生物菌液配比为植物乳杆菌、干酪乳杆菌的菌种份数比为：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝(1-6)：(6-10)，优选为(3-5)：(6-8)；
其中，所述植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BFC190204，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.18915，保藏日期为2019年11月7日。
所述干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20432，保藏日期为2020年8月17日。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BFC190204的活菌数≥2.0×109cfu/g，优选为≥4.0×109cfu/g。
所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3的活菌数≥1×109cfu/g，优选为≥3.0×109cfu/g。
步骤3接种发酵，按发酵底物的1-1.2％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28-30℃，水分含量15-30％，发酵时间为3-5天，得到发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料。
本申请还提供一种高膳食纤维发酵反刍饲料的使用方法，包括以下步骤：
步骤1制备发酵底物，将发酵底物的各原料按质量百分比混合均匀，备用，其中，蔬菜尾菜35-50％，玉米25-40％，豆粕5-10％，麸皮5-15％，玉米蛋白粉0.5-1.5％，食盐0.5-1.5％，磷酸氢钙0.5-1％，预混料0.5-1％；各组份百分比为100％。
所述蔬菜尾菜包括有白菜、菠菜、小白菜、娃娃菜等。
步骤2制备复合微生物菌液，混合均匀，备用，其中，复合微生物菌液配比为植物乳杆菌、干酪乳杆菌的菌种份数比为：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝(1-6)：(6-10)，优选为(3-5)：(6-8)；
其中，所述植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BFC190204，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.18915，保藏日期为2019年11月7日。
所述干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20432，保藏日期为2020年8月17日。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BFC190204的活菌数≥2.0×109cfu/g，优选为≥4.0×109cfu/g。
所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3的活菌数≥1×109cfu/g，优选为≥3.0×109cfu/g。
步骤3接种发酵，按发酵底物的1-1.2％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28-30℃，水分含量15-30％，发酵时间为3-5天，得到发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料。
步骤4按普通配合饲料总质量的10-50％替换为步骤3的发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料，优选用量是30％，直接进行投喂。
本申请的有益效果是：
1.本申请提供一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3，以及发现了它的利用价值，尤其是该干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3在抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌中的应用。
2.本申请提供了一种发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料产品，能够提高反刍动物的生长性能、屠宰性能及肉品质，可以提高反刍动物机体的抗氧化性能和免疫性能，降低生产成本，提高养殖效益，同时可以提高蔬菜尾菜的资源化利用率，提高蔬菜种植的经济效益，提高尾菜的营养价值。
3.与已有技术相比，现技术具有如下优点，通过利用复合微生物发酵技术处理蔬菜尾菜，解决当前农村蔬菜尾菜处理方式的局限性和不科学性，充分地将蔬菜尾菜转变成可利用的物质，提高蔬菜尾菜的饲用价值，避免废弃蔬菜尾菜对环境造成污染，旨在提供一种工艺简单、操作方便、废物再利用、高效环保的一种干酪乳杆菌及其制备发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料的方法及其应用。
4.本申请的发酵工艺可使得发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料中粗蛋白中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量提高。发酵前后氨基酸营养水平均有不同程度升高。本申请试验得出，随着发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料替代水平的增加，在30％替代水平时获得最佳料重比。
5.通过不同发酵菌的配比试验，得出本申请的干酪乳杆菌菌液BFEC2002G3和植物乳杆菌菌液BFC190204组合配比4：6可获得最佳终末体重、平均日增重和料重比，通过该复合菌制备的发蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A能够促进湖羊机体蛋白质合成；促进机体尿素循环，降低BUN含量，改善羊体内的氮素营养，增加体内的蛋白质储备；还可以提高湖羊机体的抗氧化能力，减少机体损伤，提高湖羊的屠宰性能，降低湖羊的肌肉嫩度、蒸煮损失，可以改善湖羊肉色，改善湖羊的食用品质。通过对比单一使用干酪乳杆菌菌液BFEC2002G3和植物乳杆菌菌液BFC190204任一种菌株发酵时，得出本申请的两种菌组合效果最好。
保藏说明
中文名：干酪乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus casei
菌株编号：BFEC2002G3
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年8月17日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20432。
中文名：植物乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus Plantarum
菌株编号：BFC190204
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2019年11月7日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18915。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述。
以下实施例的公开，是便于对本申请的理解，并非对本申请加以限定，本领域的专业技术人员可以根据应用的目的对工艺参数进行适当的优化和调整，特别需要申明的是，在本领域技术人员看来，所有类似的修改和替换都是显而易见的，均视同在本申请包含的范围内，本申请的方法及应用均在实例中进行了描述，相关人员完全可以在不脱离本申请内容、主旨和范围的前提下对所述的方法和应用进行调整或适当的替换，以此来实现本申请的应用。
以下实施例的复合微生物菌液中，复合微生物菌液为植物乳杆菌BFC190204、干酪乳杆菌BFEC2002G3的混合液，所述植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BFC190204的活菌数≥4.0×109cfu/g。所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3的活菌数≥3.0×109cfu/g。
实施例1一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3
试验一干酪乳杆菌BFEC2002G3菌种分离、筛选及鉴定
1 材料与方法
1.1 样品来源
天津市蓟县上仓镇土壤及附近农田，重庆农家酸菜。
2培养基
LB培养基：胰蛋白胨1.0％，酵母提取物0.5％，NaCl 1.0％，琼脂1.5％，pH7.0。
MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，K2HPO4·7H2O 2.0g，醋酸钠·3H2O 5.0g，柠檬酸三铵2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O0.05g，琼脂粉15.0g，pH 6.2。将上述成分加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121℃高压灭菌15min～20min。
3菌株筛选
干酪乳杆菌筛选方法：样品稀释至10-7后，取100uL涂布MRS培养基平板上，37℃培养2-3d，观察菌落形态和镜检后，分离纯化。
4菌株鉴定
4.1形态学、生理生化特征
形态学、生理生化特征鉴定:伯杰细菌鉴定手册
4.2分子生物学鉴定
以菌株总DNA为模板，利用细菌的16S rDNA或真菌18S rDNA通用引物进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，产物送北京天一辉远生物科技有限公司进行DNA测序。进入NCBI主页，应用BLAST程序与数据库中的已有细菌16S rDNA序列或真菌18S rDNA序列进行相似性比较分析。利用ClustalX1.83进行匹配比对，然后用MEGA5.05软件构建系统发育树。
5菌种性质评价
5.1耐酸试验
将干酪乳杆菌BFEC2002G3活化后，按2％的接种量分别接种于pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的MRS液体培养基中，37℃培养16h，采用平板计数法检测活菌数。
表1干酪乳杆菌BFEC2002G3对pH值的耐受性(CFU/mL)
从表1可见:干酪乳杆菌BFEC2002G3在pH 2.0环境中可以存活，活菌数为5.3×102CFU/mL，对酸性环境有一定的耐受能力；在pH 3.0时，干酪乳杆菌BFEC2002G3增殖非常明显，活菌数为5.12×107CFU/mL；在pH为4.0 -7.0时，干酪乳杆菌BFEC2002G3增殖效果非常显著，在pH 6.0时，活菌数最高，为42.6×108CFU/mL。干酪乳杆菌BFEC2002G3对酸有一定的抵抗能力。
5.2耐胆盐试验
在已灭菌的MRS液体培养基中，无菌条件下添加不同质量分数的胆盐(质量/体积):0、0.3％、0.6％、0.9％和1.2％，将BFEC2002G3按2％的接种量，分别接种于含不同胆盐质量分数的MRS培养基中，37℃培养16h，采用平板计数法检测活菌数。
表2不同质量浓度的胆盐对副干酪乳杆菌的影响(CFU/mL)
从表2可见:随着胆盐质量分数的增加，干酪乳杆菌BFEC2002G3的存活率显著降低。干酪乳杆菌BFEC2002G3在胆盐质量分数为0.3％时存活较好，含菌数为3.2×106CFU/mL；胆盐质量分数为1.2％时，含菌数降低为6.3×104CFU/mL。干酪乳杆菌BFEC2002G3对胆盐具有一定的耐受力。
5.3对病原菌的抑菌试验
采用牛津杯法对BFEC2002G3抑菌效果进行检测。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌4种指示菌在LB液体培养基中分别培养24h后，进行10倍梯度稀释，从稀释度为100万-1 000万的指示菌稀释液中，分别取20mL指示菌悬液加入冷却至45℃的300mL MRS培养基中，摇匀，作为菌层，让其完全凝固。在无菌操作箱中，将121℃灭菌30min的不锈钢牛津杯，等距离放置于培养基表面，每个平板中放置2个牛津杯，分别用无菌移液枪吸取相同体积的副干酪乳杆菌菌液，填充牛津杯，每种菌各重复3次，平放在培养箱中，37℃培养24h，抑菌圈的直径用游标卡尺准确测量,并计算平均值。
表3干酪乳杆菌BFEC2002G3对病原菌得抑菌作用
从表3可见:干酪乳杆菌BFEC2002G3对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌的均具有抑菌效果，抑菌效果达到高度敏感程度，表明干酪乳杆菌BFEC2002G3对这4种病原菌都有很好的抑菌效果。
5.4模拟胃液的耐受性试验
配MRS液体培养基，用盐酸溶液调节pH至3.0，分装于500mL锥形瓶中，100mL/瓶，121℃灭菌20min，灭菌后在无菌操作箱中，每100mL培养基中分别添加0.5g胃蛋白酶，0.5gNaCl，配制成模拟胃液；以10％的接种量，将BFEC2002G3菌液接种到模拟胃液中，37℃恒温培养，分别于0、0.5、1.0、1.5和2.h取样，测定存活细胞的数量，并计算存活率(存活率＝不同时间的活菌数/0时活菌数)。
表4干酪乳杆菌BFEC2002G3对体外模拟胃液的耐受性(CFU/mL)
由表4可见：随着时间的延长，干酪乳杆菌BFEC2002G3活菌数逐步减少，1h后干酪乳杆菌BFEC2002G3活菌数为4.39×107CFU/mL，2h后干酪乳杆菌BFEC2002G3活菌数为3.60×107CFU/mL。干酪乳杆菌BFEC2002G3在模拟胃液环境中耐受时间超过2h，存活率70％以上，说明干酪乳杆菌BFEC2002G3能耐受胃液环境，并且存活率高，进入肠道的活菌数多。
5.5体外模拟肠液的耐受性试验
配MRS液体培养基，用NaOH溶液调节pH至8.0，分装于500mL锥形瓶中，100mL/瓶，121℃灭菌20min，灭菌后在无菌操作箱中，每100mL培养基中分别加入0.3g猪胆盐，1g胰蛋白酶，0.5g NaCl，配制成模拟肠液；
以10％的接种量，将BFEC2002G3菌液接种到模拟肠液中，37℃恒温培养，分别于0、1、2和4h取样，测定存活细胞的数量，并计算存活率(存活率＝不同时间的活菌数/0时活菌数)。
表5干酪乳杆菌BFEC2002G3对体外模拟肠液的耐受性(CFU/mL)
由表5可见：1h后的存活率为96.18％，2h后的存活率为92.15％，4h后干酪乳杆菌BFEC2002G3存活率为82.56％。随着时间的延长，存活率逐步降低。试验结果表明:干酪乳杆菌BFEC2002G3能耐受模拟猪体肠液环境，4h后存活率为80％以上，说明干酪乳杆菌BFEC2002G3能抵抗肠液环境，并且存活率高，在肠道中发挥益生效应的活菌数多。
实施例2
一种发酵蔬菜尾菜制备高膳食纤维的方法制得的蔬菜尾菜高膳食纤维，包括以下步骤：
步骤1制备发酵底物，所述发酵底物包括白菜尾菜；
步骤2制备复合微生物菌液，混合均匀，备用，其中，复合微生物菌液配比为植物乳杆菌BFC190204、干酪乳杆菌BFEC2002G3的菌种份数比为：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝4：6。
步骤3接种发酵，按发酵底物的1％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28℃，水分含量15％，发酵时间为3天，得到发酵蔬菜尾菜高膳食纤维。
实施例3
一种发酵蔬菜尾菜制备高膳食纤维的方法制得的饲料，包括以下步骤：
步骤1制备发酵底物，所述发酵底物具体包括白菜尾菜40％，玉米35％，豆粕10％，麸皮11％，玉米蛋白粉1％，食盐1％，磷酸氢钙1％，预混料1％；所述预混料每千克预混料含维生素A 15000IU，维生素D3 50000IU，维生素E 2200IU，Fe 27mg，Cu 37mg，Zn 15mg，Mn17mg，I15 mg，Co16 mg，Se10 mg；
步骤2制备复合微生物菌液，混合均匀，备用，其中，复合微生物菌液配比为植物乳杆菌BFC190204、干酪乳杆菌BFEC2002G3的菌种份数比为：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝4：6；
步骤3接种发酵，按发酵底物的1％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28℃，水分含量15％，发酵时间为3天，得到发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料。
试验二发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料发酵前后的营养成分
比较实施例3的发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料发酵前后的营养成分，重复3次取平均值。粗蛋白：根据GB/T6432-2018(饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法)规定的方法实施；氨基酸：根据GB/T18246-2019(饲料中氨基酸的测定)规定的方法实施；中性洗涤纤维：GB/T 20806-2006饲料中中性洗涤纤维(NDF)的测定；酸性洗涤纤维：NY/T 1459-2007饲料中酸性洗涤纤维的测定。
表6发酵工艺对发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料营养成分的影响
试验结果：
发酵工艺对发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料的营养的影响如表6所示，本申请的发酵工艺可使得发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料中粗蛋白中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量提高。发酵前后氨基酸营养水平变化较大，经过本申请的发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料，表6中各种氨基酸均有不同程度升高。
实施例4
一种发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料的使用方法，包括以下步骤：
步骤1制备发酵底物，所述发酵底物具体包括白菜尾菜40％，玉米35％，豆粕10％，麸皮11％，玉米蛋白粉1％，食盐1％，磷酸氢钙1％，预混料1％；所述预混料每千克预混料含维生素A 15000IU，维生素D3 50000IU，维生素E 2200IU，Fe 27mg，Cu 37mg，Zn 15mg，Mn17mg，I15 mg，Co16 mg，Se10 mg；
步骤2制备复合微生物菌液，混合均匀，备用，其中，复合微生物菌液配比为植物乳杆菌BFC190204、干酪乳杆菌BFEC2002G3的菌种份数比为：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝4：6；
步骤3接种发酵，按发酵底物的1％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28℃，水分含量15％，发酵时间为3天，得到发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料；
步骤4按普通配合饲料总质量的10～50％替换为步骤3的发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料，直接进行投喂。
试验三发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料替代水平对湖羊生长性能的影响
2021年6月，将此批发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料在山东东营养殖基地进行试验。采用羊场粗饲料为对照组，试验组是采用发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料在羊场粗饲料基础日粮基础上分别替代0，10％，20％，30％，40％，50％。用上述获得的饲料按照常规投喂方式饲喂健康体壮的湖羊。预试期7天，正试期35天，羊场粗饲料日粮组成及营养水平见表7。
表7羊场粗饲料日粮组成及营养水平(％干物质)
| 项目 | 羊场粗饲料日粮 |
| 苜蓿干草 | 40 |
| 玉米 | 35 |
| 豆粕 | 12 |
| 麸皮 | 10 |
| 食盐 | 1 |
| 磷酸氢钙 | 1 |
| 预混料 | 1 |
所述预混料每千克饲粮提供：VA 1250IU，VD 184IU，VE 25IU，VE 15IU，Co 0.3mg，I 1.0mg，Fe 70mg，Se 0.3mg，Mn 35mg，Zn 45mg。
试验结束，计算试验羊的平均日采食量、平均日增重和料重比。
平均日采食量＝(总投喂量-总剩料量)/(试验动物数×试验天数)
平均日增重＝(末重-初重)/试验天数
料重比＝平均日采食量/平均日增重
表8不同发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料替代水平对湖羊生长性能的影响
由表8可知，随着发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料替代水平的增加，湖羊的终末体重和平均日增重呈先升高后降低的趋势，且在替代水平为30％时获得最佳值；而料重比呈相反趋势，在30％替代水平时获得最佳料重比为4.48。
试验组1
一种发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料的使用方法，包括以下步骤：
发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A的生产方法：
步骤1制备发酵底物，将发酵底物的各原料按质量百分比混合均匀，备用，其中，白菜尾菜40％，玉米35％，豆粕10％，麸皮11％，玉米蛋白粉1％，食盐1％，磷酸氢钙1％，预混料1％；所述预混料每千克预混料含维生素A 15000IU，维生素D3 50000IU，维生素E2200IU，Fe 27mg，Cu 37mg，Zn 15mg，Mn 17mg，I15 mg，Co16 mg，Se10 mg；
步骤2制备复合微生物菌液，混合均匀，备用，其中，复合微生物菌液配比为植物乳杆菌、干酪乳杆菌的菌种份数比为：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝为4：6；
步骤3接种发酵，按发酵底物的1％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28℃，水分含量15％，发酵时间为3天，得到发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A。
试验组2
发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料B的生产方法：
步骤1制备发酵底物，将发酵底物的各原料按质量百分比混合均匀，备用，其中，白菜尾菜40％，玉米35％，豆粕10％，麸皮11％，玉米蛋白粉1％，食盐1％，磷酸氢钙1％，预混料1％；所述预混料每千克预混料含维生素A 15000IU，维生素D3 50000IU，维生素E2200IU，Fe 27mg，Cu 37mg，Zn 15mg，Mn 17mg，I15 mg，Co16 mg，Se10 mg；
步骤2制备植物乳杆菌菌液，BFC190204
步骤3接种发酵，按发酵底物的1％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28℃，水分含量15％，发酵时间为3天，得到发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料B。
试验组3
发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料C的生产方法：
步骤1制备发酵底物，将发酵底物的各原料按质量百分比混合均匀，备用，其中，白菜尾菜40％，玉米35％，豆粕10％，麸皮11％，玉米蛋白粉1％，食盐1％，磷酸氢钙1％，预混料1％；所述预混料每千克预混料含维生素A 15000IU，维生素D3 50000IU，维生素E2200IU，Fe 27mg，Cu 37mg，Zn 15mg，Mn 17mg，I15 mg，Co16 mg，Se10 mg；
步骤2制备干酪乳杆菌菌液，BFEC2002G3，
步骤3接种发酵，按发酵底物的1％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28℃，水分含量15％，发酵时间为3天，得到发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料C。
试验四不同发酵菌液的组合对湖羊生长性能的影响
2022年4月，将此批发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A、B和C在山东东营养殖基地进行试验。采用羊场粗饲料为对照组，采用发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A、B和C替代羊场粗饲料30％作为试验组1、2和3。用上述获得的饲料按照常规投喂方式饲喂健康体壮的湖羊。预试期7天，正试期35天，羊场粗饲料日粮组成及营养水平见表9。
表9羊场粗饲料日粮组成及营养水平(％干物质)
所述预混料每千克饲粮提供：VA 1250IU，VD 184IU，VE 25IU，VE15IU，Co0.3mg，I1.0mg，Fe 70mg，Se 0.3mg，Mn 35mg，Zn 45mg。
1生长性能
试验结束，计算试验羊的平均日采食量、平均日增重和料重比。
平均日采食量＝(总投喂量-总剩料量)/(试验动物数×试验天数)
平均日增重＝(末重-初重)/试验天数
料重比＝平均日采食量/平均日增重
2血清生化指标及抗氧化指标
试验结束，试验结束后，每个重复随机取2只羊，颈静脉采血10mL，收集血清，-20℃冰箱保存。采用富士全自动干式生化分析仪(dri-chennx500ivc+)测定总蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)含量，使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。
3屠宰性能测定
试验结束后，每组随机选择6只湖羊，停止喂料16h后进行颈静脉放血屠宰，分别称胴体重、骨重、肉重，然后计算屠宰率、骨肉比、胴体净肉率。屠宰率为胴体重与宰前活重之比；胴体净肉率为净肉重与胴体重之比。
4肉品质
屠宰后，采集背最长肌进行肉色、肌肉pH、滴水损失、剪切力、系水力等肉品质的测定。
试验结果：
表10发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A、B、C对湖羊生长性能的影响
如表10所示，发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A、B、C三种饲料湖羊生长性能均高于对照组，其中饲喂发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A的试验组1获得最佳终末体重、平均日增重和料重比。
表11发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A、B、C对湖羊血清生化指标的影响
如表11所示，各实验组湖羊血清TP、ALB、GLU和TG含量高于对照组，BUN含量低于对照组。试验组1获得TP、ALB、GLU、TG的最高值，BUN的最低值，这表明饲喂发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A能够促进湖羊机体蛋白质合成；促进机体尿素循环，降低BUN含量，改善羊体内的氮素营养，增加体内的蛋白质储备；通过饲喂发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A促进了湖羊瘤胃微生物生长繁殖，同时提高了湖羊脂类代谢。
表12发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A、B、C对湖羊抗氧化指标的影响
由表12所示，各实验组湖羊血清GSH-PX、SOD和T-AOC含量高于对照组，MDA含量低于对照组。试验组1获得血清GSH-PX、SOD和T-AOC含量最高值，MDA最低值，这说明饲喂发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A可以提高湖羊机体的抗氧化能力，减少机体损伤。
表13发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A、B、C对湖羊屠宰性能的影响
由表13所示，与对照组相比，试验组1、2和3屠宰率分别提高了5.80％、1.12％和3.39％，肉骨比分别提高10.74％、2.89％和6.61％，胴体净肉率分别提高7.79％、3.53％和4.98％，且试验组1获得最佳的屠宰性能。这说明，饲喂发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A可以提高湖羊的屠宰性能。
表14发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A、B、C对湖羊肉品质的影响
由表14所示，与对照组相比，试验组1、2和3的熟肉率分别提高10.17％、3.75％和6.79％，剪切力分别降低26.69％、20.95％和23.26％，pH分别降低5.98％、2.11％和3.69％，亮度分别提高17.16％、3.53％和11.97％，红度分别提高12.06％、9.18％和11.50％，黄度分别提高44.22％、27.23％和31.19％。试验组1获得最佳的肉品质。这说明饲喂发酵蔬菜尾菜高膳食纤维反刍饲料A可以降低湖羊的肌肉嫩度、蒸煮损失，可以改善湖羊肉色，改善湖羊的食用品质。
试验五不同发酵参数的筛选对发酵尾菜制备高膳食纤维指标的影响
比较不同发酵参数发酵蔬菜尾菜高膳食纤维的营养成分，重复3次取平均值。因素1：植物乳杆菌BFC190204、干酪乳杆菌BFEC2002G3的菌种份数比，因素2：接种量，因素3：发酵温度，因素4：发酵时间。发酵方法同实施例3，具体的发酵参数可替换成表15的参数。发酵后测定中性洗涤纤维：GB/T 20806-2006饲料中中性洗涤纤维(NDF)的测定；酸性洗涤纤维：NY/T 1459-2007饲料中酸性洗涤纤维的测定。
表15不同发酵参数的筛选对发酵尾菜制备高膳食纤维指标的影响
试验结果：
最佳发酵工艺参数是：复合微生物菌液配比为植物乳杆菌BFC190204、干酪乳杆菌BFEC2002G3的菌种份数比为：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝4：6；按发酵底物的1％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28℃，发酵时间为3天，得到发酵蔬菜尾菜制备高膳食纤维，其中中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的含量较高。
通过对照使用本申请单一发酵菌株发酵蔬菜尾菜，我们看出，本申请的复合菌发酵的效果更优，其中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的含量都要比单一使用一种发酵菌株的效果好，说明本申请的复合菌具有协同效果。
通过对照使用本课题组其他植物乳杆菌菌株BFC1602与干酪乳杆菌BFEC2002G3配以份数比4:6，对照得出，其组合得到发酵蔬菜尾菜制备高膳食纤维，没有本申请的发酵效果好。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3，保藏编号为CGMCCNo.20432。
2.权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFEC2002G3在抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副伤寒沙门菌或鸡白痢沙门菌中的应用。
3.一种发酵蔬菜尾菜制备高膳食纤维的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1制备发酵底物，所述发酵底物包括蔬菜尾菜；
步骤2制备复合微生物菌液，混合均匀，备用，其中，复合微生物菌液配比为植物乳杆菌BFC190204、干酪乳杆菌BFEC2002G3的菌种份数比为：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝(1-6)：(6-10)。
步骤3接种发酵，按发酵底物的1-1.2％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28-30℃，水分含量15-30％，发酵时间为3-5天，得到发酵蔬菜尾菜高膳食纤维。
4.如权利要求3的方法，其特征在于，所述发酵底物具体包括蔬菜尾菜35-50％，玉米25-40％，豆粕5-10％，麸皮5-15％，玉米蛋白粉0.5-1.5％，食盐0.5-1.5％，磷酸氢钙0.5-1％，预混料0.5-1％，各组份百分比为100％。
5.如权利要求3或4的方法，其特征在于，所述蔬菜尾菜包括白菜、菠菜、小白菜或娃娃菜中的一种或多种。
6.如权利要求3的方法，其特征在于，所述步骤2的菌种份数比为：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝(3-5)：(6-8)。
7.如权利要求3的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BFC190204，保藏编号为CGMCC No.18915，
所述植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BFC19020的活菌数≥2.0×109cfu/g，优选为≥4.0×109cfu/g，
所述干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BFC2002G的活菌数≥1×109cfu/g，优选为≥3.0×109cfu/g。
8.如权利要求3的方法，其特征在于，所述步骤2的菌种份数比为：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝4：6；所述步骤3接种发酵，按发酵底物的1％的量加入复合微生物菌液(w/w)，混合均匀；发酵温度为28℃，水分含量15％，发酵时间为3天。
9.一种由权利要求3或4或5所述的方法生产的饲料。
10.如权利要求9的饲料的使用方法，其特征在于：按普通配合饲料总质量的10-50％替换为权利要求3或4或5发酵后的饲料，直接进行投喂。
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