CN109363004A - 大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法与应用 - Google Patents

大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法,包括如下具体步骤:1、复方中草药制备;2、微生物菌株活化;3、复方中草药发酵物制备;4、复方中草药发酵;5、发酵后处理;6、粉碎。本发明的大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂,具有促生长、提高免疫力和调节肠道菌群等多种功效;本发明将中草药和益生菌合二为一,不仅具有中草药和益生菌的双重优点,而且中草药和益生菌能在机体内通过协同作用发挥更大的益生作用,中草药和益生菌均属于绿色安全环保型饲料添加剂,无耐药性和药物残留等问题,可有效地降低抗生素类药物的使用,提高水产品质量和安全性。

Description

大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及水产养殖饲料添加剂领域,具体涉及一种大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法与应用。
背景技术
大鳞鲃(Barbus capito)属于鲤科、鲃属,是咸海名贵经济鱼类,具有肉质鲜美、生长速度快、抗逆性强、耐盐碱等优良性状(尼科里斯基,1985),我国于2003年从乌兹别克斯坦引进,现已在黑龙江、河北、天津、北京、重庆、辽宁等地推广。随着总产量和市场需求量越来越高,我国水产养殖业规模的不断扩大,工厂化、集约化程度越来越高,养殖水域的污染日益严重,病害频繁发生。
免疫增强剂可以提高机体防御机制,预防和治疗疾病,促进水产养殖业持续发展。水产上常用的免疫增强剂有葡聚糖、乳铁传递蛋白、左旋咪唑、壳聚糖、生长激素、vitaminC、芦荟以及分枝杆菌的胞外产物等。这些免疫增强剂可以通过提高吞噬细胞数量,增强溶菌酶和补体活性,增加免疫球蛋白等途径来改善鱼体免疫状态。另一方面,大量抗生素、化学药物和激素造成细菌耐药性,环境污染、药物残留、致癌、致畸等,给养殖业和人类健康带来严重危害,因此,寻找安全性较高的新型饲料添加剂替代抗生素类药物是实现水产动物健康养殖的关键。中草药饲料添加剂应用于水产养殖完全符合发展无公害水产业,生产绿色水产品的病害防治准则。目前,中草药已被广泛应用于水产养殖业。
发明内容
本发明的目的是提供一种大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法与应用,不仅在一定程度上减少水产养殖中抗生素的大量使用,避免造成养殖水体污染,而且可以改善大鳞鲃鱼生长性能,提高机体免疫力,增加水产品安全性。
本发明的技术解决方案:
大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法,其特征在于:包括如下具体步骤:
1、复方中草药制备:准确称取复方中草药各组分,将其粉碎至60-80目,充分混匀,于紫外灯下灭菌,无菌下放置备用;
2、微生物菌株活化:将双歧杆菌接种到PYG液体培养基中,在厌氧条件下38℃摇瓶培养20-24h;将植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中,在厌氧条件下37℃摇瓶培养16-18h;将枯草芽孢杆菌接种到LB液体培养基中,37℃摇瓶培养22-24h;将酿酒酵母接种YPD液体培养基中,有氧条件下28℃摇瓶培养22-24h;将上述微生物连续培养两代,之后用平板计数法检测微生物数量达到108cfu/mL时,即为种子液;
3、复方中草药发酵物制备:将步骤1所得的复方中草药加入到50L发酵罐中,并向其中加入可溶性淀粉3.0-5.0%、葡萄糖0.8-1.2%、酵母膏0.1-0.3%、K2HPO4 0.05%,混匀,加入6-8倍无菌蒸馏水后混匀;
4、复方中草药发酵:向步骤3所得中草药发酵物中分别按2-3%和3-5%接种步骤2所得枯草芽孢杆菌和酿酒酵母种子液,控制发酵温度28-35℃、转速160-300r/min、通气量15-20L/min,在此条件下发酵20-40h;之后分别接种3-5%的双歧杆菌和植物乳杆菌种子液,控制发酵温度28-35℃、转速160-300r/min,在此无氧条件下发酵15-24h;
5、发酵后处理:复方中草药发酵结束后,向发酵液中按体积比1:1.5-2加入麸皮,进行吸附,然后放入干燥箱中于50-60℃进行干燥,水分控制在8-10%;
6、粉碎:干燥后,用粉碎机将其粉碎至60-80目,即得大鳞鲃鱼用中草药免疫增强剂。
优选地,所述步骤1中复方中草药各组分及质量份比为黄芪10-15份、地黄12-18份、山楂10-15份、山茶籽15-20份、肉桂8-12份、甘草6-10份、鱼腥草6-8份、当归5-8份、党参3-5份、白术2-4份。
优选地,所述步骤2中所用活化培养基配方为PYG液体培养基(g/L):蛋白胨20.0,葡萄糖5.0,酵母浸粉10.0,氯化钠0.08,半胱氨酸盐酸盐0.5,氯化钙0.008,硫酸镁0.008,磷酸氢二钾0.08,碳酸氢钠0.4,pH 7.2;MRS液体培养基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉浸粉5.0,酵母浸粉4.0,葡萄糖20.0,磷酸氢二钾2.0,柠檬酸三铵2.0,醋酸钠5.0,硫酸镁0.2,硫酸锰0.05,吐温80 1.0,pH 6.2;LB液体培养基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,氯化钠10.0,pH 7.0;YPD液体培养基(g/L):酵母膏10.0,蛋白胨20.0,葡萄糖20.0,pH 6.0,PYG液体培养基、MRS液体培养基、LB液体培养基、YPD液体培养基均经121℃高压蒸汽灭菌20min后使用。
优选地,所述步骤4中枯草芽孢杆菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心,菌种编号CGMCC1.14985)和酿酒酵母(中国普通微生物菌种保藏管理中心,菌种编号CGMCC2.3973)种子液的最优接种量分别为2%和5%。
优选地,所述步骤4中双歧杆菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心,菌种编号CGMCC1.5014)和植物乳杆菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心,菌种编号CGMCC1.12934)种子液的最优接种量均为5%。
优选地,所述大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂需添加到配合饲料中使用,其添加量为0.2-0.8%,或所述免疫增强剂在预混料、浓缩料以配合料中所需的比例添加使用。
本发明的有益效果:本发明的大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂,具有促生长、提高免疫力和调节肠道菌群等多种功效。本发明将中草药和益生菌合二为一,不仅具有中草药和益生菌的双重优点,而且中草药和益生菌能在机体内通过协同作用发挥更大的益生作用:通过调节机体内环境和肠道菌群,促进益生菌生长和消化相关酶活性,提高饲料转化率,起到促生长作用;中草药富含多糖类、有机酸、萜类等挥发性物质,这些物质可提高淋巴细胞免疫功能及溶菌酶活力,从而起到增强机体非特异性免疫的功能;通过提高机体白细胞杀菌活性和血清中溶菌酶活性,提升肠道中乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌数量,从而增加肠道内有益菌的组成和数量,并抑制大部分条件致病菌的生长,可预防和控制鱼病的发生,降低养殖风险,提高养殖收益。中草药和益生菌均属于绿色安全环保型饲料添加剂,无耐药性和药物残留等问题,可有效地降低抗生素类药物的使用,提高水产品质量和安全性,具有非常广阔的前景。
附图说明
图1为嗜水气单胞菌感染后大鳞鲃鱼成活率比较图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1
大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂,包括以下制备步骤:
1、称量:按照如下复方中草药配方准确称量各组分:黄芪12份、地黄15份、山楂10份、山茶籽15份、肉桂10份、甘草6份、鱼腥草8份、当归8份、党参3份、白术2份;
2、复方中草药的制备:将称量的中草药各组分粉碎至80目,充分混匀;
3、微生物菌株活化:将双歧杆菌接种到PYG液体培养基中,在厌氧条件下38℃摇瓶培养24h;将植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中,在厌氧条件下37℃摇瓶培养18h;将枯草芽孢杆菌接种到LB液体培养基中,37℃摇瓶培养24h;将酿酒酵母接种YPD液体培养基中,有氧条件下28℃摇瓶培养24h;将上述微生物连续培养两代,之后用平板计数法检测微生物数量达到108cfu/mL时,即为种子液;
4、复方中草药发酵物制备:将步骤2所得的复方中草药加入到50L发酵罐中,并向其中加入可溶性淀粉3.0-5.0%、葡萄糖0.8-1.2%、酵母膏0.1-0.3%、K2HPO4 0.05%,混匀,加入8倍无菌蒸馏水后混匀;
5、复方中草药发酵:向步骤4所得中草药发酵物中分别按2%和5%接种步骤3所得枯草芽孢杆菌和酿酒酵母种子液,控制发酵温度28-35℃、转速160-300r/min、通气量15-20L/min,在此条件下发酵30h;之后分别接种5%的双歧杆菌和植物乳杆菌种子液,控制发酵温度28-35℃、转速160-300r/min,在此无氧条件下发酵15h;
6、发酵后处理:复方中草药发酵结束后,向发酵液中按体积比1:2加入麸皮,进行吸附,然后放入干燥箱中于60℃进行干燥,水分控制在10%;
7、粉碎:干燥后,用粉碎机将其粉碎至80目,即得大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂。
实施例2
大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂,包括以下制备步骤:
1、称量:按照如下复方中草药配方准确称量各组分:黄芪12份、地黄15份、山楂12份、山茶籽17份、肉桂10份、甘草8份、鱼腥草7份、当归6份、党参4份、白术3份;
2、复方中草药的制备:将称量的中草药各组分粉碎至80目,充分混匀;
3、微生物菌株活化:将双歧杆菌接种到PYG液体培养基中,在厌氧条件下38℃摇瓶培养24h;将植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中,在厌氧条件下37℃摇瓶培养18h;将枯草芽孢杆菌接种到LB液体培养基中,37℃摇瓶培养24h;将酿酒酵母接种YPD液体培养基中,有氧条件下28℃摇瓶培养24h。将上述微生物连续培养两代,之后用平板计数法检测微生物数量达到108cfu/mL时,即为种子液;
4、复方中草药发酵物制备:将步骤2所得的复方中草药加入到50L发酵罐中,并向其中加入可溶性淀粉3.0-5.0%、葡萄糖0.8-1.2%、酵母膏0.1-0.3%、K2HPO4 0.05%,混匀,加入8倍无菌蒸馏水后混匀;
5、复方中草药发酵:向步骤4所得中草药发酵物中分别按2%和5%接种步骤3所得枯草芽孢杆菌和酿酒酵母种子液,控制发酵温度28-35℃、转速160-300r/min、通气量15-20L/min,在此条件下发酵30h;之后分别接种5%的双歧杆菌和植物乳杆菌种子液,控制发酵温度28-35℃、转速160-300r/min,在此无氧条件下发酵15h;
6、发酵后处理:复方中草药发酵结束后,向发酵液中按体积比1:2加入麸皮,进行吸附,然后放入干燥箱中于60℃进行干燥,水分控制在10%;
7、粉碎:干燥后,用粉碎机将其粉碎至80目,即得大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂。
实施例3
大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂,包括以下制备步骤:
1、称量:按照如下复方中草药配方准确称量各组分:黄芪10份、地黄18份、山楂15份、山茶籽15份、肉桂12份、甘草6份、鱼腥草6份、当归8份、党参5份、白术4份;
2、复方中草药的制备:将称量的中草药各组分粉碎至80目,充分混匀;
3、微生物菌株活化:将双歧杆菌接种到PYG液体培养基中,在厌氧条件下38℃摇瓶培养24h;将植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中,在厌氧条件下37℃摇瓶培养18h;将枯草芽孢杆菌接种到LB液体培养基中,37℃培养摇瓶24h;将酿酒酵母接种YPD液体培养基中,有氧条件下28℃摇瓶培养24h。将上述微生物连续培养两代,之后用平板计数法检测微生物数量达到108cfu/mL时,即为种子液;
4、复方中草药发酵物制备:将步骤2所得的复方中草药加入到50L发酵罐中,并向其中加入可溶性淀粉3.0-5.0%、葡萄糖0.8-1.2%、酵母膏0.1-0.3%、K2HPO4 0.05%,混匀,加入8倍无菌蒸馏水后混匀;
5、复方中草药发酵:向步骤4所得中草药发酵物中分别按2%和5%接种步骤3所得枯草芽孢杆菌和酿酒酵母种子液,控制发酵温度28-35℃、转速160-300r/min、通气量15-20L/min,在此条件下发酵30h;之后分别接种5%的双歧杆菌和植物乳杆菌种子液,控制发酵温度28-35℃、转速160-300r/min,在此无氧条件下发酵15h;
6、发酵后处理:复方中草药发酵结束后,向发酵液中按体积比1:2加入麸皮,进行吸附,然后放入干燥箱中于60℃进行干燥,水分控制在10%;
7、粉碎:干燥后,用粉碎机将其粉碎至80目,即得大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂。
上述中草药免疫增强剂对大鳞鲃鱼生长性能和免疫力的增强效果:试验选取体质量为(98.92±2.25)g的大鳞鲃鱼,随机分成4组,对照组投喂基础饲料,试验组投喂添加实施例1至实施例3中草药免疫增强剂的饲料,试验周期为60d。
表1 大鳞鲃鱼生产性能比较
注:同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05),标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05),下同。
从表1可以看出,与对照组相比,试验组增重率和特定生长率均有提高,且实施例1和实施例2的增重率和特定生长率均显著高于对照组(P<0.05)。
表2 大鳞鲃鱼免疫器官指数的比较
从表2可以看出,试验组中肾体指数与对照组差异不显著(P>0.05),而头肾体指数和脾体指数均显著高于对照组(P<0.05),其中实施例3的头肾体指数极显著高于对照组(P<0.05)。
表3 大鳞鲃鱼血清免疫酶活性的比较
由表3可知,实施例2和实施例3的溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均显著高于对照组(P<0.05),实施例1的碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05),而溶菌酶和酸性磷酸酶活性与对照组差异不显著(P>0.05)。
如图1所示,用嗜水气单胞菌攻毒后,试验组大鳞鲃鱼成活率显著高于对照组(P<0.05),且实施例3大鳞鲃鱼成活率极显著高于对照组(P<0.05)。
综合以上试验结果表明,在饲料中添加发酵型中草药免疫增强剂能显著提高大鳞鲃鱼免疫器官指数和血清免疫酶活性,增强大鳞鲃鱼免疫力,提高大鳞鲃鱼对嗜水气单胞菌的抵抗力,从而降低抗生素类药物和化学药物的使用,增加水产品安全性,降低环境污染;另外发酵型中草药免疫增强剂可以调节大鳞鲃鱼肠道微生物,增加有益菌的数量,促进饵料消化吸收,提高饲料转化率,进而提高大鳞鲃鱼的生产性能,降低饲料投入,增加养殖者经济效益。
以上所述实施例仅是对本发明的几种实施方式,并不是对本发明的专利范围进行限制。对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法,其特征在于:包括如下具体步骤:
1、复方中草药制备:准确称取复方中草药各组分,将其粉碎至60-80目,充分混匀,于紫外灯下灭菌,无菌下放置备用;
2、微生物菌株活化:将双歧杆菌接种到PYG液体培养基中,在厌氧条件下38℃摇瓶培养20-24h;将植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中,在厌氧条件下37℃培养16-18h;将枯草芽孢杆菌接种到LB液体培养基中,37℃培养22-24h;将酿酒酵母接种YPD液体培养基中,有氧条件下28℃摇瓶培养22-24h;将上述微生物连续培养两代,之后用平板计数法检测微生物数量达到108cfu/mL时,即为种子液;
3、复方中草药发酵物制备:将步骤1所得的复方中草药加入到50L发酵罐中,并向其中加入可溶性淀粉3.0-5.0%、葡萄糖0.8-1.2%、酵母膏0.1-0.3%、K2HPO4 0.05%,混匀,加入6-8倍无菌蒸馏水后混匀;
4、复方中草药发酵:向步骤3所得中草药发酵物中分别按2-3%和3-5%接种步骤2所得枯草芽孢杆菌和酿酒酵母种子液,控制发酵温度28-35℃、转速160-300r/min、通气量15-20L/min,在此条件下发酵20-40h;之后分别接种3-5%的双歧杆菌和植物乳杆菌种子液,控制发酵温度28-35℃、转速160-300r/min,在此无氧条件下发酵15-24h;
5、发酵后处理:复方中草药发酵结束后,向发酵液中按体积比1:1.5-2加入麸皮,进行吸附,然后放入干燥箱中于50-60℃进行干燥,水分控制在8-10%;
6、粉碎:干燥后,用粉碎机将其粉碎至60-80目,即得大鳞鲃鱼用中草药免疫增强剂。
2.如权利要求1所述大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法,其特征在于:所述步骤1中复方中草药各组分及质量份比为黄芪10-15份、地黄12-18份、山楂10-15份、山茶籽15-20份、肉桂8-12份、甘草6-10份、鱼腥草6-8份、当归5-8份、党参3-5份、白术2-4份。
3.如权利要求1所述大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法,其特征在于:所述步骤2中所用活化培养基配方为PYG液体培养基(g/L):蛋白胨20.0,葡萄糖5.0,酵母浸粉10.0,氯化钠0.08,半胱氨酸盐酸盐0.5,氯化钙0.008,硫酸镁0.008,磷酸氢二钾0.08,碳酸氢钠0.4,pH 7.2;MRS液体培养基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉浸粉5.0,酵母浸粉4.0,葡萄糖20.0,磷酸氢二钾2.0,柠檬酸三铵2.0,醋酸钠5.0,硫酸镁0.2,硫酸锰0.05,吐温80 1.0,pH6.2;LB液体培养基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,氯化钠10.0,pH 7.0;YPD液体培养基(g/L):酵母膏10.0,蛋白胨20.0,葡萄糖20.0,pH 6.0,PYG液体培养基、MRS液体培养基、LB液体培养基、YPD液体培养基均经121℃高压蒸汽灭菌20min后使用。
4.如权利要求1所述大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法,其特征在于:所述步骤4中枯草芽孢杆菌和酿酒酵母种子液的最优接种量分别为2%和5%。
5.如权利要求1所述大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的制备方法,其特征在于:所述步骤4中双歧杆菌和植物乳杆菌种子液的最优接种量均为5%。
6.大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂的应用,其特征在于:所述大鳞鲃鱼用发酵型中草药免疫增强剂需添加到配合饲料中使用,其添加量为0.2-0.8%,或所述免疫增强剂在预混料、浓缩料以配合料中所需的比例添加使用。
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