CN104430851A - 一种降胆固醇发酵乳及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降胆固醇发酵乳及其制备方法，主要以生鲜乳或乳粉为发酵原料，将乳杆菌DMDL9010接入上述原料中，进行发酵生产，制得降胆固醇发酵乳；所述乳杆菌(Lactobacillus sp.)DMDL 9010，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.5172。该菌在体外的降解胆固醇中最高能降解90mg/100mL的胆固醇，在大鼠体内也表现出很好的降血脂胆固醇的效果，并有很好的耐酸性，本发明得到的发酵乳制品凝乳时间合适，后酸化不严重，口感细腻，风味香浓的发酵乳，本发明的工艺简单，操作方便，具有重要的工业价值。

Description

一种降胆固醇发酵乳及其制备方法

技术领域

本发明属于乳酸菌和乳品加工的技术领域，具体涉及一种降胆固醇发酵乳及制备方法。

背景技术

胆固醇作为人体中重要的固醇类物质，在体内有广泛的生理作用，但随着人们日常膳食摄入的动物性食品日益增多，不合理的膳食结构导致人体内的胆固醇含量容易增多，这便会导致高胆固醇血症，从而引发冠心病、动脉粥样硬化、脑中风等心脑血管疾病。目前国内对于降胆固醇乳酸菌的研究尚处于起步阶段，大多数学者的研究都集中于菌株的筛选及其特性研究，对作用机理的探讨不深，还未见有筛选出的具有高效降胆固醇功效的乳酸菌在食品中应用的报道。因此，研究具有降胆固醇功效的食品及其加工方法，可望使人们在人体正常代谢不受干扰，也不必服用药物的情况下控制体内的血清胆固醇水平，有益人体健康。

据大量的研究结果表明，乳酸菌具有降胆固醇的效果，经常食用含有这些具有降胆固醇乳酸菌的发酵制品及其制剂，有助于降低血清中胆固醇的含量。专利号为ZL 200710123106.0的中国发明专利中筛选得到四种高产胆盐水解酶(BSH)的乳酸菌，并用于酸奶的发酵，其菌株KS4最多能降解胆固醇为42.90mg/100mL。专利号ZL 201110119378.X的中国发明专利中BBE8和BBE7菌株降解胆固醇的最好效果分别为7.28mg/100mL和7.16mg/100mL。专利号ZL 200910091381.8的中国发明专利中筛选得到的乳酸菌和酵母菌的降胆固醇的效果只以相对降解率89.3％来衡量，能降解胆固醇的绝对量未标明。研究论文“具有胆盐水解酶活力乳酸菌的筛选及16SrDNA分子生物学鉴定(董改香，王俊国，段智变，等.中国乳品工业，2008，36(11)：7-10，28)”、“植物乳杆菌LpT1和LpT2体外降胆固醇机制(于平，孙海森，励建荣，等.微生物学报，2011，51(4)：561-565)”、“降胆固醇乳酸菌的筛选及对大鼠血脂的影响(杨琴，胡颖，甘盛力，等。食品科学，2011，32(21)：223-228)”、“具有降胆盐水解酶活性的乳酸菌对高血脂症大鼠血脂的调节作用(王俊国，孟和毕力格，包秋华，等。食品科学，2013，34(1)：257-262)”等论文并未涉及到这些菌在发酵乳中的具体应用方法。

发明内容

本发明针对现有乳酸菌降胆固醇的效果及其在发酵乳中的不足，目的是提供一种降胆固醇的发酵乳及其制备方法。本发明一种降胆固醇的发酵乳具有降解胆固醇效果好的特点，制作过程简单，制品的口感和风味符合“国家标准GB19302-2010发酵乳”中规定的要求。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种降胆固醇发酵乳的制备方法，以生鲜乳或乳粉为发酵原料，将乳杆菌DMDL9010接入上述原料中，进行发酵生产，制得降胆固醇发酵乳；所述乳杆菌(Lactobacillus sp.)DMDL 9010，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNO.5172，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该乳杆菌(Lactobacillus sp.)DMDL 9010菌株具有如下性质：①形态特征：二联杆菌，无芽孢，菌落表面光滑半透明，边缘整齐，有光泽；②生理特征：接触酶阴性，氧化酶阴性，不液化明胶，不还原硝酸盐，精氨酸水解阴性，酪素水解阴性，V-P试验阳性，革兰氏染色为阳性菌，兼性厌氧菌，可利用阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、核糖、山梨糖、海藻糖、七叶灵，不能利用鼠李糖和棉籽糖。能在15℃、37℃、40℃温度下生长，在45℃温度不生长。根据16SrDNA寡核苷酸序列，生理生化特性和编码乳酸脱氢酶基因的LDH1上下游片断的序列鉴定DMDL 9010为植物乳杆菌。

具体发酵生产步骤如下：

(1)将DMDL 9010的冻干粉置于MRS液体培养基中，于28℃-43℃的条件下培养16h～24h，得到的菌体溶液为DMDL 9010的种子液；

(2)以体积比为5～10：100的比例，将步骤(1)所得的种子液接种至含胆固醇的液体培养基中，于28℃-43℃的条件下静止培养16h～24h，得到的菌体溶液为具有降胆固醇的DMDL 9010诱导种子液；

(3)将具有降胆固醇的DMDL 9010诱导种子液离心后去上清液，用生理盐水洗细胞沉淀两次后再离心，去除上清液，取细胞沉淀悬浮于生理盐水中，制成DMDL 9010发酵剂；

(4)按体积百分比为5％～10％的比例将发酵剂接入到发酵原料中，在温度28℃-43℃进行发酵，当发酵酸度达到75°T时终止发酵，即制得降胆固醇发酵乳，所述发酵剂至少含有DMDL 9010发酵剂。

所述发酵剂中还加入嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，其中，DMDL9010与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌的细胞个数比为(0.5～1.25)：1：1。

所述含胆固醇的液体培养基的配方为：以重量份数计，蛋白胨0.8～1.2份，酵母粉0.2～0.8份，牛肉膏0.5～1.5份，葡萄糖1.5～2.5份，柠檬酸三胺0.1～0.3份，七水合硫酸镁0.01～0.03份，磷酸氢二钾0.05～0.35份，四水合硫酸锰0.001～0.009份，乙酸钠0.05～0.35份，抗坏血酸0.02～0.04份，胆固醇0.05～0.50份，吐温800.05～0.50份，蒸馏水91～96份。

所述含胆固醇的液体培养基的制备方法为：

(1)按配方将胆固醇与吐温80混和并在沸水浴中充分溶解，混和均匀后，得到B溶液；将其他原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却至80℃～85℃，得到A溶液；

(2)B溶液灭菌后将温度控制在80℃～85℃，然后将其缓慢加入到A溶液中，并不断搅拌，使胆固醇形成微小的乳状，冷却后即可。

所述MRS液体培养基为：以重量份数计，蛋白胨0.8～1.2份，酵母粉0.2～0.8份，葡萄糖1.5～2.5份，柠檬酸三胺0.1～0.3份，七水合硫酸镁0.01～0.03份，牛肉膏0.5～1.5份，磷酸氢二钾0.05～0.35份，四水合硫酸锰0.001～0.009份，乙酸钠0.05～0.35份，吐温800.05～0.15份，蒸馏水92.8～96.7份，培养基的pH为6.0～7.0。

本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：

(1)本发明的乳酸菌DMDL9010是已知降解胆固醇的能力最高的，目前专利和文献公开的乳酸菌的降解能力都在10mg/100mL左右，而DMDL 9010能降解69mg/100mL以上。

(2)DMDL9010菌株具有很好的耐酸性，作为益生菌提供了一个基础条件。

(3)DDL9010与发酵乳发酵剂(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌)按特定比例复配后进行发酵乳发酵，其凝乳时间控制在5～6小时，发酵温度为28℃～43℃。发酵后的发酵乳，后酸化不严重，在4℃～5℃温度下贮藏31天内酸度维持在108°T之内，口感风味不错，表明在贮藏期内后酸化不严重。其中，胆固醇的降解量最高达到90mg/100mL。

附图说明

图1是乳酸菌DMDL 9010与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌在发酵乳发酵过程中的产酸曲线；其中按“0.25：1：1”配比的发酵乳的发酵酸度不够、“0.50：1：1”为实施例3的情况、“0.75：1：1”为实施例5的情况、“1：1：1”为实施例4的情况、“1.25：1：1”为实施例7的情况、按“1.50：1：1”的配比的发酵乳的发酵过快。

图2是含DMDL 9010菌株的发酵乳在4℃～5℃温度下贮藏31天内酸度的变化情况；其中，“10％LCA9010”为实施例2，“0.50：1：1”为实施例3，“0.75：1：1”为实施例5，“1：1：1”为实施例4，“1.25：1：1”为实施例7。

图3是实施例1中实验组大鼠肝脏大体形态的观察图，其中a、b、c、d、e分别为正常组、高脂模型组、阳性组、9010高剂量组、9010低剂量组。

图4是实施例1中实验组大鼠肝脏病理切片观察图(HE×400)，其中a、b、c、d、e分别为正常组、高脂模型组、阳性组、9010高剂量组、9010低剂量组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。

实施例1

乳杆菌DMDL 9010在体外降解胆固醇的作用非常明显，并且具有很好的耐酸性和降解胆固醇作用。

(1)乳杆菌DMDL 9010在体外降解胆固醇的作用

利用邻苯二甲醛比色法(OPA法)测定在体外降胆固醇的相对含量，来衡量胆固醇的降解效果。将其置于胆固醇含量为100mg/100mL的MRS液体培养基中，胆固醇的去除率为30.59±0.67％。所述含胆固醇的MRS液体培养基(简称MRS-CHOL培养基)的配方为：蒸馏水100mL，MRS培养基5.4g，胆固醇0.1g，吐温80 2mL，牛胆盐0.3g。分装至离心管中。所述配制MRS-CHOL培养基方法为：①胆固醇为脂溶性物质，不溶于水，故先将其置于吐温80中溶解，使其沸腾后充分溶解后趁热缓慢倒入培养基后，呈胶束溶液状态，此培养基的颜色呈不透明的淡黄色。②配制好的培养基在经高温杀菌处理后，会在底部形成深黄色胶状沉淀，该沉淀是吐温和胆固醇的混合物。此时应趁热将离心管晃动或上下颠倒振荡，以使该胶状物完全溶解，并置于室温中自然冷却。若冷却速度过快或没有趁热震荡试管，则该沉淀物会沉积在试管底部，无法溶解。③如果发现胆固醇没有溶解好，要增加吐温80的用量。

将DMDL 9010接种于MRS液体培养基中，进行活化后，按体积百分比为5％接种至MRS-CHOL培养基中，于37℃培养箱中培养24h后将菌液进行高压灭菌处理，再离心，取上清液检测胆固醇的相对含量，计算胆固醇的去除率。为使得所测得的吸光度在线性范围内，稍做修改，具体如下：①将样品经离心(3000r/min，10min)处理后，菌株沉积至试管底部，分别吸取0.5mL的上清液置于试管中作为样品；②分别添加3mL无水乙醇和2mL 50％的氢氧化钾溶液，混匀后置于60℃水浴中加热10分钟，使其充分反应；③待溶液冷却后，加入5mL正己烷，用振荡器使其混匀后，再加入3mL蒸馏水，再震荡混匀；④于室温中静置5分钟以使溶液中的各相分离，其中上层的透明液体即为正己烷层，取0.5mL正己烷层于试管中，用氮吹仪于60℃中挥发尽溶剂；⑤加入邻苯二甲醛显色剂4mL(浓度为0.25mg/mL，溶剂为冰乙酸)，静置10分钟后，再加入2mL浓硫酸，用振荡器使其充分混匀；⑥静置10分钟后，置于A_550nm处测量吸光度，检测时间不超过90分钟；⑦由于所用的MRS-CHOL培养基本身具有颜色(杀菌处理后呈金黄色)，参照文献的方法，故测定胆固醇相对含量的方法来检测菌株对胆固醇的去除率，无接种的MRS-CHOL培养基为对照组，测定吸光度时，以不加入样品，仅含4mL显色剂和2mL浓硫酸的空白溶液为参比。菌株对胆固醇的去除率的公式：胆固醇去除率＝(1-实验组上层清液的吸光度/对照组无菌MRS-CHOL培养基的吸光度)×100％。

不同降解时间对胆固醇去除率的影响：在MRS-CHOL培养基中培养了不同时间后，各菌株对胆固醇的去除率如表1所示，从表中可看出，胆固醇的去除率随着时间的延长而得到提高，但相同的培养时间内，不同乳酸菌的胆固醇降解能力仍是有较大的差别。在表1中植物乳杆菌NDC75017的降胆固醇的最高为32.87％，实际降解量最高为19.72mg/L(王今雨，满朝新，杨相宜，等.植物乳杆菌NDC75017的降胆固醇作用，食品科学，2013，34(3)：243-247)。乳酸菌的胆固醇降解率随时间的延长而提高，其胆固醇降解率在72h后即趋于稳定，至96h降解后效果最好，表现最明显的是DMDL 9010，至96h后其降解的胆固醇的能力达到69.05％，即培养基中69.05mg/100mL的胆固醇被降解掉。

表1不同降解时间对胆固醇的去除率(％)

(2)乳杆菌DMDL 9010的耐酸性

用盐酸(1mol/L)调节MRS的pH值分别为3.0，4.0，5.0，自然pH值为6.0的MRS培养基为对照组，分装至各试管。将经过两次活化后的目标菌种按体积百分比为5％接种于上述不同pH值的MRS培养基中，置于37℃环境下培养3小时后取样，以未接种的空白MRS培养基为参比，测定不同培养基中的OD_600nm值，做3个平行样品并取其平均值。依下式计算菌株的耐酸性：菌株的耐酸性存活率＝(实验组的OD_600nm值/对照组的OD_600nm值)×100％；菌种OD_600nm值的测定方法：取一定量的菌液，用生理盐水对菌液进行稀释，稀释倍数应使得所测的OD_600nm值在分光光度计的0.2～0.8的线性范围内，在波长600_600nm处测吸光度值。结果如表2所示。

表2菌株的耐酸性

(3)乳杆菌DMDL 9010在体内降解胆固醇的作用

①将DMDL 9010按体积百分比为5％的接种于200mL液体MRS培养基中活化，放置37℃培养箱中培养24h，再次按体积百分比为5％接种于发酵罐中进行高密度厌氧培养，在37℃、pH 6.8的条件下培养18h后在8000r/min、4℃条件下离心15min，弃去上清液，收集菌泥，按海藻糖(保护剂)与菌泥的体积比为1.5:1的比例加入，于-40℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上，然后进行真空冷冻干燥，干燥18-20h后，分别复水测定其活菌数，DMDL 9010菌粉中活菌数为9.30×10⁹CFU/g。

②8周龄SPF级SD(Sprague Dawley)大鼠50只，体重160～200g，根据大鼠的体重、血脂随机分为5组。所有SD大鼠由专业人员饲养，5只/笼。在温度22～24℃、湿度50％～60％的条件下，每天光照12h，黑暗12h。实验期间，大鼠自由饮水和进食，正常组喂食普通饲料，其他组均喂食高脂饲料(在普通饲料基础上添加猪油10％，胆固醇1％，胆盐0.2％)。每天上午对各实验组大鼠进行灌胃，正常组和高脂模型组均灌胃无菌水，阳性组灌胃1mg/mL阿托伐他汀钙片(也叫立普妥)水溶液，9010高剂量组灌胃用的剂量为10⁹CFU/ml的DMDL 9010菌悬液，9010低剂量组灌胃用的剂量为10⁷CFU/ml DMDL 9010菌悬液，灌胃量均为0.1mL/10gbw.d。

在第4周，第8周将全部大鼠禁食一夜，进行断尾采血，离心(3000r/min，10min)，分离血清。在第10周将全部大鼠禁食一夜，腹腔采血致死，离心(3000r/min，10min)获得血清。送检中山大学检验科用全自动生化分析仪测定血清中总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量，结果如表3、表4和表5。

如表3所示，第4周时，高脂模型组的血清TC较正常组有明显升高，具有统计学意义(p＜0.05)，这也在一定程度上验证了高脂模型组大鼠高血脂症的形成。比较发现，9010高剂量组和9010低剂量组的血清TC、TG、HDLC均介于高脂模型组和正常组之间，说明9010组灌胃的菌液已经初步显示出一定的降血清胆固醇的作用。

表3第4周(d28)各组血脂检测结果比较(mmol/L)(M±SD，n＝10)

^※相对于正常组有差异(p＜0.05)^▲相对于高脂模型组有差异(p＜0.05)

如表4所示，第8周时，比较发现各组之间的TC、TG虽无显著性差异，但9010组的TC、TG水平都较高脂模型组低，说明9010组对高脂血症具有一定的缓解作用。

比较LDL-C发现，虽各组之间无显著性差异，但所有高脂模型组的LDL-C均高于正常组，说明长期饲喂高脂饲料导致了大鼠体内的低密度脂蛋白胆固醇的增加，增大了大鼠患心血管疾病的风险。而灌胃DMDL9010菌液的实验组LDL-C较高脂模型组低，这说明DMDL9010菌株可能对心血管疾病的具有一定的预防作用。

表4第8周(d56)各组血脂检测结果比较(mmol/L)(M±SD，n＝10)

^※相对于正常组有差异(p＜0.05)^▲相对于高脂模型组有差异(p＜0.05)

如表5所示，第10周时，比较发现各组之间的TC、LDL-C均无显著性差异，但9010高剂量组的TG水平比高脂模型组有显著降低，且其TC、LDL-C水平均介于正常组和高脂模型组之间，说明9010组能缓解大鼠的高脂血症，降低血清胆固醇水平。

比较HDL-C发现，所有高脂模型组的HDL-C均低于正常组，且与正常组之间有显著性差异(p＜0.05)，这说明长期饲喂高脂饲料导致了大鼠体内的高密度脂蛋白胆固醇的减少，增大了大鼠患动脉硬化的风险。其中灌胃DMDL9010菌液的实验组HDL-C的上升较明显，这说明DMDL9010菌株可能具有一定的调节动脉硬化的功效。

表5第10周(d56)各组血脂检测结果比较(mmol/L)(M±SD，n＝10)

^※相对于正常组有差异(p＜0.05)^▲相对于高脂模型组有差异(p＜0.05)

③在实验第10周将全部大鼠禁食一夜，处死大鼠后，分离肝脏，观察大体形态及表面色泽，并对大鼠肝脏进行拍照。结果如附图3。饲喂普通饲料的正常组大鼠的肝脏形态正常，表面光滑，呈暗红色。高脂模型组的大鼠肝脏表面呈淡黄色，体积变大，质地变软，有油腻感，表明高脂诱导大鼠有轻度的脂肪变性。9010低剂量组的大鼠肝脏表面呈淡黄色，与阳性组的形态类似。表明9010低剂量组降胆固醇的效果与阳性组(喂降血脂药，阿托代他汀钙片，也叫立普妥，辉瑞中国公司)一致，此结果与血清中效果吻合，9010高剂量组的大鼠肝脏表面颜色比9010较低剂量组深，说明肝脏形态比低剂量组有好转。

称重后取肝左叶，经脱水，常规石蜡包埋、切片，HE染色，用LEICADM5000B普通光学显微镜观察(放大400倍)。肝组织HE染色的切片每张观察5个视野，对肝脂肪变性程度进行分级、评分，结果如图4。正常组大鼠肝细胞无脂肪变性，肝组织结构完整、清晰，细胞界限清楚，呈索状排列。高脂组出现中到重度程度的小泡性脂肪变性，肝脏内脂肪含量增高，细胞排列紊乱。饲喂9010的高脂大鼠肝脏变性程度有一定程度上地减轻，表现为脂变肝细胞数量减少，脂滴减少或消失，其中9010低剂量组与阳性组的类似，9010高剂量组的脂肪变性的修复最为明显。

④准确称取一定量的肝组织，按每0.5g的组织加入10mL氯仿:甲醇(2:1，V/V)混合液，振荡混匀，37℃保温30min，离心(80000r/min，10min，4℃)，小心收集氯仿层液体到新的EP管中，加6mL生理盐水，离心(80000r/min，10min，4℃)。再重复一次上述步骤后，收集底层氯仿层液体，用氮吹仪吹干，加入异丙醇：Triton-100(9:1，V/V)混合液0.8mL复溶，漩涡震荡2分钟，加1.2mL蒸馏水，再漩涡震荡2min，使之充分溶解，所得溶液为肝组织总脂的提取液，留取两份备用。

⑤精确吸取胆固醇标准液(192.000mg/dL)分别稀释成1.920mg/mL、1.536mg/mL、0.768mg/mL、0.384mg/mL、0.192mg/mL、0.000mg/mL。各取0.01mL加入1mL工作液内，混匀后37℃保温6min，用酶标仪在490nm处测定吸光度，每个孔设置两个复孔，绘制胆固醇含量的标准曲线。样品测定按照总胆固醇试剂盒进行，取0.01mL肝组织总脂的提取液加入到1mL工作液内，混匀后37℃保温6min，用酶标仪在490nm处测定吸光度，每个孔设两个复孔。

精确吸取甘油三酯标准液(200.0mg/dL)分别稀释成2.0mg/mL、1.6mg/mL、0.8mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.0mg/mL。各取0.01mL加入1mL工作液内，混匀后37℃保温10min，用酶标仪在490nm处测定吸光度，每个孔设置两个复孔，绘制甘油三酯含量的标准曲线。样品测定按照甘油三酯试剂盒进行，取0.01mL肝组织总脂的提取液加入到1mL工作液内，混匀后37℃保温10min，用酶标仪在490nm处测定吸光度，每个孔设两个复孔。

各实验组大鼠肝脏脂质检测结果如表6所示，各高脂模型组大鼠肝脏中TC和TG水平均高于正常组，具有显著性差异(p＜0.05)，说明饮食来源中过多的胆固醇会在肝脏中蓄积。9010组的TC较高脂模型组有所降低，其中9010高剂量组的TC和TG较高脂模型组分别降低33.2％和40.8％，有显著性差异(p＜0.05)，说明DMDL9010菌液在高剂量时能有效抑制肝脏中胆固醇的蓄积，降低肝脏中的甘油三酯含量。

表6各实验组大鼠肝脏脂质检测结果(M±SD，n＝10)

实施例2

第一步 将DMDL 9010的冻干粉置于MRS(由de Man,Rogosa和Sharp在1960年发明，简称MRS)液体培养基中，于30℃的条件下培养16h后的菌体溶液为DMDL 9010的种子液；

第二步 以体积比为10：100的比例，将步骤(1)所得的DMDL 9010的MRS种子液接种至含胆固醇的液体培养基中，于41℃的条件下静止培养16h后的菌体溶液为具有降胆固醇作用的DMDL 9010诱导种子液；

所述含胆固醇的液体培养基的配方为：以重量份数计，蛋白胨0.8份，酵母粉0.6份，牛肉膏0.5份，葡萄糖2.0份，柠檬酸三胺0.1份，七水合硫酸镁0.01份，磷酸氢二钾0.05份，四水合硫酸锰0.001份，乙酸钠0.05份，抗坏血酸0.02份，胆固醇0.05份，吐温800.05份，蒸馏水95.8份；所述含胆固醇的液体培养基的制备方法为：按配方称取除胆固醇、吐温80外的上述原料搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却至80℃的溶液，为A溶液；将胆固醇与吐温80中混和并在在沸水水浴中充分溶解，混和为均一的溶液为B液，灭菌后将温度控制在80℃时缓慢加入到A液中，并不断搅拌，使胆固醇形成微小的乳状，冷却后备用。

第三步 将具有降胆固醇作用的DMDL 9010诱导种子液离心后去上清液，用生理盐水洗细胞沉淀两次后再离心，去除上清液，取细胞沉淀悬浮于生理盐水中，制成DMDL 9010发酵剂。

第四步 按体积百分比为10％的比例将DMDL 9010发酵剂单独接入到符合标准的牛奶中进行发酵，发酵温度为41℃，发酵一定的时间，当发酵酸度达到75°T时终止发酵。测定具有降胆固醇发酵乳的体外降胆固醇的作用，发酵乳的口感、后酸化等指标。得到的发酵乳的口感好，在30天的保质期内的酸度维持在105°T内(如附图2)，后酸化程度不强。

取上述含DMDL 9010的发酵乳5mL置于含100mg/100mL胆固醇的MRS液体培养基中，在37℃作用96h后，按照上述方法测定胆固醇的降解量为90.1mg/100mL。

实施例3

第一步 将DMDL 9010的冻干粉置于MRS液体培养基中，于43℃的条件下培养18h后的菌体溶液为DMDL 9010的种子液；

第二步 以体积比为5：100的比例，将步骤(1)所得的DMDL 9010的MRS种子液接种至含胆固醇的液体培养基中，于28℃的条件下静止培养24h后的菌体溶液为具有降胆固醇作用的DMDL 9010诱导种子液；

所述含胆固醇的液体培养基的配方为：以重量份数计，蛋白胨1.2份，酵母粉0.2份，牛肉膏1.0份，葡萄糖1.5份，柠檬酸三胺0.2份，七水合硫酸镁0.02份，磷酸氢二钾0.35份，四水合硫酸锰0.006份，乙酸钠0.20份，抗坏血酸0.03份，胆固醇0.50份，吐温800.5份，蒸馏水94.3份；所述含胆固醇的液体培养基的制备方法为：按配方称取除胆固醇、吐温80外的上述原料搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却至85℃的溶液，为A溶液；将胆固醇与吐温80中混和并在在沸水水浴中充分溶解，混和为均一的溶液为B液，灭菌后将温度控制在85℃时缓慢加入到A液中，并不断搅拌，使胆固醇形成微小的乳状，冷却后备用。

第三步 将具有降胆固醇作用的DMDL 9010诱导种子液离心后去上清液，用生理盐水洗细胞沉淀两次后再离心，去除上清液，取细胞沉淀悬浮于生理盐水中，制成DMDL 9010发酵剂。

第四步 将DMDL 9010发酵剂与发酵乳发酵剂(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌)按细胞比为0.5：1：1混合后，按体积百分比为5％的比例接入到符合标准的牛奶中进行发酵，发酵温度为43℃，发酵一定的时间，当发酵酸度达到75°T时终止发酵。测定具有降胆固醇发酵乳的体外降胆固醇的作用，发酵乳的口感、后酸化等指标。得到的发酵乳的口感好，在30天的保质期内的酸度维持在106°T内(如图2)，后酸化程度不强。在图1中可知，DMDL9010与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌的比例分别为0.25：1：1和1.5：1：1发酵乳的酸度不适当，前者经过5-6小时的发酵，滴定酸度仅为60-62°T，酸度不够。后者的比例到5-6小时的发酵，滴定酸度高达85-95°T，酸度过头，而且后期的酸化速度也非常快，不利于发酵乳的口感的统一性。

取上述含DMDL 9010的发酵乳5mL置于含100mg/100mL胆固醇的MRS液体培养基中，在37℃作用96h后，按照上述方法测定胆固醇的降解量为85mg/100mL。

实施例4

第一步 将DMDL 9010的冻干粉置于MRS液体培养基中，于28℃的条件下培养24h后的菌体溶液为DMDL 9010的种子液；

第二步 以体积比为7.5：100的比例，将步骤(1)所得的DMDL 9010的MRS种子液接种至含胆固醇的液体培养基中，于43℃的条件下静止培养20h后的菌体溶液为具有降胆固醇作用的DMDL 9010诱导种子液；

所述含胆固醇的液体培养基的配方为：以重量份数计，蛋白胨1.0份，酵母粉0.4份，牛肉膏1.5份，葡萄糖2.5份，柠檬酸三胺0.3份，七水合硫酸镁0.03份，磷酸氢二钾0.20份，四水合硫酸锰0.009份，乙酸钠0.35份，抗坏血酸0.04份，胆固醇0.30份，吐温800.3份，蒸馏水93.1份；所述含胆固醇的液体培养基的制备方法为：按配方称取除胆固醇、吐温80外的上述原料搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却至82℃的溶液，为A溶液；将胆固醇与吐温80中混和并在在沸水水浴中充分溶解，混和为均一的溶液为B液，灭菌后将温度控制在82℃时缓慢加入到A液中，并不断搅拌，使胆固醇形成微小的乳状，冷却后备用。

第三步 将具有降胆固醇的DMDL 9010种子液离心后去上清液，用生理盐水洗细胞沉淀两次后再离心，去除上清液，取细胞沉淀悬浮于生理盐水中，制成DMDL 9010发酵剂。

第四步 将DMDL 9010发酵剂与发酵乳发酵剂(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌)按细胞比为1：1：1混合后，按体积百分比为10％的比例接入到符合标准的牛奶中进行发酵，发酵温度为30℃，发酵一定的时间，当发酵酸度达到75°T时终止发酵。测定具有降胆固醇发酵乳的体外降胆固醇的作用，发酵乳的口感、后酸化等指标。得到的发酵乳的口感好，在30天的保质期内的酸度维持在106°T内，后酸化程度不强。

取上述含DMDL 9010的发酵乳5mL置于含100mg/100mL胆固醇的MRS液体培养基中，在37℃作用96h后，按照上述方法测定胆固醇的降解量为90.0mg/100mL。

实施例5

第一步 将DMDL 9010的冻干粉置于MRS液体培养基中，于32℃的条件下培养20h后的菌体溶液为DMDL 9010的种子液；

第二步 以体积比为8：100的比例，将步骤(1)所得的DMDL 9010的MRS种子液接种至含胆固醇的液体培养基中，于37℃的条件下静止培养22h后的菌体溶液为具有降胆固醇的DMDL 9010种子液；

所述含胆固醇的液体培养基的配方为：以重量份数计，蛋白胨1.0份，酵母粉0.8份，牛肉膏0.5份，葡萄糖2.2份，柠檬酸三胺0.15份，七水合硫酸镁0.03份，磷酸氢二钾0.15份，四水合硫酸锰0.004份，乙酸钠0.15份，抗坏血酸0.04份，胆固醇0.15份，吐温800.2份，蒸馏水94.6份；所述含胆固醇的液体培养基的制备方法为：按配方称取除胆固醇、吐温80外的上述原料搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却至80℃的溶液，为A溶液；将胆固醇与吐温80中混和并在在沸水水浴中充分溶解，混和为均一的溶液为B液，灭菌后将温度控制在80℃时缓慢加入到A液中，并不断搅拌，使胆固醇形成微小的乳状，冷却后备用。

第三步 将具有降胆固醇的DMDL 9010种子液离心后去上清液，用生理盐水洗细胞沉淀两次后再离心，去除上清液，取细胞沉淀悬浮于生理盐水中，制成DMDL 9010发酵剂。

第四步 将DMDL 9010发酵剂与发酵乳发酵剂(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌)按细胞比为0.75：1：1混合后，按体积百分比为7％的比例接入到符合标准的牛奶中进行发酵，发酵温度为28℃，发酵一定的时间，当发酵酸度达到75°T时终止发酵。测定具有降胆固醇发酵乳的体外降胆固醇的作用，发酵乳的口感、后酸化等指标。得到的发酵乳的口感好，在30天的保质期内的酸度维持在100°T内，后酸化程度不强。

取上述含DMDL 9010的发酵乳5mL置于含100mg/100mL胆固醇的MRS液体培养基中，在37℃作用96h后，按照上述方法测定胆固醇的降解量为87.0mg/100mL。

实施例6

第一步 将DMDL 9010的冻干粉置于MRS液体培养基中，于37℃的条件下培养22h后的菌体溶液为DMDL 9010的种子液；

第二步 以体积比为9：100的比例，将步骤(1)所得的DMDL 9010的MRS种子液接种至含胆固醇的液体培养基中，于32℃的条件下静止培养18h后的菌体溶液为具有降胆固醇的DMDL 9010种子液；

所述含胆固醇的液体培养基的配方为：以重量份数计，蛋白胨0.8份，酵母粉0.6份，牛肉膏1.2份，葡萄糖2.5份，柠檬酸三胺0.3份，七水合硫酸镁0.01份，磷酸氢二钾0.35份，四水合硫酸锰0.008份，乙酸钠0.10份，抗坏血酸0.02份，胆固醇0.40份，吐温800.40份，蒸馏水93.3份；所述含胆固醇的液体培养基的制备方法为：按配方称取除胆固醇、吐温80外的上述原料搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却至85℃的溶液，为A溶液；将胆固醇与吐温80中混和并在在沸水水浴中充分溶解，混和为均一的溶液为B液，灭菌后将温度控制在85℃时缓慢加入到A液中，并不断搅拌，使胆固醇形成微小的乳状，冷却后备用。

第三步 将具有降胆固醇的DMDL 9010种子液离心后去上清液，用生理盐水洗细胞沉淀两次后再离心，去除上清液，取细胞沉淀悬浮于生理盐水中，制成DMDL 9010发酵剂。

第四步 将DMDL 9010发酵剂与发酵乳发酵剂(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌)按细胞比为1：1：1混合后，按体积百分比为5％的比例接入到符合标准的牛奶中进行发酵，发酵温度为40℃，发酵一定的时间，当发酵酸度达到75°T时终止发酵。测定具有降胆固醇发酵乳的体外降胆固醇的作用，发酵乳的口感、后酸化等指标。得到的发酵乳的口感好，在30天的保质期内的酸度维持在106°T内，后酸化程度不强。

取上述含DMDL 9010的发酵乳5mL置于含100mg/100mL胆固醇的MRS液体培养基中，在37℃作用96h后，按照上述方法测定胆固醇的降解量为80.0mg/100mL。

实施例7

第一步 将DMDL 9010的冻干粉置于MRS液体培养基中，于41℃的条件下培养23h后的菌体溶液为DMDL 9010的种子液；

第二步 以体积比为10：100的比例，将步骤(1)所得的DMDL 9010的MRS种子液接种至含胆固醇的液体培养基中，于41℃的条件下静止培养19h后的菌体溶液为具有降胆固醇的DMDL 9010种子液；

所述含胆固醇的液体培养基的配方为：以重量份数计，蛋白胨1.0份，酵母粉0.7份，牛肉膏1.4份，葡萄糖2.0份，柠檬酸三胺0.1份，七水合硫酸镁0.03份，磷酸氢二钾0.25份，四水合硫酸锰0.005份，乙酸钠0.25份，抗坏血酸0.03份，胆固醇0.50份，吐温800.5份，蒸馏水93.2份；所述含胆固醇的液体培养基的制备方法为：按配方称取除胆固醇、吐温80外的上述原料搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却至80℃的溶液，为A溶液；将胆固醇与吐温80中混和并在在沸水水浴中充分溶解，混和为均一的溶液为B液，灭菌后将温度控制在80℃时缓慢加入到A液中，并不断搅拌，使胆固醇形成微小的乳状，冷却后备用。

第三步 将具有降胆固醇的DMDL 9010种子液离心后去上清液，用生理盐水洗细胞沉淀两次后再离心，去除上清液，取细胞沉淀悬浮于生理盐水中，制成DMDL 9010发酵剂。

第四步 将DMDL 9010发酵剂与发酵乳发酵剂(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌)按细胞比为1.25：1：1混合后，按体积百分比为9％的比例接入到符合标准的牛奶中进行发酵，发酵温度为34℃，发酵一定的时间，当发酵酸度达到75°T时终止发酵。测定具有降胆固醇发酵乳的体外降胆固醇的作用，发酵乳的口感、后酸化等指标。得到的发酵乳的口感好，在30天的保质期内的酸度维持在101°T内，后酸化程度不强。

取上述含DMDL 9010的发酵乳5mL置于含100mg/100mL胆固醇的MRS液体培养基中，在37℃作用96h后，按照上述方法测定胆固醇的降解量为82.5mg/100mL。

Claims (8)

1.一种降胆固醇发酵乳的制备方法，其特征在于，以生鲜乳或乳粉为发酵原料，将乳杆菌DMDL9010接入上述原料中，进行发酵生产，制得降胆固醇发酵乳；所述乳杆菌(Lactobacillus sp.)DMDL 9010，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.5172。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体发酵生产步骤如下：

(1)将DMDL 9010的冻干粉置于MRS液体培养基中，于28℃-43℃的条件下培养16h～24h，得到的菌体溶液为DMDL 9010的种子液；

(2)以体积比为5～10：100的比例，将步骤(1)所得的种子液接种至含胆固醇的液体培养基中，于28℃-43℃的条件下静止培养16h～24h，得到的菌体溶液为DMDL 9010诱导种子液；

(3)将DMDL 9010诱导种子液离心后去上清液，用生理盐水洗细胞沉淀两次后再离心，去除上清液，取细胞沉淀悬浮于生理盐水中，制成DMDL 9010发酵剂；

(4)按体积百分比为5％～10％的比例将发酵剂接入到发酵原料中，在温度28℃-43℃进行发酵，当发酵酸度达到75°T时终止发酵，即制得降胆固醇发酵乳，所述发酵剂至少含有DMDL 9010发酵剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵剂还含有嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，其中，DMDL9010与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌的细胞个数比为(0.5～1.25)：1：1。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述含胆固醇的液体培养基的配方为：以重量份数计，蛋白胨0.8～1.2份，酵母粉0.2～0.8份，牛肉膏0.5～1.5份，葡萄糖1.5～2.5份，柠檬酸三胺0.1～0.3份，七水合硫酸镁0.01～0.03份，磷酸氢二钾0.05～0.35份，四水合硫酸锰0.001～0.009份，乙酸钠0.05～0.35份，抗坏血酸0.02～0.04份，胆固醇0.05～0.50份，吐温800.05～0.50份，蒸馏水91～96份。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含胆固醇的液体培养基的制备方法为：

(1)按配方将胆固醇与吐温80混和并在沸水浴中充分溶解，混和均匀后，得到B溶液；将其他原料搅拌溶解均匀后灭菌，冷却至80℃～85℃，得到A溶液；

(2)B溶液灭菌后将温度控制在80℃～85℃，然后将其缓慢加入到A溶液中，并不断搅拌，使胆固醇形成微小的乳状，冷却后即可。

6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述MRS液体培养基为：以重量份数计，蛋白胨0.8～1.2份，酵母粉0.2～0.8份，葡萄糖1.5～2.5份，柠檬酸三胺0.1～0.3份，七水合硫酸镁0.01～0.03份，牛肉膏0.5～1.5份，磷酸氢二钾0.05～0.35份，四水合硫酸锰0.001～0.009份，乙酸钠0.05～0.35份，吐温800.05～0.15份，蒸馏水92.8～96.7份，培养基的pH为6.0～7.0。

7.一种由权利要求1～6任意一项方法制备的降胆固醇发酵乳。

8.权利要求1所述乳杆菌DMDL 9010在制备降胆固醇食品和药品中的应用。