CN103333847B - 具有辅助降血脂功能的发酵乳杆菌grx08及其应用 - Google Patents

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Abstract

具有辅助降血脂功能的发酵乳杆菌grx08,包括以下步骤:从广西巴马、如皋长寿人体肠道中分离出乳酸菌,通过对分离株的人工胃液耐受性、人工肠液耐受性和耐胆盐试验,获得具有良好耐受性菌株;通过体外比较不同分离菌株分解胆固醇能力,筛选出具有降胆固醇能力强的乳酸菌,通过动物实验,表明本发明菌株具有促进体内胆固醇的转化和分解,能有效降血脂功能,经生理、生化和API及16sDNA鉴定,本发明菌株为发酵乳杆菌。

Description

具有辅助降血脂功能的发酵乳杆菌grx08及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及具有辅助降血脂功能的发酵乳杆菌grx08分离株,及其应用。
背景技术
近年来随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变,有很大一部分人群在饮食中摄入营养过高的食品,而且这些食品(动物内脏、肥肉、鸡蛋等)都含有比较高的胆固醇,当今,心血管疾病已经是造成人类死亡的首要原因,世界范围内的死于心血管疾病的人数到2030年估计可以达到2360万人,在我国心血管疾病患者人数已超过2.7亿,占全国总人口的1.9%。。
在预防和治疗高胆固醇血症的方法上,一个是减少外源性胆固醇的摄入,一个是抑制内源性胆固醇的合成,促进胆固醇在体内的代谢和排泄。虽然降胆固醇的目前最有效的方法还是通过药物治疗,但是常常需要大量、长期的服用药物才能起到降血脂效果,这样就会引起副作用,其中包括胃部不适、肝损伤和血清转氨酶的升高等一些不良症状的出现,同时还需要支付昂贵的药物费用。因此我们需要寻找副作用小的的治疗手段,食疗虽然可以在一段时间内有一定的效果,但是效果会随着时间而慢慢减弱,因此人们试图寻找其他的途径来治疗高胆固醇血症。
益生菌被定义为,应用于动物及人体内,通过改善宿主体内的微生态平衡进而促进宿主健康的单一或混合的活的微生物制剂。现在得到广泛应用的益生菌是产生乳酸的细菌,如乳杆菌和双歧杆菌等,它们是人类肠道重要的生理菌,对机体有多种其它正常生理菌群无法比拟的生理作用。近年来,大量研究也发现益生菌及其相关制品,可降低血清胆固醇水平,因此筛选降胆固醇益生菌有着重大的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种具有辅助降血脂功能的益生菌菌株。
本发明提供的菌株是发酵乳杆菌grx08,其保藏号为CGMCC No:7695。
本发明的发酵乳杆菌grx08通过以下步骤获得:
(1)通过培养基从广西巴马、如皋长寿人体肠道中分离出乳酸菌;
(2)通过对分离株的人工胃液耐受性、人工肠液耐受性和耐胆盐试验,获得具有良好耐受性菌株;
(3)通过体外比较不同分离菌株降胆固醇能力,筛选出具有降胆固醇能力大于50%的乳酸菌,其中本发明菌株降胆固醇能力最大,达到63.72%;
(3)通过动物实验,表明本发明菌株能促进体内胆固醇的转化和分解,具有显著的降血脂的功效。
经试验证明,该菌株具有耐人工胃液、人工肠液和耐胆能力,且经体外和体外实验,菌株具有显著的调节血脂的功效体外降胆固醇作用;通过动物实验,证明该菌株能有效分解和转化肝脏胆固醇,能够促进粪便胆固醇的排泄和粪便胆汁酸的形成;通过细菌形态学、生理学和培养特征,结合法国梅埃里公司API150CHL鉴定试剂条和16S rDNA序列测定并进行对比分析,最终确定该菌株为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
本发明还提供发酵乳杆菌grx08功能发酵乳的制备方法。
本发明还公开了所述发酵乳杆菌grx08用于制备具有调节血脂功能的发酵乳产品的用途。可以是单独或与其他菌株混合发酵制备发酵乳产品。
本发明的发酵乳杆菌grx08还可用于制备具有辅助调节血脂功能的活菌制剂。
附图说明
图1为本发明菌株的形态图
图2为空白对照组大鼠肝脏切片电镜图。
图3和图4为高脂组和高脂奶粉组大鼠肝脏切片电镜图。
图5、图6和图7为高浓度组、中浓度组和发酵乳组大鼠肝脏切片电镜图。
图8为空白对照组大鼠心脏切片电镜图。
图9和图10为高脂组和高脂奶粉组大鼠心脏切片电镜图。
图11和图12为高浓度组和发酵乳组大鼠心脏切片电镜图。
图13为本发明发酵乳杆菌grx03的16S rDNA的电泳鉴定图。图中1和2均为本发明菌株。
本发明发酵乳杆菌grx08,于2013年6月9日,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏号为CGMCC No:7695;分类命名为:发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum。
具体实施方法
本研究采用传统涂布平板分离法从采集的样品中分离乳酸菌,进行体外具有降胆固醇特性菌株的筛选,通过模拟人体胃肠道的环境来筛选具有耐酸、耐胆盐的菌株,并通过对模型大鼠的降胆固醇效果进行研究,通过测定大鼠的血清的TC、TG、HDL-C、LDL-C的指标和肝脏胆固醇、粪便胆固醇和胆汁酸的指标来探讨菌株的体内将胆固醇作用。
相关培养基配方
(1)10%脱脂乳培养基:脱脂乳粉100g,用双蒸水溶解并定容至1000mL,115℃高压灭菌20min,冷却;
(2)MRS培养基:称取牛肉膏10.00g,酵母浸膏5.00g,蛋白胨10.00g,葡萄糖20.00g,无水醋酸钠5.00g,吐温-80 1.00mL,K2HPO42.00g,MgSO4·7H2O0.58g,MnSO4·4H2O0.25g,蒸馏水1000.00mL,调节pH值6.4,115℃灭菌20min,冷却备用;
(3)富胆固醇培养基:在MRS培养基中加入100μg/mL的胆固醇,胆固醇的溶解[57]方法:胆固醇0.1g,吐温-801mL,蔗糖酯0.1g,冰乙酸5mL,加热溶解,然后超声波处理15min;
(4)人工胃液的配制:准确量取20mL摩尔浓度为1mol/L的盐酸,加蒸馏水调节pH值,使pH值分别达到2.0、3.0。然后,分别加入NaCl使其质量分数达到0.2%,然后每100mL加入1g胃蛋白酶,充分溶解后,然后用孔径0.20μm微孔滤膜在无菌操作台中过滤除菌,转入灭菌过的瓶中低温保藏备用。
(5)人工肠液的配制:称取KH2PO43.4g,加蒸馏水250mL溶解,用0.4%NaOH溶液调节pH值至6.8,加水稀释至500mL,然后加入NaCl使其质量分数达到0.2%,然后每100mL加入1g胰蛋白酶,充分溶解后,然后用孔径0.20μm微孔滤膜在无菌操作台中过滤除菌,转入灭菌过的瓶中低温保藏备用。
(6)硫磷铁(P-S-Fe)显色剂——三氯化铁溶液的配制:称取10.0g FeCl3·6H2O溶于100mL浓磷酸中即得,放入硅胶干燥皿中备用;
磷硫铁试剂:取1.5mL三氯化铁溶液用浓硫酸定容到100mL即得,放入硅胶干燥皿中备用。
具体步骤
1、样品采集
从广西巴马、江苏如皋等长寿人体肠道中分离获得420株乳酸菌。
(1)采集新鲜、未使用抗生素及其他药物的健康人群黄软大便,取样以一次排便的全量为宜(选择便尾或便中),每个个体在一星期的不同时间内采集三份粪便样品。
(2)用经过灭菌的无菌竹签挑取粪便内部中心粪便样品,放入采样管中,加入1mL液体石蜡油,置于4℃的泡沫盒(生物冰袋)中。收集采样管后置于-18℃的采样箱中,带回实验室冻存(-70℃),便于下一步试验。
(3)采样时要避免样品暴露于空气中,样品采集过程中应使用一次性无菌工具,防止采样时的人为污染和样品间的交叉污染。
(4)取带回的试样在振荡器上使之匀浆,用吸管捣成糊状,然后在混旋器上,振荡10分钟制成匀浆,利用平板活菌计数法计数。
2、筛选体外具有耐受人体消化道不良环境能力的乳酸菌菌株72株
(1)人工胃液耐受性试验
将活化两代的420株菌种按10%接种量接种于不同pH值分别为2.0和3.0的人工胃液中。混匀,37℃培养,分别于0、3和5h取样,用无菌水按1:10进行系列稀释,采用MRS固体培养基培养并活菌计数。结果表明,在pH3.0中经3h的存活率超过50%的菌株有160株;其中本发明菌株在pH2.0中经3h的存活率最高,达到37.01%,在pH3.0中经3h的存活率到达68.55%,活菌数都达到了108cfu/mL。
(2)人工肠液耐受性试验
将活化两代的160株菌种按10%接种量接种于人工肠液,混匀,37℃培养,分别于0、1.5和3h取样,用无菌水按1:10进行系列稀释,采用MRS固体培养基培养并活菌计数。结果表明,经过1.5h存活率超过50%的菌株有121株;其中本发明菌株在经过1.5h存活率为72.94%,经过3h后存活率为46.84%,活菌数都达到了108cfu/mL。
(3)耐胆盐试验
在MRS液体培养基中加入牛胆盐,使其质量浓度分别为0、0.10g/100mL、0.30g/100mL和0.50g/100mL,121℃高压蒸气灭菌15min,冷却至37℃以下备用,将活化后的菌种以体积分数5%的接种量接种到上述处理后的培养基中,37℃培养24h后,分别测定上述不同浓度培养基的OD620nm值,计算菌株对胆盐的耐受力。
结果表明,在牛胆盐质量浓度为0.10g/100mL耐受力超过20%的菌株有72株;其中本发明菌株在三个浓度下的胆盐耐受力分别为24.11%、20.31%和19.92,具有较强的胆盐耐受性。
3、体外筛选获得具有较强降胆固醇能力的菌株
取活化好的菌株的菌体20μL接种在富胆固醇培养基,37℃培养24h,1800×g离心10min,取上清液0.2mL,加4.8mL的无水乙醇,4000r/min离心5min,取上清液2mL,加2mL磷硫铁显色剂,混匀,待反应管冷却到室温后,在20min内测定OD560nm值A,由标准曲线算出胆固醇浓度;降解率换算如下
通过研究菌株间降胆固醇能力差异较大,从分离获得的72株菌株中,发现有10株降胆固醇能力超过50%,其中本发明的菌株降胆固醇能力最高,达到了63.73%,命名为grx08。
4、体内辅助降血脂功能动物实验
(1)动物分组
初断乳3周龄SPF级wistar大鼠雌雄共80只(雌雄各半),普通饲料适应性饲养4天后,随机分为8组,每组雌雄各5只,具体分组见表1。
大鼠每天自由进食,自由饮水,按照表1中的方案,每天上午对大鼠灌胃,并保持饲养房的通风、透光和清洁卫生。
表1实验动物分组及饲养方式
实验分组 日常饲喂 灌胃
1对照组 普通饲料+水 生理盐水
2高脂组 高脂饲料+水 生理盐水
3高脂奶粉组 高脂饲料+水 10%脱脂乳
4高浓度组 高脂饲料+水 悬浮108CFU/mL菌株的10%脱脂乳
5中浓度组 高脂饲料+水 悬浮107CFU/mL菌株的10%脱脂乳
6低浓度组 高脂饲料+水 悬浮106CFU/mL菌株的10%脱脂乳
7发酵乳组 高脂饲料+水 发酵乳
8细胞破碎液组 高脂饲料+水 108CFU/mL菌株的10%脱脂乳的细胞破碎液
4周后测定以下指标:①摘眼球取血,血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量;②肝脏体指数;③肝脏中胆固醇含量;④粪便中胆固醇和胆汁酸的含量;⑤肝脏、心脏切片电镜观察。
(2)血清生化指标的测定
28d饲喂实验结束后,禁食14h;摘眼球采血,装入干燥离心管。由检验中心测定血清TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量,并由公式计算动脉粥样硬化指数(A I)及抗动脉粥样硬化指数(AAI)。结果如表2所示
表2对大鼠血脂的影响(x±sd,n=10)
注:ab同列比较,不同字母表示具有差异性(P<0.05)
从表2中可以看出:经过灌胃试验后,①高脂组的TC、TG、LDL-C与对照组相比显著性升高(P<0.05),高脂奶粉组与高脂组无显著性差异,说明脱脂乳并没有降血脂效果,表明造模成功;②高、中浓度组和发酵乳组与高脂组相比,TC、TG、LDL-C有显著性降低(P<0.05),表明菌株具有较强的降胆固醇能力。③高、中浓度组和发酵乳组与高脂组相比差异性显著(P<0.05),高、中浓度组和发酵乳组与高脂组相比差异性显著(P<0.05),高、中浓度和发酵乳具有一定的调节血脂的功效,对于预防心血管疾病具有显著的效果。
(3)肝脏体指数的测定
小鼠肝与体质量的百分比如表3所示
表3对大鼠脏器质量与体质量比的影响(x±sd,n=10)
组别 肝重/体重(g/100g)
照组 3.53±0.31b
高脂组 4.80±0.32a
高脂奶粉组 4.35±0.37a
高浓度组 3.62±0.36b
中浓度组 3.77±0.33b
低浓度组 3.82±0.36b
发酵乳组 3.43±0.27b
细胞破碎组 4.20±0.31ab
注:ab同列比较,不同字母表示具有差异性(P<0.05)
从表3中可以看出肝脏的脏器指数实验组的高、中、低浓度组和发酵乳组与高脂组相比具有显著性差异(P<0.05),这说明了高胆固醇饲料的喂养可以使胆固醇在肝脏上堆积,造成了肝脏重量增加,在灌胃了高、中、低浓度的本发明菌株和发酵乳后能够有效的降低肝脏胆固醇,从而使肝脏质量降低。
(4)肝脏中胆固醇含量的测定
取肝脏采用磷硫铁法测其胆固醇含量。肝脏胆固醇含量测定过程:
①取肝脏一小块称重,以0.1g加入1mL无水乙醇的比例于组织匀浆器中进行匀浆。
②取匀浆液0.1mL加入4.9mL无水乙醇混匀,室温放置10min。
③4000r/min离心10min。
④取上清2mL加入2mL磷硫铁显色剂立即混匀。
⑤室温放置20min。
⑥于560nm波长下测各样本吸收值,制作胆固醇标准曲线,计算各组大鼠肝脏胆固醇含量。
结果如表4所示
表4肝脏中胆固醇的含量(x±sd,n=10)
组别 肝脏中胆固醇含量(mg/g)
对照组 9.50±0.35a
高脂组 23.16±2.95b
高脂奶粉组 27.99±3.56b
高浓度组 14.55±1.42c
中浓度组 17.99±3.20c
低浓度组 20.63±1.16b
发酵乳组 14.30±2.99c
细胞破碎组 23.64±4.78b
从表4中可以看出:高、中浓度组和发酵乳组与高脂组相比的肝脏胆固醇含量有显著性性下降(P<0.05),分别下降了37.18%、22.32%和38.26%,这说明本发明菌株对大鼠的肝脏分解胆固醇具有促进作用,能够通过肝脏将胆固醇转化和分解。
(5)粪便中胆固醇和胆汁酸含量的测定
在实验的最后3d,每天随机收集各实验组的粪便,装入干净的玻璃瓶中,并储藏于-85℃冰柜。湿粪便56℃烘干至恒重,研磨成粉末,混匀,称量。
①取0.3g研磨成粉末状的干燥粪便,加入到带刻度的10mL的离心管中,用甲醇与氯仿(2:1)的混合物定容至3mL[84]
②45℃水浴1h后,8000rpm离心,
③取上清0.2mL加入3.8mL无水乙醇,混匀
④取2mL上述乙醇溶液加入2mL磷硫铁显色剂立即混匀。
⑤室温放置20min。
⑥于560nm波长下测各样本吸收值,制作胆固醇标准曲线,计算各组大鼠肝脏胆固醇含量。
⑦取2g干粪用无水乙醇80℃提取3次,提取液置水浴锅中80℃或旋转蒸发仪40-50℃蒸干,加入石油醚,充分混匀,留沉淀。用含2%Trition-100的乙醇溶解沉淀,取上层液,再在水浴锅中80℃蒸干得沉淀,最后用蒸馏水300ul溶解沉淀,此液即为提取的粪胆汁酸样品溶液。用酶标仪采用总胆汁酸试剂盒测定总胆汁酸含量。结果如表5所示
表5粪便中胆固醇和胆汁酸的含量(x±sd,n=10)
组别 粪便中胆固醇含量(mg/g) 粪便中胆汁酸的含量(mg/g)
对照组 6.12±1.20a 4.23±3.91a
高脂组 12.31±2.17b 13.59±1.32b
高脂奶粉组 11.91±0.82b 12.47±1.18b
高浓度组 18.92±1.96c 17.13±2.17c
中浓度组 16.58±1.22c 16.68±1.06c
低浓度组 13.99±1.76b 13.12±1.91b
发酵乳组 17.95±1.31c 18.49±2.09c
细胞破碎组 12.10±2.01b 12.31±0.71b
注:abc同列比较,不同字母表示具有差异性(P<0.05)
从表5中可以看出:高、中浓度组和发酵乳组的粪便胆固醇和胆汁酸的含量都有明显的升高,且与高脂组相比具有显著性差异(P<0.05),其中粪便胆固醇分别升高了53.70%、34.69%和45.82%,粪便胆汁酸升高了26.05%、22.74%和36.06%;表明本实验菌株可以促进体内胆固醇的降解可以通过形成粪便排泄出体外,也可以促进形成胆汁酸排出体外,两种方式同时进行。
(6)大鼠肝脏、心脏切片的电镜观察
如图1所示,对照组中肝脏组织中无脂肪变性,肝脏的整体结构正常高,肝细胞呈索状排列,在中央静脉周围呈放射状分布。
如图2、3所示,高脂组和高脂奶粉组中的脂肪泡明显比正常组的多,密度颗粒都比较大。
如图4、5、6所示,在高、中浓度组和发酵乳组中,在相同的放大倍数下,我们明显发现,脂肪颗粒明显下降,几乎接近对照组。
如图7所示,对照组中心肌纤维组织排列整齐,且线粒体均匀分布,无细胞膜破裂。
如图8、9、10所示,高脂组和高脂奶粉组中线粒体明显增多,且聚集在一起,线粒体增多可能由于缺氧造成,高胆固醇可能引起心血管堵塞而造成供氧不足。
如图11、12所示,高浓度组和发酵乳组中肌纤维排列整齐,且线粒体较高脂组有明显降低,且均匀分布在肌纤维中。
5、乳酸菌的鉴定
(1)生理生化鉴定
从纯化好的本发明菌株固体培养基上挑单菌落接种到糖发酵微量鉴定管中用无菌石蜡油封口。放入37℃恒温培养箱培养。分别于24h和48h后观察各管中液体颜色变化情况,若变色为阳性,反之阴性,对照《伯杰氏细菌鉴定手册》初步确定分离菌株的属种。初步鉴定该菌株为发酵乳杆菌。
(2)API鉴定
在37℃,在厌氧条件下将本发明菌株在MRS琼脂平板上培养48小时,然后用悬浮培养基将所得培养物悬浮,悬浮液的浊度与McFarland2的相同。然后,将该培养细胞接种到API50CHL试剂条中,在测定糖发酵的试剂条的上层覆盖一层无菌石蜡,37℃厌氧培养以便检测酶活和对各种糖的发酵能力。
使用API识别软件程序分析了酶活和糖发酵能力。结果显示,该菌株的酶活和糖发酵能力与发酵乳杆菌类似(表6),符合率为99.3%。
表6API50CHL系统鉴定结果
编号 发酵管 菌株 编号 发酵管 菌株
0 CTRL - 25 ESC +
1 GLY - 26 SAL +
2 ERY - 27 CEL +
3 DARA - 28 MAL +
4 LARA - 29 LAC +
5 RIB + 30 MEL -
6 DXYL + 31 SAC -
7 LXYL - 32 TRE +
8 ADO - 33 INU -
9 MDX - 34 MLZ -
10 GAL - 35 RAF -
11 GLU + 36 AMD -
12 FRU + 37 GLYG -
13 MNE + 38 XLT +
14 SBE + 39 GEN +
15 RHA - 40 TUR +
16 DUL + 41 LYX +
17 INO - 42 TAG +
18 MAN - 43 DFUC +
19 SOR + 44 LFUC -
20 MDM + 45 DARL +
21 MDG - 46 LARL -
22 NAG - 47 GNT -
23 AMY + 48 2KG -
24 ARB + 49 5KG +
注:“+”表示阳性;“-”表示阴性
(2)16S rDNA序列鉴定
将制备的乳酸菌基因组DNA作为PCR扩增的模板,采用PCR反应体系为:10×buffer5.0μL、Mg2+3.0μL、2.5mmol/L dNTP4.0μL、10.0pmol引物Lab1和Lab2各1.5μL、Taq酶1.5U、模板DNA5.0μL,以ddH2O补至50.0μL。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性1min,64℃退火45s,72℃延伸1min,循环35次;72℃延伸8min。取PCR产物用含EB的1%琼脂糖凝胶电泳检测拍照,扩增片段长度为1.5kb左右,见图13。
将PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序,将测序结果提交到BLAST进行在线比对以得出结果,表明本发明菌株100%为发酵乳杆菌(L.fermentum)。
应用实施例
1、含本发明菌株发酵乳的制作方法
将鲜乳加热到50℃以上,加入6%的白砂糖搅拌至完全溶解,预热到60~65℃,20Mpa压力均质,90℃左右热处理5-8分钟,冷却至42~45℃,接种发酵乳杆菌grx08。接种数量为2%~3%。40~42℃发酵至pH值为4.2~4.5,冷却、冷藏,即制成凝固型酸奶。发酵结束后经搅拌,添加果酱、果汁等,冷藏,即制成搅拌型发酵乳。
2、含本发明菌株乳酸菌饮料的制作方法
按应用实施例1制备好发酵乳,以35%的发酵乳比例与配料混合,9%糖和0.5%复配乳化稳定剂杀菌后混合溶解,20MPa/60℃均质,冷却后最后无菌灌装。制成可直接饮用的含活性发酵乳杆菌grx08的乳酸菌饮料。
3、含本发明菌株冰淇淋的制作方法
按应用实施例1制备好酸乳,冰淇淋原料配比如表7所示。
表7 1000kg冰淇淋配方
原料 质量百分比(%)
发酵乳杆菌grx08 400kg
白砂糖 75kg
全脂奶粉 62.5kg
黄奶油 31.25kg
椰子油 23kg
糖浆 26.25kg
乳化稳定剂 6kg
276kg
将除酸乳以外的其他物料混匀,预热到60~65℃,采用20Mpa~30Mpa进行均质,然后在80℃/20s杀菌,冷却到40~50℃,与酸乳混合,采用20Mpa~30Mpa进行均质,在2℃~4℃时,老化时间6h,经凝冻后经过硬化的为硬质冰淇淋,不经硬化的为软质冰淇淋。
4、本发明菌种粉末状产品的制作方法
将发酵乳杆菌grx08酸乳冷冻至-40℃~-60℃,经干燥,至含水量为3%-5%,压碎成粉末状,可将粉末状产品加入奶粉、低聚糖、麦芽糊精、风味剂等制成粉末状或片块状产品,用于日常使用或作为药品、保健品。
以上本发明提供的菌株发酵的各种产物都具有降胆固醇的作用,该菌株的发酵乳,以及经乳酸菌发酵的各种发酵乳产品、乳酸菌饮料产品等,都获得了不同程度的具有辅助降血脂功效。

Claims (3)

1.一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)grx08,其保藏号为CGMCC No:7695 
2.权利要求1所述发酵乳杆菌grx08用于制备具有调节血脂功能的发酵乳产品的用途。 
3.权利要求1所述发酵乳杆菌grx08用于制备具有辅助调节血脂功能的活菌制剂的用途。 
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