CN109479956A - 一种具有调节血脂作用的人源混合乳酸菌发酵乳及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有调节血脂作用的人源混合乳酸菌发酵乳及其应用。所述人源混合乳酸菌发酵乳采用人源化的益生乳酸菌L.rhamnosus LV108、L.casei grx12和L.fermentum grx08以特定比例2:1:1混合发酵制备而成，相对于其他组合的益生菌组而言，制备获得的人源混合乳酸菌发酵乳具有较高的酸度，明显弱后酸化程度及高粘度，并具有调节血脂的作用，可用于制备具有辅助调节血脂作用的营养品或药品。

Description

一种具有调节血脂作用的人源混合乳酸菌发酵乳及其应用
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，特别涉及一种具有调节血脂作用的人源混合乳酸菌发酵乳及其应用。
背景技术
血脂是血浆中的中性脂肪(甘油三酯)和类脂(磷脂、糖脂、固醇、类固醇)的总称，广泛存在于人体中。它们是生命细胞的基础代谢必需物质。一般说来，血脂中的主要成分是甘油三酯和胆固醇，其中甘油三酯参与人体内能量代谢，而胆固醇则主要用于合成细胞浆膜、类固醇激素和胆汁酸。其中，胆固醇是人体所必需的营养成分，但随着人们生活水平的提高，过量的胆固醇摄入会导致冠心病、脑中风、动脉粥样硬化等各类疾病，成为威胁人类健康的一大重要危险因素。
发酵乳具有独特的风味、丰富的营养物质和多种健康因子，广受各国消费者青睐，已成为乳制品中发展最快的产品之一。中国发酵乳市场每年保持着两位数的高速增长，增长率领跑全球，2017年产值已经超过1000亿，预计2020年中国发酵乳市场规模将近2000亿元。发酵乳产品和品牌的竞争也日趋激烈，功能性发酵乳产品的研究与开发将成为下一阶段乳制品发展的重点。研究表明，乳酸菌是人体内必不可少的且具有重要生理功能的细菌，乳酸菌可参与体内、蛋白质、脂肪等物质的代谢，并能够降低血清中的血脂水平。在过去的40年中，乳酸菌的益处得到广泛的报道和应用，且乳酸菌对胆固醇的影响水平已在动物和人体模型中得到评价，科学研究已公认乳酸菌对宿主具有降胆固醇作用。早在1974年，Mann和Spoerry首次报道了肯尼亚马赛部落人因摄入大量发酵乳而具有较低的胆固醇水平。我国幅员辽阔，具有多个典型的长寿地区，潜在的人源乳酸菌菌种资源十分丰富。本实验室从上世纪90年代起，致力于长寿地区人群体内乳酸菌的分离，筛选保藏了一批具有良好益生功能特性的乳酸菌。可见，目前有待研究出一种能够调节血脂的发酵乳，从而在提供多种营养物质的同时还能够具有调节血脂的功能，满足广大消费者的需求。
发明内容
本发明通过对筛选得到的乳酸菌的安全性、益生特性及加工特性的研究，获得一种能够调节血脂的发酵乳，并通过体内动物试验的验证，为后续的功能研究提供基础保障。本发明具体采用以下技术方案。
一方面，本发明提供了一种人源益生菌发酵剂，包括人源益生乳酸菌L.rhamnosusLV108、L.casei grx12和L.fermentum grx08。
所述L.rhamnosus LV108为现有技术，参见文献“益生菌对大鼠肝脏脂质过氧化损伤拮抗作用的研究”(“食品研究与开发”，瞿恒贤等，第39卷第10期，第164-169页)。
所述L.casei grx12(保藏号：CGMCC No：7696)记载于专利CN103893215A。
所述L.fermentum grx08(保藏号CGMCC No：7695)记载于专利CN103333847B。
在2012年至2018年期间，本实验室进行人源乳酸菌分离与筛选工作，累计分离乳酸菌3160株，鉴定乳酸菌820株，其中乳杆菌属215株。对分离得到的人源乳酸菌进行了体外功能益生特性研究，其中获得了3株益生特性良好且对甘油三酯和胆固醇具有降解作用的乳酸菌株，具体如表1所示。
表1 3株益生特性良好的乳酸菌
进一步地，其中所述人源益生乳酸菌L.rhamnosus LV108、L.casei grx12和L.fermentum grx08的体积比2:1:1。
另一方面，本发明提供了一种具有辅助降低胆固醇作用的人源混合乳酸菌发酵乳，其包括权利要求1-2任一所述的人源益生菌发酵剂。
进一步地，所述人源混合乳酸菌发酵乳还包括乳固形物、蔗糖。
另一方面，本发明还提供了一种具有辅助降低胆固醇作用的人源混合乳酸菌发酵乳的制备方法，所述方法步骤包括：配料，均质，杀菌，冷却，发酵，冷却，灌装。
进一步地，所述配料是指，选择乳固形物和蔗糖，所述乳固形物的含量为以质量百分数计12％-14％，所述蔗糖添加量为以质量百分数计6.0％-8.0％。
进一步地，所述乳固形物的含量为以质量百分数计12％，所述蔗糖添加量为以质量百分数计7.0％。
进一步地，所述均质是指，将所述配料在60-65℃溶解，水合。
进一步地，所述杀菌是指，在94-96℃下杀菌5-8min。
进一步地，所述发酵是指人源益生菌发酵剂接种量为以质量百分数计4％-6％，在35℃-39℃下发酵，所述冷却是指冷却至37℃左右。
进一步地，所述发酵是指，人源益生菌发酵剂接种量为以质量百分数计5.0％，在37℃下发酵。
另一方面，本发明提供了所述的人源混合乳酸菌发酵乳在制备用于调节血脂的营养品或药品中的应用。
进一步地，其中调节血脂是指辅助降低血脂的含量。
进一步地，其中辅助降低血脂是指降低血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。
进一步地，其中辅助降低血脂是指升高血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量。
本发明有益效果：
1.在前期的研究的基础上，进一步发现人源乳酸菌L.rhamnosus LV108、L.caseigrx12和L.fermentum grx08之间的相互作用，意外发现人源乳酸菌L.casei grx12和L.fermentum grx08复配组合为2:1:1时制备得到的人源发酵乳，相对于其他组合而言，具有较高的酸度，较弱的后酸化程度以及高粘性，且能够提高人源乳酸菌贮藏期内的活菌率。
2.通过研究获得了混合人源乳酸菌发酵乳的最佳制备条件为：混合乳酸菌接种量为
5.0％，发酵温度为37℃，蔗糖添加量为8.0％，乳固形物含量为12.0％，所制备的发酵乳风味、质构、贮藏特性良好，在21d贮藏期内活菌数均在108CFU·mL-1以上。
3.采用本发明的制备方法获得的人源混合乳酸菌，具有调节血脂的作用，可以降低血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量，升高所述血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量。
附图说明
图1为实施例1中人源乳酸菌发酵剂产酸特性检测结果
图2为实施例2中人源乳酸菌发酵剂产粘特性检测结果
图3为实施例8中大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C和VLDL-C的变化情况
图4为实施例9中大鼠肝脏中TC、TC和TBA的变化情况
图5为实施例10中大鼠粪便中TC、TC和TBA的变化情况
图6为实施例11中大鼠肝脏组织病理学检查
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的实施例是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
实验菌株组合设计：
将脱脂乳粉复原成12％(w/v)的脱脂乳，放置30min使蛋白质充分复水后分装每个三角玻璃小瓶100mL(平行样5个)，95℃灭菌5min，冷却至37℃左右，分别以不同比例组合(具体参见表2)接种L.rhamnosus LV108、L.casei grx12和L.fermentum grx08，制成乳酸菌脱脂乳发酵剂，进行发酵乳各个条件的测试试验。
表2混合乳酸菌各菌株的发酵比例(体积比)
组合编号 L.rhamnosus LV108 L.casei grx12 L.fermentum grx08
发酵剂1 1 1 1
发酵剂2 2 1 1
发酵剂3 3 1 1
发酵剂4 4 1 1
发酵剂5 1 2 1
发酵剂6 1 1 2
发酵剂7 1 3 1
发酵剂8 1 1 3
实施例1人源混合乳酸菌发酵剂产酸特性
酸度的测定主要监测不同混合乳酸菌发酵剂发酵剂的产酸能力及后酸化情况，分别不同配比的人源乳酸菌组制成的发酵乳产酸情况进行测定。测定方法参照GB5413.34-2010(中华人民共和国卫生部，乳和乳制品酸度的测定.北京:中国标准出版社,2010.)中方法对发酵乳进行滴定酸度测定。每5h取样测定其酸度，连续测定24h。
由图1发现，其中混合乳酸菌发酵剂(1:1:2)及混合乳酸菌发酵剂(4:1:1)的酸度在20h左右的时候仍又跳跃式的增长，大部分混合乳酸菌发酵剂酸度随时间的变化呈现先急速增加后缓慢增长的趋势，可以明显看出混合乳酸菌发酵剂(2:1:1)的酸度随测定时间而增加，且在凝乳后缓慢增长。
跟踪测定3d后各组发酵乳酸度发现，混合乳酸菌发酵剂(4:1:1)制备的发酵乳酸度上升6.3°T，混合乳酸菌发酵剂(1:1:1)制备的酸乳上升5.2°T，混合乳酸菌发酵剂(2:1:1)后酸化较弱仅上升2.1°T，这可能由于各个菌株中的脲酶能够分解尿素形成氮，从而有效减缓后酸化。由此可看出，混合乳酸菌发酵剂(2:1:1)后酸化程度不高，最适宜作为生产发酵菌剂使用。
实施例2人源混合乳酸菌发酵剂产粘特性
选择产高粘度发酵剂，既可提高产品在生产过程中经泵运输时的抗剪切作用，也可提高产品拉丝感及醇厚的口感。测定方法参照文献“嗜热链球菌在鲜奶发酵中的抗逆性研究”(栾少萌,李鹏,马超峰,等.中国食品添加剂，2012:265-269)。
由图2可看出，不同人源乳酸菌组别发酵剂的粘度随测定时间的延长先增加后缓慢变化，但最大粘度差异较大，其变化范围在900-1900cp，其中混合乳酸菌(2:1:1)的发酵粘度最高为1900cP，这可能主要由于不同菌株间的比例以及共生环境能够刺激菌株的产粘特性。同时，多菌株以特定比例在发酵过程中胞外多糖的组分不同，会直接影响酸乳的组织状态。因此，混合乳酸菌(2:1:1)最适宜作为生产发酵菌剂使用。
实施例3人源混合乳酸菌发酵乳贮藏期内活菌存活率
本研究产品属于低温活性发酵乳制品，产品活菌数是考量产品品质的一个重要因素，对使用不同人源乳酸菌组别制成的发酵乳测定3d和21d后的产品活菌数值。结果如表3所示。
表3混合乳酸菌发酵乳贮藏过程中的活菌数变化
由表3可以看出，不同组合发酵剂在活菌数达到最大值后会随着储存时间的延长而减少，且呈显著性差异。其中发酵剂2的活菌总数3d后仍高达1.10×109CFU·mL-1，这可能是该发酵温度下，混合乳酸菌具有良好的共生关系，也可能是某些代谢产物刺激乳酸菌生长繁殖。另外，21d后发酵剂2的活菌数仍然高达0.78×108CFU·mL-1，表明混合人源乳酸菌具有较强的稳定性，且该发酵剂制备发酵乳活菌数显著高于国标GB19302中关于乳酸菌含量要达到1×106CFU·mL-1的要求。
实施例4人源乳酸菌发酵乳的制备条件
根据单因素实验的实验结果，以混合乳酸菌(2:1:1)作为人源乳酸菌发酵乳发酵剂，选择接种量、发酵温度、乳固形物含量及蔗糖添加量作为实验因素，设计正交实验，因素水平见表4。
表4人源乳酸菌发酵乳配方因素水平表
根据L9(34)表所要求的工艺条件进行实验，设计两个平行组，并记录每组乳酸菌发酵乳活菌数量作为评价指标，并用数据分析软件对正交试验结果进行直观和极差分析，结果如表5所示。
表5混合乳酸菌发酵乳正交实验结果
由表5可知，发现对混合乳酸菌发酵乳活菌数量影响程度顺序依次为A＞C＞D＞B。因此，选定A2B2C2D1，即混合乳酸菌接种量为5.0％，蔗糖添加量为7.0％，发酵温度为37℃，乳固形物含量为12.0％作为混合乳酸菌发酵乳制备条件。
实施例5人源乳酸菌体外降低胆固醇作用
对混合乳酸菌(L.rhamnosus LV108:L.casei grx12:L.fermentum grx08＝2:1:1)的发酵乳在不同发酵时间的上清液和沉淀洗液中胆固醇含量进行测定和分析，计算其对胆固醇的同化和共沉淀作用。
其中，采用的培养基配方法如下：
胆固醇源(10mg·mL-1)：胆固醇200mg溶于20mL吐温80中。
胆固醇标准液(1mg·mL-1)：胆固醇100mg溶于20mL吐温80中(加热)，用冰乙酸定容至100mL。
邻苯二甲醛试剂(OPA)：邻苯二甲醛10mg，溶于冰乙酸定容至100mL，避光保存。
MRS-CHOL培养基：秤取胆固醇1.0g溶解于20mL吐温80中(可加热)，胆盐3g加入MRS培养基中，定容至1L，胆固醇浓度为1mg·mL-1。
MRS-THIO液体培养基：在MRS液体培养基中加入0.2％巯基乙酸钠(THIO)。
MRS-THIO液体高胆固醇培养基：秤取胆固醇1.0g溶解于20mL吐温80中(可加热)，胆盐3g加入MRS-THIO液体培养基中，定容至1L，胆固醇浓度为1mg·mL-1。
测定方法如下：
将分离培养的乳酸菌接种于液体培养基MRS中活化，之后在平板上划线获得单菌落，挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h后，4℃冰箱冷藏备用或冻干保藏。采用邻苯二甲醛法测定样品中胆固醇含量。具体方法如下：取培养液100μL，加冰乙酸300μL，OPA 1.5mL、浓硫酸1.0mL。充分振荡，混匀，室温静置10min，测定OD550。溶液配制时浓硫酸缓慢加入，震荡摇匀，室温静置10min后用分光光度计测量550nm处波长。以胆固醇标准液的浓度为横坐标，550nm处波长为纵坐标绘制标准曲线，得到定量方程式为y＝22.678x+0.005，R2＝0.9998。
分别测定经乳酸菌发酵的MRS上清液及沉淀洗液部分中胆固醇的含量，将发酵过程中发酵液中减少而又未出现在沉淀洗液中的胆固醇视为由菌株同化进入细胞中，由此可得到胆固醇同化率及沉淀率，如下:
其中，A：同化率
C总：胆固醇总量
C上：上清液中的胆固醇含量
C沉：沉淀洗液贮奶罐的胆固醇含量。
将乳酸菌发酵液离心(12000g,10min,4℃)得到沉淀，将沉淀用pH值7.0的磷酸钠缓冲液洗涤两遍，同样条件离心，得到的上清液即为沉淀洗液。沉淀率计算方法如下：
其中，B：沉淀率，C总：胆固醇总量，C沉：沉淀洗液贮奶罐的胆固醇含量。
对于在不同发酵时间的上清液和沉淀洗液中胆固醇含量进行测定和分析，计算其对胆固醇的同化和共沉淀作用，结果如表6、表7和表8所示。
表6不同乳酸菌总胆固醇降解率(％)
注：同行中不同上标小写字母表示具有显著性差异，P＜0.05。
表7不同乳酸菌胆固醇同化作用(同化率/％)
注：同行中不同上标小写字母表示具有显著性差异，P＜0.05。
表8不同乳酸菌胆固醇共沉淀作用(共沉淀率/％)
注：同行中不同上标小写字母表示具有显著性差异，P＜0.05。
由表6-8可知，3种混合乳酸菌对胆固醇总降解率随时间随发酵时间的延长(24h内)而增强。不同乳酸菌和混合乳酸菌间的同化作用存在显著差异，混合乳酸菌发酵乳(2:1:1)对胆固醇的同化作用最强，随后依次为混合乳酸菌(1:1:1)、混合乳酸菌发酵乳(3:1:1)。而3种混合乳酸菌对胆固醇的共沉淀作用无显著差异，可以推断，混合乳酸菌对胆固醇的降解能力强弱主要由乳酸菌对胆固醇的同化作用强弱决定，即同化作用越强，乳酸菌降胆固醇能力越强。
实施例6动物分组及处理
将大鼠适应性饲养1周后，随机分为4组，每组10只，分别为空白组，模型组，混合乳酸菌(L.rhamnosus LV108、L.rhamnosus grx12、L.casei grx08)发酵乳组1-6。连续灌胃4周，空白组和模型组给予生理盐水灌胃，混合乳酸菌发酵乳组给予混合乳酸菌发酵乳灌胃。所有样品均按0.1mL·10g-1·d-1剂量灌胃，每天定时补充饮水和饲料，灌胃完成后对大鼠进行观察，及时记录动物状态，一周更换两次垫料。实验开始前，对除空白组外的其余组连续饲喂高脂乳酸菌发酵乳辅助降血脂效应与机制研究47饲料14d后采血，检验是否形成高血脂模型。实验进行中，除空白组外的其余组继续饲喂高脂饲料。具体分组及处理见表。
表9动物分组及处理
实验分组 饲料 灌胃样品
空白组 常规饲料 生理盐水
模型组 高脂饲料 生理盐水
混合乳酸菌发酵乳组1(采用发酵剂1) 高脂饲料 相应比例的混合乳酸菌发酵乳
混合乳酸菌发酵乳组2(采用发酵剂2) 高脂饲料 相应比例的混合乳酸菌发酵乳
混合乳酸菌发酵乳组3(采用发酵剂3) 高脂饲料 相应比例的混合乳酸菌发酵乳
混合乳酸菌发酵乳组4(采用发酵剂4) 高脂饲料 相应比例的混合乳酸菌发酵乳
混合乳酸菌发酵乳组5(采用发酵剂5) 高脂饲料 相应比例的混合乳酸菌发酵乳
混合乳酸菌发酵乳组6(采用发酵剂6) 高脂饲料 相应比例的混合乳酸菌发酵乳
混合乳酸菌发酵乳组7(采用发酵剂7) 高脂饲料 相应比例的混合乳酸菌发酵乳
混合乳酸菌发酵乳组8(采用发酵剂8) 高脂饲料 相应比例的混合乳酸菌发酵乳
实施例7大鼠体重变化
以基础饲料填入10.0％猪油、1.0％胆固醇和0.2％胆酸钠的配方作为诱导建立大鼠高血脂症模型。每周定期对大鼠称重，记录大鼠体重变化，并根据体重调整灌胃量。灌胃4周后，小鼠称体重，眼球取血，颈椎脱臼处死后摘取脾脏，肝脏和心脏，将周围组织剥离干净后称重。按下公式计算：结果如表10所示。
表10大鼠体重及脏器指数
注：同列中不同上标小写字母表示具有显著性差异(P＜0.05)
由表10可知，各组大鼠在饲养4周后体重均有不同程度增加，其中高脂模型组及混合乳酸菌发酵乳组的大鼠体重均显著于空白组(P＜0.05)。模型组、混合乳酸菌发酵乳组大鼠肝指数显著高于空白组(P＜0.05)，其余脏器指数无显著性差异，表明动物经高脂配方饲料喂养后，在一定程度上对大鼠肝脏造成损伤。
实施例8大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C和VLDL-C的变化情况
每只小鼠取眼球血化0.5～1mL置于1.5mL离心管中，静置1h后，3000g离心15min使得血清充分析出，转移血清至另一离心管，-20℃冻存即为待测样。按照试剂盒说明书测定大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。按照试剂盒说明书测定大鼠血清VLDL-C含量
结果如图3所示，模型组大鼠血清中TC和TG含量最高，均与其余组别存在显著差异(P＜0.05)。在TC含量上，所有发酵乳组大鼠血清TC含量与模型组大鼠血清TC含量均有明显差异，且发酵乳组2与发酵乳组7与其他发酵乳组也有明显差异，能够显著降低血清中TC含量。在TG含量上，所有发酵乳组大鼠血清中TG含量与模型组均存在明显差异，且发酵乳组2大鼠TG含量明显低于其他发酵乳组，与空白对照组不存在明显差异。在VLDL-C含量上，所有发酵乳组大鼠血清中VLDL-C含量与模型组均存在明显差异，其中发酵乳组2、6、8血清中VLDL-C含量明显低于其他发酵乳组。综合而言，仅有发酵乳组2血清中的各项指标都与其他发酵乳组存在显著差异。因此，人源混合乳酸菌发酵乳(L.rhamnosus LV108、L.rhamnosusgrx12、L.casei grx08比例2:1:1)干预对高膳食诱导的高血脂症血脂具有明显的改善作用，能降低动脉粥样硬化和心脑血管疾病发生的危险。
实施例9大鼠肝脏中TC、TC和TBA的变化情况
大鼠颈椎脱臼处死后，解剖采取大鼠结肠与肝脏组织，去除周围脂肪组织，PBS洗净，称量。将结肠放于冻存管中液氮保藏备用。将肝脏组织切块，大小为0.5×0.5×0.5cm3，放于冻存管中液氮保藏备用。按照试剂盒说明书测定大鼠血清TC、TG和TBA含量。
结果如图4所示，发酵乳组2中TC、TG含量最高，与其他组别存在显著差异(P＜0.05)，发酵乳组大鼠肝脏中TC含量均高于空白组，发酵乳组2大鼠肝脏中TG含量与空白组无明显差异。表明混合乳酸菌发酵乳(L.rhamnosus LV108、L.rhamnosus grx12、L.caseigrx08比例2:1:1)干预的效果相对于其他组别而言最为明显，混合乳酸菌发酵乳可能通过降低肝脏组织中脂肪的堆积，加快体内胆固醇的代谢。
实施例10大鼠粪便中TC、TC和TBA的变化情况
大鼠处死前12h收集大鼠粪便，重悬浮于生理盐水中，-20℃保藏备用。将收集的大鼠粪便冷冻干燥处理后，取粪便各0.2g磨碎，加入4.0mL氯仿：甲醇(2:1)混合液，振荡混匀，45℃水浴恒温提取1h，离心20min(9000r·min-1，4℃)，弃上层液并收集氯仿层液体，加入0.5mL生理盐水离心10min(9000r·min-1，4℃)。重复一次上述步骤后，收集氯仿层液体置于通风橱吹干，加入65.0μL异丙醇：Triton-100(9:1)混合液复溶，漩涡震荡2min，加入100.0μL蒸馏水再震荡2min，充分溶解后通过生化分析仪测定肝脏和粪便中TC、TG。按照试剂盒说明书测定大鼠血清VLDL-C含量TBA的浓度。
结果如图5所示经发酵乳干预后，发酵乳组大鼠粪便中TC和TG含量显著高于模型组(P＜0.05)，且发酵乳组间相比，仅有发酵乳组2干预后的大鼠粪便中TC和TG含量显著高于其他发酵乳组干预后的大鼠粪便。同时，发酵乳组大鼠粪便中TBA含量显著高于模型组(P＜0.05)，且发酵乳组间相比，仅有发酵乳组2干预后的大鼠粪便中TBA含量显著高于其他发酵乳组干预后的大鼠粪便。可见，人源混合乳酸菌发酵乳干预能够降低大鼠肠道对甘油三酯及胆固醇的吸收，进而直接通过粪便排出，能够促进大鼠体内脂肪及胆固醇的代谢，使其在肠道中分解胆汁酸通过粪便排出体外，对高脂膳食诱导的高血脂症具有一定的改善作用。
实施例11大鼠肝脏组织病理学检查
首先，石蜡切片的制作
1)解剖后将大鼠肝脏取出，取同一部位组织部分作为实验材料。将其置于4％多聚甲醛/0.1M PBS溶液中浸泡，中间换一次浸泡液；
2)修块并冲洗：组织块从固定液中取出后，进行修整，然后放入铜筛中用自来水冲洗夜；
3)脱水：将洗好的组织块进行梯度酒精脱水：75％(1.5h)-85％(1h)-95％(1h)
-95％(1h)-100％(45min)-100％(45min)；
4)透明：二甲苯(30min)—二甲苯(30min)；
5)浸蜡：在60℃熔蜡箱中将组织块浸入液态的低熔点蜡中1h；
6)包埋：将组织块取出，置于液态的高熔点蜡中后进行冷却包埋；
7)修块切片：用小刀将包裹组织的大蜡块切成见方的蜡块，用切片机将组织块切成5μm厚的薄膜；
8)展片：用毛笔将薄膜置于酒精中展开；
9)贴片：40℃水浴中将组织薄片均匀贴于载玻片上。
其次，石蜡切片的HE染色(苏木素-伊红染色)
1)烤片：45℃恒温箱中烤；2)脱蜡：二甲苯10min×2次；3)水化：100％乙醇3min×2次、95％乙醇2min、80％乙醇2min、70％乙醇2min；4)染核：使用苏木素染色液染色10min；5)冲洗：自来水洗至镜下观察细胞呈无色；6)分化：0.5％盐酸乙醇分化1～2s；7)蓝化：自来水冲洗至镜下观察细胞核呈蓝色，胞浆为无色；8)胞浆染色：95％乙醇，0.5％伊红乙醇染色液1～2min；9)分化：80％乙醇适当分化30s；10)脱水：95％乙醇5min×2次；11)脱水：100％乙醇脱水3min×2次；12)透明：二甲苯5min×2次；13)封片：中性树胶封片。
最后，使用倒置显微镜观察并拍摄照片。
如图6所示，空白组大鼠肝无异常，肝窦清晰可见，肝索排列整齐；而模型组大鼠肝脏出现程度不等的弥漫性脂变，脂变肝细胞增大，肝窦受压变窄甚至消失，肝索排列紊乱，有的尚可见肝细胞水肿、点状坏死、炎细胞浸润等现象。饲喂混合人源乳酸菌发酵乳大鼠肝脏脂变肝细胞的数目减少，胞浆内脂滴减少或消失，减轻了肝脏的脂变程度。表明混合乳酸菌发酵乳干预能够降低肝脏中脂质堆积，进而降低肝脏脂变程度，对高脂膳食诱导的高血脂症具有一定的改善作用。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种具有调节血脂作用的人源益生菌发酵剂，其特征在于，包括体积比2:1:1的人源益生乳酸菌L.rhamnosus LV108、L.casei grx12和L.fermentum grx08。
2.一种具有调节血脂作用的人源混合乳酸菌发酵乳，其特征在于，包括权利要求1所述的人源益生菌发酵剂。
3.根据权利要求3所述的人源混合乳酸菌发酵乳，其特征在于，所述人源混合乳酸菌发酵乳还包括乳固形物、蔗糖。
4.权利要求2-3任一所述的人源混合乳酸菌发酵乳在制备用于调节血脂的营养品或药品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，其中调节血脂是指辅助降低血脂的含量。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其中辅助降低血脂是指降低血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其中辅助降低血脂是指升高血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量。
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