CN116369387B - 一种改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪及其制备方法和应用 - Google Patents

一种改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属药食两用食物发酵制备奶酪的技术领域，为解决目前奶酪营养单一、功效单一等问题，提供一种改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪及其制备方法和应用，猴头菌的种子液接种于酸枣果粉培养基中发酵，所得发酵产物冷冻干燥、冷冻粉碎为酸枣猴头菌共发酵产物；将酸枣猴头菌共发酵产物与新鲜牛乳混合均匀，再接种入嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌的复合乳酸菌种子液进行发酵，所得发酵产物中加入氯化钙、凝乳酶的水稀释液，将发酵产物凝结成块，过滤期初乳清液体，加入食盐浸渍后压榨成型即为酸枣猴头菌奶酪。实验证明其具有增强免疫、改善睡眠的功效。酸枣猴头菌奶酪可制备成用于增强免疫、改善睡眠的药物、保健食品或功能性食品。

Description

一种改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于药食两用食物发酵制备奶酪的技术领域，具体涉及一种改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪及其制备方法和应用。
背景技术
酸枣（ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou）为属鼠李科枣属酸枣的干燥成熟果实，野生灌木或小乔木，别名为棘、野枣、山枣、葛针等。现广泛分布于我国北方山区，是我国特色优势野生果树和重要的药用植物。现代药理学研究表明，酸枣中含有大量的糖类、生物碱类、黄酮类、三萜及其皂苷类、核苷类等化学成分，具有镇静催眠、抗抑郁、保护心脑血管系统、抗氧化、增强人体免疫力、抑菌以及保护肝脏等多种营养价值和保健功效。酸枣的多个部位富含对机体有保健功能的有效活性成分，并且具有较高的药用价值，无论是酸枣的加工食品，还是将其活性成分应用于医疗，都有很高的利用价值。
猴头菌Hericiumerinaceus又称猴头蘑、猴头菇、刺猬菌，隶属于担子菌门、伞菌纲、红菇目、猴菇科，是著名的食药两用真菌，富含蛋白质、脂肪、维生素等多种营养成分，肉质细嫩、美味鲜香，素有“素中荤”、“山珍猴头、海味燕窝”之称。猴头菌性平、味甘，在治疗消化道疾病、神经功能障碍以及益胃健脾、保肝补肾等方面具有显著作用，在国内广泛用于胃炎、胃溃疡等胃部疾病的治疗。猴头菌中含有多糖、多肽、脂肪酸、甾醇、吡喃酮类等多种活性成分，其中多糖是其主要活性成分之一。研究表明，猴头菌多糖具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、助消化等多种药理作用，可广泛应用于药品、保健食品及普通食品开发，具有广阔的市场前景。利用猴头菌为培养基，对酸枣果肉进行共发酵，制备酸枣猴头菌发酵产物。
奶酪又名芝士、干酪，是一种在牛奶或羊奶中加入适量乳酸菌发酵剂和凝乳酶制剂，使奶中的蛋白质凝固，排除乳清，并经一定时间的成熟而制成的食品。奶酪作为各类乳源浓缩的精华，被誉为乳制品中的“黄金”，具有极高的营养价值，其中钙含量在乳制品中最高，且更易于被人体吸收，同时还含有其他多种营养成分。研究表明食用奶酪对人体有多种益处，可以增强人体免疫力、维持肠道健康、预防心血管疾病等。嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌是是公认的食品级安全性菌株，被广泛地应用于酸奶和硬质奶酪的发酵，同时均为富含γ-氨基丁酸（GABA）发酵的优良益生菌，这些菌株能合成多种功能化合物，如短链脂肪酸（丁酸）等，并赋予菌株诸多益生作用，维持肠道有益的天然的肠道菌群，同时也直接或间接影响发酵乳制品的品质。γ-氨基丁酸（GABA）是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质，GABA是哺乳动物脑组织中重要的起抑制作用的神经抑制剂，参与睡眠觉醒的调节。短链脂肪酸（SCFAs）是由肠道微生物代谢产生、少于7个碳原子的一类有机脂肪酸，其中丁酸能被结肠上皮细胞吸收利用，是肠壁细胞主要能源，对改善睡眠具有明显促进作用。
酸枣既是食品又是中药材物质，而猴头菌是珍贵的食药两用菌，目前两者均是开发增强免疫，改善睡眠药物的热点研究对象。奶酪是一种风味独特的发酵乳制品，具有丰富的营养价值，不仅富含蛋白质、脂肪，还含有丰富的矿物质和微量元素。但是目前还没有任何研究显示能够利用二者制备奶酪。
发明内容
本发明为了解决目前奶酪营养单一、功效单一等问题，提供了一种改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪及其制备方法和应用，该酸枣猴头菌奶酪在制备改善睡眠、增强免疫保健食品或功能性食品中的应用。
本发明由如下技术方案实现的：一种改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪的制备方法，将培养好的猴头菌的种子液接种于酸枣果粉培养基中进行发酵，所得发酵产物冷冻干燥、冷冻粉碎为酸枣猴头菌共发酵产物；然后将酸枣猴头菌共发酵产物与新鲜牛乳混合均匀，再接种入嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌的复合乳酸菌种子液进行发酵，所得发酵产物中加入氯化钙、凝乳酶的水稀释液，将发酵产物凝结成块，过滤期初乳清液体，加入食盐浸渍后压榨成型即为酸枣猴头菌奶酪。
步骤如下：
（1）培养猴头菌的种子液：活化的猴头菌菌株接种于猴头菌液体种子培养基中，28℃，150r/min条件下，摇瓶培养7d，即为猴头菌的液体种子；
（2）酸枣果粉培养基的制备：超微酸枣果粉中加入蒸馏水混匀，121℃灭菌20min，即得酸枣果粉培养基；
酸枣猴头菌一次共发酵产物的制备：将步骤（1）所制备的液体种子接种入步骤（2）所制备的酸枣果粉培养基中，室温避光摇床培养，获得的发酵产物冷冻干燥、冷冻粉碎，过100-120目筛，即为酸枣猴头菌一次共发酵产物；
（4）酸枣猴头菌牛乳混合物的制备：将步骤（3）所得酸枣猴头菌一次共发酵产物与新鲜牛乳按质量体积比为1-3:1-7的比例混合，4000r/min分散5-10min，然后2000r/min搅拌5-10min，使其混合均匀，50-95℃灭菌20-40min，然后自然冷却至30-35℃，即得酸枣猴头菌牛乳混合物；
（5）二次发酵产物获得：复合乳酸菌为：嗜热链球菌菌粉、保加利亚乳杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉按照质量比为1.5:0.5:0.5的比例混合接种于乳酸菌培养基中，37℃培养，传代2-3次，即为复合乳酸菌；
将所得复合乳酸菌按照体积比为1%-7%的接种量，接种入步骤（4）中所得酸枣猴头菌牛乳混合物中，2000-6000r/min搅拌5-10min，使其混合均匀，然后36-44℃发酵5-9h，即得二次发酵产物；
（6）酸枣猴头菌奶酪的获得：以步骤（5）中所得二次发酵产物为计算基准，二次发酵产物中添加体积比为0.005%-0.025%的氯化钙，随后将1%-4%活力1000 U凝乳酶用10倍无菌水稀释，缓慢加入二次发酵产物中，2000r/min搅拌10min，静置，至凝乳块充分形成；
凝乳块切成立方体，继续2000r/min搅拌15 min，静置30-50min后，四层纱布过滤，排除产生的乳清液体，收集固形物；
固形物放入预先灭菌好的质量浓度为15%-20%的食盐溶液中浸渍3-6h，浸渍后压榨成型24h，即得酸枣猴头菌奶酪。
进一步的，步骤（1）中猴头菌液体种子培养基配方为：葡萄糖2g/L、蛋白胨0.5g/L、磷酸二氢钾0.15g/L、硫酸镁0.075g/L、维生素B 11g/L；猴头菌菌丝的接种量为12-15 g/L。
步骤（2）中，超微酸枣果粉的制备方法为：酸枣果肉于50-60℃电热干燥箱中干燥3-4h；真空低温干燥，冻结温度为-10～-30℃，冷阱温度为-29～-31℃，真空度为10～20Pa，冻干最终温度为30～70℃；，常温高速粉碎机6000-10000转/分钟粉碎60 s，振动磨超微粉碎机3000-6000转/分钟粉碎5 min，，过250~300目筛，即为酸枣果肉超微粉；酸枣果粉培养基配方为：所述酸枣果粉培养基中酸枣粉末、蒸馏水的质量比为0.5-1.5︰3-7。
步骤（3）中，以酸枣果粉培养基为计算基准，液体种子的接种量为8%-15% g/L，室温避光摇床培养中，培养温度为22-34℃，摇床转速为120-240 rpm，避光发酵7～21天；冷冻干燥条件为：冷冻温度为-10～-30 ℃，真空度为10-20 Pa，冷阱温度为-30～-45℃，时间为25-30h；冷冻粉碎的条件为：以液氮为冷源通入粉碎机，打粉1min，过100-120目筛，收集密封于4℃冰箱保存备用。
步骤（6）中，凝乳块切成1cm3的立方体；所得酸枣猴头菌奶酪真空包装，4℃保藏。
优选，步骤（3）中，室温避光摇床培养中，培养温度为26-32℃，摇床转速为160-220rpm，避光发酵10-18天；步骤（5）中，复合乳酸菌与牛乳一次发酵产物混合后的发酵条件为：复合乳酸菌的添加量为2%-5%；发酵温度为38-42℃、发酵时间为6-8小时。
本发明还提供了按照上述方法制备所得到的改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪。
另外，本发明还提供了所述改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪在制备改善睡眠、增强免疫药物中的应用。以及在制备改善睡眠、增强免疫保健食品或功能型食品中的应用。
本发明中，改善睡眠是小鼠协同戊巴比妥钠后睡眠时间延长，睡眠潜伏期缩短，同时通过旷场实验减少小鼠的自主活动，从而延长小鼠睡眠时间；增强免疫力指增强小鼠胸腺，脾脏功能，小鼠T淋巴细胞亚群，IFN-γ含量，从而提高小鼠的免疫力。
本发明通过双重产物发酵，采用多菌种混合发酵，在精准控制发酵条件下，从而制备出具有多种功能的复合奶酪，可以定向增加奶酪中丁酸以及GABA含量；通过微生物二次复合发酵，增强酸枣猴头菌奶酪改善睡眠，增强免疫的功能。所制备的酸枣猴头菌奶酪可用于开发具有改善睡眠，增强免疫功能的中药新药、保健食品或功能食品等多种产品。
本发明分别对酸枣猴头菌奶酪改善睡眠，增强免疫作用进行了考察。结果表明，酸枣猴头菌奶酪均能显著抑制小鼠的自主活动，延长阈下剂量戊巴比妥钠引起的小鼠入睡率，缩短戊巴比妥钠阈上剂量小鼠进入睡潜伏期的时间，表明酸枣猴头菌奶酪具有显著的镇静催眠作用；同时酸枣猴头菌奶酪可以增加免疫低下小鼠血清中的IFN-γ含量以及小鼠T淋巴细胞亚群百分比率，对免疫低下小鼠体重也具有明显的回调作用，表明酸枣猴头菌奶酪具有显著的增强免疫作用，可以根据使用需要应用于不同的药品、保健食品和功能食品中。
本发明采用超微粉碎制作酸枣果粉，使其酸枣充分与真菌得到接触，更好地进行微生物发酵反应；以酸枣超微粉为本底基质，利用猴头菌与酸枣果肉共同发酵，所制备的共发酵产物复合了猴头菌的营养成分，根据多糖含量检测方法测得酸枣果肉本身多糖含量为3.87%，经过猴头菌发酵后发酵产物中多糖含量为12.68%，与酸枣果肉原本多糖含量相比显著提高了将近4倍左右。一次发酵增强了酸枣果肉原本多糖含量，具有增强免疫，改善睡眠等药理作用，拓展了酸枣在中医药以及药食同源领域的用途。
通过复合菌种发酵酸枣猴头菌奶酪，精准控制发酵条件，从而制备具有多种营养功能及药理作用的复合奶酪；复合菌种可有效调节肠道菌群平衡，同时产生大量对人体有益的次级代谢产物丁酸和GABA。通过定向选取高产丁酸和GABA的多种乳酸杆菌复合发酵，从而进一步增强酸枣猴头菌奶酪调节肠道菌群、改善睡眠与增强免疫的功能。根据GABA以及丁酸含量的测定方法，测得酸枣果肉本身几乎不含丁酸，而GABA含量仅为0.29 g/ml，而经过双重发酵后，测得发酵液中GABA含量为2.40 g/ml，丁酸含量为0.52mmol/l，与本身GABA与丁酸含量相比，与酸枣果肉原本GABA和丁酸含量相比显著分别提高了将近8倍与2倍左右。采用双重发酵工艺增强了酸枣果肉GABA和丁酸含量，并且最终产物为酸枣猴头菌奶酪，其口感较好，咀嚼性和弹性适中，是一款具有良好感官特性且营养与药用功效兼备的新型奶酪。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
本发明所使用的猴头菌菌株购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为：CGMCC5.823；本发明所使用的嗜热链球菌菌粉、保加利亚乳杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉均为常规市售菌粉。
实施例1：酸枣猴头菌制备工艺的单因素考察
1、不同发酵温度对猴头菌多糖得率的影响：
猴头菌液体种子培养基配方为：葡萄糖2g/L、蛋白胨0.5g/L、磷酸二氢钾0.15g/L、硫酸镁0.075g/L、维生素B 11g/L。
将活化后的猴头菌菌株切成小块，以8块0.4 cm×0.4 cm，即12-15 g/L菌丝的接种量接种于制备好的猴头菌液体种子培养基中，在28℃，150 r/min条件下，摇瓶培养7d。即为猴头菌的液体种子。
超微酸枣果粉的制备：酸枣果肉于50-60℃电热干燥箱中干燥3-4h；真空低温干燥，冻结温度为-10～-30℃，冷阱温度为-29～-31℃，真空度为10～20Pa；常温高速粉碎机粉碎60 s，6000-10000转/分钟，振动磨超微粉碎机3000-6000转/分钟粉碎8 min，过250~300目筛，即为酸枣果肉超微粉；所述酸枣果粉培养基中酸枣粉末、蒸馏水的质量比为0.5-1.5︰3-7。
将猴头菌液体种子接种入制备好的酸枣果粉培养基中，室温避光培养。放入摇床中，于培养温度22、28、30、32、34 ℃，摇床转速200 rpm，避光发酵15天；所得产物，冷冻超微粉碎，过筛，即得酸枣猴头菌共发酵产物粉；进行多糖含量测定。多糖含量测定结果见表1，综合考虑不同发酵温度酸枣猴头菌共发酵产物的含量，选取28-32℃为最佳的发酵温度。
表1 不同发酵温度与多糖含量测定
2、不同发酵天数对猴头菌多糖提取率的影响：猴头菌液体种子培养方法、酸枣果粉培养基的制备同不同发酵温度对猴头菌多糖得率的影响中猴头菌液体种子的培养方法。
将猴头菌液体种子接种入制备好的酸枣果粉培养基中，放入摇床中，于培养温度30℃，摇床转速200 rpm，避光发酵7、10、15、18、21天；所得产物，冷冻超微粉碎，过筛，即得酸枣猴头菌共发酵产物粉；进行多糖含量测定。多糖含量测定结果见表2，综合考虑不同发酵时间酸枣猴头菌共发酵产物的含量，选取10~18天为最佳的发酵天数，多糖含量测定结果见表2。
表2不同发酵天数与多糖含量测定
3、不同摇床转速对猴头菌多糖提取率的影响：猴头菌液体种子培养方法、酸枣果粉培养基的制备同不同发酵温度对猴头菌多糖得率的影响中猴头菌液体种子的培养方法。
将猴头菌液体种子接种入制备好的酸枣果粉培养基中，室温避光培养。放入摇床中，于培养温度30℃，摇床转速分别为120、160、200、220、240 rpm，避光发酵15天；所得产物，冷冻超微粉碎，过筛，即得酸枣猴头菌共发酵产物粉；进行多糖含量测定。多糖含量测定结果见表3，综合考虑不同摇床转速温度酸枣猴头菌共发酵产物的含量，选取160~220 rpm为最佳的摇床转速。
表3不同转速与多糖含量测定
4、酸枣猴头菌制备工艺的响应曲面优化
对上述各单因素条件下酸枣猴头菌制备工艺的多糖含量进行t-检验，表明影响酸枣猴头菌发酵产物的主效应因素为发酵温度、发酵天数和摇床转速。根Box-Behnken的中心组合设计原理，利用Design Expert 8 .0 .6软件设计3因素响应面设计，以发酵温度、发酵天数和摇床转速等3个因素为自变量，进一步优化酸枣猴头菌发酵产物工艺。按照软件设计出不同因素水平进行试验后，测定酸枣猴头菌发酵产物的多糖含量。
在Design expert软件中，进一步对模型进行典型性分析，设置发酵温度、发酵天数和摇床转速含量为最大值，软件自动预测的最佳发酵条件，综合考虑，选用最佳发酵温度为26~32 ℃，最佳的发酵天数为10-18天，最佳的摇床转速为选取160~220 rpm为最佳发酵条件。
5、发酵液中多糖样品制备及其检测方法
准确移取1.0 ml酸枣猴头菌发酵液，稀释150倍，取稀释后的溶液2.0 ml于试管，加1.0 ml 5.0%苯酚溶液，振荡，立刻加5.0 ml浓硫酸，振荡，静置5 min，沸水浴20 min冷却，在波长490 nm下比色测定吸光度，将测定的吸光度代入标准曲线，计算多糖提取率。多糖提取率计算公式为：；式中，R为猴头菌中多糖的提取率（%）；C为提取液中多糖的浓度（g/mL）；V为提取溶液的总体积（mL）；M提取所用的猴头菌子实体干粉质量（g）。采用以上多糖检测方法对酸枣果肉中原本的多糖含量进行测定，结果测得酸枣果肉中原成分多糖含量为3.87%。
实施例2：酸枣猴头菌奶酪制备工艺的单因素考察
1、酸枣猴头菌和牛奶比例的考察：在发酵剂复合乳酸菌的添加量4%、发酵时间7h、凝乳酶添加量3%、氯化钙添加量0.015%和发酵温度40 ℃条件下进行发酵，将酸枣猴头菌发酵产物冻干粉和鲜牛奶分别按1∶1、2∶3、3∶7、1∶4、1∶6的比例混合，综合考虑不同浓度配比下凝乳时间、凝乳色泽和凝乳质地的变化，选取酸枣猴头菌和牛奶按（2：3）~（1：4）为最佳的发酵配比。
2、发酵时间的考察：在酸枣猴头菌发酵产物与鲜牛奶比例为3∶7、发酵剂复合乳酸菌添加量4%、凝乳酶添加量3%、氯化钙添加量0.015%和发酵温度40℃条件下进行发酵，发酵时间分别设置为5、6、7、8、9h。综合考虑不同浓度配比下凝乳时间、凝乳色泽和凝乳质地的变化，选取6~8小时为最佳发酵时间。
3、氯化钙添加量的考察：在酸枣猴头菌发酵产物与鲜牛奶比例为3∶7、发酵剂复合乳酸菌添加量4%、发酵时间7 h、凝乳酶添加量3%和发酵温度40 ℃条件下进行发酵，氯化钙添加量分别为0.005%、0.010%、0.015%、0.020%、0.025%。综合考虑不同浓度配比下凝乳时间、凝乳色泽和凝乳质地的变化，选取0.010%~0.020%为最佳氯化钙添加量。
4、凝乳酶添加量的考察：在酸枣猴头菌发酵产物与鲜牛奶比例为3∶7、发酵剂复合乳酸菌添加量4%、发酵时间7 h、氯化钙添加量0.015%和发酵温度40 ℃条件下进行发酵，凝乳酶添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%。综合考虑不同浓度配比下凝乳时间、凝乳色泽和凝乳质地的变化，选取2%~4%为最佳凝乳酶添加量。
5、发酵温度的考察：在酸枣猴头菌发酵产物与鲜牛奶比例为3∶7、发酵剂复合乳酸菌添加量4%、发酵时间7 h、氯化钙添加量0.015%和凝乳酶添加量3%条件下进行发酵，分别设置发酵温度为36、38、40、42、44℃。综合考虑不同浓度配比下凝乳时间、凝乳色泽和凝乳质地的变化，选取38~42 ℃为最佳发酵温度。
6、发酵剂添加量的考察：在酸枣猴头菌发酵产物与鲜牛奶比例为3∶7、发酵温度40℃、发酵时间7 h、氯化钙添加量0.015%和凝乳酶添加量3%条件下进行发酵，分别添加1%、2%、4%、5%、7%的发酵剂复合乳酸菌，综合考虑不同浓度配比下凝乳时间、凝乳色泽和凝乳质地的变化，选取2%~5%为最佳发酵剂添加量。
7、酸枣猴头菌奶酪共发酵工艺的响应曲面优化：对上述各单因素条件下奶酪的pH值、丁酸含量、GABA含量和乳酸菌活菌数进行t-检验，表明影响酸枣猴头菌奶酪的主效应因素为发酵温度、发酵时间、发酵剂复合乳酸菌的添加量。根Box-Behnken的中心组合设计原理，利用Design Expert 8 .0 .6软件设计3因素响应面设计，以发酵温度、发酵时间、发酵剂的添加量等3个因素为自变量，进一步优化酸枣猴头菌奶酪发酵工艺。按照软件设计出不同因素水平进行试验后，测定奶酪的pH、丁酸含量、GABA含量和乳酸菌活菌数含量。
在Design expert软件中，进一步对模型进行典型性分析，设置奶酪的pH、丁酸含量、GABA含量和乳酸菌活菌数含量为最大值，软件自动预测的最佳发酵条件，综合考虑，选用发酵条件为温度38~42 ℃，发酵时间为6~8小时，发酵剂复合乳酸菌的添加量为2%~5%为最佳发酵条件。
8、发酵液中GABA样品制备及其检测方法：GABA样品制备：取1 mL发酵液体培养基于1.5 mL离心管，6000 r/min离心10 min，得到的上清液用于GABA含量的检测。检测方法：取0.3 mL上清液于25 mL离心管中；依次加入0.2 mL的0.2 M硼酸盐缓冲液（pH9.0)，1 mL的6%苯酚溶液，0.8 mL的5%次氯酸钠溶液，充分振荡混匀；置于沸水浴中保持10 min；然后迅速置于冰浴中保持15 min；剧烈振荡至显示蓝色；最后加入2 mL的60%乙醇溶液；在645 nm波长条件下检测光密度值。
9、发酵液中丁酸样品制备及其检测方法：精密量取1 mL发酵上清液，加入100 μL浓盐酸振荡混匀，加入2 mL无水乙醚萃取20 min，于3000 r/min离心5 min后取上清液，加入500 μL 1.0 mol/L NaOH萃取20 min，3000 r/min离心5 min后取下层，加入100 μL浓盐酸，0.22 μm膜过滤后转入液相瓶中待测。检测方法：色谱柱为DB-WAX 30M(0.32 mm，5 μm)，进样口温度为250 ℃，检测器温度为250 ℃，程序升温(50 ℃保持3 min后，以6 ℃/min的速率升温至120 ℃，保持0.5 min后以6 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持5 min)，N2流量为3 mL/min，H2流量为47 mL/min，空气流量为400 mL/min，分流比为1∶3，进样量为1.0 μL。
实施例3：称取葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氢钾1.5 g、硫酸镁0.75 g、维生素B110 g加入至1000 mL水中。PH自然，250 mL三角瓶中分装100 mL。0.2 MPa灭菌30 min。即得液体种子培养基。将活化后的猴头菌菌株切成小块，以8块0.4cm×0.4cm的接种量接种于制备好的猴头菌液体种子培养基中，22℃，150 rpm/min条件下，摇瓶培养7 d。即为猴头菌的液体种子培养；精密称取酸枣果粉置于摇瓶中，加入蒸馏水，混匀，用纱布及报纸封口，在121 ℃条件下灭菌20min后，即得酸枣果粉培养基；将制备好的猴头菌种子液，接入制备好的酸枣果粉培养基中室温避光摇床培养，种子液接种量10%，于培养温度22℃，摇床转速120rpm，避光发酵7天；将所得发酵产物，冷冻干燥后进行冷冻粉碎，过100~120目筛，即得酸枣猴头菌共发酵产物，测得多糖含量为8.42%。
酸枣猴头菌发酵产物粉与新鲜牛乳按照1：1进行混合，高速分散器以转速4 000r/min分散7 min，充分搅拌，使其混合均匀，用巴氏灭菌法进行灭菌63 ℃，30min，冷却至32℃，接种量为1%的混合菌种发酵剂（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌，1.5:0.5:0.5），搅拌使其混合，发酵温度为36℃，乳发酵时间约5 h；将所得产物添加0.005%氯化钙，然后将1%凝乳酶用10倍无菌水稀释，缓慢加入灭菌乳中，并进行搅拌，搅拌时间约为10min，静置，直到凝乳块充分形成；将所得产物用奶酪刀将凝乳块切成直径为1 cm3的小立方体，搅拌约15min，静置40 min后，用四层纱布进行过滤，37 ℃，10 min排除产生的乳清液体；将所得产物在0～4 ℃，17%食盐溶液中浸渍5 h。压榨24 h，将其压榨24 h成型，真空包装后4℃保藏；即得酸枣猴头菌奶酪，测得pH值为3.62、丁酸含量为0.35 mmol/L、GABA含量1.35g/L和乳酸菌活菌数含量为6.9×107CFU。
实施例4：猴头菌种子液制备方法同实施例3所述方法，将制备好的猴头菌种子液，接入制备好的酸枣果粉培养基中室温避光摇床培养，种子液接种量10%，于培养温度28℃，摇床转速150 rpm，避光发酵10天；将所得发酵产物，冷冻干燥后进行冷冻粉碎，过100~120目筛，即得酸枣猴头菌共发酵产物，测得多糖含量为10.22%。
酸枣猴头菌发酵产物粉与新鲜牛乳按照2：3进行混合，接种量为2%的混合菌种发酵剂，发酵温度为38℃，乳发酵时间约6 h；将所得产物添加0.010%氯化钙，然后将2%凝乳酶用10倍无菌水稀释，其余方法同实施例3所述方法，即得酸枣猴头菌奶酪，测得pH值为4.15、丁酸含量0.22mmol/L、GABA含量2.03 g/L和乳酸菌活菌数含量为5.6×107CFU。
实施例5：将制备好的猴头菌种子液，接入制备好的酸枣果粉培养基中室温避光摇床培养，培养温度30℃，摇床转速200 rpm，避光发酵15天；其余方法同实施例3所述方法，得酸枣猴头菌共发酵产物，得发酵产物多糖含量为12.68%，是酸枣果肉原本多糖含量的4倍左右。
酸枣猴头菌发酵产物粉与新鲜牛乳按照3∶7进行混合，接种量为4%的混合菌种发酵剂，发酵温度为40℃，乳发酵时间约7 h；将所得产物添加0.015%氯化钙，然后将3%凝乳酶用10倍无菌水稀释，缓慢加入灭菌乳中，其余方法同实施例3所述方法，即得酸枣猴头菌奶酪，测得pH值为3.85、丁酸含量0.52 mmol/L、GABA含量为2.40 g/L，和乳酸菌活菌数含量为7.9×107CFU。
实施例6：制备好的猴头菌种子液，接入制备好的酸枣果粉培养基中室温避光摇床培养，培养温度32 ℃，摇床转速220 rpm，避光发酵18天；其余方法同实施例3所述方法，得酸枣猴头菌，测得多糖含量为7.57%。
酸枣猴头菌发酵产物粉与新鲜牛乳按照1：4进行混合，接种量为5%的混合菌种发酵剂，搅拌使其混合，发酵温度为42 ℃，乳发酵时间约8 h；将所得产物添加0.020%氯化钙，然后将4%凝乳酶用10倍无菌水稀释，缓慢加入灭菌乳中，其余方法同实施例3所述方法，得酸枣猴头菌奶酪，测得pH值为3.97、丁酸含量0.47 mmol/L、GABA含量0.95 g/L和乳酸菌活菌数含量为3.2×107CFU。
实施例7：将猴头菌种子液，接入制备好的酸枣果粉培养基中室温避光摇床培养，培养温度34℃，摇床转速240 rpm，避光发酵21天；其余方法同实施例3所述方法，得酸枣猴头菌，测得多糖含量为9.19%。
酸枣猴头菌发酵产物粉与新鲜牛乳按照1：6进行混合，接种量为7%的混合菌种发酵剂，搅拌使其混合，发酵温度为44 ℃，乳发酵时间约9 h；将所得产物添加0.025%氯化钙，然后将5%凝乳酶用10倍无菌水稀释，缓慢加入灭菌乳中，其余方法同实施例3所述方法，得酸枣猴头菌奶酪，测得pH值为3.81、丁酸含量0.38 mmol/L、GABA含量1.68 g/Lg和乳酸菌活菌数含量为6.3×107CFU。
实施例8：酸枣猴头菌奶酪提取物改善睡眠活性研究
1、动物分组及分组处理：140只健康雄性BALB/c小鼠，适应性饲养7 d后，随机分为2批，每批70只。实验一批进行戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验，实验二批进行旷场实验和神经递质指标测定。每批实验动物均分为空白组、模型组，阳性药组地西泮（2 mg/kg）以及实施例3-7酸枣猴头菌奶酪组（20 g/kg）。以上受试物均用无菌水混悬，睡眠实验连续灌胃36d，旷场实验连续灌胃37 d。
2、对氯苯丙氨酸（PCPA）诱导小鼠失眠模型建立：给予受试物第29 d和第30 d，正常对照组腹腔注射生理盐水，模型组、阳性药组、酸枣猴头菌奶酪组均腹腔注射PCPA 350mg/kg，每天1次，连续2 d。当造模小鼠昼夜节律消失，整体观察与正常对照组明显不同，表明模型复制成功。此模型一般能维持2周。
3、戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验：首次灌胃受试物30 min后，采用腹腔注射戊巴比妥钠（45 mg/kg）建立睡眠模型。利用戊巴比妥钠诱导小鼠进入睡眠，翻正反射消失1 min以上即认定动物进入睡眠状态。腹腔注射至翻正反射消失的总时间即为睡眠潜伏期。翻正反射消失至小鼠恢复翻正的总时间即为睡眠时间。记录各组翻正反射消失与恢复的时间。实验结果见表4。
表4戊巴比妥钠诱导失眠小鼠协同睡眠实验（，n = 10）
注:与空白组比较，##P<0.05；与模型组比较，**P<0.05，*P<0.1
空白组与模型组相比，模型组的睡眠时间缩短，睡眠潜伏延长，具有明显的统计学意义（P<0.05），模型成立；阳性药组与模型组相比，睡眠时间延长，睡眠潜伏期缩短，差异具有统计学意义（P<0.05）；实施例3-7酸枣猴头菌奶酪组与模型组相比，均缩短睡眠潜伏期，延长睡眠时间，（P<0.1）；而实施例5酸枣猴头菌奶酪组显著缩短睡眠潜伏期，睡眠时间明显延长（P<0.05），表明酸枣猴头菌奶酪在改善睡眠效果条件下具有一定意义。
4、旷场实验：给予受试物第37 d，进行旷场实验。测试时，实验室保持安静，室温恒定，光线均匀，将小鼠放与旷场场箱（25 cm×100 cm×100 cm，箱底由25个5 cm×5 cm小方格构成）正中央格，适应1 min。将各组小鼠重新至于旷场场箱中央，观察并记录小鼠在3分钟内的水平活动得分（穿越底面的方格数，三爪以上跨入即可）、垂直活动得分（前肢离地、后肢站立的次数）、修饰活动得分（梳理毛发、抓耳挠腮等行为次数与粪便数之和）。两次实验之间，清除小鼠粪便和尿液，并用75%的酒精喷雾去除异味。实验结果见表5。
表5旷场实验（，n = 10）
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注:与空白组比较，##P<0.05；与模型组比较，**P<0.05，*P<0.1
空白组与模型组相比，模型组的总路程明显增加，静止时间显著缩短，差异具有统计学意义（P<0.05），模型成立；阳性药组与模型组相比，总路长明显缩短，静止时间增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；实施例3-7酸枣猴头菌奶酪组与模型组相比，均缩短总路长，延长静止时间，活动能力减弱（P<0.1）；而实施例5酸枣猴头菌奶酪组显著缩短总路长，延长静止时间（P<0.05），活动能力明显减弱，表明酸枣猴头菌奶酪对小鼠有一定的镇静安眠作用。
5、神经递质指标测定：结束给药24 h后，脱颈处死小鼠，保留脑组织，于冰浴上迅速剥离小鼠海马、下丘脑组织，迅速置于-80℃冰箱备用。严格按照试剂盒操作步骤，测定5-HT、GABA含量。结果见表6。
表6酸枣猴头菌奶酪对失眠小鼠5-HT、GABA含量的影响（，n = 10）
注:与空白组比较，##P<0.05；与模型组比较，**P<0.05，*P<0.1
PCPA诱导失眠模型的原理是抑制色氨酸羟化酶（TPH），阻碍5-HT合成。GABA缺乏时，会产生失眠，忧虑等情绪。空白组与模型组相比，模型组的5-HT、GABA含量显著减少，差异具有统计学意义（P<0.05），模型成立；阳性药组与模型组相比，显著增加了5-HT、GABA含量，差异具有统计学意义（P<0.05）；实施例3-7酸枣猴头菌奶酪组与模型组相比，均增加5-HT、GABA含量（P<0.1）；而实施例5酸枣猴头菌奶酪组显著增加了5-HT、GABA含量，差异具有统计学意义（P<0.05），表明酸枣猴头菌奶酪对小鼠有一定的镇静安眠作用。
实施例9：酸枣猴头菌奶酪发酵提取物增强免疫活性研究
1、将70小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、以及实施例3-7酸枣猴头菌奶酪组，每组10只，雌雄各半。空白组腹腔注射生理盐水，其余各组连续3 d腹腔注射环磷酰胺（50 mg/kg/d），之后每隔7 d再进行一次注射加强（80 mg/kg/d）。第4 d开始，酸枣猴头菌奶酪组灌胃给予1.56 g/kgBW、空白组和模型组给予等体积的蒸馏水，阳性对照组给予1.40mg/kgBW的蛋白粉；每天灌胃一次，连续21 d。于末次给药24 h后，处死动物进行取材，检测指标。
2、小鼠体重和生长状态的变化：试验开始后，每间隔一天称量小鼠体重，并记录小鼠的生长状态。结果见表7。
表7 酸枣猴头菌奶酪对免疫低下小鼠体重的影响（，n = 10）
注:与空白组比较，##P<0.05；与模型组比较，**P<0.05，*P<0.1
空白组与模型组相比，模型组体重显著下降，差异具有统计学意义（P<0.05），模型成立；阳性药组与模型组相比，体重显著上调，差异具有统计学意义（P<0.05）；实施例3-7酸枣猴头菌奶酪组与模型组相比，体重均明显增加（P<0.1）；而实施例5酸枣猴头菌奶酪组显著增加了小鼠体重，差异具有统计学意义（P<0.05），表明酸枣猴头菌奶酪产物组能增强小鼠的体重，提高小鼠的免疫力。
3、小鼠脏器指数的测定：末次给药24 h后，各组小鼠称定重量，处死，分离胸腺、肝、肾、肺，精密称量，计算脏器指数。结果见表8。
表8酸枣猴头菌奶酪对免疫低下小鼠脏器指数的影响（，n = 10）
注:与空白组比较，##P<0.05；与模型组比较，**P<0.05，*P<0.1
空白组与模型组相比，模型组胸腺指数、肝指数、肾指数和肺指数均显著下降，差异具有统计学意义（P<0.05），模型成立；阳性药组与模型组相比，各个肝脏指数均显著上调，差异具有统计学意义（P<0.05）；实施例3-7酸枣猴头菌奶酪组与模型组相比，各个肝脏指数均增加（P<0.1）；而实施例5酸枣猴头菌奶酪组显著增加了小鼠胸腺指数、肝指数、肾指数和肺指数，差异具有统计学意义（P<0.05），表明酸枣猴头菌奶酪产物组能增强小鼠胸腺，脾脏功能，从而提高小鼠的免疫力。
4、酸枣猴头菌奶酪对免疫低下小鼠T淋巴细胞亚群的影响：将脾脏迅速放入盛有少量无菌PBS溶液的培养皿中，用一次性注射器针芯经200目不锈钢细胞筛网研磨脾脏，制成细胞悬液；将细胞悬液转移至离心管中，以转速为1500 r/min离心5min；离心后弃上清，再加适量无菌PBS溶液吹打混匀；以1500 r/min离心5 min，弃上清并调整细胞浓度为1×106～5×106个/mL。
吸取CD3、CD4和CD8抗体置于EP管中，涡旋混匀，4 ℃避光保存；用移液枪吸取混匀后的CD3、CD4和CD8抗体探于脾细胞悬液底部，将细胞吹打混匀，避光静置30 min后即可进流式细胞仪检测。结果见表9。
表9酸枣猴头菌奶酪对免疫低下小鼠T淋巴细胞亚群百分比率的影响（，n =10）
注:与空白组比较，##P<0.05，###<0.01；与模型组比较，**P<0.05，*P<0.1
空白组与模型组相比，模型组CD3+(%)、CD4+(%)、CD8+(%)、CD4+CD8+(%)百分比率均显著下降，差异具有统计学意义（P<0.05），模型成立；阳性药组与模型组相比，各个百分比率均显著上调，差异具有统计学意义（P<0.05）；实施例3-7酸枣猴头菌奶酪组与模型组相比，各个百分比率均增加（P<0.1）；而实施例5酸枣猴头菌奶酪组显著增加了小鼠CD3+(%)、CD4+(%)、CD8+(%)、CD4+CD8+(%)百分比率，差异具有统计学意义（P<0.05），表明酸枣猴头菌奶酪产物组能增强小鼠T淋巴细胞亚群，提高小鼠的免疫力。
5、小鼠摘眼球取血，分离血清，参照试剂盒说明书检测IFN-γ含量。结果见表10。
表10 酸枣猴头菌奶酪对免疫低下小鼠血清中的 IFN-γ含量的影响（，n =10）/>
注:与空白组比较，##P<0.05；与模型组比较，**P<0.05，*P<0.1
空白组与模型组相比，模型组免疫低下小鼠血清中的IFN-γ含量显著下降，差异具有统计学意义（P<0.05），模型成立；阳性药组与模型组相比，IFN-γ含量显著上调，差异具有统计学意义（P<0.05）；实施例3-7酸枣猴头菌奶酪组与模型组相比，免疫低下小鼠血清中的IFN-γ含量均增加（P<0.1）；而实施例5酸枣猴头菌奶酪组显著增加了小鼠免疫低下小鼠血清中的IFN-γ含量，差异具有统计学意义（P<0.05），表明酸枣猴头菌奶酪产物组能增强小鼠血清中的IFN-γ含量，提高小鼠的免疫力。
实施例10：感官物质评价：选择10名年龄在17~22岁的在校大学生和5名年龄在30~50岁的教师组成感官评价，在室温20℃的条件下，对制得的酸枣猴头菌奶酪进行感官评定，对气味、滋味、色泽、组织状态、总体可接受性5个评定项目进行评分检验(总分为100分)。评分标准见表11。
表11 酸枣猴头菌奶酪评分标准
经感官检验，在校大学生组10人对该产品的评价平均分是89.3分,教师组5人评价的平均分是87.9分。评鉴人员一致认为在上述加工工艺下制得的酸枣猴头菌奶酪具有淡淡的奶酪风味，质地柔软，组织细腻致密，软硬适度，其风味滋味及组织状态等易被消费者所接受。
实施例11：酸枣果肉与酸枣猴头菌奶酪GABA及丁酸含量比较实验：分别量取2 ml的酸枣猴头菌奶酪发酵液与2 ml的酸枣提取液，用于GABA与丁酸的含量测定，测定结果见表12。
表12酸枣果肉与酸枣猴头菌奶酪发酵液GABA与丁酸含量测定
经含量测定后，从表中可看出，酸枣果肉本身不具备丁酸并且GABA含量也仅仅为0.29 g/L；而经过一次发酵后测得GABA含量为1.05 g/L，丁酸含量为0.21 mmol/L，含量均有所上升；经过两次发酵后，测得发酵提取液中GABA含量为2.40 g/L，丁酸含量为0.52mmol/L。GABA与丁酸含量均大幅度明显升高，证明了经过双重发酵后，充分利用其酸枣果肉本身的化学成分以及进行二次发酵后，又富集到大量的活性物质丁酸以及GABA，从而使得最终制备的奶酪具有改善睡眠，调节免疫的功效，进一步提高了奶酪的营养价值，同时扩大了奶酪的使用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种有助于改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪的制备方法，其特征在于：将培养7d的猴头菌种子液接种于酸枣果粉培养基中进行发酵，所得发酵产物冷冻干燥、冷冻粉碎为酸枣猴头菌共发酵产物；然后将酸枣猴头菌共发酵产物与新鲜牛乳混合均匀，再接种入嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌的复合乳酸菌种子液进行发酵，所得发酵产物中加入氯化钙、凝乳酶的水稀释液，将发酵产物凝结成块，过滤期初乳清液体，加入食盐浸渍后压榨成型即为酸枣猴头菌奶酪；
步骤如下：
（1）培养猴头菌的种子液：活化的猴头菌菌株接种于猴头菌液体种子培养基中，28℃，150r/min条件下，摇瓶培养7d，即为猴头菌的液体种子；
（2）酸枣果粉培养基的制备：超微酸枣果粉中加入蒸馏水混匀，121℃灭菌20min，即得酸枣果粉培养基；
（3）酸枣猴头菌一次共发酵产物的制备：将步骤（1）所制备的液体种子接种入步骤（2）所制备的酸枣果粉培养基中，室温避光摇床培养，培养温度为28-32℃，摇床转速为160-220rpm，避光发酵10-18天；获得的发酵产物冷冻干燥、冷冻粉碎，过100-120目筛，即为酸枣猴头菌一次共发酵产物；
（4）酸枣猴头菌牛乳混合物的制备：将步骤（3）所得酸枣猴头菌一次共发酵产物与新鲜牛乳按质量体积比为1-3:1-7的比例混合，4000r/min分散5-10min，然后2000r/min搅拌5-10min，使其混合均匀，50-95℃灭菌20-40min，然后自然冷却至30-35℃，即得酸枣猴头菌牛乳混合物；
（5）二次发酵产物获得：复合乳酸菌为：嗜热链球菌菌粉、保加利亚乳杆菌菌粉、植物乳杆菌菌粉按照质量比为1.5:0.5:0.5的比例混合接种于乳酸菌培养基中，37℃培养，传代2-3次，即为复合乳酸菌；
将所得复合乳酸菌按照体积比为2%-5%的接种量，接种入步骤（4）中所得酸枣猴头菌牛乳混合物中，2000-6000r/min搅拌5-10min，使其混合均匀，然后38-42℃发酵6-8h，即得二次发酵产物；
（6）酸枣猴头菌奶酪的获得：以步骤（5）中所得二次发酵产物为计算基准，二次发酵产物中添加体积比为0.005%-0.025%的氯化钙，随后将1%-4%活力1000 U凝乳酶用10倍无菌水稀释，缓慢加入二次发酵产物中，2000r/min搅拌10 min，静置，至凝乳块充分形成；
凝乳块切成立方体，继续2000r/min搅拌15 min，静置30-50min后，四层纱布过滤，排除产生的乳清液体，收集固形物；
固形物放入预先灭菌好的质量浓度为15%-20%的食盐溶液中浸渍3-6h，浸渍后压榨成型24h，即得酸枣猴头菌奶酪。
2.根据权利要求1所述的一种有助于改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪的制备方法，其特征在于：步骤（1）中猴头菌液体种子培养基配方为：葡萄糖2g/L、蛋白胨0.5g/L、磷酸二氢钾0.15g/L、硫酸镁0.075g/L、维生素B 11g/L；猴头菌菌丝的接种量为12-15 g/L。
3.根据权利要求1所述的一种有助于改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，超微酸枣果粉的制备方法为：酸枣果肉于50-60℃电热干燥箱中干燥3-4h；真空低温干燥，冻结温度为-10～-30℃，冷阱温度为-29～-31℃，真空度为10～20Pa，冻干最终温度为30～70℃；常温高速粉碎机粉碎60 s，6000-10000转/分钟，振动磨超微粉碎机3000-6000转/分钟粉碎8 min，过250~300目筛，即为酸枣果肉超微粉；酸枣果粉培养基配方为：所述酸枣果粉培养基中酸枣果肉超微粉、蒸馏水的质量比为0.5-1.5︰3-7。
4.根据权利要求1所述的一种有助于改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，冷冻干燥条件为：冷冻温度为-10～-30℃，真空度为10-20Pa，冷阱温度为-30～-45℃，时间为25-30h；冷冻粉碎的条件为：以液氮为冷源通入粉碎机，打粉1min，过100-120目筛，收集密封于4℃冰箱保存备用。
5.根据权利要求1所述的一种有助于改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪的制备方法，其特征在于：步骤（6）中，凝乳块切成1cm3的立方体；所得酸枣猴头菌奶酪真空包装，4℃保藏。
6.一种利用权利要求1-5任一制备方法所获得的有助于改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪。
7.权利要求6所述的有助于改善睡眠、增强免疫力的酸枣猴头菌奶酪在制备改善睡眠、增强免疫保健食品或功能型食品中的应用。
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