CN113502230A

CN113502230A - 猴头菇菌株及其培养方法、猴头菌-人参双向固体发酵方法和高效转化稀有人参皂苷的方法

Info

Publication number: CN113502230A
Application number: CN202110789327.1A
Authority: CN
Inventors: 王欢; 陈长宝; 王淑敏; 张金亭; 唐敏
Original assignee: Changchun University of Chinese Medicine
Current assignee: Changchun University of Chinese Medicine
Priority date: 2021-07-13
Filing date: 2021-07-13
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2041-07-13
Also published as: CN113502230B; CN116622798A

Abstract

本发明涉及发酵技术领域，特别涉及猴头菇菌株及其培养方法、猴头菌‑人参双向固体发酵方法和高效转化稀有人参皂苷的方法。该猴头菇菌株的保藏编号为CGMCC No.22450。本发明的猴头菇菌株可以高效转化人参中稀有人参皂苷。

Description

猴头菇菌株及其培养方法、猴头菌-人参双向固体发酵方法和高效转化稀有人参皂苷的方法

技术领域

本发明涉及发酵技术领域，特别涉及猴头菇菌株及其培养方法、猴头菌- 人参双向固体发酵方法和高效转化稀有人参皂苷的方法。

背景技术

人参(Panaxginseng C.A.Mey)为多年生宿根阴性草本双子叶植物，是我国传统的名贵中药材，主产于我国东北地区，被人们誉为“百草之王”。据《中国药典》中记载，人参具有大补元气、复脉固脱、安神等多重药用功效。研究表明，人参的药理活性主要是依赖于人参苷元及稀有人参皂苷Rd、Rg₁、 Rg₃、Rh₁、Rh₂等。但此类天然皂苷含量极少，提取分离复杂而且收率极低，无法进行工业化生产，因此将人参皂苷转化为稀有皂苷具有深远意义。

人参固体发酵技术是以人参药材或药渣为药性基质，通过微生物自身丰富的酶系统，水解药性基质中的纤维素类物质，为自身的生长代谢提供能量。通过微生物的生理代谢活动与生化反应过程对人参皂苷进行结构修饰，使其产生新的生物活性成分和新的药效作用。通过这种微生物转化作用，能够快速而有效地改变皂苷的糖链结构，使原型人参皂苷转化为稀有人参皂苷，提高其生物活性。如植物乳杆菌KCCM 11613P能将人参皂苷Rb₂、Rb₃转化为人参皂苷Rd，乳酸双歧杆菌Bi-07和鼠李糖乳杆菌HN001能对人参皂苷Rb₁、 Rc和Rb₂进行转化，得到特异性去糖基化人参皂苷Rd作为最终代谢产物。 Hasegawa等利用从肠道厌氧微生物中分离筛选出菌株Prevotella oris，可将多种人参皂苷(如Rb₁、Rc、Rd等)转化成稀有人参皂苷成分。Qin等通过β- 葡萄糖苷酶在拟青霉Bainier sp.229中将二醇型人参皂苷Rb₁转化为稀有人参皂苷CK。Choi从蛋白质工程角度出发，通过微生物中特定的酶水解与人参皂苷结合的特定苷类物质，将人参皂苷Rc转化为稀有人参皂苷CK。

经微生物固体发酵后的人参药材，其发酵产物更利于人体消化吸收，降低药材原有毒性的同时大幅度提高了其药用价值。如，由原型人参皂苷转化得到的稀有人参皂苷Rg₂、Rg₃具有更高效的抗焦虑、抗炎、抗癌活性作用，稀有皂苷CK、F₁₂在抗肿瘤、抗突变、抗炎保肝、哮喘等诸多方面都表现出良好的药效活性，相比于原型人参皂苷具有更高的药理活性作用。王洪峰等在研究人参双向固体发酵过程中的化学成分变化时发现，在人参药性菌质中检测到大量稀有人参皂苷，并猜测人参皂苷Rg₁、Re、Rb可能转化为人参稀有皂苷Rg₃、Rh等。其中，相比于化学转化法，这种双向发酵的生物转化技术可以大幅度提高转化效率，同时不会产生有害的副产物。如人参皂苷Rd经脱糖基化转化为大量的稀有人参皂苷。

猴头菌(Hericium erinaceus)隶属担子门(Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)红菇目(Russulales)猴头菌科(Hericiaceae)猴头菌属 (Hericium)，子实体一年生，无柄或具文献非常短的侧生柄，新鲜时肉质，后期软革质，无臭无味，干燥后奶酪质或软木栓质，略具馊味。在其生长过程中会伴随着甾体类化合物、生物碱类化合物、芳香类化合物、萜类化合物、脂肪酸及其脂类等次级代谢产物的生成，具有一定的抗氧化、抗菌、抗衰老、抗肿瘤和神经保护、抗炎等作用。而猴头菌的这些次生代谢产物的潜在的药用价值也受到了高度的关注。

自然界中许多微生物可在固体基质上生长，特别是丝状真菌，可在没有水的情况下与固体药性基质相互依附生长。猴头菌作为自然界中一种珍贵的大型药食两用真菌，可与药材或药渣等固体基质进行双向发酵。在固体发酵过程中，真菌经代谢产生的多种次生代谢产物可对固体基质的物质基础进行改造，从而提高基质中活性物质含量。如，刘明明等利用猴头菌与小麦固体培养基进行双向发酵，结果发现与对照组相比，猴头菌发酵组明显提高了小麦基质中蛋白质的含量。猴头菌与大豆固体培养基发酵后，总黄酮、总三萜的含量下降，总多酚及花色苷的含量上升。盛悦利用猴头菌与玉米蛋白粉进行发酵，发现发酵产物的抗氧化活性明显增高。

猴头菌固体发酵过程模拟了许多高等丝状真菌的生活条件，在此过程猴头菌可通过改变活性物质的成分结构来增强发酵产物的药理活性。与液体发酵产生的真菌孢子相比，固体发酵的培养条件下的生物酶、真菌孢子及代谢物都具有较强的环境适应能力。经前人研究发现，猴头菌经固体发酵产生的孢子稳定性更高、抗干燥性更强，并且在冻干后较长时间内的萌发率更高。

人参中含量较高的皂苷如Rb₁，Rb₂，Rc，Rd，Re和Rg₁等。稀有人参皂苷如F₁、F₂、Rg₃、Rh₁、Rh₂、CK、CY和CMc等，在天然人参中含量很低，但药理活性往往更好。由于稀有人参皂苷与高含量皂苷具有相同的母核结构，只是糖残基的数量不同，因此可通过水解高含量皂苷中的糖残基来制备稀有人参皂苷。常见的方法包括酸水解、高温高压、微生物转化和酶转化。酸水解和高温高压等化学法由于反应条件剧烈、转化效率低、副产物多、分离纯化难等缺点限制了其发展应用。而生物转化法由于反应条件温和、转化效率高、专一性好，成为最具潜力的方法，国内外在此领域已取得一定的成果。生物转化一般包括微生物转化和酶转化。

目前主要用于人参皂苷转化的微生物如下：

1.人类肠道细菌，包括多型杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、乳酸菌属等，由于它们能够代谢口服的人参皂苷且在食品中可被安全使用，因此肠道细菌在降解人参皂苷方面受到科研人员的广泛关注。这些微生物在以人参皂苷为碳源的厌氧环境下可以生长。然而使用肠道细菌转化人参皂苷也存在着培养基成本高，产率低等问题。

2.从人参种植土壤中分离的微生物，真菌有月状弯孢菌、根曲霉、兰色犁头霉、甘蔗镰孢、直立顶孢霉、拟青霉属等，细菌有巨大芽胞杆菌、海胆鞘氨醇单胞菌、柄细菌属、间孢囊菌属、细杆菌属等，这些真菌和细菌均被应用于转化人参皂苷。和肠道细菌相比，土壤微生物在普通培养基中便可快速生长，在转化人参皂苷中具有明显的经济优势。然而土壤微生物必须被鉴定为安全的，才能被应用于食品工业中。尽管非致病微生物可应用于食品工业中，但微生物转化法依然存在着选择性差，产率低等缺点，且微生物所分泌的参与降解的酶也难以确定。

还有应用传统的中药红曲、桑黄和植物乳杆菌、酵母菌等发酵转化，目前，主要应用细菌、酵母菌和霉菌进行生物转化人参皂苷，尚并没有应用双向固体发酵技术，利用猴头菌株与人参共发酵转化稀有人参皂苷的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了猴头菇菌株及其培养方法、猴头菌-人参双向固体发酵方法和高效转化稀有人参皂苷的方法。该猴头菇菌株可以高效转化人参中稀有人参皂苷。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种猴头菇菌株，其保藏编号为CGMCC No.22450。

本发明还提供了该猴头菇菌株的培养方法，包括如下步骤：

将猴头菇菌株复苏，接种于斜面培养基进行斜面培养；

将斜面培养后的猴头菇菌株接种于一级液体培养基中进行一级种子培养；

将一级种子培养后的猴头菇菌株接种于二级液体培养基中进行二级种子培养。

作为优选，斜面培养基为PDA固体培养基。

作为优选，斜面培养的温度为24～28℃，时间为5～20小时。

在本发明提供的具体实施例中，斜面培养的温度为26℃。

作为优选，一级液体培养基的配方为：葡萄糖10～30g，蛋白胨5～15g， KH₂PO₄ 1～5g，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.5g，水1L；

作为优选，一级种子培养的条件为：24～28℃，150～200rpm/min，黑暗条件，培养10～20天。

在本发明提供的具体实施例中，一级液体培养基的配方为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 1g，水1L。

在本发明提供的具体实施例中，一级种子培养的条件为：26℃，160 rpm/min，黑暗条件，培养15天。

作为优选，二级液体培养基的配方为：葡萄糖20～30g，蛋白胨0.1～0.5g，酵母粉0.1～0.5g，KH₂PO₄ 2～8g，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.5g，水1L；

作为优选，二级种子培养的温度为24～28℃，150～200rpm/min，黑暗条件，培养5～10天。

作为优选，一级种子培养后的猴头菇菌株的接种量为1:(10～30)(V/V)。

在本发明提供的具体实施例中，一级种子培养后的猴头菇菌株的接种量为1:20(V/V)。

在本发明提供的具体实施例中，二级液体培养基的配方为：葡萄糖22g，蛋白胨0.2g，酵母粉0.2g，KH₂PO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O 1g，水1L；

在本发明提供的具体实施例中，二级种子培养的条件为：26℃，160 rpm/min，黑暗条件，培养7天。

本发明还提供了一种猴头菌-人参双向固体发酵方法，包括如下步骤：

将人参粉末与水混合，灭菌，得到人参药材基质；

将猴头菇菌株接种于人参药材基质，进行发酵培养。

作为优选，水与人参粉末的质量百分比为30％～50％。

在本发明提供的具体实施例中，水与人参粉末的质量百分比为40％。

作为优选，人参粉末的细度为10～20目。

作为优选，灭菌为高温高压灭菌和/或紫外灭菌。

作为优选，猴头菇菌株的接种量为10％～30％(W/V)二级猴头菌种子培养液。

在本发明提供的具体实施例中，猴头菇菌株的接种量为20％(W/V)二级猴头菌种子培养液。

作为优选，发酵培养的条件为：温度为23～28℃，时间为30～50天。

经过固体发酵后，得到的共发酵产物(人参药性菌质)，可以制成具有人参和猴头相似的功效的产品(药品、保健品、功能性食品、食品)，如片剂、颗粒剂、泡腾片、丸剂、口服液等产品。

本发明还提供了由上述猴头菌-人参双向固体发酵方法制得的菌质。

本发明还提供了一种食品，包括上述菌质和食品学上可接受的辅料。

本发明还提供了一种高效转化稀有人参皂苷Rg₃和Rh₁的方法，包括如下步骤：

将人参粉末与水混合，灭菌，得到人参药材基质；

将猴头菇菌株接种于人参药材基质，进行发酵培养，纯化后得到Rg₃和 Rh₁。

本发明提供了猴头菇菌株及其培养方法、猴头菌-人参双向固体发酵方法和高效转化稀有人参皂苷的方法。该猴头菇菌株的保藏编号为CGMCC No.22450。本发明具有如下优势：

1.猴头菌是我国传统的药食两用真菌，具有利五脏、健脾益胃的功能，作为食品药品，安全性和功效都要好，本发明发现并培养出一株野生的可以转化人参中稀有人参皂苷的菌株CCUCM-HE-001。

2.本发明首次利用猴头菌与4年生的人参进行双向固体发酵，提高稀有人参皂苷Rg3和Rh1的含量，此研究尚未见报道。

3.本发明工艺可高效转化稀有人参皂苷Rg₃和Rh₁。

生物保藏说明

CCUCM-HE001，分类命名：猴头菇(Hericium erinaceus)，于2021年6 月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22450。

附图说明

图1菌株CCUCM-HE-001菌落形态；

图2菌株CCUCM-HE-001菌丝形态；

图3菌株CCUCM-HE001的ITS系统进化树；

图4二醇型及齐墩果酸型人参皂苷含量比较；注：***代表与0天相比，差异极显著(P＜0.001)；###代表发酵30天与40天相比，差异极显著(P ＜0.001)；

图5三醇型人参皂苷含量比较；注：***代表与0天相比，差异极显著(P ＜0.001)；**代表与0天相比，差异显著(P＜0.005)；###代表发酵30天与 40天相比，差异极显著(P＜0.001)。

具体实施方式

本发明公开了猴头菇菌株及其培养方法和猴头菌-人参双向固体发酵方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中所用培养基、试剂等均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 猴头菌种鉴定

1.猴头菌种培养及菌种形态鉴定

将菌株CCUCM-HE001接种于PDA平板培养基上，28℃恒温培养10天左右，观察菌落生长情况，利用固体培养基玻片法，依据真菌菌落颜色、菌丝生长状况、孢子形态等特征进行显微形态分类鉴定。利用PDA培养基对该菌种进行培养，菌落呈圆形，边缘不整齐，菌丝呈白色绒毛状，由接种点向四周放射状扩散，菌丝前期生长缓慢，后期基内菌丝多，能产生色素，使培养基变为棕黄色(图1)。菌丝较粗，无隔阂，孢子呈圆形(图2)。

2分子生物学鉴定

通过对测得序列进行同源性分析并构建系统发育树，测序结果及系统发育树结果如下所示。菌株CCUCM-HE001的基因组DNA的ITS区序列长度为606bp，利用NCBI中的GenBank数据库BLAST在线比对结果可知，菌株 CCUCM-HE-001与猴头菌(Hericium erinaceum)的序列相似率达99％以上。选取与菌株相似性较大的序列构建系统发育树，进一步确定该菌种的种属关系。以长齿白齿耳菌(Mycoleptodonoides aitchisonii)为外源菌株，发育树按Neighbour-Joining的方法对菌种序列进行两两比较，计算序列中间的进化或亲缘关系，构建系统发育树如图3所示。通过ITS序列对比分析构建的系统发育树研究结果表明，菌株CCUCM-HE001与猴头菌(Hericium erinaceum) 同源性关系较高，亲缘关系较近，说明菌株CCUCM-HE001属于猴头菌。

实施例2 猴头菌-人参双向固体发酵技术

1.猴头菌的斜面培养

将保存于4℃冰箱的猴头菌菌种复苏，在无菌条件下转接至新配制的PDA 固体培养基中，于26℃恒温培养箱在黑暗条件下培养7天，再次传代，重复上述步骤，观察猴头菌菌丝生长布满整个培养基表面，即可进行液体培养。

2.一级、二级猴头菌液体菌种的制备

取上述适量猴头菌固体培养物接种于一级液体培养基(葡萄糖20g，蛋白胨10g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 1g，蒸馏水1L)，以26℃、160rpm/min 的黑暗条件下培养15天，然后按1:20(V/V)的比例将一级液体菌种转接至猴头菌二级液体培养基(葡萄糖22g，蛋白胨0.2g，酵母粉0.2g，KH₂PO₄ 5 g，MgSO₄·7H₂O 1g，蒸馏水1L)，在上述条件下培养7天。当观察到二级摇瓶中布满形态均匀的淡黄色菌球时，终止发酵。

实施例3 猴头菌-人参双向固体发酵菌质的制备

参考文献(陈天丽.复方参草菌质颗粒制备工艺及其抗肿瘤活性研究[D]. 长春中医药大学,2019；谭彦琦.北冬虫夏草固体发酵条件对主要活性成分含量影响的研究[D].湖南农业大学,2013.)中优化的条件，对人参及猴头菌进行双向固体发酵。将人参粉碎，过16目药典筛，得到粒度均匀的人参粉末。称取上述人参粉末30g置于200mL的培养瓶中，加入40％的蒸馏水为初始加水量，将水与人参粉末混合均匀后，装入培养瓶中，121℃高压灭菌两次，每次30分钟。将灭菌后的人参药材基质转移至无菌条件下，放凉后振摇基质使之松散，紫外灯下灭菌30分钟。以人参固体培养基质中接入20％(W/V)二级猴头菌种子培养液为实验组，以未接入二级猴头菌种子培养液的人参固体培养基质为对照组。待猴头菌菌丝布满整个培养瓶且形成明显的菌蕾结构时，即为发酵终点(30天)，后又继续发酵10天。每隔3天分别取出实验组和样品组样品各3瓶，40℃条件下烘干，粉碎，过3号筛，避光密封保存。

实施例4 UPLC-QQQ-MS/MS技术对猴头菌-人参菌质中13种人参皂苷含量变化进行分析监测

1、对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷对照品Rb₁、Rb₂、Rc、Rd、Re、Rf、Rg₁、Rg₂、Rg₃、 F₂、F₃、Rh₁、Ro对照品适量，加色谱甲醇溶解，作为混合对照品溶液，摇匀，过0.22μm有机滤膜，备用。将上述混合对照品溶液保存于4℃冰箱中，备用。

2、供试品溶液的制备

根据《中国药典》中的方法，精密称定菌质1.0g，用滤纸将其包好，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流3小时后弃去三氯甲烷液，取出药渣包，挥干溶剂，将滤纸包转移至100mL具塞锥形瓶中，加入水饱和正丁醇50mL，密塞静置，过夜，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22μm有机滤膜，保存于 4℃冰箱中，备用。

3、液相色谱分离条件

Thermo C₁₈色谱柱(50mm×3mm，1.7μm)，流动相为0.1％甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～5min，19％B；5～29min，19％～25％B；29～72min， 25％～40％B；72～77min，40％～90％B；77～80min，90％B；80～83min，90％～19％ B；83～88min，19％B；流速0.2mL/min，柱温35℃，样品室温度4℃，进样量5μL。

4、质谱检测条件

采用电喷雾方式进行离子化，负离子模式，电喷雾离子源(ESI)全扫描检测；质量扫描范围m/z 100～1500；喷雾电压：2500V；鞘气压力：35arb；辅助气压力:10arb；传输毛细管温度:350℃；雾器温度：300℃。

试验例1 猴头菌-人参菌质皂苷含量测定

采用实施例4方法对实施例3中不同发酵时期的发酵菌质进行人参皂苷含量的测定，记录峰面积，根据上述相对应的线性回归方程计算13种皂苷含量。

对不同发酵时间菌质中的皂苷含量进行测定，测定结果如图4、5所示。通过上述结果发现，人参药材经双向发酵后，各人参皂苷的含量均有不同程度的上升与下降。与0天相比，当菌质发酵至第30天时，稀有皂苷Rg₃增加 41.07％，齐墩果酸型皂苷Ro含量增加64.18％，稀有皂苷Rh₁增加63.57％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种猴头菇菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.22450。

2.权利要求1所述猴头菇菌株的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

将猴头菇菌株复苏，接种于斜面培养基进行斜面培养；

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述斜面培养基为PDA固体培养基；所述斜面培养的温度为24～28℃，时间为5～20小时。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述一级液体培养基的配方为：葡萄糖10～30g，蛋白胨5～15g，KH₂PO₄ 1～5g，MgSO₄·7H₂O0.5～1.5g，水1L；

所述一级种子培养的条件为：24～28℃，150～200rpm/min，黑暗条件，培养10～20天。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的培养方法，其特征在于，所述二级液体培养基的配方为：葡萄糖20～30g，蛋白胨0.1～0.5g，酵母粉0.1～0.5g，KH₂PO₄ 2～8g，MgSO₄·7H₂O0.5～1.5g，水1L；

所述二级种子培养的温度为24～28℃，150～200rpm/min，黑暗条件，培养5～10天。

6.一种猴头菌-人参双向固体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

将人参粉末与水混合，灭菌，得到人参药材基质；

将权利要求1所述的猴头菇菌株接种于人参药材基质，进行发酵培养。

7.根据权利要求6所述的猴头菌-人参双向固体发酵方法，其特征在于，所述水与所述人参粉末的质量百分比为30％～50％；

所述猴头菇菌株的接种量为10％～30％(W/V)二级猴头菌种子培养液；

所述发酵培养的条件为：温度为23～28℃，时间为30～50天。

8.权利要求6或7所述猴头菌-人参双向固体发酵方法制得的菌质。

9.一种食品，其特征在于，包括权利要求8所述的菌质和食品学上可接受的辅料。

10.一种高效转化稀有人参皂苷Rg₃和Rh₁的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将人参粉末与水混合，灭菌，得到人参药材基质；

将权利要求1所述的猴头菇菌株接种于人参药材基质，进行发酵培养，纯化后得到Rg₃和Rh₁。