CN112280686B - 一种终极腐霉swh-9及其固态发酵生产黄姜皂素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种终极腐霉（Pythium ultimum）SWH‑9及其固态发酵生产黄姜皂素的方法，该终极腐霉SWH‑9保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M 2019716，保藏日期：2019年9月11日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学），接入黄姜原料中进行固态发酵，能够高效转化黄姜皂苷为皂素。经菌种活化、种子扩大培养、黄姜原料处理、接种、固体发酵、二次发酵、过滤、离心、纯化提取得到黄姜皂素。本发明利用终极腐霉SWH‑9接入黄姜原料中进行固态发酵，生物法转化黄姜皂素，不产生酸性污染废水，解决传统酸水解工艺污染大的问题，达到绿色生产黄姜皂素的目的。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域和生物技术领域，涉及一种终极腐霉SWH-9及其固态发酵生产黄姜皂素的方法。
背景技术
黄姜是我国特有的药用植物资源，它的主要活性成分薯蓣皂苷元（又名黄姜皂素），在所有植物中薯蓣皂苷元含量最高，作为生产皮质激素、性激素等甾体激素和避孕药物的重要原料，在医药上常用于治疗心脑血管、风湿关节炎等疾病。我国是黄姜的主产区，陕西、河南、湖北、贵州等地种植面积较大。黄姜中含有大量的淀粉、纤维素等，将活性成分皂苷包裹在内，皂苷又以糖苷的形态存在，游离苷元极少，需要将苷键断裂，才能生成葡萄糖、鼠李糖和皂苷元。因此，黄姜皂素的提取应该使皂苷游离出来，并断开皂素和糖基，才能得到游离的黄姜皂素。传统黄姜皂素的生产主要采用酸解法，即在强酸存在的条件下加入黄姜原料进行加压水解，中和洗涤后采用120号汽油提取、结晶、干燥得到黄姜皂素成品。这种方法污染大，水消耗量大，不能满足环保生产的理念和要求，急需产业的绿色转换和升级。
目前报道微生物法生产黄姜皂素的有青霉菌051016（CN 100572553 C）、黑曲霉（CN 85108564 B）、米曲霉（CN 101012474 B）、塔宾曲霉HG-57（CN 106754422 A）、芽孢杆菌XBT2011（CN 103146795 B）、嗜酸乳杆菌（CN 103497987 B）等，大多转化菌种单一，效率低，难以实现产业化应用。菌种的进一步筛选及转化效率提高仍然是需要解决的问题。
总之，微生物法生产黄姜皂素是皂素行业绿色发展的重要方向。从自然界中筛选酶解活力高、皂素转化效果好、生产工艺简单的是解决微生物法生产黄姜皂素的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种终极腐霉及其固态发酵生产黄姜皂素的方法。本发明涉及的终极腐霉（Pythium ultimum）SWH-9，保藏号为CCTCC M 2019716，保藏日期:2019年9月11日，能够高效转化黄姜皂苷为皂素。利用终极腐霉SWH-9接入黄姜原料中进行固态发酵，生物法转化黄姜皂素，不产生酸性污染废水，解决传统酸水解工艺污染大的问题，达到绿色生产黄姜皂素的目的。
本发明所采用的技术方案是，
一种用终极腐霉（Pythium ultimum）SWH-9保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M 2019716，保藏日期：2019年9月11日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学），该终极腐霉SWH-9接入黄姜原料中进行固态发酵，能够高效转化黄姜皂苷为皂素。
一种终极腐霉（Pythium ultimum）SWH-9固态发酵生产黄姜皂素的方法，其特征在于按照下列步骤进行：
S1、菌种活化：终极腐霉SWH-9菌种从斜面或甘油管中转接至PDA斜面培养基中，25-35℃活化培养3-5天，至菌丝布满斜面；
S2、种子扩大培养：从活化斜面中将终极腐霉SWH-9菌种转接至种子培养基中，25-35℃培养3-5天；
S3、黄姜原料处理：挑选新鲜、饱满、无霉变的黄姜清洗干净，或者黄姜干片充分复水后，放入粉碎机绞成小米粒大小，混匀后入锅蒸煮，或者121℃灭菌30-40分钟；
S4、接种：原料蒸熟后，出锅摊凉，将上述种子均匀拌入，接种量0.1%-0.5%；
S5、固体发酵：将上述原料置于固体发酵浅盘或者发酵槽中，25-35℃，一般不超过38℃，室内温度在28℃左右；保持发酵原料湿度45-70%左右，同时采用增湿装置保持室内湿度；保持通风通气；72小时左右，固体发酵结束；
S6、二次发酵：将固体发酵完成的黄姜原料转入密闭罐状容器中，加入1.5～2.5倍水，接入安琪酵母，接种量0.5-1‰，常温发酵3-5天，充分利用黄姜淀粉分解后的糖分等小分子有机物；
S7、过滤：上述混合发酵液用20目筛网进行过滤，去掉未分解的黄姜皮和根须，收集滤液；
S8、离心：将上述黄姜滤液置于离心机中离心，收集滤渣，60-90℃烘干，得黄姜粗提粉；
S9、纯化提取：黄姜粗提粉中加入3-6倍60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。
一种用终极腐霉（Pythium ultimum）SWH-9制备黄姜皂素的方法，其特征在于的述种子培养基组分：麸皮80g，葡萄糖5g，水90mL，混匀后分装于250mL锥形瓶中，121℃灭菌30分钟。
本发明的有益效果是：本发明提供了一株终极腐霉，命名为Pythium ultimumSWH-9，可应用于黄姜生物法转化生产黄姜皂素，替代传统酸水解法生产黄姜皂素，实现皂素的绿色生产。在发酵过程中，主要是各种酶对皂苷的释放，皂素的生成起作用，例如纤维素酶、糖化酶、果胶酶和糖苷酶。因此各种酶的酶活力的提高也代表着皂苷水解的转化率在增加。通过测定本发明的技术方法中得到的发酵液糖化酶和纤维素酶的活力，可以发现与传统的酸水解方法相比，该技术方法不仅实现了皂素的绿色生成，也大大提高了皂苷的水解效率。该方法不产生酸性污染废水；黄姜不需酶解前处理，直接常温固态发酵，成本低，操作简单，设备投入少；二次发酵既提高了皂素的得率，也充分利用了黄姜淀粉酶解后产生的糖类和有机酸等小分子物质，减少废水处理难度。
附图说明
图1是终极腐霉SWH-9的菌落形态；
图2是终极腐霉SWH-9菌丝的400倍显微形态；
图3是发酵产物中糖化酶活力变化曲线图；
图4是发酵产物中纤维素酶活力变化曲线图；
图5是黄姜粗提粉中皂素的HPLC检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供的终极腐霉（Pythium ultimum）SWH-9，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2019716，保藏日期：2019年9月11日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学）。该终极腐霉SWH-9接入黄姜原料中进行固态发酵，能够高效转化黄姜皂苷为皂素, 其18S rDNA序列长度为1363 bp，具体如下：
ACAATTTTGTACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTATATCAGTTATAGTCTACTCGATAGTACCTTACTACTTGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCACAAATACCCAACTGCTTGTCGGACGGGTAGCATTTATTAGATTGAAACCAATGCAGTCTTCGGGCTGGTATTGTGTTGAGTCATAATAACTGTGCGGATCGCACTCAGTGCGATAAATCGATTGAGTTTCTGCCCTATCAGCTTTGGATGGTAGGATATGGGCCTACCATGGCATTAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTTGATTCCGGAGAGGGAGCCTTAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATGCTCTGGCTCTTCGAGTCGGGCAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTAACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGTTTTGAGCGTCCGGTCGGCTTCCTCTGGGAGTGTGTACTTGTGATGTTCGAGGCATTTTTTGTGAGGATGTTTTTCTGCCATTAAGTTGGTGGTTGAATAGACTTGCATCGTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTTAAAGCAGGCGTTTGCTCATTGAATACATTAGCATGGAATAATAAGATACGACCTTGGTGGTCTATTTTGTTGGTTTGCACACCAGGGTAATGATTAATAGGGACAGTTGGGGGTATTCATATTTCAGCGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATCGCTGAAAGATGAGCTTAGGCGAAAGCATTTACCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTCGGGATTGGCAGTCGTTTTTTCAAATGACCTTGTCAGCACCGTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTCCGCGTGCTAAATAGTTTCGCTTACAATTTTTTGTAGGTTTGAGACTTCTTAGAGGGACTTTGGGTAATCATCCAATGAAGG
图1为终极腐霉SWH-9在PDA培养基培养2天的菌落形态。本发明的尖孢镰刀菌SWH-3在PDA固体培养基中生长迅速，30℃培养2天，直径达到4～6cm，3～5天可布满平板皿，菌丝白色，无色素，在平板上呈花瓣状层次生长。
图2为终极腐霉SWH-9菌丝的400倍显微形态。菌丝较为粗壮，粗2.3-9.8μm，未见分隔。
图3和图4分别为为终极腐霉SWH-9在发酵转化黄姜过程中的糖化酶和纤维素酶活力变化曲线。糖化酶和纤维素酶活力的变化趋势均表现为先升后降，大概在第3天能达到最高水平。可见终极腐霉SWH-9转化黄姜是一个多酶系协同作用的结果，较高的酶活保证了皂素的高效转化。
图5为终极腐霉SWH-9在发酵转化黄姜后黄姜粗提粉中皂素的HPLC检测图，黄姜皂素在粗提粉含量达到10.1%，计算皂素产量为3.2g/100g干黄姜。
该终极腐霉（Pythium ultimum）SWH-9固态发酵生产黄姜皂素的方法，按照下列步骤进行：
1、菌种活化：终极腐霉SWH-9菌种从斜面或甘油管中转接至PDA斜面培养基中，25-35℃活化培养3-5天，至菌丝布满斜面。
2、种子扩大培养：从活化斜面中将终极腐霉SWH-9菌种转接至种子培养基中，25-35℃培养3-5天。种子培养基：麸皮80g，葡萄糖5g，水90mL，混匀后分装于250mL锥形瓶中，121℃灭菌30分钟。
3、黄姜原料处理：挑选新鲜、饱满、无霉变的黄姜清洗干净，或者黄姜干片充分复水后，放入粉碎机绞成小米粒大小，混匀后入锅蒸煮，或者121℃灭菌30-40分钟。
4、接种：原料蒸熟后，出锅摊凉，将上述种子均匀拌入，接种量0.1%-0.5%。
5、固体发酵：将上述原料置于固体发酵浅盘或者发酵槽中，25-35℃，一般不超过38℃，室内温度在28℃左右。保持发酵原料湿度45-70%左右，同时采用增湿装置保持室内湿度。保持通风通气。72小时左右，固体发酵结束。
6、二次发酵：将固体发酵完成的黄姜原料转入密闭罐状容器中，加入1.5～2.5倍水，接入安琪酵母，接种量0.5-1‰，常温发酵3-5天，充分利用黄姜淀粉分解后的糖分等小分子有机物。
7、过滤：上述混合发酵液用20目筛网进行过滤，去掉未分解的黄姜皮和根须等，收集滤液。
8、离心：将上述黄姜滤液置于离心机中离心，收集滤渣，60-90℃烘干，得黄姜粗提粉。
9、纯化提取：黄姜粗提粉中加入3-6倍60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。
实例1
1kg鲜黄姜清洗干净，粉碎机打碎成小米粒大小，121℃灭菌30分钟，冷却后按照原料重量的0.1%接入终极腐霉SWH-9种子，搅拌均匀，将原料置于固体发酵浅盘中，25℃培养，保持发酵原料湿度45-70%，通风通气，发酵60小时。
二次发酵：将固体发酵完成的黄姜原料转入密闭罐状容器中，加入发酵料1.5倍重量的水，接入0.5‰市售安琪酵母，密封发酵3天。
用20目筛网将上述混合发酵液过滤，去掉滤渣，收集滤液。滤液置于离心机中离心，收集沉淀，60℃烘干，得黄姜粗提粉。黄姜粗提粉中加入3-6倍60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。
实例2
100kg鲜黄姜清洗干净，晾干后用粉碎机打碎，100℃蒸煮60分钟，冷却后接入500g终极腐霉SWH-9种子，搅拌均匀，将原料置于固体发酵槽中，30℃培养，保持发酵原料湿度45-70%，通风通气，发酵72小时。
二次发酵：将固体发酵完成的黄姜原料转入密闭罐状容器中，加入发酵料2.5倍重量的水，接入50g市售安琪酵母，密封发酵5天。
用20目筛网将上述混合发酵液过滤，去掉滤渣，收集滤液。滤液置于离心机中离心，收集沉淀，90℃烘干，得黄姜粗提粉。黄姜粗提粉中加入300升60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。
实例3
100kg干黄姜充分浸泡后，水沥干，粉碎机打碎成小米粒大小，121℃灭菌40分钟，冷却后接入1000g终极腐霉SWH-9种子，搅拌均匀，将原料置于固体发酵槽中，30℃培养，保持发酵原料湿度45-70%，通风通气，发酵72小时。
二次发酵：将固体发酵完成的黄姜原料转入密闭罐状容器中，加入发酵料2倍重量的水，接入100g市售安琪酵母，密封发酵5天。
用20目筛网将上述混合发酵液过滤，去掉滤渣，收集滤液。滤液置于离心机中离心，收集沉淀，90℃烘干，得黄姜粗提粉。黄姜粗提粉中加入300升60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。
Claims (3)
1.一种终极腐霉Pythiumultimum SWH-9，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M 2019716，保藏日期：2019年7月16日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，接入黄姜原料中进行固态发酵，能够高效转化黄姜皂苷为皂素。
2.如权利要求1所述的终极腐霉Pythium ultimum SWH-9在固态发酵生产黄姜皂素中的应用，其特征在于按照下列步骤进行：
S1、菌种活化：终极腐霉SWH-9菌种从斜面或甘油管中转接至PDA斜面培养基中，25-35℃活化培养3-5天，至菌丝布满斜面；
S2、种子扩大培养：从活化斜面中将终极腐霉SWH-9菌种转接至种子培养基中，25-35℃培养3-5天；
S3、黄姜原料处理：挑选新鲜、饱满、无霉变的黄姜清洗干净，或者黄姜干片充分复水后，放入粉碎机绞成小米粒大小，混匀后入锅蒸煮，或者121℃灭菌30-40分钟；
S4、接种：原料蒸熟后，出锅摊凉，将上述种子均匀拌入，接种量0.1%-0.5%；
S5、固体发酵：将上述原料置于固体发酵浅盘或者发酵槽中，25-35℃，一般不超过38℃，室内温度在28℃左右；保持发酵原料湿度45-70%左右，同时采用增湿装置保持室内湿度；保持通风通气；72小时左右，固体发酵结束；
S6、二次发酵：将固体发酵完成的黄姜原料转入密闭罐状容器中，加入1.5～2.5倍水，接入安琪酵母，接种量0.5-1‰，常温发酵3-5天，充分利用黄姜淀粉分解后的糖分等小分子有机物；
S7、过滤：上述混合发酵液用20目筛网进行过滤，去掉未分解的黄姜皮和根须，收集滤液；
S8、离心：将上述黄姜滤液置于离心机中离心，收集滤渣，60-90℃烘干，得黄姜粗提粉；
S9、纯化提取：黄姜粗提粉中加入3-6倍60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。
3.如权利要求2所述的终极腐霉Pythiumultimum SWH-9在固态发酵生产黄姜皂素中的应用，其特征在于所述种子培养基组分：麸皮80g，葡萄糖5g，水90mL，混匀后分装于250mL锥形瓶中，121℃灭菌30分钟。
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