CN112159762B - 一种尖孢镰刀菌swh-3及其发酵生产黄姜皂素的方法 - Google Patents

一种尖孢镰刀菌swh-3及其发酵生产黄姜皂素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种尖孢镰刀菌SWH‑3及其发酵生产黄姜皂素的方法。该尖孢镰刀菌SWH‑3保藏编号为：CCTCC NO:M2019715，保藏在中国典型培养物保藏中心，该菌株能够高效转化黄姜皂苷为皂素。该菌株应用于生产黄姜皂素的方法，经菌种活化、种子扩大培养、黄姜原料处理、二次发酵、烘干、纯化提取制备黄姜皂素，可以替代传统酸水解工艺，解决酸水解工艺污染大的问题，达到绿色生产黄姜皂素的目的。

Description

一种尖孢镰刀菌SWH-3及其发酵生产黄姜皂素的方法
技术领域
本发明属于微生物领域和生物技术领域，涉及一种尖孢镰刀菌SWH-3发酵生产黄姜皂素的方法。
背景技术
黄姜，学名盾叶薯蓣（Dioscorea Zingiberensis C.H.Wright），又名火头根，主要的活性成分是薯蓣皂苷元，又名黄姜皂素，商品名为薯蓣皂素，在所有植物中薯蓣皂苷元含量最高，含量在1%以上。薯蓣皂苷元是合成可的松、黄体酮等甾体激素的重要原料。传统黄姜皂素的生产主要采用酸解法，即在强酸存在的条件下加入黄姜原料进行加压水解，中和洗涤后采用120号汽油提取、结晶、干燥得到黄姜皂素成品。这种方法污染大，水消耗量大，不能满足环保生产的理念和要求，急需产业的绿色转换和升级。
目前报道微生物法生产黄姜皂素的有青霉菌051016（CN 100572553 C）、黑曲霉（CN 85108564 B）、米曲霉（CN 101012474 B）、塔宾曲霉HG-57（CN 106754422 A）、芽孢杆菌XBT2011（CN 103146795 B）、嗜酸乳杆菌（CN 103497987 B）等，大多转化菌种单一，效率低，难以实现产业化应用。菌种的进一步筛选及转化效率提高仍然是需要解决的问题。
总之，微生物法生产黄姜皂素是皂素行业绿色发展的重要方向。从自然界中筛选酶解活力高、皂素转化效果好、生产工艺简单的是解决微生物法生产黄姜皂素的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种尖孢镰刀菌SWH-3发酵生产黄姜皂素的方法。本发明涉及的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）SWH-3，保藏号为CCTCC NO: M 2019715，能够高效转化黄姜皂苷为皂素，可以替代传统酸水解工艺，解决酸水解工艺污染大的问题，达到绿色生产黄姜皂素的目的，解决了现有技术中存在的问题。
利用尖孢镰刀菌SWH-3对黄姜原料进行有氧液体发酵，利用微生物代谢和产生的多种活性酶将黄姜皂苷转化黄姜皂素，不产生酸性污染废水。
本发明所采用的技术方案是，
该一种尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）SWH-3，保藏编号为：CCTCC NO:M2019715，保藏在中国典型培养物保藏中心，该菌株能够高效转化黄姜皂苷为皂素。
一种尖孢镰刀菌SWH-3发酵生产黄姜皂素的方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1.菌种活化：将尖孢镰刀菌SWH-3菌种从斜面或甘油管中转接至PDA斜面培养基中，28-32℃活化培养3-5天，至菌丝和孢子布满斜面；
S2.种子扩大培养：在活化斜面中加入玻璃珠和无菌水，震荡收集孢子，将尖孢镰刀菌SWH-3孢子菌悬液种转接至种子培养基中，28-32℃，150-220r/min培养1-3天即得种子发酵液；
S3.黄姜原料处理：
黄姜原料包括鲜黄姜和干黄姜；
鲜黄姜处理方法：鲜黄姜清洗干净，加4倍水粉碎匀浆得鲜黄姜液；
干黄姜处理方法：黄姜干片用粉碎机粉碎后过200目筛，按照料液比1:5～1:8加水混匀得干黄姜液；
以上黄姜原料调节pH值为7.0，加入中温α-淀粉酶（200 U/g）和糖化酶（100 U/g），60℃反应4-6h；
S4.发酵：原料放入发酵罐中121℃灭菌30-40分钟,冷却后接入尖孢镰刀菌SWH-3种子发酵液，150-220 r/min，28-32℃培养48-72 h；
S5.二次发酵：在发酵完成的黄姜培养基中继续接入安琪酵母，接种量0.5-1‰，静置培养18-24 h；
S6.烘干：上述混合发酵液离心收集滤渣，60-90℃烘干，得黄姜粗提粉；
S7.纯化提取：黄姜粗提粉中加入3-6倍60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。
所述种子培养基组分为：10g/L黄姜粉，3g/L蔗糖，5 g/L酵母粉，3 g/L NaNO3，1g/L K2HPO4，0.5g/L MgSO4•7H2O，0.5 g/L KCl，0.01 g/L FeSO4•7H2O，pH7.0。
本发明的有益效果是：本发明提供了一株尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）SWH-3，可应用于黄姜生物法转化生产黄姜皂素。尖孢镰刀菌是一种侵染植物的真菌病原菌，可分泌纤维素酶、淀粉酶、果胶酶等复合酶系，降解黄姜中的淀粉、纤维素等，有利于黄姜皂素的转化生成。在发酵过程中，主要是各种酶对皂苷的释放，皂素的生成起作用，例如纤维素酶、糖化酶、果胶酶和糖苷酶。因此各种酶的酶活力的提高也代表着皂苷水解的转化率在增加。通过测定本发明的技术方法中得到的发酵液糖化酶和纤维素酶的活力，可以发现与传统的酸水解方法相比，该技术方法不仅实现了皂素的绿色生成，也大大提高了皂苷的水解效率。该生物法转化生产黄姜皂素废水量少，污染程度低；直接利用黄姜原料采用微生物液体发酵生产黄姜皂素，操作简单，容易实现自动化操作。替代传统酸水解法生产黄姜皂素，实现皂素的绿色生产。
附图说明
图1是尖孢镰刀菌SWH-3的菌落形态；
图2是尖孢镰刀菌SWH-3菌丝和孢子的400倍显微形态；
图3是发酵液中糖化酶活力变化曲线图；
图4是发酵液中纤维素酶活力变化曲线图；
图5是黄姜粗提粉中皂素的HPLC检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种用尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）SWH-3（保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M 2019715，保藏日期：2019年7月15日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学）。该菌株能够高效转化黄姜皂苷为皂素, 其18S rDNA序列长度为1354 bp，具体如下：
GTCTAAGTATAAGCAATTATACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCACTGGTGATTCATGATAACTCCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATAAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGGCCCGGGCCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCCGAGTAAT
图1为尖孢镰刀菌SWH-3在PDA培养基培养4天的菌落形态。本发明的尖孢镰刀菌SWH-3在PDA固体培养基中生长迅速，30℃培养2天，直径达到3～4cm，5天可布满平板皿，菌丝白色绒毛状。
图2为尖孢镰刀菌SWH-3菌丝和孢子的400倍显微形态。培养4天的菌丝上可见典型的镰刀状分生孢子。
图3和图4分别为为尖孢镰刀菌SWH-3在发酵转化黄姜过程中的糖化酶和纤维素酶活力变化曲线。糖化酶和纤维素酶活力的变化趋势均表现为先升后降，大概在第3天能达到最高水平。可见尖孢镰刀菌SWH-3转化黄姜是一个多酶系协同作用的结果，较高的酶活保证了皂素的高效转化。
图5为尖孢镰刀菌SWH-3在发酵转化黄姜后黄姜粗提粉中皂素的HPLC检测图，黄姜皂素在黄姜粗提粉含量达到9.7%，计算皂素产量为2.5g/100g干黄姜。
尖孢镰刀菌液态发酵生产黄姜皂素的方法，按照下列步骤进行。
1、菌种活化：尖孢镰刀菌SWH-3菌种从斜面或甘油管中转接至PDA斜面培养基中，28-32℃活化培养3-5天，至菌丝和孢子布满斜面。
2、种子扩大培养：在活化斜面中加入玻璃珠和无菌水，震荡收集孢子，将尖孢镰刀菌SWH-3孢子菌悬液种转接至种子培养基中，28-32℃，150-220r/min培养1-3天即得种子发酵液。种子培养基：10g/L黄姜粉，3g/L蔗糖，5 g/L酵母粉，3 g/L NaNO3，1g/L K2HPO4，0.5g/L MgSO4•7H2O，0.5 g/L KCl，0.01 g/L FeSO4•7H2O，pH7.0。
3、黄姜原料处理：
黄姜原料包括鲜黄姜和干黄姜。
鲜黄姜处理方法：鲜黄姜清洗干净，加4倍水粉碎匀浆得鲜黄姜液。
干黄姜处理方法：黄姜干片用粉碎机粉碎后过200目筛，按照料液比1:5～1:8加水混匀得干黄姜液。
以上黄姜原料调节pH值为7.0，加入中温α-淀粉酶（200 U/g）和糖化酶（100 U/g），60℃反应4-6h。
4、发酵：原料放入发酵罐中121℃灭菌30-40分钟。冷却后接入尖孢镰刀菌SWH-3种子发酵液，150-220 r/min，28-32℃培养48-72 h。
5、二次发酵：在发酵完成的黄姜培养基中继续接入安琪酵母，接种量0.5-1‰，静置培养18-24 h。
6、烘干：上述混合发酵液离心收集滤渣，60-90℃烘干，得黄姜粗提粉。
7、纯化提取：黄姜粗提粉中加入3-6倍60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。
实例1
尖孢镰刀菌SWH-3菌种从斜面或甘油管中转接至PDA斜面培养基中，28-32℃活化培养3-5天，至菌丝和孢子布满斜面。在活化斜面中加入玻璃珠和无菌水，震荡收集孢子，将尖孢镰刀菌SWH-3孢子菌悬液种转接至种子培养基中，28-32℃，150-220r/min培养3天。将1kg鲜黄姜清洗干净，切成小块后加4倍水进磨浆机中研磨15-20min，调节pH7.0。加入中温α-淀粉酶（200 U/g）和糖化酶（100 U/g），60℃反应4h。将黄姜酶解液加入发酵罐中121℃灭菌30-40分钟。冷却后接入1%种子发酵液，150-220r/min，28-32℃培养48h。在发酵完成的黄姜培养基中接入安琪酵母，静置培养24h。发酵完成后将发酵液离心，收集滤渣，60℃烘干，得黄姜粗提粉。加入3-6倍60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。
实例2
尖孢镰刀菌SWH-3菌种从斜面或甘油管中转接至PDA斜面培养基中，28-32℃活化培养3-5天，至菌丝和孢子布满斜面。在活化斜面中加入玻璃珠和无菌水，震荡收集孢子，将尖孢镰刀菌SWH-3孢子菌悬液种转接至种子培养基中，28-32℃，150-220r/min培养3天。将100kg鲜黄姜清洗干净，切成小块后加4倍水进磨浆机中研磨15-20min，调节pH7.0。加入中温α-淀粉酶（200 U/g）和糖化酶（100 U/g），60℃反应6h。将黄姜酶解液加入发酵罐中121℃灭菌30-40分钟。冷却后接入1%种子发酵液，150-220r/min，28-32℃培养72h。在发酵完成的黄姜培养基中接入安琪酵母，静置培养24h。发酵完成后将发酵液离心，收集滤渣，60℃烘干，得黄姜粗提粉。加入3-6倍60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。
实例3
尖孢镰刀菌SWH-3菌种从斜面或甘油管中转接至PDA斜面培养基中，28-32℃活化培养3-5天，至菌丝和孢子布满斜面。在活化斜面中加入玻璃珠和无菌水，震荡收集孢子，将尖孢镰刀菌SWH-3孢子菌悬液种转接至种子培养基中，28-32℃，150-220r/min培养3天。100kg黄姜干片用粉碎机粉碎后过200目筛，按照料液比1:5加水混匀，调节pH值为7.0。加入中温α-淀粉酶（200 U/g）和糖化酶（100 U/g），60℃反应6h。将黄姜酶解液加入发酵罐中121℃灭菌30-40分钟。冷却后接入1%种子发酵液，150-220r/min，28-32℃培养72h。在发酵完成的黄姜培养基中接入安琪酵母，静置培养24h。发酵完成后将发酵液离心，收集滤渣，60℃烘干，得黄姜粗提粉。加入3-6倍60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。

Claims (3)

1.一种尖孢镰刀菌Fusarium oxysporumSWH-3，保藏编号为：CCTCC NO:M 2019715，保藏在中国典型培养物保藏中心，该菌株能够高效转化黄姜皂苷为皂素。
2.如权利要求1所述的尖孢镰刀菌Fusarium oxysporumSWH-3在发酵生产黄姜皂素中的应用，其特征在于，包含以下步骤：
S1.菌种活化：将尖孢镰刀菌SWH-3菌种从斜面或甘油管中转接至PDA斜面培养基中，28-32℃活化培养3-5天，至菌丝和孢子布满斜面；
S2.种子扩大培养：在活化斜面中加入玻璃珠和无菌水，震荡收集孢子，将尖孢镰刀菌SWH-3孢子菌悬液种转接至种子培养基中，28-32℃，150-220r/min培养1-3天即得种子发酵液；
S3.黄姜原料处理：
黄姜原料包括鲜黄姜和干黄姜；
鲜黄姜处理方法：鲜黄姜清洗干净，加4倍水粉碎匀浆得鲜黄姜液；
干黄姜处理方法：黄姜干片用粉碎机粉碎后过200目筛，按照料液比1:5～1:8加水混匀得干黄姜液；
以上黄姜原料调节pH值为7.0，加入中温α-淀粉酶（200 U/g）和糖化酶（100 U/g），60℃反应4-6h；
S4.发酵：原料放入发酵罐中121℃灭菌30-40分钟,冷却后接入尖孢镰刀菌SWH-3种子发酵液，150-220 r/min，28-32℃培养48-72 h；
S5.二次发酵：在发酵完成的黄姜培养基中继续接入安琪酵母，接种量0.5-1‰，静置培养18-24 h；
S6.烘干：上述混合发酵液离心收集滤渣，60-90℃烘干，得黄姜粗提粉；
S7.纯化提取：黄姜粗提粉中加入3-6倍60-90沸程石油醚，索氏提取2-3次，合并提取液，烘干后即得黄姜皂素。
3.如权利要求2所述的尖孢镰刀菌Fusarium oxysporumSWH-3在发酵生产黄姜皂素中的应用，其特征在于：所述种子培养基组分为：10g/L黄姜粉，3g/L蔗糖，5 g/L酵母粉，3 g/LNaNO3，1g/L K2HPO4，0.5g/L MgSO4•7H2O，0.5 g/L KCl，0.01 g/L FeSO4•7H2O，pH7.0。
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