CN111617120B - 一种人参虫草发酵提取物的制备方法 - Google Patents

一种人参虫草发酵提取物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人参虫草发酵提取物的制备方法，包括：制备人参固体发酵基质；粗糙脉孢霉发酵人参；蛹虫草菌发酵人参；提取发酵产物活性成分。本发明制备方法缩短了人参固体发酵的时间，同时通过固体发酵能够促进稀有皂苷的转化，提高稀有皂苷含量。本发明制备得到的人参虫草发酵提取物具有较好的抗氧化活性。

Description

一种人参虫草发酵提取物的制备方法
技术领域
本发明公开了一种人参虫草发酵提取物的制备方法，具体地说，是一种通过真菌在人参基质上进行固体发酵的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
人参在植物分类学上属于五加科人参属，为多年生寄根植物。人参作为营养价值很高的天然物，在中医学上作为医药品使用，很多医学书中记载有人参的药效。人参的主要功能性成分是人参皂苷，人参皂苷是众多植物皂苷中特殊命名。人参成分中的皂苷有抗癌、抗糖尿病、抗抑郁、抗老化等药理性能。
根据已有的人参药理知识，目前显示药理性能的主要人参皂苷有Rg1，Rb2、Re等皂苷。但实际上，许多研究表明稀有人参皂苷的抗氧化、抗炎效果更加优异，也是发挥其抗癌、抗老化等作用的关键成分。因此，如何将常规人参皂苷转化为药理功效更好的稀有皂苷是目前许多研究者关注的方向。此外，人参中的有效成分主要包裹在植物细胞壁内，这些植物细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶质等物质构成的致密结构。在进行人参有效成分提取时，植物细胞壁会阻碍细胞内有效成分向提取溶剂扩散，导致人参有效成分提取率较低。
食药用菌是一种重要的生物资源，其种类十分丰富，在我国被用于食品和药品已有上千年的历史。食药用菌在发酵过程中可分泌蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等几十种胞外酶进入培养基，这些酶可以使植物细胞壁破裂，帮助细胞中有效成分溶出。有些胞外酶可以将发酵底物的有效成分进行转换成新的化合物。目前已有研究通过食药用菌对人参进行固体发酵将底物中的药效成分进行转换，从而提高人参中皂苷提取物的含量。然而，这些研究中使用固体发酵时的发酵时间较长，并且稀有皂苷的提取率也不高。
因此，开发一种发酵时间短，同时稀有皂苷产出率高的制备方法对于人参的推广应用非常有必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种人参虫草发酵提取物的制备方法。该制备方法是将人参作为固体发酵基质，分别将粗糙脉孢霉菌和蛹虫草菌接种于上述基质中进行发酵，最后对发酵产物进行有效成分提取制备出人参虫草发酵提取物。该方法比传统的固体发酵的时间短，同时，稀有皂苷的产出率高。
为此，本发明提供的技术方案是这样的：
一种人参虫草发酵提取物的制备方法，该方法按照如下步骤进行：
(1)制备人参固体发酵基质：将人参按照料液比1:2-1:3(g/ml)加入去离子水充分润湿5h，在110-120℃下灭菌30min后制得人参固体发酵基质；
(2)粗糙脉孢霉发酵人参：将粗糙脉孢霉菌液活化、扩增培养后得粗糙脉孢霉种子液，将种子液加入到步骤(1)中的人参固体发酵基质，在35-37℃下暗光发酵5天，粗糙脉孢霉菌灭活；
(3)蛹虫草菌发酵人参：将蛹虫草菌株经复合PDA培养基平板活化后加入复合PDA液体培养基摇床培养，制备蛹虫草液体菌种；液体菌种接种到步骤(2)的人参固体发酵基质中，在20-25℃暗光培养20天即得人参虫草发酵产物；
(4)将步骤(3)中的人参虫草发酵产物清洗干燥后粉碎，加入料液比为1:10-1:15(g/ml) 的50％乙醇，在50-60℃下提取8h后，将提取液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，洗脱至流出液近无色，再用70-95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至干后再冷冻干燥，即得人参虫草发酵提取物，该提取物为人参和蛹虫草提取物的混合物。
本发明中，所述人参可以为生晒参或者红参。可选整根人参作为发酵基质，也可以将人参切片或者粉碎作为固体发酵基质。
本发明中，优选经过浸润、清洗、分选、蒸制、晾晒、烘干等工序制备的红参。经过热处理的红参容易发生化学转换，产生特有的成分，对于稀有皂苷的提取有辅助作用。此外，人参优选来自韩国生长多年的成熟人参制备的红参，其有效成分更加充足。
本发明中，粗糙脉孢霉的活化方法为从原始菌种斜面上挑取一环，划线法接种于培养基斜面上，置于30℃培养箱中，培养3-4天，得到粗糙脉孢霉菌活化液。其中，斜面培养基为蔗糖25g，NaNO3 2g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。培养基pH 4.5，且在120℃灭菌20min。
接着，将粗糙脉孢霉菌活化液接入如下培养基：葡萄糖20g，酵母粉1.5g，KH2PO41.5g， CaCl2 0.05g，蒸馏水1000mL。培养基pH 4.5，且在120℃灭菌30-35min。在恒温30-35℃、转速300-500r/min下培养48h制得粗糙脉孢霉种子液。
优选地，粗糙脉孢霉种子液与人参固体发酵基质的液料比为1:5-1:10(ml/g)。其中，粗糙脉孢霉种子液中的活菌数为1×106-1×107个孢子/ml。
本发明中，步骤(3)中的复合PDA培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，MgSO4 2g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 1.5g，琼脂18g，水1000mL；复合PDA液体培养基为不加琼脂的复合PDA培养基配方。
将经复合PDA培养基培养的活化蛹虫草菌经打孔器打孔(直径4mm)，取3块菌块接种于复合PDA液体培养基中。在温度20-25℃，转速150-180r/min条件下摇床暗光培养5 天得蛹虫草菌液体菌种。
本发明中，优选蛹虫草菌液体菌种与人参固体发酵基质的液料比为2:5-3:5(ml/g)。该比例下的接种量能够提高人参中的稀有皂苷转换量。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
本发明通过固体发酵的方式对人参进行发酵。为了提高人参中稀有皂苷的含量，首先将人参用粗糙脉孢霉菌进行发酵，通过将活化、扩增后活性较强的粗糙脉孢霉菌接种于人参上，粗糙脉孢霉菌分泌出有利于人参发酵的酶帮助人参有效活性成分产出。再将蛹虫草菌接种于已活化的人参固体发酵基质上，通过蛹虫草菌在发酵过程中分泌的胞外酶将人参皂苷进行转化，提高人参中稀有皂苷的含量。本发明中，通过粗糙脉孢霉菌预发酵再联合蛹虫草菌固体发酵的人参能够产生的稀有皂苷含量高，同时能够缩短单一菌种固体发酵时的时间。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。对于未特别注明的工艺参数或者条件，可参照常规技术进行。本发明所用的原料可通过自制获得或商业渠道购买。其中，生晒参、红参采购自吉林加一土产有限公司；粗糙脉孢霉菌种采购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；蛹虫草菌种采购自四川省岷源高新所菌种生产中心；人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rg5、Rh4、Rk1、20R-Rg3、20S-Rg3标准品购自四川维克奇生物科技有限公司。
实施例1
粗糙脉孢霉种子液制作：将粗糙脉孢霉从原始菌种斜面上挑取一环，划线法接种于培养基斜面上，置于30℃培养箱中，培养3天，得到粗糙脉孢霉菌活化液。其中，斜面培养基为蔗糖25g，NaNO3 2g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。培养基pH 4.5，且在120℃，灭菌20min。接着，将粗糙脉孢霉菌活化液接入如下培养基：葡萄糖20g，酵母粉1.5g，KH2PO4 1.5g，CaCl2 0.05g，蒸馏水1000mL。培养基pH 4.5，且在120℃灭菌30min。在恒温30℃、转速300r/min下培养48h制得粗糙脉孢霉种子液。
蛹虫草液体菌种制作：将蛹虫草菌株经复合PDA培养基平板活化后加入复合PDA液体培养基。其中，复合PDA培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，MgSO4 2g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 1.5g，琼脂18g，水1000mL。复合PDA液体培养基为不加琼脂的复合PDA培养基配方。经复合PDA培养基培养的活化蛹虫草菌经打孔器打孔(直径4mm)，取3块菌块接种于复合PDA液体培养基中。在温度20℃，转速150r/min条件下摇床暗光培养5天得液体菌种。
按照如下方法制备人参虫草发酵提取物：
(1)制备人参固体发酵基质：将整根生晒参按照料液比1:2(g/ml)加入去离子水充分润湿5h，在110℃下灭菌30min后制得人参固体发酵基质；
(2)粗糙脉孢霉发酵人参：粗糙脉孢霉种子液加入人参固体发酵基质，其与人参固体发酵基质的液料比为1:10(ml/g)，粗糙脉孢霉种子液中的活菌数为1×107个孢子/ml。粗糙脉孢霉种子液与人参固体发酵基质在35℃下暗光发酵5天后，粗糙脉孢霉菌灭活；
(3)蛹虫草菌发酵人参：将蛹虫草液体菌种接种到步骤(2)的人参固体发酵基质中，在20℃暗光培养20天即得人参虫草发酵产物；其中，液体菌种与人参固体发酵基质的液料比为1:5(ml/g)；
(4)将步骤(3)中的人参虫草发酵产物清洗干燥后粉碎，加入料液比为1:10(g/ml)的50％乙醇，在50℃下提取8h后，将提取液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，洗脱至流出液近无色，再用95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至干后再冷冻干燥，即得人参虫草发酵提取物，该提取物为人参和蛹虫草提取物的混合物。
实施例2
粗糙脉孢霉种子液制作：将粗糙脉孢霉从原始菌种斜面上挑取一环，划线法接种于培养基斜面上，置于30℃培养箱中，培养4天，得到粗糙脉孢霉菌活化液。其中，斜面培养基为蔗糖25g，NaNO3 2g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。培养基pH 4.5，且在120℃灭菌20min。接着，将粗糙脉孢霉菌活化液接入如下培养基：葡萄糖20g，酵母粉1.5g，KH2PO4 1.5g，CaCl2 0.05g，蒸馏水1000mL。培养基pH 4.5，且在120℃灭菌35min。在恒温35℃、转速500r/min下培养48h制得粗糙脉孢霉种子液。
蛹虫草液体菌种制作：将蛹虫草菌株经复合PDA培养基平板活化后加入复合PDA液体培养基；其中，复合PDA培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，MgSO4 2g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 1.5g，琼脂18g，水1000mL；复合PDA液体培养基为不加琼脂的复合PDA培养基配方。经复合PDA培养基培养的活化蛹虫草菌经打孔器打孔(直径 4mm)，取3块菌块接种于复合PDA液体培养基中。在温度25℃，转速180r/min条件下摇床暗光培养5天得蛹虫草液体菌种。
按照如下方法制备人参虫草发酵提取物：
(1)制备人参固体发酵基质：将红参切片按照料液比1:3(g/ml)加入去离子水充分润湿5h，在120℃下灭菌30min后制得人参固体发酵基质；
(2)粗糙脉孢霉发酵人参：粗糙脉孢霉种子液加入人参固体发酵基质，其与人参固体发酵基质的液料比为1:5(ml/g)，粗糙脉孢霉种子液中的活菌数为1×106个孢子/ml。粗糙脉孢霉种子液与人参固体发酵基质在37℃下暗光发酵5天后，粗糙脉孢霉菌灭活；
(3)蛹虫草菌发酵人参：将蛹虫草液体菌种接种到步骤(2)的人参固体发酵基质中，在25℃暗光培养20天即得人参虫草发酵产物。其中，液体菌种与人参固体发酵基质的液料比为2:5(ml/g)；
(4)将步骤(3)中的人参虫草发酵产物清洗干燥后粉碎，加入料液比为1:15(g/ml)的50％乙醇，在60℃下提取8h后，将提取液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，洗脱至流出液近无色，再用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至干后再冷冻干燥，即得人参虫草发酵提取物，该提取物为人参和蛹虫草提取物的混合物。
实施例3
实施例3中的粗糙脉孢霉种子液制作、蛹虫草液体菌种制作方法与实施例2相同，人参虫草发酵提取物的制备方法与实施例2基本相同，区别在于将步骤(1)中的红参粉碎后加入去离子水润湿。此外，当进行蛹虫草菌发酵时，蛹虫草液体菌种与人参固体发酵基质的液料比为1:10(ml/g)。
实施例4
实施例4中的粗糙脉孢霉种子液制作、蛹虫草液体菌种制作方法与实施例2相同，人参虫草发酵提取物的制备方法与实施例2基本相同，区别在于将步骤(1)中的红参粉碎后加入去离子水润湿。此外，当进行蛹虫草菌发酵时，蛹虫草液体菌种与人参固体发酵基质的液料比为3:5(ml/g)。
实施例5
实施例5中的粗糙脉孢霉种子液制作、蛹虫草液体菌种制作方法与实施例2相同，人参虫草发酵提取物的制备方法与实施例2基本相同，区别在于将步骤(1)中的红参粉碎后加入去离子水润湿。此外，当进行蛹虫草菌发酵时，蛹虫草液体菌种与人参固体发酵基质的液料比为1:1(ml/g)。
对比例1
对比例1中的粗糙脉孢霉种子液制作方法与实施例4相同，人参发酵提取物的制备方法按照如下：
(1)制备人参固体发酵基质：将红参粉碎后按照料液比1:3(g/ml)加入去离子水充分润湿5h，在120℃下灭菌30min后制得人参固体发酵基质；
(2)粗糙脉孢霉发酵人参：粗糙脉孢霉种子液加入人参固体发酵基质，其与人参固体发酵基质的液料比为1:5(ml/g)，粗糙脉孢霉种子液中的活菌数为1×106个孢子/ml。粗糙脉孢霉种子液与人参固体发酵基质在37℃下暗光发酵25天后，粗糙脉孢霉菌灭活；
(3)将步骤(2)中的人参发酵产物清洗干燥后粉碎，加入料液比为1:15的50％乙醇，在60℃下提取8h后，将提取液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，洗脱至流出液近无色，再用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至干后再冷冻干燥，即得人参发酵提取物。
其中，对比例1与实施例4的区别在于延长粗糙脉孢霉菌发酵时间至25天，省略蛹虫草菌发酵人参步骤。
对比例2
对比例2中的蛹虫草液体菌种制作方法与实施例4相同，人参虫草发酵提取物的制备方法按照如下：
(1)制备人参固体发酵基质：将红参粉碎后按照料液比1:3(g/ml)加入去离子水充分润湿5h，在120℃下灭菌30min后制得人参固体发酵基质；
(2)蛹虫草菌发酵人参：将蛹虫草液体菌种接种到步骤(1)的人参固体发酵基质中，在25℃暗光培养25天即得人参虫草发酵产物。其中，液体菌种与人参固体发酵基质的液料比为3:5(ml/g)；
(3)将步骤(2)中的人参虫草发酵产物清洗干燥后粉碎，加入料液比为1:15(g/ml)的50％乙醇，在60℃下提取8h后，将提取液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，洗脱至流出液近无色，再用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至干后再冷冻干燥，即得人参虫草发酵提取物，该提取物为人参和蛹虫草提取物的混合物。
其中，对比例2与实施例4的区别在于延长蛹虫草菌发酵时间至25天，省略粗糙脉孢霉发酵人参步骤。
对比例3
对比例3中的粗糙脉孢霉种子液制作、蛹虫草液体菌种制作方法与实施例4相同，人参虫草发酵提取物的制备方法按照如下：
(1)制备人参固体发酵基质：将红参粉碎后按照料液比1:3(g/ml)加入去离子水充分润湿5h，在120℃下灭菌30min后制得人参固体发酵基质；
(2)蛹虫草菌发酵人参：将蛹虫草液体菌种接种到步骤(1)的人参固体发酵基质中，在25℃暗光培养20天即得人参虫草发酵产物。其中，液体菌种与人参固体发酵基质的液料比为3:5(ml/g)；
(3)粗糙脉孢霉发酵人参：粗糙脉孢霉种子液加入人参固体发酵基质，其与人参固体发酵基质的液料比为1:5(ml/g)，粗糙脉孢霉种子液中的活菌数为1×106个孢子/ml。粗糙脉孢霉种子液与人参固体发酵基质在37℃下暗光发酵5天后，粗糙脉孢霉菌灭活；
(4)将步骤(4)中的人参虫草发酵产物清洗干燥后粉碎，加入料液比为1:15(g/ml)的50％乙醇，在60℃下提取8h后，将提取液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，洗脱至流出液近无色，再用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至干后再冷冻干燥，即得人参虫草发酵提取物，该提取物为人参和蛹虫草提取物的混合物。
其中，对比例3与实施例4的区别在于粗糙脉孢霉和蛹虫草菌的发酵顺序改变。
对照实验组
称取与实施例4等量的红参清洗干燥后粉碎，加入料液比为1:15(g/ml)的50％乙醇，在60℃下提取8h后，将提取液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，洗脱至流出液近无色，再用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至干后再冷冻干燥，即得人参提取物。
为了更好地体现本发明制备方法的优势、本发明对于人参皂苷中化学成分变化的影响以及发酵提取物的抗氧化效果，本发明分别对菌丝生长情况、提取物中部分皂苷含量以及提取物的抗氧化性进行了分析。
1.菌丝生长情况
菌丝在人参发酵基质上的生长情况体现真菌与培养基的适应性。当菌丝生长状况越好，说明该发酵时间、温度、菌种等条件是适宜的，能够进行充分发酵，菌株对于发酵基质利用情况好。表1中为实施例和对比例发酵完后菌丝生长情况。
表1固体发酵中菌丝生长情况
长势 菌丝外观
实施例1 +++ 洁白密集
实施例2 +++ 洁白密集
实施例3 +++ 洁白密集
实施例4 +++ 洁白密集
实施例5 +++ 洁白密集
对比例1 + 淡黄稀疏
对比例2 ++ 淡黄密集
对比例3 ++ 淡黄密集
注：“+”表示菌丝长势一般，“++”表示菌丝长势较强，“+++”表示菌丝长势很强
结果显示，当人参固体发酵基质经过5天粗糙脉孢霉菌发酵，再经过20天蛹虫草菌发酵20天后，人参固体发酵基质上的菌丝均长势很强，且菌丝洁白密集。如果人参固体发酵基质只经过粗糙脉孢霉菌发酵或者蛹虫草菌发酵25天，均不能形成长势较好的菌丝，同时菌丝颜色也不够洁白。
2.发酵提取物中各种皂苷含量
为了说明本发明方法对于人参皂苷中化学成分变化的影响，通过高效液相色谱法对实施例和对比例制备的提取物皂苷成分进行定量分析。
其中，色谱柱：Kromasil 5C18(5μm，250mm×4.6mm)；流动相：乙腈(A)-水(B)；0-20min， 22％(A)，78％(B)；22-25min，22％-30％(A)，78％-70％(B)；25-45min，30％-46％(A)， 70％-54％(B)；45-55min，46％-64％(A)，54％-36％(B)；55-70min，64％-66％(A)，36％-34％(B)； 70-90min，66％-100％(A)，34％-0％(B)。柱温：25℃；检测波长：203nm；流速：1ml/min；进样量：20μl，所有组分均在90min内出完。
分别精确称取Rb1、Rg1、Re、Rg5、Rh4、Rk1、20R-Rg3、20S-Rg3皂苷标准品4.00mg 置于10mL容量瓶中，加适量乙腈溶解后稀释至刻度，摇匀后再分别使用6支试管，配置成不同浓度梯度的皂苷标准液后注入高效液相色谱，制备标准曲线。
分别精确称取0.5g实施例和对比例制备的提取物溶解于15ml容量瓶中，加适量乙腈溶解后稀释至刻度。取20μl的提取物溶液注入高效液相色谱进行分析，结果如表2所示。
表2提取物中的人参皂苷的含量(mg/g)
Rb1 Rg1 Re Rg5 Rh4 Rk1 20R-Rg3 20S-Rg3
实施例1 1.08 2.67 1.25 1.08 0.19 0.28 0.15 0.19
实施例2 0.78 1.27 1.14 1.47 0.36 0.39 0.34 0.25
实施例3 1.15 2.54 1.59 1.11 0.17 0.24 0.21 0.17
实施例4 0.64 1.57 1.08 1.86 0.25 0.32 0.29 0.34
实施例5 1.36 2.03 1.43 0.97 0.20 0.14 0.18 0.12
对比例1 2.04 3.94 1.64 0.17 0.13 0.05 0.01 0
对比例2 1.67 3.24 1.09 0.23 0.14 0 0.04 0.06
对比例3 1.78 3.51 1.42 0.13 0.12 0.01 0 0.07
对照组 2.64 4.35 1.86 0.11 0.03 0 0 0
表2结果显示，本发明方法发酵制备的人参虫草发酵提取物中的主要皂苷Rb1、Rg1、 Re的含量经过发酵后，由于发酵作用进行了皂苷转换，主要皂苷含量减少，稀有皂苷含量得到了提升，说明该发酵方法有利于稀有皂苷的转化。
3.人参虫草发酵提取物的抗氧化效果
3.1羟自由基清除能力测定
取实施例、对比例、空白组的提取物配置成1.5mg/mL的水溶液，取0.1mL的测试样品水溶液与0.1mLFeSO4(6mmol/L)和0.1mLH2O2(2.4mmol/L)混合。在室温下孵育10min 后，将混合物与0.1mL6mmol/L水杨酸在30℃温育30min，于510nm处测定吸光值。以 1.5mg/mL的VC作为阳性对照。每组实验做三个平行，最终值取三次的平均值，清除率计算公式如下：
清除率/％＝[1-(A0-A1)]/A2×100
式中：A0为样品溶液参与的反应体系的吸光值；A1：不加显色剂H2O2的体系的吸光值；A2：空白对照的吸光值(蒸馏水代替样品溶液参与反应)。
3.2DPPH·清除能力测定
取实施例、对比例、空白组的提取物配置成1.5mg/mL的水溶液，取1mL的测试样品水溶液，1mL 0.2mmol/L DPPH·溶液和2mL蒸馏水组成。将反应组合摇匀后置于25℃恒温水浴锅中避光加热反应15min，后于517nm处测定混合反应体系的吸光值(A1)。用1mL 的蒸馏水代替1mL的DPPH·溶液其余成分相同，测得样品的本底吸光值(A2)，用1mL 的蒸馏水代替1mL的样品溶液其余成分相同，测得空白吸光值(A0)。以VC作为阳性对照。每组实验做三个平行，最终值取三次值的平均值，清除率计算公式如下：
清除率/％＝[1-(A1-A2)/A0]×100
3.3抗氧化能力测试结果
本发明提取物对羟自由基、DPPH·清除能力测试结果如表3所示。从结果可以看出，经过粗糙脉孢霉预发酵人参，再用蛹虫草发酵得到的提取物由于人参稀有皂苷多，含量高，提取物羟自由基清除能力达到87.36％，DPPH·清除能力达82.47％。因此，本发明方法制得的提取物抗氧化效果优异，具有较好的应用价值。
表3人参虫草发酵提取物的抗氧化效果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_IMAGE002
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种人参虫草发酵提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法按照如下步骤进行：
(1)制备人参固体发酵基质：将人参按照料液比1:2-1:3(g/ml)加入去离子水充分润湿5h，在110-120℃下灭菌30min后制得人参固体发酵基质；
(2)粗糙脉孢霉发酵人参：将粗糙脉孢霉菌液活化、扩增培养后得粗糙脉孢霉种子液，将种子液加入到步骤(1)中的人参固体发酵基质，在35-37℃下暗光发酵5天，粗糙脉孢霉菌灭活；
(3)蛹虫草菌发酵人参：将蛹虫草菌株经复合PDA培养基平板活化后加入复合PDA液体培养基摇床培养，制备蛹虫草液体菌种；液体菌种接种到步骤(2)的人参固体发酵基质中，在20-25℃暗光培养20天即得人参虫草发酵产物；
(4)将步骤(3)中的人参虫草发酵产物清洗干燥后粉碎，加入料液比为1:10-1:15(g/ml)的50％乙醇，在50-60℃下提取8h后，将提取液通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，洗脱至流出液近无色，再用70-95％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，将洗脱液减压浓缩至干后再冷冻干燥，即得人参虫草发酵提取物，该提取物为人参和蛹虫草提取物的混合物。
2.根据权利要求1所述的人参虫草发酵提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中粗糙脉孢霉种子液中的活菌数为1×106-1×107个孢子/ml。
3.根据权利要求1所述的人参虫草发酵提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中粗糙脉孢霉种子液与人参固体发酵基质的液料比为1:5-1:10(ml/g)。
4.根据权利要求1所述的人参虫草发酵提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中粗糙脉孢霉活化时的斜面培养基为蔗糖25g，NaNO32g，MgSO40.5g，KCl 0.5g，FeSO40.01g，K2HPO41g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；粗糙脉孢霉的扩增培养基为葡萄糖20g，酵母粉1.5g，KH2PO41.5g，CaCl20.05g，蒸馏水1000mL。
5.根据权利要求1所述的人参虫草发酵提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中蛹虫草菌的摇床培养温度20-25℃，转速控制在150-180r/min。
6.根据权利要求1所述的人参虫草发酵提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中蛹虫草液体菌种与人参固体发酵基质的液料比为2:5-3:5(ml/g)。
7.根据权利要求1所述的人参虫草发酵提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中复合PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，MgSO42g，K2HPO41.5g，KH2PO41.5g，琼脂18g，水1000mL；复合PDA液体培养基为不加琼脂的复合PDA培养基配方。
8.根据权利要求1所述的人参虫草发酵提取物的制备方法，其特征在于，所述人参为生晒参、红参中一种。
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