WO2023282655A1 - 수면 촉진 및 개선용 조성물 및 이를 포함하는 음료와 그 제조 방법 - Google Patents

수면 촉진 및 개선용 조성물 및 이를 포함하는 음료와 그 제조 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for promoting and improving sleep, and more particularly, to a beverage containing the composition for promoting and improving sleep and a method for producing the same.
  • Antidepressants with sedative action such as benzodiazepines, non-benzodiazepines, or benzodiazepine receptor agonists, are commonly prescribed as sleeping pills.
  • these drugs have a problem in that tolerance and dependence are formed during long-term use, which causes difficulties in daily life, and may additionally be a risk factor for developing other diseases such as cognitive impairment or depression.
  • the present inventors studied whether the lactobacillus fermented sanzoin extract could be used to promote and improve sleep, and increased the content of spinosin related to the sleep promotion and improvement effect in the lactic acid bacteria fermented sanzoin extract of the present invention, and the It was confirmed that the increase in the content was confirmed, and the mixed fermented beverage prepared by additionally mixing hop extract, L-theanine, magnesium, etc. to the lactic acid bacteria fermented sanzoin extract of the present invention has an excellent sleep promotion and improvement effect.
  • the present invention was completed by experimentally verifying and confirming it.
  • an object of the present invention is to provide a composition for promoting and improving sleep containing a fermented product of lactic acid bacteria for sanjoin extract as an active ingredient and a beverage containing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a composition for promoting and improving sleep.
  • Another object of the present invention is to provide a food for promoting and improving sleep containing the composition for promoting and improving sleep.
  • the present invention provides a composition for promoting and improving sleep comprising a lactic acid bacteria fermented product of sanzoin extract as an active ingredient.
  • the lactic acid bacteria are Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei and Lactobacillus ra It may include one or more lactic acid bacteria selected from the group consisting of Lactococcus lactis.
  • the composition may have increased spinosyn and glycine contents compared to before the lactic acid bacteria fermentation treatment.
  • the spinosyn content may be increased by 5% or more compared to before lactic acid bacteria fermentation, or the glycine content may be increased by 10% or more compared to before lactic acid bacteria fermentation.
  • the spinosyn content may preferably be increased by 7% or more, more preferably by 10% or more.
  • the glycine content may preferably be increased by 13% or more, more preferably by 15% or more.
  • the extract may be extracted using water including purified water, an organic solvent, or a mixture thereof as an extraction solvent.
  • the organic solvent may be selected from the group consisting of C1-C4 alcohol, hexane (n-hexane), ether, glycerol, propylene glycol, butylene glycol, ethyl acetate and methyl acetate, but is not limited thereto , It is preferable to use ethanol or methanol as the C1-C4 alcohol, but it is not limited thereto.
  • a method for preparing the composition for promoting and improving sleep comprising the following steps:
  • step (b) sterilizing the liquid sanzoin extract obtained in step (a);
  • step (c) fermenting by inoculating lactic acid bacteria into the liquid sanzoin extract sterilized in step (b).
  • step (a) extracting the roasted acid join with an extraction solvent, filtering, powdering through spray drying, and diluting it in purified water.
  • a drink for promoting and improving sleep containing the composition for promoting and improving sleep is provided.
  • composition for promoting and improving sleep proposed in the present invention When the composition for promoting and improving sleep proposed in the present invention is used, excellent sleep promoting and improving effects can be expected even when prepared in the form of food or beverage, and sufficient effects can be expected simply by simply taking it.
  • composition for promoting and improving sleep proposed in the present invention does not contain special chemical components and uses natural extracts, and has the advantage of being safe to take without any concerns about side effects, tolerance, or dependence.
  • the manufacturing method proposed in the present invention and the composition for promoting and improving sleep using the same have a much higher effect than some precedents that have previously attempted to promote sleep using similar raw materials due to the specificity of the processing method. can be expected
  • Figure 1 shows the results of HPLC analysis of the content of each type of amino acid in the sanzoin extract before fermentation by the lactic acid bacteria of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of HPLC analysis of the content of each type of amino acid in the sanzoin extract fermented for 12 hours by the lactic acid bacteria of the present invention.
  • Figure 3 shows the results of HPLC analysis of the content of each type of amino acid in the sanzoin extract fermented for 24 hours by the lactic acid bacteria of the present invention.
  • Figure 4 shows the results of HPLC analysis of the content of each type of amino acid in the sanzoin extract fermented for 48 hours by the lactic acid bacteria of the present invention.
  • Zizyphus Seed is a seed of Zizyphus jujuba Miller var.spinosa Hu ex H.F. Chou of the Rhamnaceae family. It has a flat round or oval shape, 5-9 mm long, 5-7 mm wide, and 3 mm thick. It is a natural material with a reddish purple or purple brown color, flat on one side and protruded on the other side, with one raised vertical line in the middle. One end has a concave, linear umbilical point, and the other end has a small protruding junction.
  • the pharmacological activities of sanzoin include anti-inflammatory action, hepatoprotective action, memory improvement and anti-anxiety action, gastritis/gastric ulcer antioxidant action, and anticancer action.
  • sanzoin there is a pharmacological effect on the central nervous system, and a significant decrease in endurance time was confirmed in the rota-rod test, and a significant onset time ( It is a substance that has been confirmed to reduce the onset time).
  • the ingredients of Sanjoin include jujuboside A, jujuboside A2, jujuboside B, betulin, betulinic acid, and spinosin. , isospinosin, nicotiflorin, 6"'-p-coumaroylspinosin, hovetricoside C, doucosterol ( daucosterol), butyl ⁇ -D-fructofuranoside, magnoflorine, zizyphus saponin III, ursolic acid, pomolic acid ), adenosine, and alphitolic acid.
  • the active index components of sanzoin can usually be set to spinosin, betulinic acid, and jujuboside A.
  • spinosin Considering only the action on the central nervous system, it is known that it is okay to use only the flavonoid C-glycoside, spinosin, as an indicator component (Source: Ministry of Food and Drug Safety, Food and Drug Safety Evaluation Institute, Herbal Medicine Research Institute). .
  • sanjoin has been mainly used as a herbal medicine and contains fatty oil (about 31.8%).
  • fermentation refers to a metabolic process in which chemical changes occur in organic matter by enzyme action. Through the process of fermentation, various properties that did not exist in the raw material and new substances are created. Functions of fermented foods include increasing digestibility, increasing water-soluble protein, increasing bioavailability, increasing antioxidant activity, synthesizing nutrients, and improving immune function. Special physiological functions can be expected from low-molecular substances that can be obtained through fermentation.
  • the inventors of the present invention confirmed that the effect of promoting and improving sleep was improved when the material extracted from sanzoin was fermented using lactic acid bacteria, and completed the present invention. Specifically, in the lactic acid bacteria-fermented sanzoin extract proposed in the Examples of the present invention, an increase in the content of spinosin and glycine related to sleep promotion and improvement was confirmed.
  • the inventors of the present invention have prepared a mixed fermented beverage by further mixing lactic acid bacteria fermented sanzoin extract with hop extract, L-theanine, magnesium, etc., more excellent sleep promotion and improvement effect was confirmed.
  • Spinosin is known as an activity index component of representative sanzoin acting on the central nervous system. According to one embodiment of the present invention, the content of spinosin is increased through lactic acid bacteria fermentation of the sanzoin extract, and when this is used, excellent sleep promotion and improvement effects can be expected.
  • Spinosyn represented by Formula 1 can be obtained from various types of herbal medicines.
  • the spinosyn is Zizyphus jujuba Mill var. inermis, Zizyphus jujuba Mill var. hoonensis, Zizyphus jujuba Mill var.
  • spinosa Passiflora edulis flavicarpa, Cayaponia tayuya, Desmodium tortuosum, Wilbrandia ebracteata, Strophioblachia fimbricalyx, Clutia abyssinica, Saccharopolyspora spinosa or mixtures thereof, preferably Zizyphus jujuba Mill var as proposed in one embodiment of the present invention . It can be obtained from Sanjoin, a seed of spinosa.
  • a commercially available spinosyn component may be purchased, further added according to the required content, and then lactic acid bacteria fermentation may be performed.
  • the spinosyn is a component included in the herbal medicines described above, and is a natural substance, and can realize an intended sleep improvement effect without side effects on the human body.
  • Glycine is known as the only substance that does not have an asymmetric carbon atom among amino acids.
  • the glycine is also called glycocoll or aminoacetic acid and can be extracted from protein hydrolysates.
  • the amount of glycine synthesized in the human body is limited to about 2.5 g per day, and the insufficient portion must be consumed through external food.
  • Glycine is effective in improving sleep, obsessive-compulsive disorder, schizophrenia, and stroke recovery, and specifically, it can mediate inhibition of muscle movement during REM (rapid eye movement) sleep.
  • the extract may be extracted by using water, ethanol, or a mixture thereof as an extraction solvent.
  • extract refers to a substance extracted or separated from a raw material by any method, and includes without limitation an extract extracted from a raw material, a concentrate obtained therefrom, and a dried product and powder of the concentrate.
  • the extract may be obtained through all known extraction methods such as hot water extraction, solvent extraction, cold extraction, reflux extraction, and ultrasonic extraction, but is not limited thereto.
  • the sanzoin extract may be prepared in a powder state by an additional process such as concentration under reduced pressure and freeze drying or spray drying.
  • the sanzoin extract of the present invention can be prepared according to a conventional method known in the art, that is, under conventional conditions of temperature and pressure, using a conventional solvent.
  • the "fermented product” may be used in the form of a fermentation broth obtained by culturing lactic acid bacteria in a sanjoin extract, a concentrated fermentation broth, a dried fermentation broth, a fermentation filtrate, a concentrated fermentation filtrate, or a dried fermentation filtrate. It may be a fermentation filtrate containing or removing lactic acid bacteria after fermentation.
  • the formulation of the fermented product is not limited, and may be, for example, liquid or solid.
  • the composition using the sanzoin extract may further include at least one of hops (humulus lupulus) extract, L-theanine and magnesium.
  • the mixed fermented beverage prepared by additionally mixing the lactic acid bacteria fermented sanzoin extract with hop extract, L-theanine and magnesium, etc. sleep promotion and improvement It can be usefully used in various health processed foods that can help.
  • the hop (humulus lupulus) is a plant of the genus Hemp and Hansam vine with a length of 6 to 12 m and is distributed in Europe and Asia. It is mainly used as a raw material for beer and has been cultivated in Germany since the late 8th century. It was found that hops have a hypnotic effect on the fact that hop harvesters induce drowsiness during work, and German committee E allowed hops to be used as a treatment for neurosis and insomnia.
  • alpha-bitteracid humulones
  • beta acids ⁇ -acid, lupulones
  • xanthohumol binds to GABA receptors.
  • the L-theanine is mainly contained in foods such as green tea, black tea, and mushrooms, and is a safe functional raw material recognized by the Food and Drug Administration and the FDA. As a result of clinical trial studies, the effect of relieving tension caused by stress has been proven. Its mechanism of action is known to inhibit glutamate, an excitatory signal transduction system, and to increase the generation of brain waves ( ⁇ waves) in a state of mental relaxation.
  • the magnesium is called a natural sedative and acts to calm the excitement of the mind as an anti-stress mineral. It is also a cofactor of more than 300 enzyme systems, acts to relax muscles, and is a necessary nutrient for GABA production.
  • composition for promoting and improving sleep of the present invention further contains at least one of the hops (humulus lupulus) extract, L-theanine and magnesium to prepare various health processed foods with better sleep promoting and improving effects can do.
  • Foods containing the composition of the present invention include, for example, various foods, beverages, gum, tea, vitamin complexes, health supplements, etc., and can be used in the form of powders, granules, tablets, capsules or beverages.
  • the food of the present invention may contain additives such as food-acceptable food additives, such as natural carbohydrates and various flavoring agents, as additional components.
  • Examples of the natural carbohydrate include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • flavoring agent natural flavoring agents such as stevia such as thaumatin, rebaudioside A or glycyrrhizin, and synthetic flavoring agents such as saccharin and aspartame may be used.
  • the embodiments of the food proposed in the present invention include various nutrients, vitamins, minerals, flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and enhancers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids , protective colloidal thickener, pH adjusting agent, stabilizer, preservative, glycerin, alcohol, carbonating agent used in carbonated beverages, and the like.
  • the food of the present invention may contain fruit flesh for production of natural fruit juice, fruit juice beverage, vegetable beverage, and the like. These components may be used independently or in combination.
  • ′′%′′ used to indicate the concentration of a particular substance is (weight/weight) % for solids/solids, (weight/volume) % for solids/liquids, and Liquid/liquid is (volume/volume) %.
  • the liquid phase was filtered once more with a 0.45 ⁇ m PVDF filter, and the solid phase was left using a Speed Vac, followed by reconstitution with MeOH, filtered once more with a 0.45 ⁇ m PVDF filter, and analyzed through LC-MS.
  • the analysis conditions of LC-MS used for analysis are as follows.
  • Step 1 Preparation of Sanjoinin Extract (Examples 1 to 3)
  • the roasted sanzoin was extracted at room temperature in a mixed solvent condition of water and ethanol.
  • the extract was filtered, powdered by spray drying, and diluted in purified water at a concentration of 25% to obtain a liquid sanzoin extract.
  • Step 2 Sterilization of Sanjoin or Sanjoin Extract
  • the liquid sanzoin extract obtained in step 1 was sterilized at a temperature of 100° C. or higher for several minutes.
  • Step 3 Lactobacillus culture step
  • Lactobacillus plantarum Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei and Lactococcus lactis, respectively, at a temperature of 100 ° C or higher It was inoculated into a sterilized MRS medium for several minutes and incubated for several hours at a temperature slightly higher than room temperature. It was washed twice with PBS buffer using centrifugation (4°C, 20000 rpm, 15 minutes).
  • Step 4 Preparation of Sanjoin Extract Fermented with Lactic Acid Bacteria
  • Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei and Lactococcus lactis washed in step 3 above After dissolving in purified water and mixing to prepare a mixture of lactic acid bacteria, inoculate the mixture of lactic acid bacteria at 1% compared to the sanjoin extract sterilized in step 2, and ferment at a temperature slightly higher than room temperature for 12 hours or more to obtain fermented sanjoin extract with lactic acid bacteria manufactured. Then, while increasing the fermentation time, samples of the lactic acid bacteria-fermented sanzoin extract were collected and analyzed according to the fermentation time.
  • Dionex Ultimate 3000 (Thremo Dionex, USA) was used as the HPLC analysis condition for the content of each type of amino acid, including glycine, and the column was an Inno C-18 column (Youngjinbiochrom, Koera 4.6*250, 5 um) , the temperature of the column was 40 °C, and the injection volume was 0.5 ⁇ L.
  • the mobile phase a mixture of 40 mM sodium phosphate, acetonitrile, and methanol was used, and each was detected at 266 to 450 nm (FIGS. 1 to 4).
  • the lactic acid bacteria fermented Sanjoin extract of the present invention showed an increase in the content of glycine related to sleep promotion and improvement compared to the Sanjoin extract before fermentation.
  • the active oxygen scavenging rate was measured using the DPPH test method.
  • Fermentation time (hr) 0 12 24 48 mean 52.04819 51.16466 48.59438 53.25301 standard deviation (stdev) 0.481928 1.452461 0.139121 0.417362
  • Total polyphenol content was measured according to the Folin-Denis method (Folin O. and Denis W., 1912, J Biol chem. 12:239-249). 75 ⁇ L of methanol and 25 ⁇ L of Folin-Ciocalteu phenol reagent were added to 25 ⁇ L of the sample diluted in methanol, reacted at room temperature for 6 minutes, and 100 ⁇ L of saturated solution Na 2 Co 3 was added. After adding and mixing, the absorbance was measured at 765 nm after being allowed to stand at room temperature for 90 minutes. A standard calibration curve was prepared using gallic acid as a standard material, and the total polyphenol content of the extract was expressed as ⁇ g GAE (gallic acid equivalent)/mL.
  • Standard materials were prepared and treated with gallic acid at 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50 and 100 mg/mL, respectively, and then a standard curve was created to show the relationship between absorbance and concentration, and lactic acid bacteria fermented by fermentation time conditions
  • the total polyphenol content of the sanzoin extract is shown in Table 5 below.
  • the total polyphenol content was increased in the Sanjoin extract fermented with lactic acid bacteria for 48 hours compared to the Sanjoin extract before fermentation.
  • Hop extract, L-theanine, magnesium, glycine, and other additives for food and beverages were added to the fermented product of sanzoin raw material or sanzoin extract obtained by the lactic acid bacteria fermentation process of the present invention, and a fermented beverage was prepared.
  • a control beverage was prepared by mixing 1 mg of synthetic fruit flavor and 3 g of sweetener with 110 mL of purified water.
  • the experimental group beverage refers to a mixed fermented beverage containing the Sanzoin extract fermented with lactic acid bacteria for 48 hours in the above Preparation Example.
  • Group 1 consumed 110 mL of a mixed fermented beverage (experimental group beverage) containing the Sanjoin extract fermented with lactic acid bacteria prepared according to the above-described example, 30 minutes before going to bed for a week.
  • Group 2 consumed the control drink first for a week, and then for a week thereafter, a mixed fermented drink containing the lactic acid bacteria fermented Sanjoin extract (experimental group drink) Ingested. It was designed so that the evaluator could not know what the experimental group drink was, and a daily sleep diary was recorded and questions and answers about the effect of sound sleep were conducted on a weekly basis. The questions and answers were evaluated by simply filling out a questionnaire reflecting the Korean version of the Pittsburgh Sleep Quality Index (PSQI-K), which is generally used as a criterion for evaluating sleep disorders, and the results are shown in Tables 6 to 10 below.
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Abstract

본 발명은 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 산조인 추출물은 유산균 발효를 통해서 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 스피노신(spinosin)의 함량 증대 및 글리신(glycine)의 함량 증대가 나타났다. 또한, 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에 홉추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘 등을 추가로 혼합하여 제조한 혼합 발효음료에 의한 우수한 수면 촉진 및 개선 효과를 확인함으로써, 수면 촉진 및 개선에 도움을 줄 수 있는 다양한 건강가공식품에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

수면 촉진 및 개선용 조성물 및 이를 포함하는 음료와 그 제조 방법
본 발명은 수면 촉진 및 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 수면 촉진 및 개선용 조성물을 포함하는 음료와 그 제조방법에 관한 것이다.
국민건강보험공단 자료에 따르면 국내 수면장애 환자가 2014년부터 2018년 연평균 8%의 증가세를 보이고 있으며 2019년은 13%의 증가세로 수면장애 진료환자만 64만명에 달하고 있다. 2020년 코로나 19 사태로 인한 스트레스와 불안 등 정신적 요인과 더불어 생활패턴의 변화, 활동량 감소로 수면 장애 환자 문제는 급속한 증가세를 보이고 있다.
수면제로는 흔히 벤조디아제핀(benzodiazepine) 계열의 약물, 비-벤조디아제핀(non-benzodiazepine) 계열의 약물 또는 벤조디아제핀 수용체 작용제(benzodiazepine receptor agonists)와 같은 진정작용이 있는 항우울약이 처방된다. 하지만 이러한 약물들은 장기간 사용 시 내성, 의존성이 형성되어 일상생활에 어려움을 호소하게 되는 문제점이 있으며, 추가적으로 인지적 장애나 우울 등 다른 질병을 발생시키는 위험요인이 되기도 한다.
따라서, 많은 이들이 수면문제를 경험함에도 불구하고 부작용과 내성, 의존성 등에 대한 우려로 관련 솔루션을 취하지 못하고 있다. 급성불면증 환자의 약 40%가 만성불면증으로 전환되기에 수면문제는 조기진단과 대처가 중요하며, 부작용, 내성, 의존성에 대한 우려가 없는 천연 수면 솔루션을 개발하는 것이 시급한 실정이다.
본 발명자들은 수면 촉진 및 개선에 유산균 발효된 산조인 추출물을 사용할 수 있는지 연구하였고, 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에서 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 스피노신(spinosin)의 함량 증대, 글리신(glycine)의 함량 증대를 확인하였으며, 또한 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에 홉추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘 등을 추가로 혼합하여 제조한 혼합 발효음료에 의한 우수한 수면 촉진 및 개선 효과을 가짐을 실험적으로 입증 및 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물과 그를 포함하는 음료를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 수면 촉진 및 개선용 조성물의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 수면 촉진 및 개선용 조성물을 포함하는 수면 촉진 및 개선용 식품을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 유산균은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토코커스 라티스(Lactococcus lactis)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균인 것을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 유산균 발효 처리 전과 비교하여 스피노신 및 글리신 함량이 증가한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 스피노신 함량은 유산균 발효 처리 전과 비교하여 5% 이상 증가한 것이거나, 상기 글리신 함량은 유산균 발효 처리 전과 비교하여 10% 이상 증가한 것일 수 있다.
상기 스피노신 함량은 바람직하게는 7% 이상 증가한 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 10% 이상 증가한 것일 수 있다. 상기 글리신 함량은 바람직하게는 13% 이상 증가한 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 15% 이상 증가한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출될 수 있다.
본 발명에서, 상기 유기용매는 C1-C4의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 상기 C1-C4의 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 상기 수면 촉진 및 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) 볶은 산조인을 추출용매로 추출하여 액상 산조인 추출물을 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 수득한 액상 산조인 추출물을 멸균하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 멸균한 액상 산조인 추출물에 유산균을 접종하여 발효하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (a)에서, 볶은 산조인을 추출용매로 추출한 후 필터링(filtering)하여 분무 건조(spray drying)를 통해 분말화하여 이를 정제수에 희석시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 수면 촉진 및 개선용 조성물을 포함하는 수면 촉진 및 개선용 음료를 제공한다.
본 발명에서 제안하는 수면 촉진 및 개선용 조성물을 이용할 경우, 식품이나 음료 형태로 제조한 상태에서도 우수한 수면 촉진 및 개선 효과를 기대할 수 있어, 단순히 단순히 복용하는 것만으로도 충분히 효과를 기대할 수 있다.
나아가, 본 발명에서 제안하는 수면 촉진 및 개선용 조성물은 특별한 화학성분을 포함하지 않고 천연추출물을 이용한 것으로서, 부작용, 내성, 의존성에 대한 우려가 전혀 없이 안전하게 복용 가능한 장점이 있다.
또한, 본 발명에서 제안하는 제조방법과 그를 이용한 수면 촉진 및 개선용 조성물은, 그 가공방법의 특수성으로 인하여 기존에 유사한 원재료를 사용하여 수면을 촉진하려 시도하였던 일부 선례들에 비하여 훨씬 더 높은 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 본 발명의 유산균에 의한 발효 전 산조인 추출물의 아미노산 종류별 함량에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 유산균에 의한 12시간 발효된 산조인 추출물의 아미노산 종류별 함량에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 유산균에 의한 24시간 발효된 산조인 추출물의 아미노산 종류별 함량에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 유산균에 의한 48시간 발효된 산조인 추출물의 아미노산 종류별 함량에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
이하, 본 발명에서 중요한 하나의 성분으로 이용되는 산조인과 그 추출물에 대하여 설명하면서, 본 발명에서 제안하는 구체적인 실시예들을 설명한다.
산조인(Zizyphus Seed)는 갈매나무과(Rhamnaceae)의 산조(Zizyphus jujuba Miller var.spinosa Hu ex H. F. Chou)의 씨이다. 납작한 원형 또는 타원형을 띄며, 길이 5~9 mm, 폭 5~7 mm, 두께 3 mm이다. 적자색 혹은 자갈색을 띄며, 한쪽면은 평탄하고 다른 면은 돌기되어 있으며 중간에는 1 줄의 융기한 세로 줄 무늬가 있는 천연 물질이다. 한쪽 끝은 오목하고 선형인 배꼽점이 있고, 다른 끝에는 튀어나온 작은 합점이 있다.
산조인의 약리활성은 항염증 작용, 간보호 작용, 기억력 개선 및 항불안 활성 작용, 위염/위 궤양의 항산화 작용, 항암작용을 한다. 또한 중추신경 약리 효능이 있으며, 로타로드 테스트(rota-rod test)에서 유의성 있게 지구력 시간 (endurance time) 감소가 확인되었고, 티오펜탈 나트륨(thiopental sodium)으로 유도된 수면 실험에서 유의성 있게 개시시간(onset time)을 감소시킴이 확인된 물질이다.
산조인의 성분으로는 주주보사이드 A (jujuboside A), 주주보사이드 A2 (jujuboside A2), 주주보사이드 B (jujuboside B), 베툴린(betulin), 베툴린산 (betulinic acid), 스피노신(spinosin), 이소스피노신(isospinosin), 니코티플로린(nicotiflorin), 6"'-p-쿠마로일스피노신(6"'-p-coumaroylspinosin), 호베트리코사이드 C (hovetrichoside C), 다우코스테롤(daucosterol), 부틸 β-D-프룩토푸라노사이드(butyl β-D-fructofuranoside), 마그노플로린 (magnoflorine), 지지푸스 사포닌 Ⅲ (zizyphus saponin Ⅲ), 우르솔산(ursolic acid), 포몰산(pomolic acid), 아데노신(adenosine), 알피톨산(alphitolic acid) 등이 있다.
또한, 기존 효능연구 및 성분연구의 결과로 통상적으로 산조인의 활성지표성분은 스피노신(spinosin), 베툴린산(betulinic acid), 주주보사이드 A (jujuboside A)로 설정할 수 있다. 중추신경계에 대한 작용만을 고려한다면, 플라보노이드 C-글리코사이드(flavonoid C-glycoside)인 스피노신(spinosin)만을 지표성분으로 삼아도 무방하다고 알려져 있다(출처: 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 생약연구원).
산조인은 앞서 언급한 바와 같이, 주로 한약재로 사용되어 왔으며 지방유(약 31.8%)를 함유하고 있다.
그러나, 이와 같은 산조인은 특성상 약한 기름 냄새와 특이한 산미를 포함하여 섭취 시 불쾌함을 호소하는 사람들이 있어 기능성 성분을 유지 또는 향상함과 동시에 소비자 기호에 맞는 음료로의 가공방법 개발이 필요한 실정이었다.
기존에는 이러한 문제의 보완책으로 단맛을 띄는 용안육, 감초와 같은 한약재를 함께 달여 음용하도록 유도하였으나, 이는 일반인이 한약재 활용 식품에 대해 가지고 있는 통상적인 맛에 대한 인식을 벗어나지 못하는 상황이었고 식품으로서의 상용화를 저해하는 요인이 되어 왔다.
한편, 발효(fermentation)란 효소작용에 의하여 유기물에서 화학적 변화가 일어나는 대사과정을 말한다. 발효라는 공정을 통하여 원재료에 존재하지 않았던 여러 특성들과, 새로운 물질들의 생성이 이루어지게 된다. 발효식품의 기능으로는 소화성 증대, 수용성 단백질 증가, 생체이용률(bioavailability) 증가, 항산화 활성의 증가, 영양성분의 합성 및 면역기능의 개선등이 있다. 발효를 통해 획득할 수 있는 저분자 물질들로부터 특수한 생리적 기능을 기대할 수 있다.
본 발명자들은, 산조인으로부터 추출된 물질을 유산균을 이용하여 발효할 경우 수면 촉진 및 개선 효과가 향상됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 구체적으로는 본 발명의 실시예에서 제안하는 유산균 발효된 산조인 추출물에서는, 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 스피노신(spinosin)의 함량 증대, 글리신(glycine)의 함량 증대가 확인되었다.
또한 본 발명자들은 또 다른 실시예에서, 유산균 발효된 산조인 추출물에 홉추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘 등을 추가로 혼합하여 혼합 발효음료를 제조할 경우, 더욱 우수한 수면 촉진 및 개선 효과를 확인였다.
본 발명의 일 실시예에 따르는 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물에서는 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 (i) 스피노신(spinosin)의 함량 증대 및 (ii) 글리신(glycine)의 함량 증대가 확인되었다.
(i) 스피노신(spinosin)은 중추신경계에 작용하는 대표적인 산조인의 활성지표성분으로 알려져 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 산조인 추출물에 대한 유산균 발효를 통하여 스피노신(spinosin)의 함량을 증대시키고, 이를 이용하면 우수한 수면 촉진 및 개선 효과를 기대할 수 있다.
스피노신(spinosin, 6-(2-O-beta-D-Glocopyranosyl-beta-D-glucopyranosyl)-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-7-methoxy-4H-1-benzopyran-4-one)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022009833-appb-img-000001
상기 화학식 1로 표시되는 스피노신은 다양한 종류의 생약으로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 상기 스피노신은 Zizyphus jujuba Mill var. inermis, Zizyphus jujuba Mill var. hoonensis, Zizyphus jujuba Mill var. spinosa, Passiflora edulis flavicarpa, Cayaponia tayuya, Desmodium tortuosum, Wilbrandia ebracteata, Strophioblachia fimbricalyx, Clutia abyssinica, Saccharopolyspora spinosa 또는 이들의 혼합물로부터 수득될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 일 실시예에서 제안하는 것처럼 Zizyphus jujuba Mill var. spinosa의 씨(seed)인 산조인으로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 산조인 추출물 성분 외에, 상기 스피노신을 포함하는 다른 생약 성분 중 하나 이상으로부터 추출물을 추가적으로 확보한 후, 유산균으로 발효를 시도할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에서 이용하는 산조인 추출물에는 시중에 판매되는 스피노신 성분을 구입하여, 필요 함량에 맞추어 더 추가한 후 유산균 발효를 진행할 수도 있다. 상기 스피노신은 위에서 설명한 생약들에 포함된 성분으로서, 천연물질이며 인체 부작용 없이 의도한 수면 개선 효과를 구현할 수 있다.
(ii) 글리신(glycine)은 아미노산 중 비대칭 탄소원자를 가지지 않은 유일한 물질로 알려져 있다. 상기 글리신은 글리코콜(glycocoll) 또는 아미노아세트산이라고도 하며 단백질의 가수분해물에서 추출할 수 있다.
인체에서 합성되는 글리신의 양은 매일 약 2.5 g으로 제한되어 있는데, 부족한 부분은 외부 식품을 통하여 섭취해야 한다. 글리신은 수면개선, 강박증, 정신분열증, 뇌졸중 회복에 효과가 있으며, 구체적으로는 렘(rapid eye movement, REM) 수면 동안 근육움직임의 억제를 매개할 수 있다.
본 발명에서 제안하는 산조인 추출 성분에 대한 유산균 발효물에서는 글리신(glycine)의 함량 또한 증대되는 것이 확인되었으며, 앞서 설명한 스피노신의 함량 증대와 함께 작용하여 수면 촉진 및 개선 효과를 기대할 수 있다. 또한, 부가적으로 항산화능의 증대 및 폴리페놀 함량의 증대도 확인되어 다양한 건강 보조식품으로서의 활용가능성을 기대할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이의 혼합물을 추출용매로 하여 추출되는 것일 수 있다.
본 발명에서 "추출물"은 원료로부터 임의의 방법으로 추출 또는 분리해 낸 물질을 말하며, 원료로부터 추출된 추출액, 이로부터 얻을 수 있는 농축액, 상기 농축액의 건조물 및 분말을 제한없이 모두 포함하는 의미이다. 상기 추출물은 열수 추출법, 용매 추출법, 냉침 추출법, 환류 추출법 및 초음파 추출법 등 종래 알려진 모든 추출 방법을 통해 수득될 수 있으며, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에 있어서, 산조인 추출물은 감압 농축 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 산조인 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 "발효물"은 산조인 추출물에서 유산균을 배양하여 수득한 발효액, 농축 발효액, 발효액의 건조물, 발효 여과액, 농축 발효 여과액, 또는 발효 여과액의 건조물의 형태로 이용할 수 있으며, 상기 유산균을 포함하는 것 또는 발효한 후 유산균을 제거한 발효 여액일 수 있다. 또한 상기 발효물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체, 또는 고체일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 산조인 추출물을 이용한 조성물에 홉(humulus lupulus)추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에 홉추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘 등을 추가로 혼합하여 제조한 혼합 발효음료에 의한 우수한 수면 촉진 및 개선 효과를 확인함으로써, 수면 촉진 및 개선에 도움을 줄 수 있는 다양한 건강가공식품에 유용하게 활용될 수 있다.
상기 홉(humulus lupulus)은 길이 6~12 m의 삼과 한삼덩굴속의 식물로 유럽과 아시아 등지에 분포한다. 맥주의 원료로 주로 사용되며 8세기 후반부터 독일 등지에서 재배되기 시작했다. 홉 수확자들이 작업 중 졸음이 유발된다는 점에서 착안되어 최면작용이 있음이 밝혀졌으며 독일 위원회 E는 홉을 신경증, 불면증 치료로 사용을 허용했다. 홉의 주요 활성 성분 중에서 알파 고미산(α-bitteracid, humulones) 및 베타산(β-acid, lupulones)이 진정효과와 항우울효과를 발생시키며, 잔토휴몰(xanthohumol)이 GABA 수용체에 결합한다고 알려져 있다.
상기 L-테아닌(L-theanine)은 주로 녹차, 홍차, 버섯 등의 식품에 포함되어 있으며 식약청과 FDA가 인정한 안전한 기능성 원료이다. 임상시험 연구결과, 스트레스로 인한 긴장 완화효과가 입증되었다. 그 작용기전은 흥분성 신호 전달체계인 글루타메이트(glutamate)를 억제시키고, 정신적 이완 상태의 뇌파(α파) 발생 증가로 알려져 있다.
상기 마그네슘은 천연 진정제라 불리며 항 스트레스 무기질로 정신의 흥분을 가라앉히는 작용을 한다. 300종 이상의 효소체계의 보조인자(cofactor)이기도 하며 근육을 이완시키는 작용을 하고, GABA 생성 필요 영양소이기도 하다.
본 발명의 수면 촉진 및 개선용 조성물에 상기 홉(humulus lupulus)추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘 중 하나 이상을 더 포함하여 보다 우수한 수면 촉진 및 개선 효과가 있는 다양한 건강가공식품을 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 식품은 필수 성분으로서 상기 수면 촉진 및 개선용 조성물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클 로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제안하는 식품의 실시예들에는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 ″％″는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
(1) 산조인 원물을 이용한 발효물과 스피노신 증대 효과 확인
산조인 원물을 갈아서 분말 형태를 형성한 후 물을 1:4(산조인:물) 부피 비율로 첨가하여 수용액을 만들고 각 종류의 유산균을 접종하였다. 이후, 이를 상온보다 조금 더 높은 온도 조건에서 72시간동안 발효하고 거즈를 이용하여 액상을 분리한 후, 원심분리를 통해 2차적으로 불순물을 제거하였다.
이후 0.45μm의 PVDF 필터로 액상을 한 번 더 거른 후 Speed Vac을 사용하여 고체 상을 남긴 뒤 MeOH로 reconstitution을 진행하고 0.45μm의 PVDF 필터로 한번 더 거른 후 LC-MS를 통해 분석하였다. 이 때, 분석에 사용한 LC-MS의 분석 조건은 다음과 같다.
- Column: AcQuity UPLC BEH C18 column (1.7um, 100mm x 2.1mm)
- Flow rate: 0.3 mL/min
- Ionization Mode: NEG
- Injection volume: 5uL
각각의 샘플에 대하여 샘플 내에서 스피노신 농도를 나타내는 넓이와 스피노신 농도 간의 관계를 수식화하고 총 3회를 반복하여 실험한 후 평균값을 계산함으로써 유산균 접종 및 발효에 따른 스피노신(spinosin) 함량의 증대를 확인하였으며, 그 결과는 아래 표 1에 제시된 것과 같다. 하기의 표 1에서 control은 균을 접종하지 않은 비교예이며, brevis는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종한 실시예이며, lactics는 락토코커스 라티스(Lactococcus lactis)를 접종한 또 다른 실시예이다. 이외에도 다양한 유산균을 통한 실험을 수행하였으며, 여기서는 대표적으로 두 가지의 유산균에 대한 실험을 예로 설명한다.
Sample 종류 Calc(μg/ml) 평균(μg/ml)
Control 1 16.398 16.820
Control 2 17.606
Control 3 16.456
Brevis 1 18.378 18.192
Brevis 2 18.230
Brevis 3 17.966
Lactis 1 18.162 17.897
Lactis 2 17.977
Lactis 3 17.553
최종적으로 Brevis 샘플 및 Lactis 샘플에서 비교예에 해당하는 Control 군 샘플에 비해 스피노신 함량들이 증대가 나타난 것을 확인할 수 있었다.
(2) 산조인 추출물을 이용한 발효물과 구현되는 각종 효과 확인
1 단계: 산조인 추출물의 제조 단계(실시예 1 내지 3)
볶은 산조인을 물과 에탄올의 혼합 용매 조건에서 상온에서 추출하였다. 상기 추출액을 필터링(filtering)하여 분무 건조(spray drying)를 통해 분말화하여 이를 25%의 농도로 정제수에 희석시켜 액상 산조인 추출물을 수득하였다.
상기 실시예 들을 이용하여 다음 2 단계를 실시하였다.
2 단계: 산조인 또는 산조인 추출물의 멸균 단계
상기 1 단계에서 수득한 액상 산조인 추출물을 100℃ 이상의 온도에서 수 분간 멸균을 진행하였다.
3 단계: 유산균 배양 단계
락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토코커스 라티스(Lactococcus lactis)를 각각 100℃ 이상의 온도에서 수분간 멸균된 MRS 배지에 접종하여 상온보다 조금 더 높은 온도에서 수 시간 동안 배양하였다. 이를 원심분리(4℃, 20000 rpm, 15분)를 이용하여 PBS 완충용액(buffer)로 2회 세척하였다.
4 단계: 유산균 발효된 산조인 추출물의 제조단계
상기 3 단계에서 세척한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토코커스 라티스(Lactococcus lactis)를 정제수에 푼 뒤 혼합하여 유산균 혼합액을 제조한 후, 상기 2 단계에서 멸균한 산조인 추출물 대비 상기 유산균 혼합액을 1%로 접종한 후 상온보다 조금 더 높은 온도에서 12시간 이상 발효하여 유산균 발효된 산조인 추출물을 제조하였다. 이후 발효시간을 증가시켜 가면서 발효시간에 따른 유산균 발효된 산조인 추출물 샘플을 채취하여 분석하였다.
[실험예 1] 발효시간에 따른 유산균 발효된 산조인 추출물에 대한 아미노산 종류별 및 스피노신 함량 분석
상기 발효시간 조건별(0시간, 12시간, 24시간, 48시간) 유산균 발효된 산조인 추출물 샘플을 채취하여 글리신(glycine)을 포함한 아미노산 종류별 및 스피노신(spinosin) 정량 분석을 위해 HPLC를 이용한 전처리 및 조건을 확립하였으며 추출 공정 및 함량 분석의 최적의 조건을 확인하였다. 분석은 서울대학교 농생명과학공동기기원(nicem)에 위치한 크로마토그래피실에서 진행하였다.
글리신(glycine)을 포함한 아미노산 종류별 함량에 대한 HPLC 분석조건으로는, Dionex Ultimate 3000 (Thremo Dionex, USA)을 사용하였으며 컬럼(column)은 Inno C-18 컬럼(Youngjinbiochrom, Koera 4.6*250, 5 um), 컬럼의 온도는 40℃, 주입량(injection volume)은 0.5 μL이었다. 이동상으로는 40 mM 인산나트륨(sodium phosphate)과 아세토니트릴(acetonitrile), 메탄올(methanol)을 혼합하여 이용하였으며 각각 266~450 nm에서 검출하였다(도 1 내지 도 4).
상기 HPLC 분석조건으로 아미노산 종류별 함량에 대한 분석은 하기 표 2에 나타내었다.
발효시간(hr) 0 12 24 48
(함량 단위) mg/L mg/L mg/L mg/L
Aspartic acid 88.43 88.90 85.94 91.02
Glutamic acid 7.24 8.28 5.47 5.61
Asparagine 475.63 474.41 458.98 434.17
Serine 19.68 19.61 17.42 16.60
Glutamine 1.03 1.02 0.90 0.82
Histidine 4.99 4.82 4.00 3.92
Glycine 5.93 6.03 6.00 6.99
Threonine 15.80 15.62 13.50 10.67
Citrulline 1.54 2.14 2.47 2.80
Arginine 56.09 51.62 47.29 44.91
Alanine 18.69 19.62 17.69 15.69
GABA 32.78 32.71 32.39 31.88
Tyrosine 6.00 6.07 4.70 3.22
Valine 18.68 19.55 17.49 17.75
Phenylalanine 8.03 8.98 6.75 5.73
Isoleucine 6.95 7.30 6.41 5.89
Ornitnine 2.32 3.01 2.98 3.54
Leucine 9.39 10.25 8.29 7.94
Lysine 4.55 4.01 3.20 2.30
Proline 1335.49 1317.94 1061.08 1295.30
아미노산 종류별 함량 분석결과, 상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 발효 전 산조인 추출물에 비해서 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물에서는 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 글리신(glycine)의 함량 증대가 나타났다.
스피노신(spinosin) 함량에 대한 HPLC 분석조건으로는, Ultimate 3000 HPLC (Thermo Dionex, USA)을 사용하였으며 컬럼(column)은 Inno C-18 컬럼(Youngjinbiochrom, Koera 4.6*250,5 um), 컬럼의 오븐 온도는 45℃, 주입량 (injection volume)은 10 μL이었다. 이동상으로는 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)과 메탄올(methanol)을 이용하였으며 335 nm에서 검출하였다.
상기 HPLC 분석조건으로 스피노신(spinosin) 함량에 대한 분석은 하기 표 3에 나타내었다.
발효시간(hr) 0 12 24 48
Spinosin 함량(mg/L) 19.06 19.29 20.17 20.05
스피노신(spinosin) 함량 분석결과, 상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 발효 전 산조인 추출물에 비해서 12시간 내지 48시간 유산균 발효된 산조인 추출물에서 수면 촉진 및 개선 효과와 관련된 스피노신 함량의 증대가 나타났다.
[실험예 2] 발효시간 조건별 유산균 발효된 산조인 추출물에 대한 항산화 효과 확인
발효 전 산조인 추출물 및 본 발명의 유산균 발효된 산조인 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 DPPH 시험법을 이용하여 활성산소 소거율을 측정하였다.
시험관에 농도별로 준비된 시료 용액 100 μL를 넣고, 100 μL의 에탄올과 50 μL의 0.5 mM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)/에탄올 용액을 첨가하여 25℃의 실온에서 30분 동안 방치한 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거율(%)은 하기의 식에 따라 계산하였고 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다. 기준 물질로는 항산화제인 아스코르빈산(ascorbic acid)을 사용하였다.
라디칼 소거율(%)=(B-A)/B × 100
A: 시료를 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도
B: 시료를 처리한 실험군 웰의 흡광도
발효시간(hr) 0 12 24 48
평균(mean) 52.04819 51.16466 48.59438 53.25301
표준편차(stdev) 0.481928 1.452461 0.139121 0.417362
상기 표 4에서 확인되는 바와 같이 발효 전 산조인 추출물에 비해서 48시간 유산균 발효된 산조인 추출물에서 항산화능이 증대된 것으로 나타났다.
[실험예 3] 발효시간 조건별 유산균 발효된 산조인 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량(total polyphenol content, TPC) 분석 확인
총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis법(Folin O. and Denis W., 1912, J Biol chem. 12:239-249)에 따라 실시하였다. 메탄올에 희석한 25 μL의 시료에 75 μL의 메탄올과 25 μL의 폴린-시오칼투 페놀 시약(Folin-Ciocalteu phenol reagent)을 첨가하여 6분간 실온에서 반응시킨 후, 포화용액 Na2Co3 100 μL를 첨가하여 혼합하고, 90분간 실온에서 방치한 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질인 갈릭산(gallic acid)을 사용하여 표준 검량선을 작성하였으며, 추출물의 총 폴리페놀 함량을 μg GAE(gallic acid equivalent)/mL로 나타내었다. 표준물질은 갈릭산(gallic acid)을 각각 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50 및 100 mg/mL로 제조하여 처리한 후 흡광도와 농도와의 관계를 나타내는 표준곡선을 만들어 발효시간 조건별 유산균 발효된 산조인 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량(total polyphenol content)을 하기 표 5에 나타내었다.
발효시간(hr) 0 12 24 48
평균(mean) 2742.006 2654.874 2742.006 2829.138
표준편차(stdev) 65.349 78.53972 78.53972 75.45853
상기 표 5에서 확인되는 바와 같이 발효 전 산조인 추출물에 비해서 48시간 유산균 발효된 산조인 추출물에서 총 폴리페놀 함량의 증대가 나타났다.
[제조예] 유산균 발효된 혼합 발효음료 제조
본 발명의 유산균 발효 처리를 하여 확보한 산조인 원물 또는 산조인 추출물의 발효물에 홉추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘, 글리신 및 기타 식음료용 첨가 성분들을 추가하고 발효음료를 제조하였다.
[실험예 4] 본 발명의 혼합 발효음료에 대한 수면장애 개선 평가
평소에 수면장애로 불편을 겪고 있는 대상자 84명을 모집 후 최근 6개월간 신경계 관련 약품 및 건강기능식품을 복용한 경험이 있는 사람을 제외하고 무작위적으로 10명을 선발하였다.
정제수 110 mL에 합성과일향 1 mg, 감미료 3 g을 혼합하여 대조군 음료를 제조하였다. 실험군 음료는 상기 제조예의 48시간 유산균 발효된 산조인 추출물이 포함된 혼합 발효음료를 의미한다.
이번 실험에서 최종 10명을 5명씩 2그룹으로 나누어 그룹 1은 상술한 실시예에 따라 제조된 유산균 발효된 산조인 추출물이 포함된 혼합 발효음료(실험군 음료) 110 mL를 일주일 동안 잠자리에 들기 30분 전 섭취하게 하고 그 이후 일주일 동안은 대조군 음료를 일주일 동안 동일한 방법으로 섭취하였으며 그룹 2는 일주일 동안 대조군 음료를 먼저 섭취하고 그 이후 일주일 동안 상기의 유산균 발효된 산조인 추출물이 포함된 혼합 발효음료(실험군 음료)를 섭취하였다. 무엇이 실험군 음료인지 평가자가 알 수 없도록 설계하였으며, 매일 수면 일지를 기록하고 숙면 효과에 대한 문답은 일주일 단위로 실시하였다. 문답은 일반적으로 수면장애의 평가 기준으로 활용되는 한국판 피츠버그 수면의 질 지수(PSQI-K)를 반영하여 간이적으로 설문을 작성해 평가하였으며, 그 결과를 하기 표 6 내지 표 10에 나타내었다.
입면 시간(/10명)
일주일 평균값 실험군 대조군
15분 이내 2 1
15분 ~ 30분 5 2
30분 ~ 2시간 3 6
2시간 이상 0 1
수면 시간(/10명)
실험군 대조군
4시간 이하 0 2
4시간 ~ 7시간 5 7
7시간 이상 5 1
수면 방해 빈도(/10명)
실험군 대조군
지난 한주동안 없었다. 3 2
한 주에 1회~2회 5 4
한 주에 3회 이상 2 4
수면의 질(/10명)
실험군 대조군
수면 만족도 4.1 2.7
낮 시간 기능 저해 빈도(/10명)
실험군 대조군
지난 한주동안 없었다. 4 2
한 주에 1회~2회 5 5
한 주에 3회 이상 1 3
본 발명의 발효된 산조인 추출물 혼합 발효음료에 대한 수면장애 개선 평가를 실시한 결과, 상기 표 6 내지 표 10에서 확인되는 바와 같이 수면 촉진 및 개선 효과가 우수한 것으로 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 산조인 또는 산조인 추출물에 대한 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는, 수면 촉진 및 개선용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) 및 락토코커스 라티스(Lactococcus lactis)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유산균인 것을 포함하는, 수면 촉진 및 개선용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 유산균 발효 처리 전과 비교하여 스피노신 및 글리신 함량이 증가한 것인, 수면 촉진 및 개선용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 스피노신 함량은 유산균 발효 처리 전과 비교하여 5% 이상 증가한 것인, 수면 촉진 및 개선용 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 글리신 함량은 유산균 발효 처리 전과 비교하여 10% 이상 증가한 것인, 수면 촉진 및 개선용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는 수면 촉진 및 개선용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유기용매는 C1-C4의 알코올, 헥산(n-헥산), 에테르, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 에틸아세테이트 및 메틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기용매인 것을 특징으로 하는 수면 촉진 및 개선용 조성물.
  8. 다음의 단계를 포함하는 수면 촉진 및 개선용 조성물의 제조방법:
    (a) 산조인 원물을 용매에 용해하거나, 볶은 산조인을 추출용매로 추출하여 전처리 용액을 수득하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 수득한 전처리 용액을 멸균하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 멸균한 전처리 용액에 유산균을 접종하여 발효하는 단계.
  9. 제1항의 조성물을 포함하는 수면 촉진 및 개선용 식품.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 식품은 홉(humulus lupulus)추출물, L-테아닌(L-theanine) 및 마그네슘을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수면 촉진 및 개선용 식품.
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