CN109645280A - 具有美容养颜功能的大枣发酵食品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵应用领域，涉及利用益生菌发酵大枣、大豆粉、山药、龙眼肉、阿胶等生产的功能性食品，以及功能性食品的制备方法。所述发酵食品是利用包括植物乳杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、副干酪乳杆菌在内的益生菌混菌对大枣、大豆粉、山药、龙眼肉、阿胶等进行液态或固态发酵所得。发酵后的饮料和食品既保存了天然植物的营养价值,又具有益生菌发酵制品的营养保健作用,且口感独特，功效明显，具有很好的市场前景。本发明所生产益生菌发酵饮料和食品具有提高皮肤透明质酸和弹性蛋白含量的功效，而且对皮肤黄斑有明显改善作用，具有有效的美容养颜功能。而且对睡眠质量，精神状态有良好的改善。

Description

具有美容养颜功能的大枣发酵食品及其制备方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵应用领域，涉及利用益生菌发酵大枣、大豆粉、山药、龙眼肉、阿胶等生产的功能性食品，以及功能性食品的制备方法。
背景技术：
保健品市场是全球性的朝阳产业，市场增长迅速。近年来在时尚潮流的推动下，女性消费水平和保健意识不断提高，女性保健品市场已成为继“银发市场”后又一强力消费市场，其中排毒养颜类、补血类及减肥类等保健品备受女性欢迎。
在目前的零售市场上，美容养颜产品最大的两个类别是保健品和中成药，且销售走势一直较为平稳。保健品类占据了美容养颜产品约60％的市场份额，略胜中成药类一筹。由于美容养颜产品的使用不受季节因素的限制，而且消费者的购买动机容易受到引导，因此，美容养颜产品的销售也不易受到季节因素的影响。
中国市场报告网发布的2018-2025年中国美容养颜保健食品行业现状调研分析及发展趋势研究报告认为，美容养颜保健品多以传统的中草药为原料研制而成，它们几乎都避开了美容化妆品仅仅使人外部美丽的办法，在功能上多强调通过调节人的内部生理机制使人达到一种自然的美丽。女人天性爱美，特别是在女性驰骋于社会各界的当今时代，美就是女人的第二生命，因此女性美容型保健品将有着巨大的市场需求。
2015年国内美容保健品市场容量70亿元，未来5-8年内销售额将达200亿元。目前，针对美容养颜产品食品方面的研究并不多，主要为以下这些：
公开号：102988599A的发明《养颜美容的药酒》公开了一种用于美容养颜的食品，由以下按照重量份的原料组成：龙眼200-300；枸杞子100-140；当归20-40；大枣10-20；白芷10-20；白酒3000-4000；本发明还公布了该用于美容养颜食品的制备工艺。
公开号：102652553B的发明《一种美容养颜复合糙米》公开了一种美容养颜复合糙米食品配方，由以下质量份数组分而成：糙米粉100-120，玉米粉8-15，黑豆粉5-10，木瓜粉3-8，黑芝麻粉3-5,黄豆粉3-5,莲子粉3-5,枸杞粉3-5,荞麦粉3-5,百合粉3-5，赤小豆粉5-8，白芷粉2-5，茯苓粉2-5，葛根粉2-5，薏米粉2-5，茶多酚5-8。本发明采用双螺杆挤压再造米技术，将营养丰富的原料经过糊化、挤压、再造粒等工艺精致而成
公开号：107997180A的发明《活血化瘀养颜美容饮料》公开了一种活血化瘀养颜美容饮料。它由龙眼肉，大枣，枸杞，沙棘，桂花蕊，维生素B2，维生素B1和维生素为原料，白砂糖，柠檬酸和山梨酸钾为辅料，共5味药食同源的天然植物，3种营养强化剂组成。具有改善女性内分泌失调、面部色斑、皮肤松弛等问题。
公开号：108576710A的发明《一种美容养颜营养膏及制作工艺》每份营养膏包括下述物质：核桃仁100～120g、茯苓90～110g、杏仁90～110g、玫瑰花20～40g、银杏10～30g、薏仁米10～30g、黑芝麻100～120g、冰糖46～62g、阿胶46～62g、红枣142～162g、黄酒230～270g。本发明融合了多种坚果、谷物、中药成分和玫瑰花成分，同时加入了阿胶，并使用了黄酒的浸泡和蒸煮，黄酒不仅提供了维生素等成分，同时还能充分提取各种成分当中的有益营养物质并提供了一种微反应环境，使得其中的氨基酸、维生素、矿物质等元素能够进一步溶解、分子化、取代性反应，使得营养物质更容易吸收。
公开号：107823577A的发明《一种美容养颜的药物》公开了一种美容养颜的药物，其特征在于由以下重量份的原料制成：阿胶5-15份、山药10-20份、桂圆10-20份、姜黄5-15份、莪术10-20份、川芎10-20份、当归10-20份、白茯苓5-15份、白芍10-30份、益母草10-30份、熟地10-30份、百合10-30份、甘草5-15份。
上述现有技术公开的美容养颜的食品多以枸杞，中药等传统认为对美容养颜有疗效的药食两用物品作为原料来制备美容养颜保健食品，且制备方法一般为将材料进行简单的混合加工。而采用益生菌发酵制备的食品非常少。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明将提供一种以大枣为主要原材料的益生菌混菌发酵食品，所述发酵食品是利用包括植物乳杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌和副干酪乳杆菌在内的益生菌混菌对大枣、大豆粉、山药、龙眼肉、阿胶等进行液态或固态发酵所得。
本发明提供一种大枣益生菌液态发酵功能性饮料，原料组成如下：每1000ml水中加入10-15％(质量体积比)的大枣粉，同时加入1-5％的大豆粉、1-3％的山药粉、1-3％的龙眼肉粉、1％阿胶粉搅拌均匀；采用植物乳杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌和副干酪乳杆菌混菌发酵而得；
本发明提供上述大枣益生菌液态发酵功能性饮料的制备方法，具体步骤如下：
(1)大枣、山药、龙眼肉、阿胶、大豆清洗后晾干，粉碎，分别磨粉过100目筛，得五种原料的粉末，备用。
(2)液态混菌发酵培养：
发酵培养基：每100ml水中添加10-15g大枣粉，另外添加1-5g的大豆粉、1-3g山药粉、1-3g龙眼肉粉、1g阿胶粉，121℃，20min灭菌得液态发酵培养基；
将种子液按如下接种量接种于发酵培养基中，混菌液态发酵24-48h，温度为37℃；植物乳杆菌，动物双歧杆菌，青春双歧杆菌，凝结芽孢杆菌，副干酪乳杆菌的接种量均为105-107CFU/ml；
(4)发酵结束后，发酵液经乳化、加稳定剂、调酸、调香、均质、杀菌后即得大枣益生菌液态发酵饮料；
所述大枣、大豆粉、山药、龙眼肉、阿胶、均为市售；
优选地，种子液的制备方法如下：
活化培养基：每100ml水中添加10g大豆粉，121℃，20min灭菌得活化培养基；
植物乳杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌和副干酪乳杆菌的甘油管分别按1％(v/v活化培养基的体积比)接种于活化培养基进行活化，pH＝7.2-7.4，控制温度为37℃；分别活化20h后，按10％(v/v)的接菌量再次转接活化培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
优选的，液态发酵培养基的组成为：每100ml水中添加11g大枣粉，5g的大豆粉，2g的山药粉，2g的龙眼肉粉，1g的阿胶粉；
优选的，混菌液态发酵时间为24h；
优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TK9，保藏编号为CGMCC No.11891；
优选的，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)937，保藏编号为CGMCC No.11892；
优选的，所述青春双歧杆菌为青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)TK99，保藏编号为CGMCC No.12784；
优选的，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33，保藏编号为：CGMCC No.5233；
优选的，所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501，保藏编号为CGMCC No.13130；
本发明同时提供一种大枣益生菌固态发酵功能性食品，是将大枣、大豆粉、山药、龙眼肉、阿胶作为发酵基质，采用植物乳杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、副干酪乳杆菌经固态混菌发酵后制备而得；
所述大枣益生菌固态发酵功能性食品的制备方法，具体步骤如下：
(1)按大枣粉：大豆粉：山药粉：龙眼肉粉：阿胶粉＝10-15:1-5:1-3:1-3:1(质量比)称取原料并混合，将混合料与水按1：1.25-2(m:V)混合均匀后，121℃，20min灭菌制得固态发酵培养基；
(2)将种子液接入固态发酵培养基中，使得每克固态培养基中，植物乳杆菌，动物双歧杆菌，青春双歧杆菌，凝结芽孢杆菌，副干酪乳杆菌的接种量均为106-107CFU/g；37℃，混菌固态发酵24-48h；
(3)发酵结束后，放入真空冷冻干燥机内24-48小时，制得大枣益生菌固态发酵食品；
所述大枣、大豆粉、山药、龙眼肉、阿胶、均为市售；
优选地，大枣粉：大豆粉：山药粉：龙眼肉粉：阿胶粉＝10:5:2:2:1(质量比)；
优选的，所述大枣与辅料的混合物：水＝1：1.4；
优选地，混菌固态发酵24h；
优选的，所述固态发酵物真空冷冻干燥36h，至含水量不大于5％；
优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TK9，保藏编号为CGMCC No.11891；
优选的，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)937，保藏编号为CGMCC No.11892；
优选的，所述青春双歧杆菌为青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)TK99，保藏编号为CGMCC No.12784；
优选的，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33，保藏编号为：CGM CC No.5233；
优选的，所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501，保藏编号为CGMCC NO.13130；
有益效果：
本发明所述的大枣发酵饮料和食品，通过发酵可以使大枣中的活性物质胡萝卜素、维生素E，尼克酸和维生素C等的作用发挥到最大。异黄酮、透明质酸(HA)、硫酸皮肤素(Ds)、纤维粘蛋白、皂甙、大分子环酮、胆甾醇等这些原料中富含的物质能延缓我们身体和皮肤细胞的衰老，令身体中的废物快速排出，令我们的身体充满活力，具有非常不错的美容养颜作用。十分适合女性使用。发酵后的饮料和食品既保存了天然植物的营养价值,又具有益生菌发酵制品的营养保健作用,且口感独特，功效明显，具有很好的市场前景。本发明所生产益生菌发酵饮料和食品具有提高皮肤透明质酸和弹性蛋白含量的功效，而且对皮肤黄斑有明显改善作用，具有有效的美容养颜功能。而且对睡眠质量，精神状态有良好的改善。
具体实施方式：
通过表格及实施例，对本发明做进一步详细说明，以使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明了。此处所描述的具体实施例仅限用以解释本发明，但本发明并不只局限于以下具体实施例子。
实施例中涉及到的百分号“％”，如果没有特别说明，则指质量百分比；溶液的百分比指100mL水中含有溶质的克数；液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
本发明采用大枣、大豆、山药、龙眼、阿胶等为原料，并采用植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和凝结芽孢杆菌多种菌株进行混菌液态或固态发酵后制备而得，以下实施例将以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TK9、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)937、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)TK99、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33为例对本发明进行说明，以上选用的菌种应理解为示例性的而非具体限定，本发明方法对于目前已知的具有相同功能的同种属的菌株均适用。
其中，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TK9，该菌株已于2015年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.11891；此株植物乳杆菌具有较好的抗胃酸、抗胆盐的能力，在pH 3时2h存活率88.03％，0.3％胆盐4h存活率81.06％，并且具有广泛的抗真菌性，不需要添加额外的防腐剂，也可以延长饮料和食品保藏时间；
其中，动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)937，该菌株已于2015年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.11892；；
其中，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501，该菌株已于2016年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.13130；
其中，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)TK99，该菌株已于2016年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.12784；
其中，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33，该菌株已于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为：CGMCC No.5233；
以下将采用上述菌株对本发明进行具体说明。
实施例1、大枣益生菌发酵功能性饮料制备方法
1、原料中大枣与其它四种原料配比的确定
(1)将大枣、山药、龙眼肉、阿胶、大豆分别清洗后晾干，磨粉过100目筛，备用；
(2)配制活化培养基：每100ml水中添加10g大豆粉；对活化培养基进行灭菌，条件为，121℃，20min；
(3)配制发酵培养基：每100ml水中添加10-15g的大枣粉，1-5g大豆粉，1-3g山药粉，1-3g龙眼肉粉，1g阿胶粉；
(4)菌种活化：植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和凝结芽孢杆菌的甘油管分别按1％接种于活化培养基进行活化，pH7.2-7.4，控制温度为37℃；分别活化20h后，按10％(v/v)的接菌量再次转接活化培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
(5)益生菌发酵：按接种量植物乳杆菌为107CFU/mL、动物双歧杆菌107CFU/mL、副干酪乳杆菌107CFU/mL、青春双歧杆菌107CFU/mL、凝结芽孢杆菌107CFU/mL接种于发酵培养基中，混菌液态发酵24h，温度为37℃；分别对发酵液中的益生菌活菌数进行检测，结果如表1：
菌种标号：1号为植物乳杆菌TK9单菌，2号为动物双歧杆菌937单菌，3号为青春双歧杆菌TK99单菌，4号为凝结芽孢杆菌TQ33单菌，5号为副干酪乳杆菌TK1501单菌；表1-6标号均与此相同。
表1不同原料比益生菌的活菌数(CFU/mL)
组合一 组合二 组合三 组合四 组合五 组合六 组合七 组合八 组合九
1号 2.53×10<sup>8</sup> 2.15×10<sup>8</sup> 2.23×10<sup>8</sup> 2.01×10<sup>8</sup> 2.41×10<sup>8</sup> 3.84×10<sup>8</sup> 3.75×10<sup>8</sup> 5.21×10<sup>8</sup> 4.92×10<sup>8</sup>
2号 1.05×10<sup>7</sup> 1.43×10<sup>7</sup> 2.4×10<sup>7</sup> 3.21×10<sup>7</sup> 3.18×10<sup>7</sup> 2.12×10<sup>7</sup> 3.17×10<sup>7</sup> 3.32×10<sup>7</sup> 2.32×10<sup>7</sup>
3号 4.28×10<sup>7</sup> 4.68×10<sup>7</sup> 5.47×10<sup>7</sup> 6.78×10<sup>7</sup> 7.16×10<sup>7</sup> 6.78×10<sup>7</sup> 6.68×10<sup>7</sup> 7.96×10<sup>7</sup> 7.43×10<sup>7</sup>
4号 2.43×10<sup>8</sup> 2.57×10<sup>8</sup> 3.19×10<sup>8</sup> 2.18×10<sup>8</sup> 3.27×10<sup>8</sup> 3.12×10<sup>8</sup> 4.15×10<sup>8</sup> 4.45×10<sup>8</sup> 4.46×10<sup>8</sup>
5号 1.57×10<sup>7</sup> 1.98×10<sup>7</sup> 3.57×10<sup>7</sup> 5.02×10<sup>7</sup> 4.78×10<sup>7</sup> 6.28×10<sup>7</sup> 3.54×10<sup>7</sup> 7.66×10<sup>7</sup> 5.98×10<sup>7</sup>
总活菌数 4.43×10<sup>8</sup> 4.50×10<sup>8</sup> 4.27×10<sup>8</sup> 5.70×10<sup>8</sup> 5.90×10<sup>8</sup> 5.04×10<sup>8</sup> 6.51×10<sup>8</sup> 7.02×10<sup>8</sup> 6.42×10<sup>8</sup>
注：以标号表示各个组别：组合一：大枣粉：大豆粉：山药：龙眼肉：阿胶＝15：2：1：1：1，组合二：大枣粉：大豆粉：山药：龙眼肉：阿胶＝15：2：2：2：1，组合三：大枣粉：大豆粉：山药：龙眼肉：阿胶＝15：2：3：3：1，组合四：大枣粉：大豆粉：山药：龙眼肉：阿胶＝13：4：1：1：1，组合五：大枣粉：大豆粉：山药：龙眼肉：阿胶＝13：4：2：2：1，组合六：大枣粉：大豆粉：山药：龙眼肉：阿胶＝13：4：3：3：1，组合七：大枣粉：大豆粉：山药：龙眼肉：阿胶＝11：5：1：1：1，组合八：大枣粉：大豆粉：山药：龙眼肉：阿胶＝11：5：2：2：1，组合九：大枣粉：大豆粉：山药：龙眼肉：阿胶＝11：5：3：3：1。
由表1可知大枣粉与四种辅料发酵后，组合八：大枣粉：大豆粉：山药：龙眼肉：阿胶＝11：5：2：2：1，即每100ml水中加入11g大枣粉、5g大豆粉、2g山药、2g龙眼肉、1g阿胶时活菌数达到最高，7.02×108CFU/mL。
2、益生菌接种量的确定
其他条件同实施例1，按11g大枣粉、5g大豆粉、2g山药粉、2g龙眼肉粉、1g阿胶粉配置发酵培养基，将植物乳杆菌TK9分别按以下接菌量1×106、5×106、1×107、5×107CFU/mL接种于发酵培养基中，其他菌种按与植物乳杆菌的比例如下接入发酵培养基：植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501的接菌量比为1：1：1：1：1：1，进行发酵，发酵完成之后测定发酵液中的益生菌活菌数。
表2不同接种量下的活菌数(CFU/mL)
结果如表2所示：最佳接种量植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501均为5×107CFU/mL。测得的总活菌数为3.98×109CFU/mL。
3、培养时间的确定
在接种量已优化的条件下，液态发酵培养基选择每100ml水中添加11g大枣粉+5g大豆粉+2g山药+2g龙眼肉+1g阿胶。
植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501的甘油管按1％接种于大豆粉活化培养基进行一次活化，均活化20h，然后均按10％(v/v)的接种量转接入二次活化培养基中，二次活化24h。在液态发酵培养基中接种植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501种子液混菌发酵。使得接入到大枣液态发酵培养基中植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501，均为5×107CFU/mL；pH7.2-7.4，培养温度37℃，混菌发酵12、24、36、48h，分别对发酵液中的益生菌活菌数进行检测。
表3不同发酵时间对培养后益生菌活菌数的影响
12h 24h 36h 48h
1号 5.59×10<sup>8</sup> 6.77×10<sup>8</sup> 4.56×10<sup>8</sup> 3.94×10<sup>8</sup>
2号 5.21×10<sup>7</sup> 6.31×10<sup>7</sup> 5.36×10<sup>7</sup> 4.99×10<sup>7</sup>
3号 7.97×10<sup>6</sup> 8.91×10<sup>6</sup> 8.45×10<sup>6</sup> 7.81×10<sup>6</sup>
4号 7.37×10<sup>7</sup> 8.17×10<sup>7</sup> 7.49×10<sup>7</sup> 7.15×10<sup>7</sup>
5号 5.11×10<sup>8</sup> 6.57×10<sup>8</sup> 5.01×10<sup>8</sup> 4.31×10<sup>8</sup>
总活菌数 6.01×10<sup>8</sup> 7.11×10<sup>8</sup> 5.51×10<sup>8</sup> 5.23×10<sup>8</sup>
结果如表3所示：最佳培养时间为接种后再混菌发酵24h，总活菌数为7.11×108CFU/ml。
4、一种大枣液态发酵饮料的制备方法
(1)将大枣、大豆、山药、龙眼肉、阿胶清洗后晾干，分别磨粉过100目筛得大枣粉和其它辅料的粉；
(2)配制活化培养基：每100ml水中添加10g大豆粉；对活化培养基进行灭菌，条件为，121℃，20min；
(3)配制发酵培养基：每100ml水中添加11g大枣粉+5g大豆粉+2g山药粉+2g龙眼肉粉+1g阿胶粉；
(4)菌种活化，植物乳杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501甘油管分别按1％接种于活化培养基进行活化，pH7.2-7.4，控制温度为37℃；分别活化20h后，按10％(v/v)的接菌量再次转接活化培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
(5)益生菌发酵：将二级种子液按植物乳杆菌接菌量为5×107CFU/mL接种于发酵培养基中，同时接种青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌TK1501，五种菌接菌量比为1：1：1：1：1，混菌液态发酵24h，温度为37℃；
(6)发酵结束后发酵液经乳化后加稳定剂，稳定剂按与发酵液的质量体积百分比进行添加，添加量为羧甲基纤维素钠0.5％，黄原胶0.6％，乳化剂0.8％；添加发酵液质量体积百分比为8％的异麦酮糖进行调酸调香；在65℃，30MPa的条件下均质一次，经80℃杀菌15-20min，得大枣发酵饮料，该饮料具有美容养颜功效。
5、益生菌液态发酵饮料工艺-发酵前后培养基活性成分变化(抗氧化物含量、维生素C含量、黄酮类、环磷酸腺苷、叶酸、大枣多糖)
以实施例1-4步骤(1)-(5)获得的产品为样品；以相同条件下的单菌发酵作为对照，接菌量同混菌发酵中的单菌接种量；
利用活氧指数法(ORAC)测定抗氧化物含量；利用高效液相法测定维生素C和黄酮类物质含量；利用福林酚反应测定总酚类含量；参考郜文和徐菲等人文章中的测定方法用HPLC法测定环磷酸腺苷的含量；用HPLC-UV法测定叶酸含量；利用DNS法测定还原糖含量，结果见表4：
表4：大枣液态饮料发酵前后活性成分变化
检测项目 1 2 3 4 5 6 7
抗氧化物(mmol TE/ml) 0.0104 0.0211 0.0166 0.0124 0.0170 0.0158 0.0109
维C类(mg/ml) 7.5 9.6 8.9 7.9 8.0 8.3 9.0
黄酮类(mg/ml) 0.11 0.34 0.18 0.17 0.29 0.19 0.28
环磷酸腺苷(μg/ml) 59.5 86.2 72.4 65.3 70.8 71.9 73.8
叶酸(μg/ml) 1.367 2.422 2.231 2.125 2.204 2.035 2.351
大枣多糖(mg/ml) 0.46 0.78 0.65 0.59 0.62 0.61 0.58
注：以编号表示各阶段：1-发酵前含量；2-混菌发酵后含量；3-植物乳杆菌TK9发酵后含量；4-动物双歧杆菌937发酵后含量；5-青春双歧杆菌TK99发酵后含量；6-凝结芽孢杆菌TQ33发酵后含量；7-副干酪乳杆菌TK1501发酵后含量；
由以上数据可知，大枣在经过液态发酵后活性成分都有提高。尤其是混菌发酵后活性物质提高更为明显，环磷酸腺苷含量在经发酵后有所增加，大枣混菌发酵后环磷酸腺苷含量达到86.2μg/ml，均高于单菌发酵，该成分有调节免疫反应，维持血管内环境稳定的功效；经混菌发酵后，大枣饮料中的维C类含量达到9.6mg/ml，均高于单菌发酵，维C类物质都具有抗氧化功效，是女性美容养颜必不可少的活性物质，混菌后发酵后抗氧化活性明显提高；经混菌发酵后，大枣发酵饮料中黄酮类物质含量明显增加，含量达到0.34mg/ml，黄酮类物质具有降血糖血脂和抗氧化功效，异黄酮的美容养颜效果早已收到公认；大枣混菌发酵饮料中叶酸含量相对于单菌发酵增加显著，经益生菌发酵后达2.422μg/ml，叶酸参与血细胞的形成，有补血的功效；大枣混菌发酵饮料中大枣多糖的含量是发酵前的近两倍，大枣中的多糖种类丰富，且具有补血养颜的作用。活性物质检测的结果表明利用混菌发酵可以开发出营养更丰富的大枣功能性饮料。
实施例2：大枣益生菌固态发酵食品制备方法
1、大枣与辅料配比的确定
(1)将大枣、山药、龙眼肉、阿胶、大豆分别清洗后晾干，磨粉过100目筛；
(2)配制活化培养基：每100ml水中添加10g大豆粉；对活化培养基进行灭菌，条件为，121℃，20min；
(3)配制发酵培养基：选取大枣粉、大豆粉、山药粉、龙眼肉粉、阿胶粉按一定重量比混合；再与水按1:1.5(m:V)混合制得固态发酵培养基；
(4)菌种活化：植物乳杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌和副干酪乳杆菌的甘油管分别按1％接种于活化培养基进行活化，pH7.2-7.4，控制温度为37℃；分别活化20h后，按10％(v/v)的接菌量再次转接活化培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
(5)益生菌发酵：将植物乳杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌和副干酪乳杆菌接种于发酵培养基中；植物乳杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌和副干酪乳杆菌接菌量比为1：1：1：1：1，接菌量分别为106CFU/g，混菌发酵24h，温度为37℃；分别对发酵样品中的益生菌活菌数进行检测，结果如表5：
发酵培养基中大枣粉、大豆粉、山药粉、龙眼肉粉、阿胶粉配比如下：
组合一：14：2：1：1：1；
组合二：14：2：2：2：1；
组合三：14：2：3：3：1；
组合四：12：4：1：1：1；
组合五：12：4：2：2：1；
组合六：12：4：3：3：1；
组合七：10：5：1：1：1；
组合八：10：5：2：2：1；
组合九：10：5：3：3：1；
表5大枣粉与其它辅料的配比
组合一 组合二 组合三 组合四 组合五 组合六 组合七 组合八 组合九
1号 3.33×10<sup>8</sup> 2.95×10<sup>8</sup> 3.03×10<sup>8</sup> 2.81×10<sup>8</sup> 3.21×10<sup>8</sup> 4.64×10<sup>8</sup> 4.55×10<sup>8</sup> 6.01×10<sup>8</sup> 5.72×10<sup>8</sup>
2号 1.95×10<sup>7</sup> 2.33×10<sup>7</sup> 3.3×10<sup>7</sup> 4.22×10<sup>7</sup> 4.08×10<sup>7</sup> 3.02×10<sup>7</sup> 4.07×10<sup>7</sup> 4.22×10<sup>7</sup> 3.22×10<sup>7</sup>
3号 5.28×10<sup>7</sup> 5.68×10<sup>7</sup> 6.47×10<sup>7</sup> 6.78×10<sup>7</sup> 6.36×10<sup>7</sup> 5.78×10<sup>7</sup> 6.68×10<sup>7</sup> 7.64×10<sup>7</sup> 7.43×10<sup>7</sup>
4号 3.53×10<sup>8</sup> 3.67×10<sup>8</sup> 4.29×10<sup>8</sup> 3.28×10<sup>8</sup> 4.37×10<sup>8</sup> 4.22×10<sup>8</sup> 5.25×10<sup>8</sup> 5.95×10<sup>8</sup> 5.56×10<sup>8</sup>
5号 2.77×10<sup>7</sup> 3.18×10<sup>7</sup> 4.77×10<sup>7</sup> 6.22×10<sup>7</sup> 5.98×10<sup>7</sup> 7.48×10<sup>7</sup> 6.74×10<sup>7</sup> 8.86×10<sup>7</sup> 7.18×10<sup>7</sup>
总活菌数 5.83×10<sup>8</sup> 5.9×10<sup>8</sup> 5.67×10<sup>8</sup> 7.1×10<sup>8</sup> 7.3×10<sup>8</sup> 6.44×10<sup>8</sup> 7.91×10<sup>8</sup> 8.42×10<sup>8</sup> 7.82×10<sup>8</sup>
由表5可知,得到的最优配比为组合八：大枣粉：大豆粉：山药：龙眼肉：阿胶＝10：5：2：2：1，总活菌数为8.42×108CFU/g。
2、菌种接种量的确定
植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33和副干酪乳杆菌TK1501甘油管分别按1％接种于大枣活化培养基(每100ml水中添加10g大豆粉，灭菌条件为，121℃，20min；)进行一次活化；均活化20h，然后均按10％(v/w)的接菌量转接入二次活化培养基(同一次活化培养基)中，二次活化24h，在大枣固态发酵培养基(大枣粉：大豆粉：山药粉：龙眼肉粉：阿胶粉＝10：5：2：2：1；大枣+其它辅料和水料水比为1：1.4(质量体积比)制得固态发酵培养基，灭菌条件为，121℃，20min)；同时接种植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33和副干酪乳杆菌TK1501种子液进行混菌发酵，混菌固态发酵24h，37℃，pH维持在7.2-7.4。对发酵后培养基中的益生菌活菌数进行检测。
接种量：将等量的植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501同时接入固态发酵培养基，接种量分别为：1×106CFU/g；5×106CFU/g；1×107CFU/g；5×107CFU/g四组，结果如表6所示：
表6大枣固态发酵不同接种量下的活菌数(CFU/g)
结果如表6所示：植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501的最佳接种量为5×107CFU/g，即测得所得大枣益生菌发酵功能性食品中的总活菌数为4.63×109CFU/g。其中，植物乳杆菌活菌数为2.67×109CFU/g，动物双歧杆菌的活菌数达到1.61×108CFU/g，青春双歧杆菌活菌数为1.93×108CFU/g，凝结芽孢杆菌活菌数为1.86×109CFU/g，副干酪乳杆菌活菌数为4.57×109CFU/g，
3、料水比的确定
大枣固态发酵培养基：大枣粉：大豆粉：山药粉：龙眼肉粉：阿胶粉＝10：5：2：2：1；大枣+其它辅料和水的比例(质量体积比)分别为1：1.25，1：1.4，1：1.6，1：1.8，1：2。即混合料40g对应50、56、64、72、80ml水。
植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501的甘油管按1％接种于大豆粉活化培养基进行一次活化，均活化20h，然后均按10％(v/v)的接种量转接入二次活化培养基中，二次活化24h。在液态发酵培养基中接种植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501种子液混菌发酵。使得接入到大枣液态发酵培养基中植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501，均为5×107CFU/mL；pH7.2-7.4，培养温度37℃，培养时间：24h，对发酵后培养基中的益生菌活菌数进行检测。
结果如下表所示：最佳料水比为1：1.4，即测得所得大枣益生菌发酵功能性食品中的总活菌数为9.03×108CFU/g。其中，植物乳杆菌活菌数为5.71×108CFU/g，动物双歧杆菌的活菌数达到1.86×108CFU/g，青春双歧杆菌的活菌数为1.93×108CFU/g，凝结芽孢杆菌的活菌数为4.32×108CFU/g，副干酪乳杆菌的活菌数为5.78×108CFU/g，
表7大枣和其它辅料与水的配比为1：1.25-2时，益生菌活菌数(CFU/g)
比例 1：1.25 1:1.4 1：1.6 1：1.8 1：2
TK9单菌 4.71×10<sup>8</sup> 5.71×10<sup>8</sup> 5.25×10<sup>8</sup> 4.94×10<sup>8</sup> 4.79×10<sup>8</sup>
937单菌 1.07×10<sup>8</sup> 1.86×10<sup>8</sup> 1.01×10<sup>8</sup> 9.93×10<sup>7</sup> 9.78×10<sup>7</sup>
TK99 1.27×10<sup>8</sup> 1.93×10<sup>8</sup> 1.24×10<sup>8</sup> 9.62×10<sup>7</sup> 9.31×10<sup>7</sup>
TQ33 3.98×10<sup>8</sup> 4.32×10<sup>8</sup> 3.96×10<sup>8</sup> 3.50×10<sup>8</sup> 2.97×10<sup>8</sup>
TK1501 4.65×10<sup>8</sup> 5.78×10<sup>8</sup> 5.58×10<sup>8</sup> 4.96×10<sup>8</sup> 4.25×10<sup>8</sup>
总活菌数 8.79×10<sup>8</sup> 9.03×10<sup>8</sup> 8.99×10<sup>8</sup> 8.19×10<sup>8</sup> 7.02×10<sup>8</sup>
4、培养时间的确定
植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501的甘油管分别按1％接种于大豆粉液态培养基进行一次活化，均活化20h，然后均按10％(v/w)的接菌量转接入二次活化培养基(同一次活化培养基)中，二次活化24h，在料水比及原料比已经优化的大枣固态发酵培养基(大枣粉：大豆粉：山药粉：龙眼肉粉：阿胶粉＝10：5：2：2：1；大枣+其它辅料和水的比例(质量体积比)分别为1：1.4)中同时接种植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33和副干酪乳杆菌TK1501种子液，接种量分别均为5×107CFU/g，进行混菌发酵。分别混菌发酵12、24、36、48h，37℃，pH自然。对发酵后培养基中的益生菌活菌数进行检测。
表8不同发酵时间对培养后益生菌活菌数的影响
12h 24h 36h 48h
1号 6.39×10<sup>8</sup> 7.57×10<sup>8</sup> 5.36×10<sup>8</sup> 4.74×10<sup>8</sup>
2号 6.11×10<sup>7</sup> 7.21×10<sup>7</sup> 6.26×10<sup>7</sup> 5.89×10<sup>7</sup>
3号 8.97×10<sup>6</sup> 9.91×10<sup>6</sup> 9.45×10<sup>6</sup> 8.81×10<sup>6</sup>
4号 8.47×10<sup>7</sup> 9.27×10<sup>7</sup> 8.59×10<sup>7</sup> 8.25×10<sup>7</sup>
5号 6.31×10<sup>8</sup> 7.77×10<sup>8</sup> 6.21×10<sup>8</sup> 5.51×10<sup>8</sup>
总活菌数 7.41×10<sup>8</sup> 8.51×10<sup>8</sup> 6.91×10<sup>8</sup> 6.63×10<sup>8</sup>
结果如表8所示：最佳培养时间为接种后再混菌发酵24h，总活菌数为8.51×108CFU/g。
5、所述大枣益生菌固态发酵功能性食品的制备方法，具体步骤如下：
(1)按大枣粉：大豆粉：山药粉：龙眼肉粉：阿胶粉＝10：5：2：2：1称取大枣粉、大豆粉、山药粉、龙眼肉粉、阿胶粉并混合，将混合料与水按1：1.4(m:V)混合均匀后，121℃，20min灭菌制得固态发酵培养基；
(2)菌种活化：方式同实施例1液态发酵；
(3)将二级种子液接入固态发酵培养基中，使得每克固态培养基中，植物乳杆菌的接种量为5×107CFU/g，动物双歧杆菌的接种量为5×107CFU/g，青春双歧杆菌的接种量为5×107CFU/g，凝结芽孢杆菌的接种量为5×107CFU/g，副干酪乳杆菌的接种量为5×107CFU/g；37℃，混菌固态发酵24h；
(4)发酵结束后，放入真空冷冻干燥机内36小时，至含水量不大于5％，制得大枣益生菌固态发酵食品。
6、益生菌固态发酵工艺-发酵前后培养基活性成分变化(抗氧化物含量、维生素C含量、黄酮类、环磷酸腺苷、叶酸、大枣多糖)
植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33和副干酪乳杆菌TK1501甘油管分别按1％接种于豆粉液态培养基进行一次活化，均活化20h，然后均按10％(v/w)的接菌量转接入二次活化培养基(同一次活化培养基)中，二次活化24h，在料水为1：1.4，原料比为大枣粉：大豆粉：山药粉：龙眼肉粉：阿胶粉＝10：5：2：2：1的大枣固态发酵培养基中同时接种植物乳杆菌TK9、动物双歧杆菌937、青春双歧杆菌TK99、凝结芽孢杆菌TQ33、副干酪乳杆菌TK1501种子液，接种量分别均为5×107CFU/g，进行混菌发酵24h，37℃，pH维持在7.2-7.4，单菌发酵时接种量为2×108CFU/g，其他条件不变。
利用活氧指数法(ORAC)测定抗氧化物含量；利用高效液相法测定维生素C和黄酮类物质含量；利用福林酚反应测定总酚类含量；参考郜文和徐菲等人文章中的测定方法用HPLC法测定环磷酸腺苷的含量；用HPLC-UV法测定叶酸含量；利用DNS法测定还原糖含量，结果见表9：
表9大枣固态发酵前后活性成分变化
检测项目 1 2 3 4 5 6 7
抗氧化物(mmol TE/ml) 0.0171 0.0278 0.0233 0.0191 0.0237 0.0225 0.0176
维C类(mmg/ml) 7.8 9.9 9.2 8.5 8.2 8.4 9.1
黄酮类(mg/ml) 0.13 0.37 0.20 0.19 0.31 0.22 0.31
环磷酸腺苷(μg/ml) 60.5 88.2 73.4 67.3 71.8 72.8 74.9
叶酸(μg/ml) 1.397 2.832 2.821 2.625 2.804 2.565 2.741
大枣多糖(mg/ml) 0.52 0.82 0.72 0.71 0.72 0.71 0.68
注：以编号表示各阶段：1-发酵前含量；2-混菌发酵后含量；3-植物乳杆菌TK9发酵后含量；4-动物双歧杆菌937发酵后含量；5-青春双歧杆菌TK99发酵后含量；6-凝结芽孢杆菌TQ33发酵后含量；7-副干酪乳杆菌TK1501发酵后含量；
由表9可知，大枣在经过固态发酵后活性成分都有提高。尤其是混菌发酵后活性物质提高更为明显，环磷酸腺苷含量在经发酵后有所增加，大枣混菌发酵后环磷酸腺苷含量达到为88.2μg/ml，均高于单菌发酵，该成分有调节免疫反应，维持血管内环境稳定的功效；经混菌发酵后，大枣饮料中的维C类含量达到9.9mg/ml，均高于单菌发酵，维C类物质都具有抗氧化功效，是女性美容养颜必不可少的活性物质；混菌后发酵后抗氧化活性明显提高。经混菌发酵后，大枣发酵饮料中黄酮类物质含量明显增加，含量达到0.37mg/ml，黄酮类物质具有降血糖血脂和抗氧化功效，异黄酮的美容养颜效果早已收到公认；大枣混菌发酵饮料中叶酸含量相对于单菌发酵增加显著，经益生菌发酵后达2.822μg/ml，叶酸参与血细胞的形成，有补血的功效；大枣混菌发酵饮料中大枣多糖的含量是发酵前的近两倍，大枣中的多糖种类丰富，且具有补血养颜的作用。活性物质检测的结果表明利用混菌发酵可以开发出营养更丰富的大枣功能性饮料。
实施例3：益生菌液态发酵饮料和固态食品具有美容养颜功能试验
1、实验材料：NIH小鼠30只，随机分为6组(正常组、模型组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4)。
2、实验方法：实验小鼠适应性喂养7天后，模型组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4小鼠每日背部皮下注射5％D-半乳糖，注射量为1g/kg，正常组每日注射等体积的生理盐水，持续造模40天，于第41天，实验组1给予实施例1-4样品灌胃、实验组2给予实施例2-5样品灌胃，将固体样品溶于水得1mg/ml溶液灌胃。实验组3给予实施例1-4未发酵空白样品灌胃。实验组4给予未经益生菌发酵的实施例2-5未发酵空白样品灌胃，将固体样品溶于水得1mg/ml溶液灌胃。正常组和模型组给予相同体积的生理盐水灌胃，每日进行灌胃，连续灌胃30天后处死小鼠，测定小鼠的皮肤含水量、皮肤透明质酸含量、皮肤弹性蛋白含量，上述实验中对各实验组造模和灌胃处理方式见表10所示
表10：各实验组的不同处理方法
造模方式 灌胃试剂
实验组1 5％D-半乳糖1g/kg.day 大枣液态发酵样品40ml/kg.day
实验组2 5％D-半乳糖1g/kg.day 大枣固态发酵样品40mg/kg.day
实验组3 5％D-半乳糖1g/kg.day 大枣液态未发酵样品40ml/kg.day
实验组4 5％D-半乳糖1g/kg.day 大枣固态未发酵样品40mg/kg.day
模型组 5％D-半乳糖1g/kg.day 生理盐水(等体积)
正常组 生理盐水(等体积) 生理盐水(等体积)
检测实验小鼠皮肤的含水量具体结果见表11
表11：不同实验组小鼠皮肤含水量
组号 皮肤含水量(％)
实验组1 64.10±1.11
实验组2 63.32±1.01
实验组3 54.96±1.10
实验组4 55.08±1.11
模型组 35.68±1.21
正常组 53.71±1.03
由表11的数据可以看出经发酵饮料灌胃后的小鼠皮肤含水量高于对照组，且实验组1、2高于实验组3、4的皮肤含水量。说明大枣发酵的液态饮料和固态食品有为肌肤补水的功能。且发酵过的样品比未经发酵的样品补水功能更显著。
2、应用透明质酸ELISA试剂盒，检测实验小鼠皮肤的透明质酸含量，具体结果见表12
表12：不同实验组小鼠皮肤透明质酸含量
组号 透明质酸含量(μg/mg prot)
实验组1 224±13
实验组2 227±12
实验组3 202±11
实验组4 204±12
模型组 158±15
正常组 190±12
由表12可知，经发酵饮料灌胃后的小鼠皮肤透明质酸含量高于对照组，且实验组1、2高于实验组3、4的透明质酸含量。说明大枣发酵的液态饮料和固态食品对皮肤的美容养颜有明显作用。且发酵过的样品比未经发酵的样品的美容养颜作用更显著。
3、应用弹性蛋白ELISA试剂盒，检测实验小鼠皮肤的弹性蛋白含量，具体结果见表13：
表13：不同实验组小鼠弹性蛋白含量
组号 弹性蛋白含量(ug/g)
实验组1 776±14
实验组2 775±18
实验组3 751±13
实验组4 753±15
模型组 450±15
正常组 730±22
由表13可知，经发酵饮料灌胃后的小鼠皮肤弹性蛋白含量高于对照组，且实验组1、2高于实验组3、4的弹性蛋白含量。说明大枣发酵的液态饮料和固态食品可以提高皮肤弹性蛋白含量，延缓衰老，美容养颜。且发酵过的样品比未经发酵的样品作用更显著。
实施例4：益生菌液态发酵饮料和固态食品具有美容养颜功能试食试验
1、病例选择：所选240个病例来源于门诊病人，将240人随机分为四组，每组60人。具备以下基本特征的病例入选:面部淡褐色至深褐色，界限清础的斑片，通常对称性分布，无炎性表现及鳞屑；无明显自觉症状；主要发生在青春期后，女性多发；病情有一定的季节性，夏重冬轻；无明显内分泌疾病，并排除其他疾病引起的色素沉着。排除以下情况:(1)年龄在18岁以下或65岁以上者；(2)妊娠或哺乳期妇女，对保健食品过敏者；(3)合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病，精神病患者；(4)吸烟或嗜酒者；(5)短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者；(6)不符合纳入标准，未按规定食用受试样品，无法判定功效或资料不全影响功效或安全性判断者。
2、治疗方法：
组Ⅰ病人给予本发明实施例1-4产品，每次50ml每天3次，口服，疗程为30天，受试者在试验期间停止口服或外用有关养颜祛斑的药物或者保健品及化妆品。
组Ⅱ病人给予本发明实施例1-4中未经发酵的产品，每次50ml，每天3次，口服，疗程为30天，受试者在试验期间停止口服或外用有关养颜祛斑的药物或者保健品及化妆品。
组Ⅲ病人给予本发明实施例2-5产品，每次50mg每天3次，口服，疗程为30天，受试者在试验期间停止口服或外用有关养颜祛斑的药物或者保健品及化妆品。
组Ⅳ病人给予本发明实施例2-5中未经发酵的产品，每次50mg，每天3次，口服，疗程为30天，受试者在试验期间停止口服或外用有关养颜祛斑的药物或者保健品及化妆品。
3、临床症状
了解受试者饮食情况，观察其临床症状：疲劳感、皮肤光泽、睡眠情况等。按照症状轻重统计分值，其中重症3分，中度2分、轻微1分，并且统计改善率，每一症状改善显效为2分，有效为1分。具体情况详见表14、表15、表16、表17
表14：试食效果临床症状改善情况(组Ⅰ)
显效(2分) 有效(1分) 无效(0分)
疲劳感 47 10 3
皮肤光泽 47 9 4
睡眠 48 9 3
表15：试食效果临床症状改善情况(组Ⅱ)
显效(2分) 有效(1分) 无效(0分)
疲劳感 38 11 11
皮肤光泽 37 10 13
睡眠 36 12 12
表16：试食效果临床症状改善情况(组Ⅲ)
显效(2分) 有效(1分) 无效(0分)
疲劳感 47 11 2
皮肤光泽 47 9 4
睡眠 48 10 2
表17：试食效果临床症状改善情况(组Ⅳ)
显效(2分) 有效(1分) 无效(0分)
疲劳感 39 11 10
皮肤光泽 38 10 12
睡眠 37 12 11
由表14、15、16、17可知，组Ⅰ中60个病例，“疲劳感”临床症状显效47例，有效10例，无效3例，总有效率达95％；“皮肤光泽改善”临床症状显效37例，有效10例，无效13例，总有效率达93％；“睡眠改善”临床症状显效48例，有效9例，无效3例，总有效率达95％。
组Ⅱ中60个病例，“疲劳感”临床症状显效38例，有效11例，无效11例，总有效率达81％；“皮肤光泽改善”临床症状显效37例，有效10例，无效13例，总有效率达78％；“睡眠改善”临床症状显效36例，有效12例，无效12例，总有效率达80％。
组Ⅲ中60个病例，“疲劳感”临床症状显效47例，有效11例，无效2例，总有效率达96％；“皮肤光泽改善”临床症状显效37例，有效10例，无效13例，总有效率达93％；“睡眠改善”临床症状显效48例，有效9例，无效3例，总有效率达96％。
组Ⅳ中60个病例，“疲劳感”临床症状显效39例，有效11例，无效10例，总有效率达83％；“皮肤光泽改善”临床症状显效38例，有效10例，无效12例，总有效率达80％；“睡眠改善”临床症状显效37例，有效12例，无效11例，总有效率达81％。
4、功效性指标
黄褐斑面积大小检测：用标尺测量试食前后受试者同一黄褐斑的长度和宽度，计算其面积(cm2)。
黄褐斑颜色深浅检测:按照中国科学院地理研究所设计研制，测绘出版社1992年出版的《实用标准色卡》(第一版)中的棕色(Y+M+BK即黄+品红+黑的叠色)色卡为黄褐斑深浅的判断标准:I度(15、20、5)，II度(30、40、10)，III度(40、60、15)。对试食前后黄褐斑颜色积分和面积变化进行统计，同时计算有效率。
功效判定标准：
显效：黄褐斑颜色下降II度，面积减少大于30％，且不产生新黄褐斑。
有效：黄褐斑颜色下降I度，面积减少大于10％-30％，且不产生新黄褐斑。
无效：黄褐斑颜色及面积无明显变化。
5、结果
表18：试食效果黄斑改善情况
显效(2分) 有效(1分) 无效(0分)
组Ⅰ 48 9 3
组Ⅱ 30 5 25
组Ⅲ 49 8 3
组Ⅳ 30 7 23
组Ⅰ中60个病例，显效48例，有效9例，无效3例，总有效率达95％。
组Ⅱ中60个病例，显效30例，有效5例，无效25例，总有效率达58％。
组Ⅲ中60个病例，显效49例，有效8例，无效3例，总有效率达95％。
组Ⅳ中60个病例，显效30例，有效7例，无效23例，总有效率达62％。
实施例5：感官评价
参照中华人民共和国国家标准GB 10220-2012《感观分析方法学总论》中的方法，对按照实施例1、2的方法制备产品进行味道感官评价，其中，味道感官评价的评分表标准如下表所示：
感官评价评分标准
根据以上方法及评分标准，邀请10位优选评价员对各实施例制得的产品进行评分，并最终计算平均分，数据记录结果如表18所示
表18：感官评价得分
味道(9分)
实施例1-4 8.5
实施例2-5 8.1
以上分析可知，本益生菌发酵产品风味独特，为大众喜爱。
经小鼠实验和试食实验(实施例3、实施例4)，本发明所生产益生菌发酵饮料和食品具有提高皮肤透明质酸和弹性蛋白含量的功效，而且对皮肤黄斑有明显改善作用，具有有效的美容养颜功能。而且对睡眠质量，精神状态有良好的改善。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种大枣益生菌混菌发酵食品，其特征在于，所述发酵食品是利用包括植物乳杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、副干酪乳杆菌在内的益生菌对大枣、大豆粉、山药粉、龙眼肉粉、阿胶粉进行液态或固态混菌发酵所得。
2.如权利要求1所述的一种大枣益生菌混菌发酵食品，其特征在于，所述液态混菌发酵的步骤如下：
发酵培养基：每100ml水中添加10-15g大枣粉，另外添加1-5g的大豆粉、1-3g山药粉、1-3g龙眼肉粉、1g阿胶粉，121℃，20min灭菌得液态发酵培养基；
将种子液按如下接种量接种于发酵培养基中，混菌液态发酵24-48h，温度为37℃；植物乳杆菌，动物双歧杆菌，青春双歧杆菌，凝结芽孢杆菌，副干酪乳杆菌的接种量均为105-107CFU/ml；
发酵结束后，发酵液经乳化、加稳定剂、调酸、调香、均质、杀菌后即得大枣益生菌液态发酵饮料。
3.如权利要求2所述的一种大枣益生菌混菌发酵食品，其特征在于，发酵培养基每100ml水中添加11g大枣粉，5g的大豆粉，2g的山药粉，2g的龙眼肉粉，1g的阿胶粉。
4.如权利要求2所述的一种大枣益生菌混菌发酵食品，其特征在于，混菌液态发酵时间为24h。
5.如权利要求2所述的一种大枣益生菌混菌发酵食品，其特征在于，植物乳杆菌，动物双歧杆菌，青春双歧杆菌，凝结芽孢杆菌，副干酪乳杆菌的接种量均为5×107CFU/ml。
6.如权利要求1所述的一种大枣益生菌混菌发酵食品，其特征在于，所述固态混菌发酵的步骤如下：
(1)按质量比大枣粉：大豆粉：山药粉：龙眼肉粉：阿胶粉＝10-15:1-5:1-3:1-3:1称取原料并混合，将混合料与水按质量体积比1：1.25-2混合均匀后，121℃，20min灭菌制得固态发酵培养基；
(2)将种子液接入固态发酵培养基中，使得每克固态培养基中，植物乳杆菌，动物双歧杆菌，青春双歧杆菌，凝结芽孢杆菌，副干酪乳杆菌的接种量均为106-107CFU/g；37℃，混菌固态发酵24-48h；
(3)发酵结束后，放入真空冷冻干燥机内24-48小时，制得大枣益生菌固态发酵食品。
7.如如权利要求6所述的一种大枣益生菌混菌发酵食品，其特征在于，大枣粉：大豆粉：山药粉：龙眼肉粉：阿胶粉＝10:5:2:2:1；混合料与水按质量体积比1：1.4。
8.如权利要求6所述的一种大枣益生菌混菌发酵食品，其特征在于，混菌固态发酵24h。
9.如权利要求6所述的一种大枣益生菌混菌发酵食品，其特征在于，发酵结束后，真空冷冻干燥36h，至含水量不大于5％。
10.如权利要求1-9任意一项所述的一种大枣益生菌混菌发酵食品，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TK9，保藏编号为CGMCC No.11891；所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)937，保藏编号为CGMCCNo.11892；所述青春双歧杆菌为青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)TK99，保藏编号为CGMCC No.12784；所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33，保藏编号为：CGMCC No.5233；所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)TK1501，保藏编号为CGMCC No.13130。
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