CN108294205A - 利用青春双歧杆菌和凝结芽孢杆菌发酵制备益生菌饮品或冲调食品的方法 - Google Patents
利用青春双歧杆菌和凝结芽孢杆菌发酵制备益生菌饮品或冲调食品的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种可巴氏杀菌、常温保存、无后酸化，且可以加热或冲调饮用的益生菌食品及其制备方法。该益生菌发酵食品的制备方法，包括利用青春双歧杆菌和凝结芽孢杆菌分段发酵制备一种可加热益生菌饮品或益生菌冲调食品的方法，具体是以大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉等为主要原料配制液态或固态的发酵基质，利用青春双歧杆菌进行液态发酵或固态发酵，再接入凝结芽孢杆菌进一步发酵；液态发酵结束后经乳化、加稳定剂、调酸、调香、均质、巴氏杀菌后制得可加热益生菌饮品，或者固态发酵结束后经干燥、粉碎制得益生菌冲调食品。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵应用领域，具体涉及利用青春双歧杆菌和凝结芽孢杆菌发酵多种原材料制备益生菌饮品或冲调食品的方法。
背景技术
益生菌是一类通过改善肠道微生态环境从而对宿主产生有益影响的微生物。它可通过参与肠道微生态平衡来抑制病原菌生长，避免了长期使用抗生素产生的耐药性和二重感染，因此，益生菌产品近年来备受人们的关注。
近年来，益生菌饮品的发展一日千里，越来越丰富的益生菌饮品出现在国际市场上，但现有的益生菌饮品保藏方法皆为冷藏，低温下可保持饮品的原有风味，当温度达到常温及以上时益生菌会进一步发酵出现后酸化现象，影响饮品的风味。益生菌饮品中的益生菌大都不耐高温，其灭菌条件十分繁琐需进行多次重复灭菌，在实际益生菌饮料生产过程中会消耗大量的人力物力资源。益生菌发酵饮料饮用方法为直饮法，因其保藏条件为冷藏，所以肠胃不适患者并不能饮用该类饮品，无法摄入有益微生物、不能保护肠道，进而陷入这个不良的循环当中。目前益生菌固态饮品也很常见，但都以冷冻干燥法制得，需要冷藏，因此存在生产和保藏费用高的缺陷。其主要原因是益生菌发酵产品的活菌不耐高温而无法用高温烘干法制成粉剂，即使冷冻干燥制成的粉剂在热水冲服过程中活菌也会被灭活，无法达到保护肠道的功效。目前，凝结芽孢杆菌发酵生成芽孢的技术尚不成熟，如何使凝结芽孢杆菌大量产生芽孢是该技术的关键。
目前对于能常温保存且可加热饮用的益生菌饮料尚未有报道，利用凝结芽孢杆菌产芽孢特性发酵制备食品方面的研究极少，主要为以下这些：
公开号106212673A的专利申请《一种利用凝结芽孢杆菌制备酸奶的方法》公开了一种利用凝结芽孢杆菌制备酸奶的方法，主要操作是在奶粉中加入热水，搅拌使其均匀分散，再接种凝结芽孢杆菌，静置发酵后即可形成酸奶。本发明提供的酸奶制备方法简单，传统酸奶制备方法繁琐，需要多次调节温度进行均质、杀菌，而本发明只需要一次高温，而该温度可以抑制其他菌种的生长，保证了酸奶的品质。
公开号107047778A的专利申请《凝结芽孢杆菌混菌发酵豆类食品及其制备方法》公开了一种凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌液体、固态发酵豆类食品及其制备方法。所述发酵食品是以大豆和黑豆中的至少一种，或大豆和黑豆中的至少一种混合其他豆类作为发酵基质，采用凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌进行混菌发酵后获得的,所得产品不仅口感和营养成分优于单菌发酵，凝结芽孢杆菌在繁殖过程可以利用氨作为氮源，消耗掉了传统纳豆生产过程中产生的氨气，使得产品没有了传统纳豆的臭氨味和豆类食品的豆腥味，氨气释放量低于10mg/kg。
上述现有技术公开的益生菌饮品制备方法以凝结芽孢杆菌和其它益生菌发酵牛奶、大豆等制备食品，其制备方法较为单一，发酵完成后均需要冷冻干燥和低温保藏，未能将凝结芽孢杆菌生成芽孢耐高温的特有性质发挥出来，利用凝结芽孢杆菌发酵制备能常温保存和加热的饮品尚未有报道。
发明内容
本发明目的是提供一种可巴氏杀菌、常温保存、无后酸化，且可以加热或冲调饮用的益生菌食品及其制备方法，并为相关产品的生产提供研究思路。
本发明的技术方案概述如下：
一种益生菌发酵食品的制备方法，包括利用青春双歧杆菌和凝结芽孢杆菌分段发酵制备一种可加热益生菌饮品或益生菌冲调食品的方法，具体是以大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉等为主要原料配制液态或固态的发酵基质，利用青春双歧杆菌进行液态发酵或固态发酵，再接入凝结芽孢杆菌进一步发酵；液态发酵结束后经乳化、加稳定剂、调酸、调香、均质、巴氏杀菌后制得可加热益生菌饮品，或者固态发酵结束后经干燥、粉碎制得益生菌冲调食品。
进一步地，所述可加热益生菌饮品的制备方法包括如下步骤：
(1)配制液态发酵基质：原料大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉与水的料水比为5-35:100(g/mL)，搅拌均匀，121℃灭菌20min；
(2)菌种活化：青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入以大豆和水组成的活化培养基进行活化，pH自然，密闭培养，温度为36-38℃，培养19-20h后，按10％的接种量将一级种子液再次转接入活化培养基，以相同条件进行二次活化20-22h后得二级种子液；
(3)液态发酵：将青春双歧杆菌二级种子液接入装有液态发酵基质的液态发酵罐中，36-38℃密闭厌氧发酵9-15h，再接入凝结芽孢杆菌二级种子液，36-38℃通气有氧发酵12-24h，通气量3:1V/V·min(以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示)；
(4)发酵结束后发酵液经乳化、加稳定剂、调酸、调香、均质、巴氏杀菌后即得可加热益生菌饮品。
进一步地，所述益生菌冲调食品的制备方法包括如下步骤：
(1)配制固态发酵基质：原料大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉与水的料水比为1-3:1(g/mL)，搅拌均匀，121℃灭菌20min；
(2)菌种活化：青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入以大豆和水组成的活化培养基进行活化，pH自然，密闭培养，温度为36-38℃，培养时间19-20h，作为种子液；
(4)固态发酵：将青春双歧杆菌种子液接入到装有固态发酵基质的固态发酵罐中进行密闭厌氧发酵，36-38℃下固态发酵8-15h，再接入凝结芽孢杆菌36-38℃下通气有氧发酵12-24h；
(5)发酵结束后，发酵产物放置于60-70℃烘箱烘干8小时后，取出粉碎制得益生菌冲调食品。
优选的，所述原料大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉的质量比为1-10:1-10:1-10:1-10:1-10。
更优选的，所述液态发酵基质的大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉与水的质量体积比为10:10:6:2:5:100(g/mL)，所述固态发酵基质的大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉与水的质量体积比为5:2:1:4:3:15(g/mL)。
优选的，所述青春双歧杆菌或凝结芽孢杆菌的接种量为106-108CFU/mL或106-108CFU/g。
更优选的，所述液态发酵中，青春双歧杆菌的接种量为5×106CFU/mL，凝结芽孢杆菌的接种量为1×107CFU/mL。
更优选的，所述固态发酵中，青春双歧杆菌的接种量为5×106CFU/mL，凝结芽孢杆菌的接种量为5×107CFU/mL。
优选的，所述液态发酵或固态发酵的温度为37℃。
优选的，所述青春双歧杆菌的发酵时间为12h，所述凝结芽孢杆菌的发酵时间为24h。
优选的，所述固态发酵烘箱干燥条件为70℃烘干8h。
优选的，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌TQ33(BaciLLus coaguLans TQ33)，保藏编号为：CGMCC No.5233。
优选的，所述青春双歧杆菌为青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)TK99，保藏编号为CGMCC No.12784。
所述原料为直接购买的大豆粉、枸杞粉、苦荞粉、小扁豆粉、大枣粉等市售原材料或通过本领域常规方法将大豆、枸杞、苦荞、小扁豆、大枣等自制成粉，并分别过80-100目筛。
有益效果：
大豆含有大量的脂类和膳食纤维。大豆脂肪具有很高的营养价值，这些脂肪里含有很多不饱和脂肪酸，容易被人体消化吸收。而且大豆脂肪可以阻止胆固醇的吸收，所以大豆对于动脉硬化患者来说，是一种理想的营养品。豆渣中的膳食纤维对促进良好的消化和排泄固体废物有着举足轻重的作用。适量地补充纤维素，可使肠道中的食物增大变软，促进肠道蠕动，从而加快了排便速度，具有防止便秘和降低肠癌的优点。同时，膳食纤维具有明显的降低血浆胆固醇、调节胃肠功能及胰岛素水平等功能。
大枣具有抗癌、降血压、降固醇、保肝护肝、预防骨质疏松、防治脑供血不足、防治脑溢血、防治胆结石的作用。枣能提高人体免疫力，并可抑制癌细胞，大枣中的维生素P含量为所有果蔬之冠，其具有维持毛细血管通透性，改善微循环从而预防动脉硬化的作用。大枣能提高体内单核细胞的吞噬功能，有保护肝脏、增强体力的作用；大枣中的维生素C，能减轻化学药物对肝脏的损害，并有促进蛋白质合成，增加血清总蛋白含量的作用。
苦荞麦中富含了大量的的可溶性膳食纤维和维生素E，苦荞麦中含有的黄酮营养成分具有消炎、抗菌、止咳、祛痰、平喘等多种作用，因此，苦荞麦还被誉为“消炎粮食”的美名，苦荞麦的功效与作用除此之外，它还具有降低血糖的功效。
小扁豆籽粒含蛋白质约25％，脂肪0.7％，碳水化合物60％及多种维生素和矿物质营养元素。小扁豆可以提供蛋白质和能够降低胆固醇的可溶纤维，它的含铁量是其他豆类的两倍；小扁豆中维生素B和叶酸的含量也较高，叶酸对女性非常重要，可以降低胎儿畸形率；深色扁豆里的色素有抗氧化剂的作用，可以预防心脏病和癌症，抗衰老。
枸杞子含甜菜碱、胡萝卜素、玉蜀黍黄素、烟酸、维生素B1、维生素B2、维生素C、钙、磷、铁、β-谷甾醇、亚油酸，以及14种氨基酸。枸杞有滋补肝肾，益精明目的作用。常用于虚劳精亏，腰膝酸痛，眩晕耳鸣，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明。除此之外，还有增强非特异性免疫、延缓衰老、保肝护肝、降血糖的作用。
通过青春双歧杆菌厌氧发酵多种原材料，可大幅度减少原材料中所含有的还原糖，营造凝结芽孢杆菌产芽孢的有利条件。凝结芽孢杆菌发酵生产益生菌的饮料和粉剂食品，在保留其活性成分的同时将高能量物质转换为利于肠道系统平衡的小分子物质。利用凝结芽孢杆菌发酵出的益生菌饮料食品与传统益生菌产品有所不同，其在保留了传统益生菌保护肠道系统的优点的同时，还增加了可巴氏杀菌、常温保存且存在活菌、无后酸化、可加热食用的特点。同时本品加热后，肠胃不适患者饮用效果更佳。
凝结芽孢杆菌自然发酵状态下难以达到高产芽孢的效果，主要原因是培养基中存在大量的还原糖不利于凝结芽孢杆菌芽孢的生成。而原材料中存在大量的还原糖，在正常发酵条件下，需要经过很长时间才能消耗掉培养基中存在的还原糖。青春双歧杆菌可快速消耗多糖的特性与凝结芽孢杆菌消耗多糖慢的特性恰好呈现出互补关系，在凝结芽孢杆菌与青春双歧杆菌混菌发酵时凝结芽孢杆菌可抑制青春双歧杆菌的生长，呈现出优势菌的特性。经巴氏杀菌后青春双歧杆菌和非芽孢活菌体均会被杀死，只留下凝结芽孢杆菌芽孢。
本发明采用青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌对大豆粉及多种原材料进行分段发酵，巴氏杀菌后产品与传统益生菌发酵相比较，该发酵产品的活菌体多以凝结芽孢杆菌的芽孢形式存在。凝结芽孢杆菌的芽孢可耐受高温和强酸，液态发酵产品在80℃×20min处理后其芽孢存活率依然在99％以上。由于凝结芽孢杆菌芽孢的特殊耐热机制，凝结芽孢杆菌发酵大豆粉和多种原材料生成的可加热饮料和粉剂食品能进行巴氏杀菌，避免了传统益生菌发酵产品需低温多次灭菌的过程，节约了能源的同时缩短了生产周期。同时凝结芽孢杆菌发酵大豆粉和多种原材料生成的可加热饮料能在常温下保存，凝结芽孢杆菌的芽孢在常温无氧条件下不会萌发，不会出现后发酵和后酸化现象。传统益生菌发酵产品中活菌体不耐高温，冷冻干燥后制备的益生菌粉剂用热水冲服会杀灭活菌体，因而不具备高温干燥制作粉剂的可行性。本益生菌固态发酵产品因其活菌体以芽孢形式存在而耐高温，通过干燥制得益生菌粉剂用80℃热水冲服活菌含量依然保持在97.5％以上。
本发明所述的青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌分段发酵大豆和多种原材料生成可加热饮料和粉剂食品，在发酵过程保留了多种发酵原料特有的营养成分的同时，将高热量的物质转变为有益于人体健康的益生菌和小分子物质，减少了食品中高热量物质且保护了人体的消化系统。现有的益生菌饮料均为冷饮，多数肠胃不适患者无法饮用冷饮，饮用后会出现腹泻、呕吐等现象，而本发明因其特殊的芽孢活菌机制，可加热至80℃活菌含量却不降低。因此，利用凝结芽孢杆菌发酵制备的益生菌热饮也是针对肠胃不适患者精心设计的益生菌饮料。此前，肠胃不适患者因不能饮用凉的益生菌饮料而无法摄入益生菌，肠胃得不到益生菌的保护而变得更加脆弱，进而陷入一个恶性循环当中。有益于消化系统的益生菌、小分子物质及温热的液体对肠胃均有良好的保护作用，它们综合到一起对人体的肠胃保护有着极其重要的作用。本发明在实现益生菌热饮保护肠胃的基础上进一步节约了资源和免除了繁琐的运输条件。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施方案中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。实施方案中涉及到的质量体积比“W/V”或“m/V”，若未特别说明，单位均为g/mL。
实施例1：
一种可加热益生菌发酵饮品的制备方法，包括如下步骤：
(1)将大豆、苦荞、小扁豆、枸杞、大枣清洗晾干后粉碎，分别磨粉过80-100目筛，得原料大豆粉、苦荞粉、小扁豆粉、枸杞粉、大枣粉。
(2)配制大豆粉和水组成的活化培养基，121℃灭菌20min；
(3)配制液态发酵基质：原料大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉的质量比为1-10:1-10:1-10:1-10:1-10，且控制料水比为5-35:100(g/mL)，搅拌均匀，121℃灭菌20min；
(4)菌种活化：青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基装液量为20％，pH自然，培养温度为36-38℃，密闭培养19-20h后，按10％的接种量将一级种子液再次转接入活化培养基，以相同条件进行二次活化20-22h后得二级种子液；
(5)液态发酵：将青春双歧杆菌二级种子液接入装有液态发酵基质的液态发酵罐中，36-38℃密闭厌氧发酵9-15h，再接入凝结芽孢杆菌二级种子液，36-38℃通气有氧发酵12-24h，通气量3:1V/V·min(以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示)；
(6)发酵结束后发酵液经乳化、加稳定剂、调酸、调香、均质、巴氏杀菌后即得可加热益生菌饮品。
发酵得到的益生菌饮品具有大豆、枸杞发酵完的独特香味，口感上浓稠、细腻、顺滑。
实施例2：
在实施例1技术方案的基础上实施下述试验。
2.1原料配比的确定
其他条件与实施例1基本相同，发酵基质采用不同原料配比的组合，发酵制备益生菌饮品，产品中益生菌活菌和芽孢的检测结果见表1。组合一：大豆粉:小扁豆粉:苦荞粉:枸杞粉:大枣粉＝6:4:3:2:5，组合二：大豆粉:小扁豆粉:苦荞粉:枸杞粉:大枣粉＝10:6:7:8:7，组合三：大豆粉:小扁豆粉:苦荞粉:枸杞粉:大枣粉＝10:10:6:2:5，组合四：大豆粉:小扁豆粉:苦荞粉:枸杞粉:大枣粉＝5:4:3:3:5，组合五：大豆粉:小扁豆粉:苦荞粉:枸杞粉:大枣粉＝10:7:8:5:2，水体积固定为100。
表1 不同原料配比组合发酵后益生菌活菌总数及芽孢数(CFU/mL)
| 组合一 | 组合二 | 组合三 | 组合四 | 组合五 | |
| 总活菌数 | 9.19×108 | 1.65×109 | 2.59×109 | 3.72×109 | 4.32×109 |
| 芽孢数 | 9.09×108 | 1.51×109 | 2.54×109 | 2.22×108 | 2.14×109 |
由表1结果可知，组合五总活菌数最高，可达4.32×109CFU/mL。组合三芽孢含量最高，可达2.54×109CFU/mL。
2.2青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌接种量的确定
其他条件与实施例1基本相同，液态发酵基质为大豆粉:小扁豆粉:苦荞粉:枸杞粉:大枣粉:水＝10:10:6:2:5:100(g/mL)。将青春芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌TQ33按以下接菌量1×106、5×106、1×107、5×107CFU/mL分别接种于发酵基质中，37℃发酵，发酵完成之后测定发酵液中的益生菌活菌数和芽孢数，结果见表2。
表2 不同接种量(CFU/mL)发酵产品中的活菌及芽孢数(×108CFU/mL)
结果如表2所示：青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌分别在接种量5×106CFU/mL和1×107CFU/mL时发酵产品中芽孢数含量最高，优选的接种量发酵完成后测得的总活菌数为5.42×109CFU/mL、芽孢数为5.19×109CFU/mL。
2.3发酵时间的确定
在接种量已优化的条件下，液态发酵基质为大豆粉:小扁豆粉:苦荞粉:枸杞粉:大枣粉:水＝10:10:6:2:5:100(g/mL)，其他条件与实施例1基本相同。
青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌的甘油管按1％接种于大豆粉活化培养基进行一次活化，均活化20h，然后均按10％(v/v)的接种量转接入二次活化培养基中，二次活化24h。在液态发酵基质中接种青春双歧杆菌5×106CFU/mL，密闭发酵12h，再接入凝结芽孢杆菌1×107CFU/mL，分别通气发酵12、24、36、48h，分别对发酵液中的益生菌活菌数和芽孢数进行检测，结果见表3。
表3 不同发酵时间培养的活菌及芽孢数(CFU/mL)
| 12h | 24h | 36h | 48h | |
| 总活菌数 | 7.33×108 | 5.99×109 | 5.67×109 | 5.53×109 |
| 芽孢数 | 3.71×108 | 5.4×109 | 5.52×109 | 5.47×109 |
结果如表3所示：液态发酵优选的培养时间为24h，超过24h总活菌数开始下降，芽孢含量增长速率不大。优选的培养时间下，发酵后总活菌数达到5.99×109CFU/mL，芽孢数达到5.4×109CFU/mL。
2.4一种可加热益生菌发酵饮品的制备方法，包括如下步骤：
(1)将大豆、苦荞、小扁豆、枸杞、大枣清洗晾干后粉碎，分别磨粉过100目筛，得原料大豆粉、苦荞粉、小扁豆粉、枸杞粉、大枣粉；
(2)配制活化培养基：每100mL水中添加10g大豆粉，121℃灭菌20min；
(3)配制液态发酵基质：液态发酵罐中，发酵罐装液量70％，每100mL水中加入10g大豆粉、10g小扁豆粉、6g苦荞粉、2g枸杞粉、5g大枣粉，搅拌均匀，121℃灭菌20min；
(4)菌种活化，青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌从甘油管分别按1％接种于活化培养基进行活化，pH自然，控制温度为37℃；分别活化20h后，按10％(v/v)的接菌量再次转接活化培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
(5)液态发酵：将青春双歧杆菌按接菌量为5×106CFU/mL接种于装有液态发酵基质的液态发酵罐中，温度控制在37℃，密闭发酵12h，再次接入凝结芽孢杆菌，接种量1×107CFU/mL，37℃通气发酵24h，通气量3:1V/V·min；
(6)发酵结束后发酵液经乳化后加稳定剂，稳定剂按与发酵液质量体积比进行添加，添加量为羧甲基纤维素钠0.8％，黄原胶0.5％，乳化剂0.9％；添加发酵液质量体积比为8％的异麦酮糖进行调酸调香；在65℃，30MPa的条件下均质一次，经80℃杀菌15min，即得可加热益生菌饮品。检测产品中益生菌总活菌数达到5.73×109CFU/mL，芽孢数达到5.46×109CFU/mL。
2.5可加热饮品加热温度的确定
上述2.4制备的可加热益生菌饮品。将产品分别水浴加热至70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，温育5min再自然降温至40℃，预留空白组不加热，分别对各温度处理产品的益生菌活菌数和芽孢数进行检测。
表4 不同加热温度的活菌数及芽孢数(CFU/mL)
结果如表4所示，加热到80℃以下包括80℃芽孢含量差别不大，但活菌含量有较大差别，即加热温度不够高的情况下非芽孢活菌体含量较高，即低温下若存在杂菌或致病菌等其它菌体存活下来的概率较大；当加热温度高于80℃，活菌及芽孢含量急剧下降。因此，80℃以下是适宜的加热温度，加热的最佳温度为80℃，活菌数为5.40×109CFU/mL，芽孢数为5.37×109CFU/mL，此时芽孢存活率为99.4％。
实施例3：
一种益生菌冲调食品的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料购买成品，过80-100目筛；
(2)配制大豆粉和水组成的活化培养基，121℃灭菌20min；
(3)配制固态发酵基质：原料大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉的质量比为1-10:1-10:1-10:1-10:1-10，且控制料水比为1-3:1(g/mL)，搅拌均匀，121℃灭菌20min；
(4)菌种活化：青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入以大豆和水组成的活化培养基进行活化，pH自然，培养温度为36-38℃，密闭培养19-20h，作为种子液；
(5)固态发酵：将青春双歧杆菌种子液接入到装有固态发酵基质的固态发酵罐中进行密闭厌氧发酵，36-38℃下固态发酵8-15h，再接入凝结芽孢杆菌36-38℃下通气发酵12-24h；
实施例4：
在实施例3技术方案的基础上实施下述试验。
3.1原料配比的确定
其他条件与实施例3基本相同，固态发酵基质采用不同原料配比的组合，发酵产品中益生菌活菌和芽孢的检测结果见表5。原料组合为大豆粉:小扁豆粉:苦荞粉:枸杞粉:大枣粉的质量比，组合一：1:1:4:4:3，组合二：2:4:1:4:2，组合三：5:4:4:1:4，组合四：5:3:2:2:2，组合五：5:2:1:4:3，组合六：5:2:2:3:1，组合七：2:1:2:2:4，组合八：5:2:2:1:3，组合九：5:2:1:2:4。
表5 不同原料配比组合发酵后益生菌活菌总数及芽孢数(CFU/g)
由表5可知得到的优选原料配比为大豆粉:小扁豆粉:苦荞粉:枸杞粉:大枣粉＝5:2:1:4:3，发酵产品中总活菌数为7.3×109CFU/g，芽孢数为6.92×109CFU/g。
3.2凝结芽孢杆菌接种量的确定
其他条件与实施例3基本相同，固态发酵基质原料质量比大豆粉:小扁豆粉:苦荞粉:枸杞粉:大枣粉＝5:2:1:4:3，青春双歧杆菌按接种量5×106CFU/g接入发酵基质中，37℃下密闭发酵12h，再将凝结芽孢杆菌种子液按以下接菌量1×106、5×106、1×107、5×107CFU/g分别接入装有固态发酵培养基的蓝盖瓶中，37℃下通气发酵24h，对固态发酵产物中的益生菌总活菌数和芽孢数进行测定，结果如表6所示。
表6 不同接种量(CFU/g)发酵产品中的活菌及芽孢数(CFU/g)
| 凝结芽孢杆菌接种量 | 1×106 | 5×106 | 1×107 | 5×107 |
| 总活菌数 | 2.57×109 | 6.32×109 | 9.45×109 | 1.17×1010 |
| 芽孢数 | 1.43×109 | 4.38×109 | 9.19×109 | 9.96×109 |
结果如表6所示：凝结芽孢杆菌在接种量5×107CFU/g时发酵产品益生菌活菌总数和芽孢数均达到最大值。所以固态发酵时凝结芽孢杆菌优选的接种量为5×107CFU/g。测得的总活菌数为1.17×1010CFU/g、芽孢数为9.96×109CFU/g。
3.3料水比的确定
固态发酵基质：大豆粉:小扁豆粉:苦荞粉:枸杞粉:大枣粉＝5:2:1:4:3，料水比(原料和水的质量体积比g/mL)分别为0.8:1，1:1，1.5:1，2.5:1，3:1，3.2:1，搅拌均匀，121℃灭菌20min。其他条件与实施例3基本相同。接种青春双歧杆菌种子液，接种量5×106CFU/g，37℃，pH自然，密闭发酵12h，再接入凝结芽孢杆菌，接种量5×107CFU/g，37℃下通气发酵24h。发酵结束后，对固态发酵产物中的益生菌活菌数和芽孢数进行检测，结果如表7所示。
表7 不同料水比发酵产品中活菌及芽孢数(CFU/g)
结果如表7所示：优选的料水比为1：1，即测得固态发酵粉剂食品中的总活菌数为5.82×109CFU/g，芽孢数为4.72×109CFU/g。
3.4冲调水温的确定
上述3.3固态发酵完成后放入70℃烘箱干燥8小时取出粉碎得粉剂即为益生菌冲调食品。量取65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃的热水各100mL，分别加入30g该粉剂搅拌溶解，计溶解时间、测溶解后温度，冷却至40℃测活菌及芽孢含量，结果如表8所示。
表8 不同温度水溶时间(min)、溶解后实际温度(℃)、活菌及芽孢数(CFU/mL)
| 热水温度 | 65 | 70 | 75 | 80 | 85 | 90 |
| 水溶时间 | 6 | 5.5 | 4 | 3 | 2.5 | 2.5 |
| 实际温度 | 54 | 62 | 69 | 76 | 82 | 87 |
| 总活菌数 | 1.73×109 | 1.74×109 | 1.69×109 | 1.61×109 | 1.54×109 | 7.9×108 |
| 芽孢数 | 1.63×109 | 1.61×109 | 1.58×109 | 1.59×109 | 1.53×108 | 7.8×108 |
结果如表8所示，芽孢含量及相对含量较高热水温度为80℃；溶解时间最短的温度为85℃-90℃。因此，80℃和85℃热水溶解的结果各有优劣，适宜的冲服水温可根据需要控制在80-85℃左右。
虽然上述已公开了本发明较佳的实施方式，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。
Claims (10)
1.一种益生菌发酵食品的制备方法，其特征在于，包括利用青春双歧杆菌和凝结芽孢杆菌分段发酵制备一种可加热益生菌饮品或益生菌冲调食品的方法，具体是以大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉等为主要原料配制液态或固态的发酵基质，利用青春双歧杆菌进行液态发酵或固态发酵，再接入凝结芽孢杆菌进一步发酵；液态发酵结束后经乳化、加稳定剂、调酸、调香、均质、巴氏杀菌后制得可加热益生菌饮品，或者固态发酵结束后经干燥、粉碎制得益生菌冲调食品。
2.如权利要求1所述的益生菌发酵食品的制备方法，其特征在于，所述可加热益生菌饮品的制备方法包括如下步骤：
(1)配制液态发酵基质：原料大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉与水的料水比为5-35:100(g/mL)，搅拌均匀，121℃灭菌20min；
(2)菌种活化：青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入以大豆和水组成的活化培养基进行活化，pH自然，厌氧培养，温度为36-38℃，培养19-20h后，按10％的接种量将一级种子液再次转接入活化培养基，以相同条件进行二次活化20-22h后得二级种子液；
(3)液态发酵：将青春双歧杆菌二级种子液接入装有液态发酵基质的液态发酵罐中，36-38℃密闭厌氧发酵9-15h，再接入凝结芽孢杆菌二级种子液，36-38℃通气有氧发酵12-24h，通气量3:1V/V·min(以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示)；
(4)发酵结束后发酵液经乳化、加稳定剂、调酸、调香、均质、巴氏杀菌后即得可加热益生菌饮品。
3.如权利要求1所述的益生菌发酵食品的制备方法，其特征在于，所述益生菌冲调食品的制备方法包括如下步骤：
(1)配制固态发酵基质：原料大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉与水的料水比为1-3:1(g/mL)，搅拌均匀，121℃灭菌20min；
(2)菌种活化：青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入以大豆和水组成的活化培养基进行活化，pH自然，密闭培养，温度为36-38℃，培养时间19-20h，作为种子液；
(4)固态发酵：将青春双歧杆菌种子液接入到装有固态发酵基质的固态发酵罐中进行密闭厌氧发酵，36-38℃下固态发酵8-15h，再接入凝结芽孢杆菌通气有氧发酵12-24h；
(5)发酵结束后，发酵产物放置于60-70℃烘箱烘干8小时后，取出粉碎制得益生菌冲调食品。
4.如权利要求1或2或3所述的益生菌发酵食品的制备方法，其特征在于，所述原料大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉的质量比为1-10:1-10:1-10:1-10:1-10。
5.如权利要求1或2或3所述的益生菌发酵食品的制备方法，其特征在于，所述液态发酵基质的大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉与水的质量体积比为10:10:6:2:5:100(g/mL)，所述固态发酵基质的大豆粉、小扁豆粉、苦荞粉、枸杞粉、大枣粉与水的质量体积比为5:2:1:4:3:15(g/mL)。
6.如权利要求1或2或3所述的益生菌发酵食品的制备方法，其特征在于，所述青春双歧杆菌或凝结芽孢杆菌的接种量为106-108CFU/mL或106-108CFU/g。
7.如权利要求1或2或3所述的益生菌发酵食品的制备方法，其特征在于，所述液态发酵中，青春双歧杆菌的接种量为5×106CFU/mL，凝结芽孢杆菌的接种量为1×107CFU/mL；所述固态发酵中，青春双歧杆菌的接种量为5×106CFU/mL，凝结芽孢杆菌的接种量为5×107CFU/mL。
8.如权利要求1或2或3所述的益生菌发酵食品的制备方法，其特征在于，优选的，所述青春双歧杆菌的发酵时间为12h，所述凝结芽孢杆菌的发酵时间为24h。
9.如权利要求1或2或3所述的益生菌发酵食品的制备方法，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌CGMCC No.5233，所述青春双歧杆菌为青春双歧杆菌CGMCC No.12784。
10.由权利要求1-9任一项益生菌发酵食品的制备方法制得的可加热益生菌饮品或益生菌冲调食品。
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