CN110537704A - 一种改善睡眠的益生菌发酵功能食品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种改善睡眠的益生菌发酵功能食品及其制备方法，是以大豆、茯苓、莲子的混合物作为固态发酵基质，采用植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌和乳酸片球菌等多种菌株进行混菌固态发酵后真空冷冻干燥制备而得。不仅能够提高其活性成分的含量，同时能够促进活性成分在人体内的吸收，对机体具有更好的保健作用。所述功能性食品主要用于改善入睡困难、睡眠质量下降和睡眠时间减少等症状。

Description

一种改善睡眠的益生菌发酵功能食品及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物发酵生产功能性食品领域，尤其涉及一种改善睡眠的益生菌发酵功能食品及其制备方法。
背景技术
失眠是指由于社会、人为及心理各种因素引起的非器质性睡眠障碍。流行病学调查表明，成年人约6％-20％患有失眠症，其中约54％合并易激惹、抑郁神经症、焦虑等情感障碍，对患者的正常生活及工作产生严重影响，同时也给患者心理及社会造成极大负担。随着社会飞速发展，当今世界竞争越来越大，随之而来的生活与工作压力日益增长，致使许多人处于入睡困难、睡眠质量下降和睡眠时间减少等亚健康状态，进而导致记忆功能下降、注意功能下降、计划功能下降而导致的白天困倦，工作能力下降，在停止工作时容易出现日间嗜睡现象；心血管系统表现为胸闷、心悸、血压不稳定，周围血管收缩扩展障碍；消化系统表现为便秘或腹泻、胃部闷胀；运动系统表现为颈肩部肌肉紧张、头痛和腰痛。情绪控制能力减低，容易生气或者不开心；男性容易出现阳萎，女性常出现性功能减低等表现；且容易出现短期内体重减低，免疫功能减低和内分泌功能紊乱等症状，严重者甚至会导致致命性的结果。有研究发现，在普通临床诊疗中60％-64％的严重失眠未能被医生识别，70％的慢性失眠病人没有和医生讨论过睡眠问题。
失眠的治疗首要是消除导致失眠的各种因素,如心理紧张、有效治疗各种神经精神及内科疾病、调整生理节律等,较理想是综合采用多方面的治疗。常用非药物治疗方法为睡眠卫生教育、刺激控制训练、睡眠约束、放松训练(冥想的生物反馈)、强光治疗、时间疗法等，虽有一定的治疗效果，但治疗时间较长且治疗效果因人而异。西医治疗有所成效，但存在乏力、注意力降低、及宿醉等副作用及药物成瘾，药物耐受等风险。在治疗失眠的药物中应用最广的是苯二氮类药物,但在长期使用过程中易于产生依赖,易引起反跳性失眠；佐匹克隆为第三代催眠药物中的代表,具有良好催眠效果,不良反应少,可用于无法耐受BZD类催眠药物残余作用的病人,非苯二氮类新药扎来普隆治疗成年人及老年人失眠有效,缩短入睡时间,但亦有头痛、嗜睡、眩晕、弱成瘾性等不良反应。
市面上关于改善睡眠问题的药物，或有效时间短且加重肝肾负担，或副作用大，可能损害身体，加重病情，存在极大隐患。
近年来，科学研究也表明某些食药两用的植物在改善亚健康、提高人体免疫功能、促进血液循环、有助胃肠蠕动、养心安神等方面有着良好的效果，当前也有很多利用中药配方来改善睡眠问题的专利申请：
公开号CN10106310141A的发明《一种治疗失眠的药物》公开了一种治疗失眠的药物,其组合物是按重量由下述组分组成黄连4-6g，肉桂3-5g，柴胡6-10g，郁金6-12g，丹参10-15g，赤芍12-20g，麦冬15-25g，人参10-15g，熟地20-30g，白术10-20g，山茱萸15-25g，茯苓15-25g，玄参15-30g，生地15-30g，莲子4-6g，山药15-25g，芡实10-15g。甘草5-10，百合8-12g，夜交藤20-30g，酸枣仁20-30g，柏子仁10-15g，石菖蒲6-10g。对心肾不交，情志所伤，湿热阻碍，气郁血郁，火郁，劳伤，都有很好的调节作用，具有见效快，无毒副作用等优点。
公开号CN104740441B的发明《一种改善失眠多梦的中药药酒》公开了一种治改善失眠失眠多梦的中药药酒的配方,其原料重份配比为：丁香180-220，山楂500-700，肉桂180-220，鸡内金180-220，黄精180-220，桑叶350-450，覆盆子350-450，大枣450-550，小茴香350-450，酸枣仁800-1200，甘草280-320，炒麦芽800-1200，陈皮350-450，芡实450-550，莲子800-1200，山药1800-2200，决明子350-450，茯苓500-700，枸杞子500-700，薄荷350-450。本酒主要以健脾为主，补脾养心，就能达到神安，胃强，脾吸收好。
公开号CN106616952A的发明《一种治疗失眠的药膳及使用方法》公开了一种治疗失眠的药膳及使用方法。包括以下原料且各原料的重量配比分别为：莲子50-80g、百合50-80g、猪瘦肉250-300g、甘草10-15g、小麦30-40g。将上述材料加水煲汤、炖熟服食。本发明治疗失眠的药膳可以益气调中，补虚损，交心肾，安神，益智，清心。适于神经衰弱，心悸失眠，病后体弱等患者用于调养身体。
公开号CN106606682A的发明《一种治疗失眠的中药组合物》公开了一种治疗失眠的中药组合物，其特征在于：主要由下述重量份的原料组成：干龙眼肉15份，芡实15份，粳米100份，去心莲子6份，白糖适量。将芡实煮熟去壳，捣碎成米粒状；粳米淘洗干净放入锅中，加莲子、龙眼肉、芡实及清水，煮成粥后调入白糖，每日1剂。
公开号CN106581333A的发明《治疗失眠的药物及其制备方法》公开了一种治疗失眠的药物及其制备方法，按重量份数组成包括：夜交藤20-30份，黑芝麻20-30份，黑灵芝70-80份，莲子50-80份，黄莲30-50份，枳壳100-150份，酸枣根100-150份，阿胶40-50份，石菖蒲100-150份，朱砂20-30份，三唑仑0.8-1.5份；其制备方法为：称取夜交藤、黑芝麻、黑灵芝、莲子、黄莲、枳壳、酸枣根、阿胶、石菖蒲、朱砂加入其总质量15倍的水熬1个小时，取其滤液；将三唑仑研碎，加入步骤a的滤液中即得；本发明配方简单，制备简易，效果良好，无副作用，促进睡眠，增加睡眠质量，适合失眠患者使用，亦适合健康人群作为保健安神药物使用。
上述专利公开的利用天然植物、中药成分改善睡眠问题的食品和药物，制备方法只是简单的加工提取后按一定比例混合而成，而利用益生菌对天然植物、中药进行发酵制备养心安神、改善睡眠质量的功能性食品未见报道。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术不足，提供一种改善睡眠的益生菌发酵功能食品及其制备方法，并为相关产品的生产提供研究思路。
本发明通过益生菌发酵大豆、茯苓、莲子生产功能性食品，不仅能够提高其活性成分的含量，同时能够促进活性成分在人体内的吸收，对机体具有更好的保健作用。所述功能性食品主要用于改善入睡困难、睡眠质量下降和睡眠时间减少等症状。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种改善睡眠的益生菌发酵功能食品，是以大豆、茯苓、莲子的混合物作为固态发酵基质，采用植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌和乳酸片球菌等多种菌株进行混菌固态发酵后真空冷冻干燥制备而得。
所述改善睡眠的益生菌发酵功能食品的制备方法，包括如下步骤：
(1)将大豆、茯苓、莲子清洗后置于60℃烘箱烘干3-4小时，然后粉碎，分别磨粉过100目筛，得大豆粉、茯苓粉、莲子粉；
(2)配制活化培养基：每100mL水中添加10g大豆粉，得活化培养基；灭菌条件为：121℃，20min；
(3)菌种活化：植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌和乳酸片球菌的甘油管分别按1％(v/v)接种于活化培养基进行活化，pH自然，控制温度为37℃；分别活化24h后，按10％(v/v)的接菌量再次至转接活化培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
(4)将大豆粉、茯苓粉、莲子粉的混合物与水按照质量比1：0.8-1.6配制固态发酵培养基；灭菌条件为：121℃，20min；
(5)益生菌发酵：将二级种子液接入固态发酵培养基中，37℃混菌固态发酵24-48h；
(6)发酵结束后，放置于-80℃预冻12h后，放入真空冷冻干燥机内冻干12h，即得所述益生菌发酵功能食品；
所述大豆、茯苓、莲子均为市售。
优选的，所述大豆粉：莲子粉：茯苓粉的质量比为10:1:2。
优选的，所述固态发酵培养基中，所述大豆粉、茯苓粉、莲子粉的混合物与水的质量比为1：1.4。
优选的，所述固态发酵培养基中植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌的接种量分别为1×107CFU/g。
优选的，所述真空冷冻干燥的条件为-80℃预冻4h后进行真空冷冻干燥12h，至含水量不大于5％。
优选的，所述混菌固态发酵的时间为36h。
优选的，所述植物乳杆菌为IOB602，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名：Lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.16021。此株植物乳杆菌具有较好的抗胃酸、抗胆盐的能力，在pH 3时2h存活率86.05％，0.3％胆盐4h存活率78.04％，并且具有广泛的抗真菌性，不需要添加额外的防腐剂，也可以延长饮料和食品保藏时间。
优选的，所述动物双歧杆菌为IOB402，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名：动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis，保藏编号为CGMCC No.16028。
优选的，所述副干酪乳杆菌为IOB413，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名：副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei，保藏编号为CGMCC No.16022。
优选的，所述青春双歧杆菌为IOB506，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名：青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis，保藏编号为CGMCC No.16026。
优选的，所述凝结芽孢杆菌为I0B502，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，保藏编号为：CGMCC No.16025。
优选的，所述枯草芽孢杆菌为IOB430，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCCNo.16024。
优选的，所述罗伊氏乳杆菌为IOB423，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名：罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri，保藏编号为CGMCC No.16023。
优选的，所述长双歧杆菌为IOB515，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名：长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏编号为CGMCCNo.16027。
优选的，所述乳酸片球菌为IOB701，已于2018年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名：乳酸片球菌pediococcus acidilactici，保藏编号为CGMCC No.16077。
有益效果:
本发明将茯苓与莲子配合，并采用多种特性优势显著的益生菌混合发酵，综合提高莲子碱、芳香苷、茯苓酸、茯苓聚糖的含量，并能够促进其在人体内的吸收，增益本功能性食品在改善睡眠方面的功效。
大豆富含植物性蛋白质，大豆中的蛋白质，可以增加大脑皮层的兴奋和抑制功能，提高学习和工作效率，还有助于缓解沮丧、抑郁的情绪。黄豆富含大豆异黄酮，这种植物雌激素能改善皮肤衰老，还能缓解更年期综合征。大豆含有蛋白酶抑制素，可以抑制多种癌症，大豆中的大豆皂苷能清除体内自由基，具有抗氧化的作用，增强人体免疫机能。
茯苓的化学成分主要为多糖、三萜、脂肪酸、甾醇、酶等，其中，起主要作用的是茯苓多糖和茯苓三萜类化合物，茯苓多糖具有抗肿瘤、保肝、利尿、抗衰老、抗炎、降血脂、增强免疫、催眠等作用。
莲子富含蛋白质、多种维生素和矿物质以及微量元素，热量也较高，尤其是很好的钙源、磷源。莲子芯含有莲心碱、异莲心碱等多种生物碱，有助于睡眠。用作补益药，补脾止泻，益肾涩精，养心安神。
本发明所述一种改善睡眠的益生菌发酵功能食品，既保存了天然植物的营养价值,又具有益生菌发酵制品的营养保健作用,口感独特；该益生菌发酵的能够改善睡眠质量兼顾调节肠道功效的食品通过特殊方法制备而得，通过益生菌发酵，使天然植物中的有益活性成分分解为小分子营养物质，更易于人体吸收，增强改善睡眠状态和调节肠道功效。通过益生菌发酵来制备改善睡眠和调节肠道的功能性食品，在保证发酵基质均匀的同时，易于实现大规模的生产。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：一种改善睡眠的益生菌发酵功能食品及其制备方法
1、原料配比的确定
(1)将大豆、茯苓、莲子清洗后置于60℃烘箱烘干3-4小时，然后粉碎，分别磨粉过100目筛，得大豆粉、茯苓粉、莲子粉；
(2)配制活化培养基：每100mL水中添加10g大豆粉，得活化培养基；灭菌条件：121℃，20min；
(3)菌种活化：植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌和乳酸片球菌的甘油管分别按1％(v/v)接种于活化培养基进行活化，pH自然，控制温度为37℃；分别活化24h后，按10％(v/v)的接菌量再次转接至活化培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
(4)将大豆粉、茯苓粉、莲子粉按一定重量比混合，混合物与水按照质量比1：0.8-1.6制得固态发酵培养基；灭菌条件：121℃，20min；
(5)益生菌发酵：将二级种子液接入固态发酵培养基中，动物双歧杆菌的接种量为106-107CFU/g，植物乳杆菌的接种量为106-107CFU/g，副干酪乳杆菌的接种量为105-106CFU/g，青春双歧杆菌的接种量为106-107CFU/g，凝结芽孢杆菌的接种量为105-106CFU/g，枯草芽孢杆菌的接种量为105-106CFU/g，罗伊氏乳杆菌的接种量为105-106CFU/g，长双歧杆菌的接种量为105-106CFU/g，乳酸片球菌的接种量为105-106CFU/g；混菌固态发酵24h，温度为37℃；分别对发酵样品中的益生菌活菌数进行检测，结果见表1。
菌种标号：1号为植物乳杆菌，2号为动物双歧杆菌，3号为副干酪乳杆菌，4号为青春双歧杆菌，5号为凝结芽孢杆菌，6号为枯草芽孢杆菌，7号为罗伊氏乳杆菌，8号为长双歧杆菌，9号为乳酸片球菌。
原料选取大豆粉、莲子粉、茯苓粉，原料重量配比标号：组合一：5:1:1，组合二：5:2:2，组合三：5:3:3，组合四：10:1:2，组合五：10:2:3，组合六：10:3:1。
表1大豆粉、莲子粉、茯苓粉不同配比固态发酵后益生菌活菌数
组合一 组合二 组合三 组合四 组合五 组合六
1号 2.51×10<sup>7</sup> 1.05×10<sup>8</sup> 3.46×10<sup>8</sup> 6.67×10<sup>8</sup> 5.66×10<sup>8</sup> 4.62×10<sup>8</sup>
2号 1.73×10<sup>7</sup> 4.33×10<sup>7</sup> 9.23×10<sup>7</sup> 5.82×10<sup>8</sup> 2.58×10<sup>8</sup> 3.43×10<sup>8</sup>
3号 8.25×10<sup>6</sup> 6.51×10<sup>7</sup> 7.86×10<sup>7</sup> 6.91×10<sup>8</sup> 3.34×10<sup>8</sup> 5.27×10<sup>8</sup>
4号 1.22×10<sup>7</sup> 4.98×10<sup>7</sup> 2.34×10<sup>8</sup> 8.12×10<sup>8</sup> 4.62×10<sup>8</sup> 6.53×10<sup>8</sup>
5号 1.06×10<sup>7</sup> 5.21×10<sup>7</sup> 6.72×10<sup>7</sup> 9.43×10<sup>7</sup> 8.13×10<sup>7</sup> 7.15×10<sup>7</sup>
6号 3.62×10<sup>5</sup> 6.72×10<sup>5</sup> 9.46×10<sup>5</sup> 5.98×10<sup>6</sup> 6.65×10<sup>6</sup> 3.21×10<sup>6</sup>
7号 4.23×10<sup>6</sup> 8.56×10<sup>6</sup> 2.36×10<sup>7</sup> 8.75×10<sup>7</sup> 6.49×10<sup>7</sup> 8.59×10<sup>7</sup>
8号 5.15×10<sup>7</sup> 6.84×10<sup>7</sup> 7.93×10<sup>7</sup> 9.93×10<sup>7</sup> 9.16×10<sup>7</sup> 5.44×10<sup>7</sup>
9号 3.89×10<sup>6</sup> 9.15×10<sup>6</sup> 3.58×10<sup>7</sup> 4.31×10<sup>8</sup> 6.73×10<sup>7</sup> 7.13×10<sup>7</sup>
总活菌数 1.34×10<sup>8</sup> 3.98×10<sup>8</sup> 9.58×10<sup>8</sup> 3.47×10<sup>9</sup> 1.93×10<sup>9</sup> 2.27×10<sup>9</sup>
由表1可知得到的最优配比为大豆粉：莲子粉：茯苓粉＝10:1:2，总活菌数为3.47×109CFU/g。
2、菌种接种量的确定
植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌甘油管分别按1％(v/v)接种于活化培养基(每100mL水中添加10g大豆粉，灭菌条件为，121℃，20min；)进行一次活化；均活化24h，然后均按10％(v/v)的接菌量转接入二次活化培养基(同一次活化培养基)中，二次活化24h得二级种子液；按大豆粉：莲子粉：茯苓粉＝10:1:2，料水比为1：1.4制得固态发酵培养基，同时接种植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌的二级种子液进行混菌发酵，37℃，pH自然，混菌固态发酵24h。对发酵后培养基中的益生菌活菌数进行检测。
接种量：植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌按照1:1:1:1:1:1:1:1:1的比例同时接入固态发酵培养基，单个接种量分别选择为1×106CFU/g、5×106CFU/g、1×107CFU/g、5×107CFU/g四组，结果如表2所示：
菌种标号：1号为植物乳杆菌，2号为动物双歧杆菌，3号为副干酪乳杆菌，4号为青春双歧杆菌，5号为凝结芽孢杆菌，6号为枯草芽孢杆菌，7号为罗伊氏乳杆菌，8号为长双歧杆菌，9号为乳酸片球菌。
表2固态发酵不同接种量下的活菌数(CFU/g)
接种量 1×10<sup>6</sup> 5×10<sup>6</sup> 1×10<sup>7</sup> 5×10<sup>7</sup>
1号 1.86×10<sup>7</sup> 2.78×10<sup>8</sup> 5.78×10<sup>8</sup> 7.41×10<sup>8</sup>
2号 1.59×10<sup>7</sup> 3.66×10<sup>7</sup> 7.54×10<sup>8</sup> 6.59×10<sup>7</sup>
3号 6.73×10<sup>6</sup> 5.71×10<sup>7</sup> 4.33×10<sup>8</sup> 5.36×10<sup>7</sup>
4号 2.45×10<sup>7</sup> 7.83×10<sup>7</sup> 9.19×10<sup>8</sup> 7.24×10<sup>8</sup>
5号 2.08×10<sup>7</sup> 4.62×10<sup>7</sup> 4.98×10<sup>7</sup> 8.59×10<sup>7</sup>
6号 3.51×10<sup>5</sup> 8.96×10<sup>5</sup> 8.46×10<sup>6</sup> 5.44×10<sup>5</sup>
7号 4.27×10<sup>6</sup> 7.33×10<sup>6</sup> 7.53×10<sup>7</sup> 8.47×10<sup>7</sup>
8号 6.73×10<sup>7</sup> 5.97×10<sup>7</sup> 6.96×10<sup>7</sup> 9.66×10<sup>7</sup>
9号 4.58×10<sup>6</sup> 3.21×10<sup>7</sup> 7.61×10<sup>8</sup> 5.35×10<sup>7</sup>
总活菌数 1.63×10<sup>8</sup> 5.96×10<sup>8</sup> 3.65×10<sup>9</sup> 1.88×10<sup>9</sup>
结果如表2所示：植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌的最佳接种量为1×107CFU/g，即测得所得改善睡眠的益生菌发酵功能性食品中的总活菌数为3.65×109CFU/g。其中，植物乳杆菌活菌数为5.78×108CFU/g，动物双歧杆菌的活菌数达到7.54×108CFU/g，副干酪乳杆菌活菌数为4.33×108CFU/g，青春双歧杆菌活菌数为9.19×108CFU/g，凝结芽孢杆菌活菌数为4.98×107CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数为8.46×106CFU/g，罗伊氏乳杆菌的活菌数为7.53×107CFU/g，长双歧杆菌的活菌数为6.96×107CFU/g，乳酸片球菌的活菌数为7.61×108CFU/g。
3、料水比的确定
固态发酵培养基：原料和水的质量比例分别为1：0.8，1：1，1：1.2，1：1.4。
植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌甘油管分别按1％(v/v)接种于活化培养基(每100mL水中添加10g大豆粉，灭菌条件为，121℃，20min；)进行一次活化；均活化24h，然后均按10％(v/v)的接菌量转接入二次活化培养基(同一次活化培养基)中，二次活化24h得二级种子液；按大豆粉：莲子粉：茯苓粉＝10:1:2及一定料水比制得固态发酵培养基，并同时接种植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌种子液，接种量分别均为1×107CFU/g，进行混菌发酵。培养条件：密闭24h，37℃，pH自然。对发酵后培养基中的益生菌活菌数进行检测，结果如表3所示。
菌种标号：1号为植物乳杆菌，2号为动物双歧杆菌，3号为副干酪乳杆菌，4号为青春双歧杆菌，5号为凝结芽孢杆菌，6号为枯草芽孢杆菌，7号为罗伊氏乳杆菌，8号为长双歧杆菌，9号为乳酸片球菌。
表3料水比为1：0.8-1.4时，发酵后益生菌活菌数(CFU/g)
比例 1：0.8 1：1 1：1.2 1：1.4
1号 8.62×10<sup>6</sup> 2.05×10<sup>8</sup> 6.82×10<sup>8</sup> 5.73×10<sup>8</sup>
2号 2.65×10<sup>7</sup> 1.62×10<sup>7</sup> 7.59×10<sup>8</sup> 9.28×10<sup>8</sup>
3号 4.35×10<sup>6</sup> 3.38×10<sup>7</sup> 6.74×10<sup>8</sup> 5.32×10<sup>8</sup>
4号 2.76×10<sup>7</sup> 8.67×10<sup>7</sup> 2.31×10<sup>9</sup> 3.25×10<sup>9</sup>
5号 3.72×10<sup>7</sup> 3.31×10<sup>7</sup> 8.71×10<sup>7</sup> 6.15×10<sup>7</sup>
6号 5.31×10<sup>5</sup> 7.59×10<sup>5</sup> 6.96×10<sup>6</sup> 5.24×10<sup>6</sup>
7号 2.89×10<sup>6</sup> 6.82×10<sup>6</sup> 2.13×10<sup>8</sup> 3.58×10<sup>8</sup>
8号 5.13×10<sup>7</sup> 8.94×10<sup>7</sup> 5.89×10<sup>7</sup> 6.03×10<sup>7</sup>
9号 4.21×10<sup>6</sup> 6.58×10<sup>7</sup> 7.13×10<sup>8</sup> 5.62×10<sup>8</sup>
总活菌数 1.59×10<sup>8</sup> 5.38×10<sup>8</sup> 5.50×10<sup>9</sup> 6.33×10<sup>9</sup>
结果如表3所示：最佳料水比为1：1.4，即测得所得益生菌发酵功能性食品中的总活菌数为6.33×109CFU/g。其中，植物乳杆菌活菌数为5.73×108CFU/g，动物双歧杆菌的活菌数达到9.28×108CFU/g，副干酪乳杆菌的活菌数为5.32×108CFU/g，青春双歧杆菌的活菌数为3.25×109CFU/g，凝结芽孢杆菌的活菌数为6.15×107CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数为5.24×106CFU/g，罗伊氏乳杆菌的活菌数为3.58×108CFU/g，长双歧杆菌的活菌数为6.03×107CFU/g，乳酸片球菌的活菌数为5.62×108CFU/g。
4、培养时间的确定
植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌甘油管分别按1％(v/v)接种于活化培养基(每100mL水中添加10g大豆粉，灭菌条件为，121℃，20min；)进行一次活化；均活化24h，然后均按10％(v/v)的接菌量转接入二次活化培养基(同一次活化培养基)中，二次活化24h得二级种子液；按照大豆粉：莲子粉：茯苓粉＝10:1:2及混合后料水比1:1.4制得固态发酵培养基，并同时接种植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌二级种子液，接种量分别均为1×107CFU/mL，进行混菌发酵。分别混菌密闭发酵12、24、36、48h，37℃，pH自然。对发酵后培养基中的益生菌活菌数进行检测。
菌种标号：1号为植物乳杆菌，2号为动物双歧杆菌，3号为副干酪乳杆菌，4号为青春双歧杆菌，5号为凝结芽孢杆菌，6号为枯草芽孢杆菌，7号为罗伊氏乳杆菌，8号为长双歧杆菌，9号为乳酸片球菌。
表4不同发酵时间培养后的益生菌活菌数(CFU/g)
培养时间 12h 24h 36h 48h
1号 5.45×10<sup>6</sup> 7.65×10<sup>7</sup> 3.24×10<sup>9</sup> 1.24×10<sup>8</sup>
2号 7.54×10<sup>6</sup> 2.34×10<sup>7</sup> 4.32×10<sup>9</sup> 7.59×10<sup>8</sup>
3号 6.24×10<sup>6</sup> 4.38×10<sup>7</sup> 6.75×10<sup>8</sup> 3.73×10<sup>8</sup>
4号 1.31×10<sup>7</sup> 3.24×10<sup>8</sup> 3.25×10<sup>9</sup> 5.11×10<sup>8</sup>
5号 4.35×10<sup>6</sup> 5.52×10<sup>7</sup> 4.32×10<sup>8</sup> 6.72×10<sup>7</sup>
6号 2.84×10<sup>5</sup> 8.96×10<sup>5</sup> 9.86×10<sup>6</sup> 4.59×10<sup>6</sup>
7号 3.39×10<sup>6</sup> 9.59×10<sup>6</sup> 4.73×10<sup>7</sup> 6.23×10<sup>7</sup>
8号 8.57×10<sup>6</sup> 6.74×10<sup>7</sup> 9.54×10<sup>7</sup> 4.58×10<sup>7</sup>
9号 3.12×10<sup>6</sup> 7.58×10<sup>7</sup> 1.58×10<sup>8</sup> 3.62×10<sup>8</sup>
总活菌数 5.20×10<sup>7</sup> 6.77×10<sup>8</sup> 1.22×10<sup>10</sup> 2.30×10<sup>9</sup>
结果如表4所示：最佳培养时间为接种后再混菌发酵36h，总活菌数为1.22×1010CFU/g。
实施例2：固态发酵工艺-发酵前后培养基活性成分变化
植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌甘油管分别按1％(v/v)接种于活化培养基(每100mL水中添加10g大豆粉，灭菌条件为，121℃，20min；)进行一次活化；均活化24h，然后均按10％(v/v)的接菌量转接入二次活化培养基(同一次活化培养基)中，二次活化24h得二级种子液；按照大豆粉：莲子粉：茯苓粉＝10:1:2以及混合后料水比为1:1.4制得固态发酵培养基，并同时接种植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌二级种子液，接种量分别均为1×107CFU/mL，进行混菌发酵。混菌密闭发酵36h，37℃，pH自然。
发酵前后分别测定固态发酵培养基中各活性成分的含量。利用高效液相色谱法测定莲子碱、芳香苷含量；利用反相高效液相色谱法测定茯苓酸含量；利用苯酚-硫酸比色法测定茯苓聚糖的含量，结果见表5：
表5改善睡眠固态食品发酵前后活性成分变化
检测项目 发酵前含量 发酵后含量
莲子碱(mg/g) 5.74 11.36
芳香苷(mg/g) 2.58 6.26
茯苓酸(mg/g) 1.63 3.89
茯苓聚糖(mg/g) 2.86 5.57
由以上数据可知，莲子粉、茯苓粉在经过益生菌混菌固态发酵后活性成分都有显著提高。莲子碱在发酵后含量达到11.36mg/g，提高约98％；芳香苷在混菌发酵后含量达到6.26mg/g，提高约143％；茯苓酸含量达到3.89mg/g，提高约139％；茯苓聚糖含量达到5.57mg/g，提高约95％。
实施例3：益生菌混菌固态发酵食品改善睡眠的实验
选取年龄相仿的40名有失眠症状的志愿者随机分为4组，第一组服用益生菌混菌固态发酵食品每日2次，每次5克，第二组服用益生菌混菌固态发酵食品每日2次，每次10克，第三组服用益生菌混菌固态发酵食品每日2次，每次15克，第四组为对照组，不服用任何改善睡眠产品，持续30日。
具体实验结果见表6:
表6益生菌混菌固态发酵食品改善睡眠的实验
由表6可以看出在40位有失眠症状的志愿者中服用益生菌混菌固态发酵食品的三组睡眠时间均有相应的延长，其中，第三组志愿者服用30日后睡眠情况明显改善，平均睡眠时间可达到7.74小时，已接近正常睡眠时间。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。

Claims (7)

1.一种改善睡眠的益生菌发酵功能食品，是以大豆、茯苓、莲子的混合物作为固态发酵基质，采用植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌和乳酸片球菌等多种菌株进行混菌固态发酵后真空冷冻干燥制备而得；其中，所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16021；所述动物双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.16028；所述副干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16022；所述青春双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.16026；所述凝结芽孢杆菌的保藏编号为：CGMCCNo.16025；所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.16024；所述罗伊氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16023；所述长双歧杆菌的保藏编号为CGMCC No.16027；所述乳酸片球菌的保藏编号为CGMCC No.16077。
2.如权利要求1所述改善睡眠的益生菌发酵功能食品，其特征在于，所述大豆粉：莲子粉：茯苓粉的质量比为10:1:2。
3.权利要求1或2所述改善睡眠的益生菌发酵功能食品的制备方法，包括如下步骤：
(1)将大豆、茯苓、莲子清洗后置于60℃烘箱烘干3-4小时，然后粉碎，分别磨粉过100目筛，得大豆粉、茯苓粉、莲子粉；
(2)配制活化培养基：每100mL水中添加10g大豆粉，得活化培养基；灭菌条件为：121℃，20min；
(3)菌种活化：植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌和乳酸片球菌的甘油管分别按1％(v/v)接种于活化培养基进行活化，pH自然，控制温度为37℃；分别活化24h后，按10％(v/v)的接菌量再次至转接活化培养基进行二次活化，再活化24h后得二级种子液；
(4)将大豆粉、茯苓粉、莲子粉的混合物与水按照质量比1：0.8-1.6配制固态发酵培养基；灭菌条件为：121℃，20min；
(5)益生菌发酵：将二级种子液接入固态发酵培养基中，37℃混菌固态发酵24-48h；
(6)发酵结束后，放置于-80℃预冻12h后，放入真空冷冻干燥机内冻干12h，即得所述益生菌发酵功能食品。
4.如权利要求3所述改善睡眠的益生菌发酵功能食品的制备方法，其特征在于，大豆粉、茯苓粉、莲子粉的混合物与水按照质量比1：1.4配制固态发酵培养基。
5.如权利要求3所述改善睡眠的益生菌发酵功能食品的制备方法，其特征在于，所述固态发酵培养基中植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、乳酸片球菌的接种量分别为1×107CFU/g。
6.如权利要求3所述改善睡眠的益生菌发酵功能食品的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥的条件为-80℃预冻4h后进行真空冷冻干燥12h，至含水量不大于5％。
7.如权利要求3所述改善睡眠的益生菌发酵功能食品的制备方法，其特征在于，所述混菌固态发酵的时间为36h。
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