WO2016072655A1 - 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선, 치료 또는 예방용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선, 치료 또는 예방용 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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constipation
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용주현
용주선
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    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a dietary supplement for improving or preventing constipation with a lactic acid lactic acid bacteria fermentation product, a pharmaceutical composition for treating or preventing constipation, and a method for producing a lactic acid lactic acid fermentation product of the Lactobacillus to increase the water content and weight of the stool.
  • the present invention also relates to a method for producing the lactic acid bacteria fermentation strain and strains used therein.
  • Constipation is defined as constipation when medically referred to as less than three times a week or less than 30 g per day. In normal conditions, after 24 hours of food intake is excreted in feces, but people with constipation, even if you see the stool once a few days or every day, the amount of the intestinal dwelling of the ingested food is longer.
  • Constipation which is said to be the source of all kinds of illnesses, has no appetite and always has a bloated abdomen, and the toxins of unexcreted stools are absorbed into the blood through the intestine to promote skin aging, headaches, acne, and skin rashes. This appears, if constipation is severe causes of hemorrhoids, such as breakage of the teeth at the time of defecation and escape of dentifrice, and toxins in the shift to colon cancer. In addition, if constipation persists, cholesterol or fat, which should be released into the body, may remain in the body, leading to atherosclerosis or cholelithiasis, and further, high blood pressure and cardiac hypertrophy, which may worsen heart disease. In addition, constipation is an important disease that requires active prevention and treatment because it causes various serious secondary diseases such as stroke, immune deficiency, vision impairment, mental illness (depression).
  • Cassia is a perennial herb that belongs to the legumes. Two varieties are known, Cassia obtusifolia L. and Cassia tora L .. The defector is also called super-determination, Longgangnamcha. The first defector is native to Central America, and the other is the tropical Asian, and is grown in China and Korea.
  • the shape of the fruit is irregular hexagonal columnar one pointed.
  • the outer surface is yellowish brown to blackish brown, 3 to 6 mm long and 2 to 3.5 mm in diameter. Seedlings are firm and lustrous, with a narrow, narrow lined patch on the left and right sides, with a slightly peculiar smell.
  • C. obtusifolia has seed alleles and C. tora is small.
  • Constipation treatment is caused by senile constipation, senile hypertension, and lack of fluid. It is known to treat dry mouth, abdominal bloating caused by constipation and constipation. .
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 1999-0084271 describes that tea bag tea prepared by mixing, or grinding and distributing a defect or cotyledonous leaves and other herbal medicines has an effect on improving constipation
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 2003-0062493 discloses First, the leaching extract produced by mixing the extract powder, Cascara sagrada extract powder, etc., which is prepared by extracting, concentrating and spray drying, has excellent palatability and improves constipation symptoms. Grinded, roasted, extracted and concentrated to dry, or mixed with these and other herbal remedies to improve constipation.
  • the present inventors have conventionally used for a long time to prove the safety of the lactic acid bacterium, the lactic acid bacterium fermentation product obtained by fermenting the lactic acid bacteria to improve the number of stool, water content of the stool or weight of the stool to improve or treat constipation It has been found that the effect is significantly enhanced to complete the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a lactic acid bacterium fermentation strain having constipation improvement or preventive activity.
  • the present invention provides a dietary supplement for improving or preventing constipation as an active ingredient of Lactobacillus lactic acid bacteria.
  • the deficiency extract may be an extract of water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a mixed solvent thereof.
  • the health functional food may be in the form of capsules, tablets, powders, granules, liquids, pills, flakes, pastes, syrups, gels, jelly or bars.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of constipation as an active ingredient of lactic acid bacteria fermentation.
  • the deficiency extract may be an extract of water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a mixed solvent thereof.
  • the present invention comprises the steps of preparing the extract; And inoculating and fermenting the lactic acid bacteria in the extract of Lactobacillus.
  • the method provides a method for producing Lactobacillus lactobacillus fermented product which increases any one or more of the number of stools, water content of stools, and weight of stools.
  • the lactic acid bacteria may be any one or more lactic acid bacteria selected from Lactobacillus genus, Bifidobacterium genus, Leukonostock genus, Pediococcus genus, Enterococcus genus.
  • the lactic acid bacteria may be Lactobacillus kefiri MJ90 (Accession No .: KCCM11575P).
  • the method for preparing the Lactobacillus lactic acid bacteria fermentation extracting the Lactobacillus or its pulverized product with water, alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a mixed solvent thereof; And inoculated with Lactobacillus kefiri MJ90 [Accession No .: KCCM11575P] to 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6 CFU / mL to the glen extract of the step to ferment for 1 to 7 days at 30 to 45 ° C. It may comprise;
  • the extracting may be performed by mixing 10 to 50 parts by weight of water with respect to 1 part by weight of the clarifier pulverizer, and then extracting it for 0.5 to 24 hours while standing or stirring.
  • the extracting may be performed by mixing 5 to 30 parts by weight of an aqueous ethanol solution of 20 to 80% by weight based on 1 part by weight of the clarifier or its pulverized product, and extracting the mixture for 0.5 to 24 hours, followed by drying the extract to remove ethanol.
  • the lactic acid bacteria nutrient source may be added to the extract of the fermenter in the fermentation step.
  • the present invention provides Lactobacillus kefiri MJ90 (Accession No .: KCCM11575P), which ferments the deficiency and promotes constipation improvement or preventive activity.
  • the present invention provides a method for the treatment or prevention of constipation patients comprising administering to a constipation patient an effective amount of a deficiency lactobacillus fermentation product.
  • Lactic acid bacteria fermented product of the present invention is effective for long-term use of sennoside, or bisacodeyl and docucetate sodium, which is a high-safety and less likely to have side effects as a herbal medicine, and is used for the treatment of irritable constipation forbidden in health functional foods due to side effects. It has the effect of increasing any one or more of the number of sides, the water content of the sides and the weight of the stool equivalent to the commercialized Dulcolax S as a component, and can be used as a pharmaceutical composition for treating or preventing constipation or as a dietary supplement for improving or preventing constipation. Can be.
  • the Lactobacillus kefiri MJ90 strain of the present invention is advantageous for the production of Lactobacillus lactic acid bacteria fermented product enhanced constipation treatment, improvement or preventive activity.
  • Figure 1 is a graph confirming the progress of lactic acid bacteria fermentation through the change in pH measured at 36 and 72 hours of fermentation when fermented to different fermentation bacteria in different solvents in Experimental Example 1,
  • Figure 1b is an extract of Preparation Example 2
  • Figure 1c is a fermentation of the dilution of Preparation Example 3, respectively.
  • Figure 2 is a graph showing the number of sides of each experimental group in C. of Experimental Example 2.
  • Figure 4 is a graph showing the number of sides of each experimental group in C. of Experimental Example 3.
  • FIG. 7 is a graph showing the Carmine moving distance of FIG.
  • FIG. 8a shows the HPLC-IT / TOP MS pattern of the clarifier ethanol aqueous solution extract of Preparation Example 2 in Experimental Example 4
  • FIG. 8b shows the HPLC-IT / TOP MS pattern of the clarifier lactobacillus fermentation of Preparation Example 4 in Experimental Example 4. It is shown.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of Lactobacillus kefiri MJ90 strain isolated and identified in Experimental Example 9.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of Lactobacillus kefiri MJ90 strain isolated and identified in Experimental Example 9.
  • the present invention relates to a dietary supplement for improving or preventing constipation using lactic acid lactic acid bacteria fermented product as an active ingredient
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing constipation using lactic acid bacteria fermented product as an active ingredient.
  • the present invention comprises the steps of preparing the extract extract; And inoculating and fermenting the lactic acid bacteria with the Lactobacillus extract; any one or more of the number of sides, the water content of the sides, and the weight of the sides It relates to a method for producing a lactic acid bacterium fermentation compound to increase.
  • the defector is Cassia obtusifolia L. or Cassia tora L., and is preferably Cassia tora L. grown in Korea.
  • the extract includes not only the crude extract obtained by treating the extraction solvent with the extraction raw material, but also the processed product of the crude extract.
  • the Cassia extract can be prepared in powder form by additional processes such as distillation under reduced pressure and freeze drying or spray drying.
  • the extract also includes a fraction further fractionated the crude extract.
  • the lactic acid bacteria for producing the lactic acid lactic acid bacteria may be any one or more lactic acid bacteria selected from Lactobacillus genus, Bifidobacterium genus, Leukonostock genus, Pediococcus genus, Enterococcus genus.
  • the lactic acid bacteria may be Lactobacillus paracasei, Lactobacillus kepyri, Lactobacillus ashdophyllus, Bifidobacterium longgum, Bifidobacterium brevis, Leukonostock mesenteroides, Pediococcus pentosase Usus, Enterococcus pecalis.
  • Lactobacillus lactic acid bacteria are suitable, more preferably Lactobacillus kepiri or Lactobacillus ashdophyllus , most preferably Lactobacillus kefiri MJ90, which is newly identified and identified by the present inventors.
  • the method for preparing the Lactobacillus lactic acid bacteria fermentation extracting the Lactobacillus or its pulverized product with water, alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a mixed solvent thereof; And inoculating lactic acid bacteria to 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 6 CFU / ml in the extractor of the above-mentioned step, and fermenting at 30 to 45 ° C. for 1 to 7 days.
  • Silver may be obtained by inoculating fermentation with lactic acid bacteria in the extract of the deficiency.
  • the components of the Clarifier may be extracted from a diluent mixed by diluting 10 to 50 parts by weight of cold water or room temperature water with respect to 1 part by weight of the Clarifier powder.
  • the component of the deficiency may be eluted from the defect in the process of fermentation by lactic acid bacteria. Therefore, in the present invention, the deficiency extract includes a diluted solution of the deficiency powder diluted in water in a broad sense.
  • the constipation improvement, treatment or prevention effect of lactic acid bacteria fermented lactic acid bacteria fermented with lactic acid bacteria is somewhat lower, but not lactic acid bacteria fermentation It was confirmed that the effect was significantly increased compared to the extract of the missing name.
  • hot water extraction may be used to improve extraction efficiency.
  • 10 to 50 parts by weight of water at 80 to 105 ⁇ ⁇ , preferably 90 to 100 ⁇ ⁇ is mixed with respect to 1 part by weight of the clarifier or its pulverized product, followed by standing or stirring for 0.5 to 24 hours, preferably 1 Can be extracted for 6 hours.
  • the solvent of the extraction step may be used for 0.5 to 24 hours by mixing 5 to 30 parts by weight of an alcohol having 1 to 4 carbon atoms or an aqueous solution of the alcohol with respect to 1 part by weight of the deficiency or its pulverized product.
  • an aqueous alcohol solution such as ethanol, methanol, isopropanol, preferably 20 to 80% by weight of an aqueous alcohol solution, more preferably 50 to 70% by weight of an aqueous alcohol solution.
  • the alcohol extract of the alcohol extract is first vaporized before inoculating the lactic acid bacteria, and then concentrated and dried to reduce the alcohol content or alcohol extract, and then used in water.
  • lactic acid bacteria nutrients such as protein source, carbohydrate source, vitamin or mineral may be further mixed.
  • a starter obtained by mixing or propagating the lactic acid bacteria nutrient source to the lactic acid bacteria before the inoculation of the lactic acid bacteria to the Lactobacillus extract can be used as lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria nutrient source may use a commercially available medium, or add only necessary nutrient sources individually.
  • the deficiency extract, or a mixture of the deficiency extract and lactic acid bacteria nutrient source may be heat sterilized before inoculating the lactic acid bacteria.
  • the content of the solid content of the Pulverized extract does not need to be particularly limited, but if there is no other concentration process after extraction, it is 1 to 15% by weight, and may be used immediately, may be used in concentration, or may be diluted and used after concentration or drying.
  • Fermentation using the Lactobacillus kefiri MJ90 strain of the present invention, or after the fermentation may be additionally added to supplement the lactic acid bacteria for intestinal action for constipation improvement or prevention.
  • the lactic acid bacteria may be any one or more lactic acid bacteria selected from Lactobacillus genus, Bifidobacterium genus, Leukonostock genus, Pediococcus genus, Enterococcus genus.
  • the conditions of the step of fermentation are the same as general lactic acid bacteria fermentation, there is no need to specifically limit, it may be carried out at 25 to 40 °C 24 to 96 hours.
  • the lactic acid lactic acid bacteria fermentation may be a fermentation product containing the lactic acid bacteria cells, may be a fermentation product from which the lactic acid bacteria cells are removed.
  • the fermentation product from which the lactic acid bacteria cells have been removed may be sterilized by the fermentation product to include the dead cells, and may be a filtrate or a centrifugal supernatant from which the cells are removed by filtration or centrifugation.
  • the improvement, treatment or prevention effect of the constipation of the present invention is a novel activity having the effect of bioconversion of the components contained in the extract of Lactobacillus to the components that are easy to use in vivo while the lactic acid bacteria are proliferating, or have the effect of improving, treating or preventing constipation It is expected that the ingredients are produced, which is significantly higher than the effect that can be obtained by the addition of simple lactic acid bacteria themselves.
  • the lactic acid lactic acid bacteria fermentation may be used as a liquid fermentation itself, it may be dried and powdered.
  • Lactobacillus lactic acid bacteria fermented product prepared above can be prepared as a functional ingredient for improving or preventing constipation, or a pharmaceutical composition for treating or preventing constipation.
  • the health functional food may be formulated in the form of capsules, tablets, powders, granules, liquids, pills, flakes, pastes, syrups, gels, jelly or bars in the form of lactic acid bacteria fermentation, or beverages, It is added to food materials such as teas, spices, gums, confectionery, etc. and is manufactured in the form of general foods.In case of ingesting it, it means that it has a specific effect on health. There are no side effects that can occur when taking.
  • the health functional food is very useful because it can be consumed on a daily basis.
  • the amount of lactic acid lactic acid bacteria fermented product in such a dietary supplement can not be defined uniformly depending on the type of dietary supplement, but may be added within a range that does not impair the original taste of the food. 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 20% by weight.
  • a health functional food in the form of capsules, tablets, powders, granules, liquids, pills, flakes, pastes, syrups, gels, jellies or bars 0.1 to 100% by weight, preferably 0.5 to 80% by weight What is necessary is just to add in% range.
  • the daily dosage is 0.001-10 g / kg, more preferably 100-1000 mg / kg, even more preferably 200-500 mg / kg, based on the Lactobacillus fermentation strainer.
  • the dietary supplement may include not only the lactic acid bacteria fermentation product as an active ingredient, but also components commonly added during food production, and include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings, and flavoring agents.
  • examples of the above carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like and xylitol, sorbitol, erythritol.
  • natural flavoring agents such as tauumatin, stevia extract (for example rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, and various plant extracts may be further included in addition to the fermented product of the red ginseng of the present invention. have.
  • lactic acid lactic acid bacteria fermentation is, for example, 0.001 mg / kg or more, preferably 0.1 mg / kg or more, more preferably 10 mg / kg or more, even more preferably 100 mg / kg or more, even more preferably 250 mg / kg or more.
  • Lactobacillus lactobacillus fermentation may be administered between 200 and 500 mg / kg.
  • Lactobacillus lactobacillus fermentation product is natural as there is no adverse effect on the human body even when the dose is excessive, the upper limit of the amount of Lactobacillus lactobacillus fermentation contained in the composition of the present invention can be carried out by those skilled in the art selected within an appropriate range.
  • the pharmaceutical composition may be prepared using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient, and the adjuvant may include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coatings, swelling agents, lubricants, lubricants or A flavourant etc. can be used.
  • the pharmaceutical composition may be formulated to include one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above for administration.
  • Formulation forms of the pharmaceutical composition may be granules, powders, tablets, coated tablets, capsules, suppositories, solutions, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions.
  • the active ingredient may be combined with an oral, nontoxic, pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water and the like.
  • suitable binders, lubricants, disintegrants and coloring agents may also be included in the mixture.
  • Suitable binders include but are not limited to natural and synthetic gums such as starch, gelatin, glucose or beta-lactose, corn sweeteners, acacia, trackercance or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium Benzoate, sodium acetate, sodium chloride and the like.
  • Disintegrants include, but are not limited to, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum, and the like.
  • Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated in liquid solutions are sterile and physiologically compatible, including saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and the like.
  • One or more components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like, and preferably, oral administration.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of the patient, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction sensitivity, and are usually skilled The physician can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition is 0.001-10 g / kg, more preferably 100-1000 mg / kg, even more preferably 200-500 mg / kg.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art. It can be prepared by incorporation into a dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the defector crushed domestically produced Cassia tora L. purchased from Chonnam Herbal Agricultural Cooperative (Hwasun-gun) and uniformly crushed with a grinder after washing. Clarifier powder with an average particle size of 300 ⁇ m was prepared and used while refrigerated.
  • the distilled water of 10 times the weight of the pulverized glyphs was put in a reflux extractor, extracted twice for 3 hours at 100 ° C., cooled, filtered and concentrated under reduced pressure. Yield was 2.2%.
  • the clarifier water diluent was prepared by mixing water so that the pulverized clarifier of Preparation Example 1 became 7% by weight.
  • Sterilizer extract obtained by diluting the extractor extract powder of Preparation Example 1 or 2 to 5% by weight in distilled water , or sterilizing water dilution solution of Preparation Example 3 at 121 ⁇ °C, 1.5 atm, for 15 minutes, and then the lactic acid bacteria of Table 1 After activating by culturing at 37 x °C for 24 hours using MRS broth and GAM broth, lactic acid bacteria were inoculated with 5% by weight (1 x 10 7 CFU / ml) of the extract, respectively, at 72 °C for 72 hours. In the meantime, the culture obtained by incubating with stirring at 150 rpm was obtained.
  • yeast 5% by weight (1 ⁇ 10 7 CFU / ml) of the yeast culture in which Saccharomyces cerevisiae was activated in advance was inoculated into the extract of Cultivator of Preparation Example 2 (5% by weight of solid content), and then 72 at 30 ° C. For hours, a culture obtained by incubating with stirring at 150 rpm was obtained.
  • the culture broth was centrifuged at 6,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C to concentrate and lyophilize the supernatant from which the cells were removed, thereby preparing a fermentor fermentate powder.
  • the number of viable cells is 1 ml of the sample in 9 ml of sterile physiological saline and mixed well. After diluting stepwise, 0.1 ml is taken and smeared in Lactobacillus genus, Pediococcus genus in MRS agar, and Bifidobacterium genus contains 5% horse blood. Smear the agar and store it in anaerobic condition using anaerobic jar (BBL Gas Pak Anaerobic System) as much as possible incubated at 37 °C for 24-48 hours, and measure the number of colonies generated. Sacchromyces is spread on YM agar and 25 °C. After 48 hours of incubation, the number of colonies produced was measured, and the colony per culture was calculated by multiplying the average number of colonies by the dilution factor.
  • Figure 1a is an extract of Preparation Example 1
  • Figure 1b is an extract of Preparation Example 2
  • Figure 1c is a fermentation of the dilution of Preparation Example 3, respectively.
  • the initial pH was 6.4, decreasing from 5.2 to 5.8 at 36 hours and from 4.9 to 5.5 at 72 hours.
  • Lactobacillus kefiri MJ90 (L1) and Lactobacillus paracasei (L2) were Lactobacillus acidophillus 128 (L3) , Lactobacillus plantarum 144 (L4), Bifidiobacterium longum (B1) , and Pediococcus pentosaceus (P1) Decreased in width.
  • the pH of Sacchromyces cerevisiae (S1) in the dilution of the extract of Preparation Example 1 and Preparation Example 3 was reduced to about the middle of L2 and L3, the pH of the extract of Preparation Example 2 was reduced to a level similar to L3.
  • lactic acid bacteria were inoculated into the Lactobacillus extract with a solid content of 6% by weight, 1% by weight, respectively, and fermented at 37 ° C. for 24 hours. After fermentation at °C for 24 hours, the number of viable cells was measured and the results are shown in Table 2.
  • the number of viable cells of culture medium prepared using Lactobacillus kefiri MJ90 (L1) strain was three times higher than that of culture medium prepared using Lactobacillus paracasei (L2) strain, and the culture medium prepared using Sacchromyces cerevisiae (S1) strain. 5 times more than the viable count was confirmed.
  • the number of viable cells of cultures prepared using Lactobacillus acidophillus 128 (L3) strain and Lactobacillus plantarum 144 (L4) strain was 1/10 of L1 strain, and Bifidiobacterium longum (B1) strain and Pediococcus pentosaceus (P1) strain were used.
  • the number of viable cells of the culture solution prepared was 1/100 level of the L1 strain.
  • Lactobacillus kefiri MJ90 (L1) strain and Lactobacillus paracasei (L2) strain, and Sacchromyces cerevisiae (S1) strain which are excellent lactic acid bacteria with excellent fermentation characteristics in terms of decreasing pH and increasing number of viable cells, were selected, and comparatively inferior in fermentation characteristics.
  • Lactobacillus acidophillus 128 (L3) strains and Bifidiobacterium longum (B1) strains were selected as a group, and animal experiments confirmed that the improvement or prevention of constipation was improved compared to the extracts of the tuber.
  • mice were purchased from SD (Sprague Dawley) rats 4 weeks old male was used in Damul Science (Daejeon), and were bred at 20 ⁇ 2 ° C., 55 ⁇ 5% humidity, and 12 hours light and dark conditions. Experimental animals were purified for 1 week after purchase, and then placed 5 animals in each group to set the experimental group as shown in Table 3.
  • the 2-200 experimental group administered 200 mg / kg of the ethanol aqueous solution extract of Preparation Example 2 showed almost no significant increase in the number of sides, and 2-L1-200 administered 200 mg / kg in the same manner as the 2-200 experimental group.
  • the 2-L2-200 experimental group showed the effect of increasing the number of sides equivalent to sennoside (CON1).
  • the 2-500 experimental group to which 500 mg / kg of the ethanol aqueous solution extract of Preparation Example 2 was administered did not show a significant increase in the number of feces.
  • the number of sides also increased significantly in the 2-L3-500 and 2-B1-500 experimental groups, which did not show a significant increase in the number.
  • 2-S1-500 experimental group did not increase the number of stools even at 500 mg / kg administration.
  • the number of stools was increased by the fermentation products of the Lactobacillus kefiri MJ90 (L1) strain and Lactobacillus paracasei (L2) strain, which had the effect of increasing the number of senosides (CON1) equal to or greater than Dulcolax S (CON2).
  • the fermented products of Lactobacillus acidophillus 128 (L3) strain and Bifidiobacterium longum (B1) strain showed an effect of increasing the number of stools only in the 500 mg / kg administration group, and the strain of yeast Sacchromyces cerevisiae (S1) increased the number of stools even after fermentation. There was no effect.
  • Lactobacillus kefiri MJ90 (L1) strain showed the same number of stools as the normal control group (NOR) in the 500 mg / kg administration group, the most effective in increasing the number of stools.
  • the 2-200 experimental group administered 200 mg / kg of the ethanol aqueous solution extract of Preparation Example 2 was weaker than sennoside (CON1), but significantly increased the weight of the stool than the negative control group (LOP).
  • 2-L1-200, 2-L2-200 experimental group administered 200 mg / kg in the same manner as the 2-200 experimental group showed sennoside (CON1) and the like and superior to Dulcolax S (CON2) showed an increase in the weight of the side.
  • the 2-500 experimental group administered 500 mg / kg of the ethanol aqueous solution extract of Preparation Example 2 showed the weight of the stool similar to that of the 2-200 test group. Although the effect was not obvious, the weight of the stool was significantly increased in the 2-L3-500 and 2-B1-500 experimental groups, which did not show a significant increase in the stool weight in the 200 mg / kg administration group. However, 2-S1-500 experimental group did not increase the weight of stool even at 500 mg / kg administration.
  • the weight increase effect of the stool was Lactobacillus kefiri MJ90 (L1) strain was superior to sennoside (CON1), the fermentation product by Lactobacillus paracasei (L2) strains sennoside (CON1) and The weight effect of the stool equivalent to or more than Dulcolax (CON2), and fermented by Lactobacillus acidophillus 128 (L3) strain and Bifidiobacterium longum (B1) strains than sennoside (CON1) and Dulcolaxes (CON2) Although low, only 500 mg / kg administration group showed an increase in the weight of the stool, yeast Sacchromyces cerevisiae (S1) strain was not effective in increasing the weight of the stool even if fermented.
  • Experimental animals were prepared in the same manner as in Experimental Example 2, and experimental animals were purified for 1 week after purchase, and then 5 animals were placed in each group to set experimental groups as shown in Table 4.
  • 1-L1-100 and 1-L1-200 were administered fermentation products of the Cassiae water extract, 3-L1-100 and 3-L1-200 were administered fermentations of the Cassiae water diluent, 2-L1 -200 (P) is intended to confirm constipation treatment effect after inducing constipation by pretreatment with loperamide.
  • each experimental group was orally administered each positive control drug or the fermentation product of Preparation Example 4 for 5 days prior to the administration of loperamide.
  • 2-L1-200 (P) was administered subcutaneously by loperamide for 5 days in the same manner as the negative control (LOP) to induce constipation, and then fermented L1 strain of the same extract of Preparation Example 2 as 2-L1-200 ( Preparation Example 4 After oral administration of 200 mg / kg for 5 days, the experimental animals were sacrificed the day after the last fermentation.
  • LOP negative control
  • 2-L1-200 (P) was removed on the 4th day from the start of fermentation and the remaining 4 days from the start of loperamide administration. The weight is measured.
  • both the 1-L1-200 and 3-L1-200 experimental groups administered the same 200 mg / kg significantly increased the number of sides
  • the 3-L1-100 experimental group significantly increased the number of stools even after the administration of 100 mg / kg, and showed an effect equivalent to that of Dulcolax S (CON2).
  • the 2-L1-200 (P) experimental group administered L1 strain fermentation product of the ethanol aqueous solution extract of Preparation Example 2 after inducing constipation had 26.2 ⁇ 3.1 sides, which was significantly higher than the negative control (LOP). Increased again.
  • the weight of the stool was significantly increased in both the 1-L1-200 and 3-L1-200 experimental groups administered the same 200 mg / kg.
  • the 1-L1-100 and 3-L1-100 experimental groups administered 100 mg / kg significantly increased the weight of the stool, showing an effect equivalent to Dulcolax (CON2).
  • the 2-L1-200 (P) experimental group had a stool weight of 3.18 ⁇ 0.28, which was significantly increased compared to the negative control (LOP).
  • Carmine pigment intestinal migration distance was administered orally administered 3mL or 6 days carmine pigment in physiological saline at a concentration of 1.5% (w / v), 20 minutes after oral administration,
  • the large intestine is ligated and extracted from both parts after the cecum to the rectum, and the photograph after washing the organs with PBS is shown in FIG. 6, and the measured distance of the Carmine pigment shown in FIG. 6 is shown in FIG. 7. It was.
  • the intestinal migration distance of the Carmine pigment was reduced to 6.6 ⁇ 0.75 cm in the loperamide-administered negative control (LOP), compared to the normal control (NOR) of 13.4 ⁇ 0.94 cm, confirming the induction of constipation by loperamide and senno
  • the side (CON1) and Dulcolax S (CON2) significantly increased the long travel distance compared to the negative control (LOP).
  • the 1-200 test group showed no significant difference from the negative control group (LOP) in the intestinal travel distance, but the 2-200 test group significantly increased the intestinal travel distance compared to the negative control group (LOP).
  • the 1-L1-100 and 3-L1-100 experimental groups showed similar intestinal travel distances as the 2-200 experimental group, even when administered in 1/2 the 2-200 experimental group, and the same amount as the 1-200 and 2-200 experimental groups. It was confirmed that the administered 1-L1-200 and 3-L1-200 experimental group significantly increased intestinal travel distance compared to the 2-200 experimental group.
  • the 1-L1-200 and 3-L1-200 experimental groups showed intestinal travel distances equal to or greater than those of the positive controls, Senosides and Dulcolax S.
  • the 3-L1-200 experimental groups were equivalent to normal controls (NOR). The distance traveled.
  • the pattern of the clarifier ethanol aqueous solution extract of Preparation Example 2 is shown in Figure 6a
  • the pattern of the clarifier lactic acid bacteria fermentation of Preparation Example 3 is shown in Figure 6b.
  • Lactobacillus kefiri MJ90 strain which was the most excellent in the preparation of fermented fermented product with excellent constipation improvement or preventive activity, will be described.
  • One piece of Vietnamese mushroom was repeated several times with sterile water for surface cleaning.
  • One piece of prepared Vietnamese mushroom was shaken in MRS liquid medium at 37 to 150 rpm for 24 hours, and then diluted three times with sterile water in MRS flat medium containing 1% CaCO 3 .
  • Erasmus culture samples diluted 1 ⁇ 10 3 fold were plated after 100 L aliquots in MRS solid medium. Smeared medium was incubated for 36 to 48 hours in a thermo-hygrostat. And morphologically different among the cultured colonies were selected and plated in MRS agar and cultured by pure separation.
  • Lactobacillus kefiri MJ90 strain isolated for sequencing was incubated in Lactobacilli MRS broth, 1.5 mL of the culture solution was centrifuged and washed with 0.8% sterile saline solution.
  • chromosomal DNA was extracted using genomic DNA kit and used as template DNA for PCR, and 9F (5'-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3 ') and 1412R (5) were used for amplification of bacterial 16s rRNA.
  • 9F 5'-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3 '
  • 1412R (5) were used for amplification of bacterial 16s rRNA.
  • '-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3') primers were used.
  • PCR product was confirmed by amplification by electrophoresis and purified using a QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, Hilden, Germany). Nucleotide sequence ABI PRISM Big Dye TM Terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, USA) and ABI PRISM 3730xl Analyzer (AppliedBiosystems) Geno Tech Co. using (Daejeon, Korea). Blast search was performed in NCBI using the provided sequencing, and the phylogeny was examined using the MEGA 5.0 program, shown in FIG. 9, and the strain was identified as Lactobacillus kepyri.
  • the 16s rRNA sequence of the Lactobacillus kefiri MJ90 is shown in SEQ ID NO: 1, and the Lactobacillus kefiri MJ90 strain was deposited on October 1, 2014 at the Korea Microorganism Conservation Center, KCCM11575P. You have been assigned an accession number.

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Abstract

본 발명의 결명자 유산균 발효물은 오랫동안 사용되어 안전성이 높고 생약으로서 부작용 발생가능성이 적으면서도, 부작용 문제로 건강기능식품에 사용이 금지된 자극성 변비 치료제인 센노사이드, 또는 비사코딜 및 도큐세이트나트륨을 유효성분으로 하는 상용화된 둘코락스에스와 동등한 변의 개수, 변의 수분 함량 및 변의 중량 중에서 어느 하나 이상을 증가시키는 효과를 나타내므로, 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품으로 활용될 수 있다. 또한 본 발명의 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90 균주는 변비 치료, 개선 또는 예방 활성을 증진된 결명자 유산균 발효물의 제조에 유리하다.

Description

결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선, 치료 또는 예방용 조성물 및 그 제조방법
본 발명은 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품, 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물, 및 변의 수분 함량 및 중량을 증가시키는 결명자 유산균 발효물의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 결명자 유산균 발효물의 제조방법 및 그에 이용되는 균주에 관한 것이다.
변비(Constipation)는 의학적으로 일주일에 3회 이하의 배변이거나, 하루 배변량이 30 g이하일 때 변비라고 정의한다. 정상적인 상태에서는 음식물을 섭취한 후 24시간이면 대변이 되어 배설되나, 변비가 있는 사람은 며칠에 한 번 변을 보거나 매일 보더라도 그 양이 적어 결과적으로 섭취한 음식물의 장내 체류시간이 길어지는 것이다.
변비의 원인으로는 아침식사를 거름으로 인한 대장연동운동의 저하, 식생활의 서구화로 인한 식이섬유의 부족, 운동부족으로 인한 기초체력 및 복근력 저하, 다이어트, 과다한 약물 복용으로 인한 약물 중독 등 여러 가지가 있다.
예로부터 만병의 근원으로까지 일컬어지고 있는 변비는 식욕이 없고 늘 복부가 팽만한 상태에 있을 뿐 아니라 배설되지 못한 변의 독소가 장을 통하여 혈액에 흡수됨으로써 피부노화를 촉진시키고 두통이나 여드름, 피부 발진 등이 나타나며, 변비가 심하면 배변시 치열의 파손과 치액의 탈출 등 치질의 원인이 되고, 변속에 있는 독소에 의해 대장암까지 발생된다. 또한 변비가 지속되면 체외로 배출되어야 할 콜레스테롤이나 지방이 몸 속에 남아있어서 동맥 경화 또는 담석증을 유발할 수 있으며, 더 나아가서는 고혈압과 심장비대를 일으켜 심장병으로 악화될 수 있다. 이 외에도 뇌졸중, 면역결핍, 시력장애, 정신질환(우울증) 등 다양하고 심각한 2차 질환의 원인이 되므로 변비는 적극적인 예방과 치료가 필요한 중요한 질환이다.
이에 현재까지 변비 치료 또는 개선을 위한 다양한 의약품과 건강기능식품이 판매되고 있으나 의약품의 경우 대부분 센나, 대황 등의 안트라퀴논 유도체 성분이 함유된 자극성 약제를 사용함으로써 복통, 설사 등의 부작용과 함께 임신 중 복용이나 지속적인 복용에 문제가 있으며, 건강기능식품의 경우도 과학적으로 그 효과가 충분히 입증되지 못한 것이 대부분이어서 변비 개선의 근본문제를 해결하지 못하고 있어 제품의 신뢰성이 떨어지고 있는 실정이다.
결명자는 콩과에 속하는 한해살이 초본으로 초결명자(Cassia obtusifolia L.)와 결명자(Cassia tora L.)의 두 품종이 알려져 있다. 결명자는 초결명, 긴강남차라고도 한다. 초결명자는 중앙아메리카 원산으로 일본 등지에서 결명자는 열대 아시아산으로 중국, 우리나라 등지에서 재배된다.
열매의 모양은 불규칙한 육각주상으로 한쪽은 뾰족하다. 외면의 색깔은 황갈 내지 흑갈색이고, 길이 3 내지 6 mm, 지름 2 내지 3.5 mm이다. 종피는 견고하고 윤택하며, 좌우 양측에 광택이 있는 폭이 좁은 한줄의 패어진 무늬가 있고, 약간 특이한 냄새가 난다. C. obtusifolia는 종자가 대립이고, C. tora는 소립이다.
결명자는 한방에서 청열명목 작용에 의하여 급성결막염, 안구출혈, 이물질이나 통증을 느끼고, 눈물을 흘리는 경우, 노인의 눈에 발생하는 각막 혼탁현상, 즉 만성진행성질환, 시신경, 망막위축에 기인하는 급속한 시력감퇴, 비만, 혈압이 높고, 정신적 스트레스에 의한 두통, 이명, 눈의 종양을 치료하고, 강압작용으로는 고혈압증 치료, 관상동맥 확장으로 혈유의 저항을 줄여 혈압을 낮추어 주며, 뇌졸중에 의한 반신불수, 경미한 설사작용, 만성질환을 치료하고, 콜레스테롤 저감작용으로는 심혈관질환, 즉 콜레스테롤치가 정상범위를 넘었을 경우나 관상동맥 경화에 의한 협심증을 치료하며, 변비치료는 노인성 변비증, 노인성 고혈압증, 진액부족으로 인한 입이 마르고, 변비 기미에 의한 복부 팽만감, 상습성 변비증 등을 치료하는 것으로 알려져 있다.
한국공개특허 제1999-0084271호에서는 결명자 또는 결명자엽과 다른 생약재를 혼합하고 단순 분쇄 및 배전하여 제조한 티백차가 변비개선에 효과가 있음을 설명하고 있고, 한국공개특허 제2003-0062493호는 결명자를 먼저 추출, 농축 후 분무건조하여 제조한 결명자 추출물 분말과 카스카라사그라다 추출분말 등을 혼합하여제조한 혼합침출차가 기호성이 우수하고 변비증상 개선 효과가 있음을 설명하고 있고, 상기 특허들은 결명자를 단순 분쇄하여 배전하거나, 추출 및 농축하여 건조한 것이거나, 또는 이들과 다른 변비 개선 효과가 있는 생약재와 혼합하는 것에 불과하였다.
그러나 본 발명자들은 전통적으로 오랫동안 사용되어 그 안전성을 검증받은 생약인 결명자를 유산균으로 발효시켜 얻은 결명자 유산균 발효물이 결명자 추출물에 비하여 변의 개수, 변의 수분 함량 또는 변의 중량을 증가시켜 변비를 개선하거나 치료하는 효과가 현저히 증진됨을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 오랫동안 사용되어 안전성이 높고 생약으로서 부작용 발생가능성이 적은 결명자를 활용하여 변의 수분 함량 및 중량을 증가시키는 효과가 현저히 증진된 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 결명자를 활용하여 변의 수분 함량 및 중량을 증가시키는 효과가 현저히 증진된 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 변비 개선 또는 예방 활성을 갖는 결명자 유산균 발효물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 결명자의 변비 개선 또는 예방 활성을 증진시킬 수 있는 신균주를 제공하는 것이다.
본 발명은 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품을 제공한다.
상기 결명자 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매의 추출물일 수 있다.
상기 건강기능식품은 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태의 제제일 수 있다.
또한 본 발명은 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 결명자 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매의 추출물일 수 있다.
또한 본 발명은 결명자 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 결명자 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는 변의 개수, 변의 수분 함량 및 변의 중량 중에서 어느 하나 이상을 증가시키는 결명자 유산균 발효물의 제조방법을 제공한다.
상기 유산균은 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 류코노스톡속, 페디오코커스속, 엔테로코커스속 유산균 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유산균일 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90[기탁번호: KCCM11575P]일 수 있다.
상기 결명자 유산균 발효물의 제조방법은, 결명자 또는 그 분쇄물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계; 및 상기 단계의 결명자 추출물에 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90[기탁번호: KCCM11575P]를 1×103 내지 1×106 CFU/㎖가 되도록 접종하여 30 내지 45 ℃에서 1 내지 7 일 동안 발효시키는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 추출하는 단계는 결명자 분쇄물 1 중량부에 대하여 물 10 내지 50 중량부를 혼합한 후 정치 또는 교반하면서 0.5 내지 24 시간 추출하는 것일 수 있다.
상기 추출하는 단계는 결명자 또는 그 분쇄물 1 중량부에 대하여 20 내지 80 중량%의 에탄올 수용액 5 내지 30 중량부 혼합하여 0.5 내지 24 시간 추출한 후, 상기 추출액을 건조하여 에탄올을 제거하는 것일 수 있다.
상기 발효시키는 단계의 결명자 추출물에 유산균 영양원을 더 첨가하는 것일 수 있다.
본 발명은 결명자를 발효시켜 변비 개선 또는 예방 활성을 증진시키는 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90[기탁번호: KCCM11575P]을 제공한다.
본 발명은 변비 환자에게 유효량의 결명자 유산균 발효물을 투여하는 것을 포함하는 변비 환자의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 결명자 유산균 발효물은 오랫동안 사용되어 안전성이 높고 생약으로서 부작용 발생가능성이 적으면서도, 부작용 문제로 건강기능식품에 사용이 금지된 자극성 변비 치료제인 센노사이드, 또는 비사코딜 및 도큐세이트나트륨을 유효성분으로 하는 상용화된 둘코락스에스와 동등한 변의 개수, 변의 수분 함량 및 변의 중량 중에서 어느 하나 이상을 증가시키는 효과를 나타내므로, 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품으로 활용될 수 있다. 또한 본 발명의 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90 균주는 변비 치료, 개선 또는 예방 활성을 증진된 결명자 유산균 발효물의 제조에 유리하다.
도 1은 실험예 1에서 용매를 달리한 결명자 추출물을 각각 다른 발효균으로 발효시켰을 때 발효시간 36 시간 및 72 시간에 측정한 pH의 변화를 통해 유산균 발효의 진행을 확인한 그래프로서, 도 1a는 제조예 1의 추출물, 도 1b는 제조예 2의 추출물, 도 1c는 제조예 3의 희석액을 각각 발효시킨 것이다.
도 2는 실험예 2의 다.에서 각 실험군의 변의 개수를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 2의 다.에서 각 실험군의 변의 중량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 3의 다.에서 각 실험군의 변의 개수를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 3의 다.에서 각 실험군의 변의 중량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험예 3의 라.에서 각 실험군의 실험동물을 희생시킨 후, 대장을 적출하여 수세한 후의 사진이고, 각각의 대장 사진 아래 표시한 점은 Carmine이 이동한 거리를 표시한 것이다.
도 7는 도 6의 Carmine 이동 거리를 나타낸 그래프이다.
도 8a는 실험예 4에서 제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물의 HPLC-IT/TOP MS 패턴을 나타낸 것이고, 도 8b는 실험예 4에서 제조예 4의 결명자 유산균 발효물의 HPLC-IT/TOP MS 패턴을 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 9에서 분리 및 동정한 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90 균주의 계통도이다.
본 발명은 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품에 관한 것이고, 또한 본 발명은 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이며, 또한 본 발명은 결명자 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 결명자 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는 변의 개수, 변의 수분 함량 및 변의 중량 중에서 어느 하나 이상을 증가시키는 결명자 유산균 발효물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 결명자는 초결명자(Cassia obtusifolia L.) 또는 결명자(Cassia tora L.)이고, 바람직하게는 한국에서 재배되는 결명자(Cassia tora L.)이다.
상기 추출물은 추출 원재료에 추출 용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 조추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 결명자 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다. 상기 추출물은 상기 조추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다.
상기 결명자 유산균 발효물 제조를 위한 유산균은 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 류코노스톡속, 페디오코커스속, 엔테로코커스속 유산균 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유산균일 수 있다. 예를 들어, 상기 유산균은 락토바실러스 파라카제이, 락토바실러스 케피리, 락토바실러스 애시도필러스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 브레비스, 류코노스톡 메센테로이데스, 페디오코터스 펜토사세우스, 엔테로코커스 페칼리스일 수 있다. 바람직하게는 락토바실러스속 유산균이 적합하고, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 케피리 또는 락토바실러스 애시도필러스, 가장 바람직하게는 본 발명자들이 새로이 분리하여 동정한 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90이다.
상기 결명자 유산균 발효물의 제조방법은, 결명자 또는 그 분쇄물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계; 및 상기 단계의 결명자 추출물에 유산균을 1×103 내지 1×106 CFU/㎖가 되도록 접종하여 30 내지 45 ℃에서 1 내지 7 일 동안 발효시키는 단계;를 포함할 수 있다.상기 결명자 유산균 발효물은 결명자 추출물에 유산균을 접종하여 발효시켜 얻은 것일 수 있다.
상기 추출하는 단계의 용매로 물을 사용하는 경우, 결명자 분쇄물 1 중량부에 대하여 냉수 또는 실온의 물 10 내지 50 중량부를 희석하여 혼합한 희석액에서 결명자의 성분이 추출될 수 있다. 냉수 또는 실온의 물을 이용하여 결명자 성분을 추출하는 경우 발효와 별도로 추출할 수도 있고, 유산균 접종하여 발효되는 과정에서 결명자로부터 결명자의 성분이 용출되도록 할 수도 있다. 따라서, 본 발명에서 결명자 추출물은 넓은 의미로는 결명자 분말을 물에 희석한 희석액을 포함한다. 본 발명의 실험예에서 결명자 열수 추출물 또는 결명자 에탄올수용액 추출물을 유산균 발효시킨 유산균 발효물에 비하여, 결명자 물 희석액을 유산균으로 발효시킨 유산균 발효물의 변비 개선, 치료 또는 예방 효과가 다소 낮지만, 유산균 발효시키지 않은 결명자 추출물에 비해서는 그 효과가 유의적으로 증대되었음을 확인할 수 있었다.
상기 용매로 물을 사용하는 경우 추출 효율 증진을 위해 열수추출을 이용할 수 있다. 예를 들어, 결명자 또는 그 분쇄물 1 중량부에 대하여 80 내지 105 ×℃, 바람직하게는 90 내지 100 ℃의 물 10 내지 50 중량부를 혼합한 후 정치 또는 교반하면서 0.5 내지 24 시간, 바람직하게는 1 내지 6 시간 추출할 수 있다.
상기 추출하는 단계의 용매로 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 그 알코올의 수용액을 결명자 또는 그 분쇄물 1 중량부에 대하여 5 내지 30 중량부 혼합하여 0.5 내지 24 시간 추출하는데에 사용할 수 있다. 예를 들어, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 등의 알코올 수용액, 바람직하게는 20 내지 80 중량%의 알코올 수용액, 더욱 바람직하게는 50 내지 70 중량%의 알코올 수용액으로 추출한다. 알코올 추출물을 사용하는 경우 유산균을 접종하기 전 먼저 알코올 추출물의 알코올을 기화시켜 알코올 함량을 낮춘 농축액 또는 알코올 추출물을 농축 및 건조시킨 후 물에 용해한 후 사용한다.
상기 결명자 추출물에 유산균을 접종하기 전에 유산균 생육을 증진시키기 위하여 결명자 추출물에 단백질원, 탄수화물원, 비타민 또는 무기질 등의 유산균 영양원을 추가로 혼합할 수 있다. 또한 상기 결명자 추출물에 유산균을 접종하기 전에 유산균에 상기 유산균 영양원을 혼합하여 증식 또는 활성화시킨 스타터를 유산균으로 사용할 수 있다. 상기 유산균 영양원은 시중에 판매되는 배지를 이용하거나 또는 필요한 영양원만을 개별적으로 첨가할 수 있다.
또한 상기 결명자 추출물, 또는 결명자 추출물과 유산균 영양원의 혼합물은 유산균을 접종하기 전에 가열살균할 수 있다.
상기 결명자 추출물의 고형분 함량은 특별히 한정할 필요는 없으나 추출 후 다른 농축 과정이 없을 경우 1 내지 15 중량%이고, 이를 바로 사용할 수도 있고, 농축하여 사용할 수도 있으며, 농축 또는 건조한 후 희석하여 사용할 수도 있다.
상기 본 발명의 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90 균주를 이용하여 발효시키는 단계 또는 그 이후에 변비 개선 또는 예방을 위한 정장작용을 위하여 보조적으로 별도의 유산균을 첨가할 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 류코노스톡속, 페디오코커스속, 엔테로코커스속 유산균 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유산균일 수 있다.
상기 발효시키는 단계의 조건은 일반적인 유산균 발효와 동일하므로 특별히 한정할 필요는 없으나, 25 내지 40 ℃에서 24 내지 96 시간 수행될 수 있다.
상기 결명자 유산균 발효물은 유산균 균체를 포함하는 발효물일 수 있고, 유산균 균체가 제거된 발효물일 수도 있다. 유산균 균체가 제거된 발효물은 발효물을 멸균하여 사균체를 포함하게 할 수도 있고, 여과 또는 원심분리를 통해 균체를 제거한 여액 또는 원심분리 상등액일 수 있다.
본 발명의 변비의 개선, 치료 또는 예방 효과는 결명자 추출물에 포함된 성분을 유산균이 증식하면서 생체 내에서 이용하기 용이한 성분으로 생물전환시키거나, 변비의 개선, 치료 또는 예방 효과를 갖는 신규의 활성 성분이 생성되기 때문으로 예상되며, 단순한 유산균 자체가 부가되어 얻을 수 있는 효과보다 현저히 상승된 것이다. 상기 결명자 유산균 발효물은 액상의 발효물을 그 자체로 사용할 수도 있고, 이를 건조하여 분말화할 수도 있다.
상기 제조된 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품, 또는 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제조할 수 있다.
상기 ‘유효성분으로 포함하는’이란 상기 결명자 유산균 발효물의 변비 개선, 치료 또는 예방 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품이란, 상기 결명자 유산균 발효물을 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태로 제제화 한 것일 수 있고, 또는 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하여 일반 식품 형태로 제조한 것으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.
상기 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 결명자 유산균 발효물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 1일 투여량을 기준으로는 결명자 유산균 발효물을 기준으로 0.001-10g/㎏, 더욱 바람직하게는 100-1000 mg/kg, 더욱 더 바람직하게는 200-500 mg/kg이다.
상기 건강기능식품은 유효성분으로서 결명자 유산균 발효물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 건강기능식품이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 홍경천 발효물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비의 치료 또는 예방용 약학 조성물에서, 결명자 유산균 발효물은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상 투여될 수 있다. 예를 들어 결명자 유산균 발효물은 200 내지 500 mg/kg 투여될 수 있다. 결명자 유산균 발효물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 결명자 유산균 발효물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
상기 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10g/㎏, 더욱 바람직하게는 100-1000 mg/kg, 더욱 더 바람직하게는 200-500 mg/kg이다.
상기 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 결명자 열수 추출물의 제조
결명자는 전남생약농업협동조합(화순군)에서 구입한 국내산 결명자(Cassia tora L.)를 정선, 수세 후 분쇄기로 균일하게 분쇄하여 평균입자크기 300 ㎛의 결명자 분말을 제조하여 냉장보관하면서 이용하였다.
상기 분쇄된 결명자 중량의 10 배의 증류수를 환류추출기에 넣고 100 ℃, 3시간 동안 2회 추출한 후, 방냉하고 여과한 다음 감압농축기로 농축하여 동결건조하여 결명자 열수 추출물 분말을 얻었다. 수율은 2.2 %이었다.
제조예 2: 결명자 에탄올수용액 추출물의 제조
상기 제조예 1의 분쇄된 결명자 중량의 4 배의 50 중량% 주정에탄올 수용액을 첨가하여 3일 동안 실온에서 추출한 후, 여과한 다음 감압농축기로 농축하여 동결건조하여 결명자 에탄올수용액 추출물 분말을 얻었다. 수율은 9.8 %이었다.
제조예 3: 결명자 물 희석액의 제조
상기 제조예 1의 분쇄된 결명자를 7 중량%가 되도록 물을 혼합하여 결명자 물 희석액을 제조하였다.
제조예 4: 결명자 발효물의 제조
상기 제조예 1 또는 2의 결명자 추출물 분말을 증류수에 5 중량%로 희석한 결명자 추출물, 또는 제조예 3의 결명자 물 희석액을 121 ×℃, 1.5기압, 15분간 멸균한 다음, 표 1의 유산균을 각각 MRS broth와 GAM broth를 이용하여 24시간, 37 ×℃에서 정치 배양하여 활성화시킨 후, 유산균을 배양액 5 중량%(1×107 CFU/㎖)를 상기 결명자 추출물에 각각 접종하여 37 ℃에서 72시간 동안, 150 rpm으로 교반하면서 배양하여 얻은 배양액을 얻었다.
효모의 경우는 제빵용 상용효모(Saccharomyces cerevisiae)를 미리 활성화시킨 효모 배양액 5 중량%(1×107 CFU/㎖)를 제조예 2의 결명자 추출물(고형분 5 중량%)에 접종하여 30 ℃에서 72시간 동안, 150 rpm으로 교반하면서 배양하여 얻은 배양액을 얻었다.
상기 배양액을 4 ℃에서 6,000 rpm에서 15 분 원심분리하여 균체가 제거된 상등액을 농축 및 동결건조하여 결명자 발효물 분말을 제조하였다.
표 1
구분 균주명 입수경로 사용배지
L1 Lactobacillus kefiri MJ90 티벳버섯에서 분리 MRS
L2 Lactobacillus paracasei 2년숙성 김치에서분리 MRS
L3 Lactobacillus acidophillus 128 한국식품연구원 MRS
L4 Lactobacillus plantarum 144 한국식품연구원 MRS
B1 Bifidobacterium longum 한국식품연구원 RCM / GAM
P1 Pediococcus pentosaceus 한국식품연구원 MRS
S1 Sacchromyces cerevisiae 상용효모 YM
실험예 1: 결명자 발효물의 발효특성 확인
제조예 4의 결명자 유산균 발효물 또는 결명자 효모 발효물의 발효특성을 확인하기 위하여, 접종 후 36 및 72시간째에 발효물의 pH 및 생균수의 변화를 확인하였다.
생균수는 생균수는 시료 1ml를 멸균 생리식염수 9ml에 희석하고 잘 섞은 후 단계별로 희석한 다음 0.1ml을 취하여 Lactobacillus속, Pediococcus속은 MRS agar에 도말하고, Bifidobacterium속은 5%의 horse blood를 함유한 BL agar에 도말하여 anaerobic jar (BBL Gas Pak Anaerobic System)를 이용하여 최대한 혐기적인 상태로 보관하여 37 ℃에서 24-48시간 배양한 후 생성된 집락수를 계측하고, Sacchromyces속은 YM agar에 도말하고 25 ℃에서 48 시간 배양한 후 생성된 집락수를 계측하여, 그 평균 집락 수에 희석배수를 곱하여 배양액 당 colony를 산출하였다.
가. pH 변화
발효균의 종류 및 배양시간에 따른 pH 변화를 도 1a, 도 1b 및 도 1c에 나타내었다. 도 1a는 제조예 1의 추출물, 도 1b는 제조예 2의 추출물, 도 1c는 제조예 3의 희석액을 각각 발효시킨 것이다.
초기 pH는 6.4 이었으며, 36 시간째에 5.2 내지 5.8로 감소하였고, 72 시간째에 4.9 내지 5.5로 감소하였다.
발효균별로 pH의 변화를 비교하면 Lactobacillus kefiri MJ90(L1) 및 Lactobacillus paracasei(L2)가 Lactobacillus acidophillus 128(L3), Lactobacillus plantarum 144(L4), Bifidiobacterium longum(B1), Pediococcus pentosaceus(P1) 보다 상대적으로 큰 폭으로 감소하였다. 또한 Sacchromyces cerevisiae(S1)는 제조예 1의 추출물과 제조예 3의 희석액에서는 L2와 L3의 중간 정도로 pH가 감소하였고, 제조예 2의 추출물에서는 L3과 유사한 수준으로 pH가 감소하였다.
발효균이 동일할 경우 기질로 제조예 1의 결명자 열수 추출물, 제조예 2의 결명자 에탄올 추출물, 제조예 3의 결명자 물 희석액을 사용하는 배양액의 pH에는 거의 차이가 없었고, 제조예 3 경우 나머지에 비해 36 시간째 및 72 시간째의 pH가 다소 높았다.
나. 생균수 변화
발효균 6종을 다시 전 배양하고 균주의 성장능을 알아보기 위하여 고형분 함량 6 중량%의 결명자 추출물에 유산균은 각각 1 중량%씩 접종하여 37 ℃에서 24 시간 발효하고, 효모균은 1 중량% 접종하여 25 ℃에서 24 시간 발효한 후 생균수를 측정하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2
구분 생균수(CFU/ml)
발효 전 발효 후 (제조예1) 발효 후 (제조예2) 발효 후 (제조예3)
L1 5.0×105 7.2×108 6.9×108 3.3×108
L2 5.0×105 2.6×108 2.2×108 1.0×108
L3 5.0×105 8.2×107 8.1×107 4.3×107
L4 5.0×105 5.4×107 6.3×107 3.2×107
B1 5.0×105 8.8×106 1.2×107 3.2×106
P1 5.0×105 7.5×106 8.1×106 1.2×106
S1 5.0×105 1.5×108 1.2×108 8.6×107
상기 표 2에 나타낸 바와 같이 기질로 제조예 1의 결명자 열수 추출물을 사용한 것과 제조예 2의 에탄올수용액 추출물을 사용한 것에서 거의 차이가 없었으나, 제조예 3의 결명자 물 희석액을 사용한 것에서는 발효 후 생균수가 제조예 1 및 2의 생균수의 절반에 조금 못 미치는 수준이었다.
Lactobacillus kefiri MJ90(L1) 균주를 사용하여 제조한 배양액의 생균수가 Lactobacillus paracasei(L2) 균주를 사용하여 제조한 배양액의 생균수 보다 3 배 정도 많고, Sacchromyces cerevisiae(S1) 균주를 사용하여 제조한 배양액의 생균수 보다 5 배 정도 많음을 확인할 수 있었다.
Lactobacillus acidophillus 128(L3) 균주 및 Lactobacillus plantarum 144(L4) 균주를 사용하여 제조한 배양액의 생균수는 L1 균주에 비해 1/10 수준이었고, Bifidiobacterium longum(B1) 균주 및 Pediococcus pentosaceus(P1) 균주를 사용하여 제조한 배양액의 생균수는 L1 균주의 1/100 수준이었다.
따라서 pH감소와 생균수 증가 측면에서 발효특성이 우수한 유산균으로 Lactobacillus kefiri MJ90(L1) 균주 및 Lactobacillus paracasei(L2) 균주, 그리고 효모인 Sacchromyces cerevisiae(S1) 균주를 선택하고, 상대적으로 발효특성이 떨어지는 비교군으로 Lactobacillus acidophillus 128(L3) 균주 및 Bifidiobacterium longum(B1) 균주를 선택하여 동물실험을 통하여 변비 개선 또는 예방 효과가 결명자 추출물에 비해 증진되는 지를 확인하였다.
실험예 2: 발효균의 종류에 따른 동물실험을 통한 변비 예방 효과 확인
가. 실험동물 및 실험군
실험동물은 SD(Sprague Dawley) 래트 4주령 수컷을 다물사이언스(대전)에서 구입하여 사용하였으며, 온도 20±2 ℃, 습도 55±5 %, 12 시간 명암조건에서 사육하였다. 실험동물은 구입 후 1주일 동안 순화한 다음, 각 군당 5마리씩을 배치하여 표 3과 같이 실험군을 설정하였다.
표 3
구분 실험군
NOR 일반 사료 섭취하는 정상 대조군
LOP 변비유발을 위해 로페라미드를 5일동안 4 mg/kg 피하투여한 음성 대조군
CON1 센노사이드 50 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여한 양성 대조군
CON2 둘코락스에스 36.25 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여한 양성 대조군
2-200 제조예2의 결명자물추출물 200 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-L1-100 제조예2 추출물의 L1균주 발효물(제조예4) 100 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-L1-200 제조예2 추출물의 L1균주 발효물(제조예4) 200 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-L1-500 제조예2 추출물의 L1균주 발효물(제조예4) 500 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-L2-100 제조예2 추출물의 L2균주 발효물(제조예4) 100 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-L2-200 제조예2 추출물의 L2균주 발효물(제조예4) 200 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-L2-500 제조예2 추출물의 L2균주 발효물(제조예4) 500 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-L3-100 제조예2 추출물의 L3균주 발효물(제조예4) 100 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-L3-200 제조예2 추출물의 L3균주 발효물(제조예4) 200 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-L3-500 제조예2 추출물의 L3균주 발효물(제조예4) 500 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-B1-100 제조예2 추출물의 B1균주 발효물(제조예4) 100 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-B1-200 제조예2 추출물의 B1균주 발효물(제조예4) 200 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-B1-500 제조예2 추출물의 B1균주 발효물(제조예4) 500 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-S1-100 제조예2 추출물의 S1균주 발효물(제조예4) 100 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-S1-200 제조예2 추출물의 S1균주 발효물(제조예4) 200 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-S1-500 제조예2 추출물의 S1균주 발효물(제조예4) 500 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
정상 대조군(NOR) 및 음성 대조군(LOP)을 제외한 모든 실험군은 로페라미드 투여 전에 각각의 양성 대조군 약물이나 제조예 4의 발효물을 5 일동안 경구 투여하였다.
정상 대조군(NOR)을 제외한 음성 대조군(LOP) 및 양성 대조군(CON1, CON2)을 제외한 모든 실험군들은 로페라미드를 5일 동안 피하투여하여 변비를 유발하였고, 로페라미드 투여개시일로부터 6 일째 실험동물을 희생시켰다.
나. 체중, 사료 섭취량 및 음수량
모든 실험군은 로페라미드 투여개시일부터 실험동물 희생시킬 때까지의 실험동물의 체중변화량(g), 사료 섭취량(g) 및 음수량(mL)을 확인한 결과, 실험기간 동안 사료섭취량 및 음수량에는 유의적인 차이가 없었고, 체중증가량에 있어서도 유의적인 차이를 보이지 않았다.
다. 변의 개수
각 실험군들의 변의 개수 결과는 도 2에 나타내었다.
변의 개수는 정상 대조군(NOR)이 47.2 ± 5.8 개인 것에 비해, 로페라미드 투여 음성 대조군(LOP)가 23.1 ± 3.6 개로 감소되어, 로페라미드에 의한 변비 유발이 확인되었고, 센노사이드(CON1)가 둘코락스에스(CON2)보다 변의 개수 증가 효과가 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물을 200 mg/kg 투여한 2-200 실험군은 유의적인 변의 개수 증가 효과가 거의 나타나지 않았고, 2-200 실험군과 동일하게 200 mg/kg 투여한 2-L1-200, 2-L2-200 실험군은 센노사이드(CON1)과 동등한 변의 개수 증가 효과를 나타내었다.
투여량을 늘려 500 mg/kg 투여한 경우, 제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물을 500 mg/kg 투여한 2-500 실험군은 여전히 유의적인 변의 개수 증가 효과를 나타내지 않았으나, 200 mg/kg 투여군에서 변의 개수의 유의적인 증가를 나타내지 않았던 2-L3-500, 2-B1-500 실험군에서도 변의 개수가 유의적으로 증가되었다. 다만 2-S1-500 실험군은 500 mg/kg 투여에서도 변의 개수 증가가 없었다.
상기 결과를 종합했을 때, 변의 개수는 Lactobacillus kefiri MJ90(L1) 균주 및 Lactobacillus paracasei(L2) 균주의 발효물이 센노사이드(CON1)가 둘코락스에스(CON2)와 동등하거나 그 이상의 변의 개수 증가 효과를 가져왔고, Lactobacillus acidophillus 128(L3) 균주 및 Bifidiobacterium longum(B1) 균주의 발효물은 500 mg/kg 투여군에서만 변의 개수 증가 효과를 나타내었으며, 효모인 Sacchromyces cerevisiae(S1) 균주는 발효를 하더라도 변의 개수 증가 효과가 없었다.
따라서 유산균들은 유효 함량의 차이는 있으나 결명자 추출물을 발효시킴으로써 변의 개수를 증가시켰고, 그 중에서도 Lactobacillus kefiri MJ90(L1) 균주는 500 mg/kg 투여군에서 정상 대조군(NOR)과 동등한 수준의 변의 개수를 나타내어, 변의 개수 증가 효과가 가장 뛰어났다.
라. 변의 중량
각 실험군들의 변의 중량 결과는 도 3에 나타내었다.
변의 중량 또한 정상 대조군(NOR)이 4.8 ± 0.89 개인 것에 비해, 로페라미드 투여 음성 대조군(LOP)가 2.6 ± 0.32 개로 감소되어, 로페라미드에 의한 변비 유발이 확인되었고, 센노사이드(CON1)와 둘코락스에스(CON2)의 변의 중량에는 유의적인 차이는 없었다.
제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물을 200 mg/kg 투여한 2-200 실험군은센노사이드(CON1)보다는 약하지만, 음성대조군(LOP) 보다는 변의 중량을 유의적으로 증가시켰다. 2-200 실험군과 동일하게 200 mg/kg 투여한 2-L1-200, 2-L2-200 실험군은 센노사이드(CON1)와 등등하고 둘코락스에스(CON2)보다 뛰어나 변의 중량 증가 효과를 나타내었다.
투여량을 늘려 500 mg/kg 투여한 경우, 제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물을 500 mg/kg 투여한 2-500 실험군은 2-200 실험군과 유사한 변의 중량을 나타내어 투여량 증가에 따른 변의 중량 증가 효과가 뚜렷하지 않았으나, 200 mg/kg 투여군에서 변의 중량의 유의적인 증가를 나타내지 않았던 2-L3-500, 2-B1-500 실험군에서도 변의 중량이 유의적으로 증가되었다. 다만 2-S1-500 실험군은 500 mg/kg 투여에서도 변의 중량 증가가 없었다.
상기 결과를 종합했을 때, 변의 중량 증가 효과는 Lactobacillus kefiri MJ90(L1) 균주에 의한 발효물이 센노사이드(CON1)보다 뛰어났고, Lactobacillus paracasei(L2) 균주에 의한 발효물은 센노사이드(CON1) 및 둘코락스에스(CON2)와 동등하거나 그 이상의 변의 중량 효과를 가져왔으며, Lactobacillus acidophillus 128(L3) 균주 및 Bifidiobacterium longum(B1) 균주에 의한 발효물은 센노사이드(CON1) 및 둘코락스에스(CON2)보다는 낮지만 500 mg/kg 투여군에서만 변의 중량 증가 효과를 나타내었으며, 효모인 Sacchromyces cerevisiae(S1) 균주는 발효를 하더라도 변의 중량 증가 효과가 없었다.
실험예 3: 추출물의 종류에 따른 동물실험을 통한 변비 개선 및 예방 효과 확인
가. 실험동물 및 실험군
실험동물은 실험예 2와 동일하게 준비하고, 실험동물은 구입 후 1주일 동안 순화한 다음, 각 군당 5마리씩을 배치하여 표 4과 같이 실험군을 설정하였다.
표 4
구분 실험군
NOR 일반 사료 섭취하는 정상 대조군
LOP 변비유발을 위해 로페라미드를 5일동안 4 mg/kg 피하투여한 음성 대조군
CON1 센노사이드 50 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여한 양성 대조군
CON2 둘코락스에스 36.25 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여한 양성 대조군
1-200 제조예1의 결명자물추출물 200 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
1-L1-100 제조예1 추출물의 L1균주 발효물(제조예4) 100 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
1-L1-200 제조예1 추출물의 L1균주 발효물(제조예4) 200 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
3-L1-100 제조예3 희석액의 L1균주 발효물(제조예4) 100 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
3-L1-200 제조예3 희석액의 L1균주 발효물(제조예4) 100 mg/kg 1주일 경구투여후, 로페라미드 5일동안 4 mg/kg 피하투여
2-L1-200(P) 로페라미드를 5일동안 4 mg/kg 피하투여한 후, 제조예2 추출물의 L1균주 발효물(제조예4) 200 mg/kg 1주일 경구투여
1-L1-100은 및 1-L1-200은 결명자 물추출물의 발효물을 투여한 것이고, 3-L1-100 및 3-L1-200은 결명자 물희석액의 발효물을 투여한 것이며, 2-L1-200(P)는 로페라미드를 선처리하여 변비를 유발시킨 후 변비 치료 효과를 확인하기 위한 것이다.
정상 대조군(NOR), 음성 대조군(LOP) 및 2-L1-200(P)를 제외한 각 실험군은 로페라미드 투여 전에 각각의 양성 대조군 약물이나 제조예 4의 발효물을 5 일동안 경구 투여하였다.
정상 대조군(NOR)을 제외한 음성 대조군(LOP), 양성 대조군(CON1, CON2) 및 2-L1-200(P)를 제외한 모든 실험군들은 로페라미드를 5일 동안 피하투여하여 변비를 유발하였고, 로페라미드 투여개시일로부터 6 일째 실험동물을 희생시켰다.
2-L1-200(P)는 음성 대조군(LOP)과 동일하게 로페라미드를 5일 동안 피하투여하여 변비를 유발시킨 후, 2-L1-200과 동일한 제조예2 추출물의 L1균주 발효물(제조예4) 200 mg/kg 5일 경구투여후, 마직막 발효물 투입 다음날 실험동물을 희생시켰다.
나. 체중, 사료 섭취량 및 음수량
2-L1-200(P)를 제외한 모든 실험군은 로페라미드 투여개시일부터 실험동물 희생시킬 때까지, 2-L1-200(P)는 로페라미드 발효물 투여개시일부터 실험동물을 희생시킬 때까지의 실험동물의 체중변화량(g), 사료 섭취량(g) 및 음수량(mL)을 확인한 결과, 실험기간 동안 사료섭취량 및 음수량에는 유의적인 차이가 없었고, 체중증가량에 있어서도 유의적인 차이를 보이지 않았다.
다. 변의 개수
각 실험군들의 변의 중량 결과는 도 4에 나타내었다.
2-L1-200(P)는 발효물 투여개시일로부터 4일째, 나머지는 로페라미드 투여개시일부터 4일째에 케이지 안의 변을 제거하고 베드를 갈아준 후 1일 동안 변을 수거하여 변의 개수 및 변의 중량을 측정한 것이다.
제조예 1의 결명자 물추출물 200 mg/kg 투여한 1-200 실험군에 비해서, 동일하게 200 mg/kg을 투여한 1-L1-200 및 3-L1-200 실험군에서 모두 유의적으로 변의 개수를 증가시켰고, 3-L1-100 실험군은 100 mg/kg 투여했음에도 유의적으로 변의 개수를 증가시켰고, 둘코락스에스(CON2)와 동등한 수준의 효과를 나타내었다.
변비를 유발한 후 제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물의 L1 균주 발효물을 투여한 2-L1-200(P) 실험군은 변의 개수가 26.2 ± 3.1 개로 음성 대조군(LOP)에 비해 변의 개수를 유의적으로 다시 증가하였다.
라. 변의 중량
각 실험군들의 변의 중량 결과는 도 5에 나타내었다.
제조예 1의 결명자 물추출물 200 mg/kg 투여한 1-200 실험군에 비해서, 동일하게 200 mg/kg을 투여한 1-L1-200 및 3-L1-200 실험군에서 모두 유의적으로 변의 중량을 증가시켰고, 100 mg/kg 투여한 1-L1-100 및 3-L1-100 실험군에서도 했음에도 유의적으로 변의 중량을 증가시켰고, 둘코락스에스(CON2)와 동등한 수준의 효과를 나타내었다.
2-L1-200(P) 실험군은 변의 중량이 3.18 ± 0.28 개로 음성 대조군(LOP)에 비해 유의적으로 다시 증가하였다.
마. Carmine 색소 장 이동 거리
Carmine 색소 장 이동 거리는 carmine 색소를 생리식염수에 1.5% (w/v)농도로 하여 6일째에 3mL 경구투여 하였으며, 경구투여 20분 후에 실험동물을 희생시킨 후, 대장은 맹장 이후 부분부터 직장까지 부위의 양쪽을 결찰하여 적출하여, PBS로 장기를 수세한 후의 사진을 도 6에 나타내었고, 도 6에서 표시한 Carmine 색소가 이동한 거리를 측정하여 도 7에 나타내었다.
Carmine 색소의 장 이동 거리는 정상 대조군(NOR)이 13.4 ± 0.94 cm인 것에 비해, 로페라미드 투여 음성 대조군(LOP)가 6.6 ± 0.75 cm로 감소되어, 로페라미드에 의한 변비 유발이 확인되었고, 센노사이드(CON1)와 둘코락스에스(CON2)는 장 이동 거리가 음성 대조군(LOP)에 비하여 현저히 증가하였다.
1-200 실험군은 장 이동 거리에서 음성 대조군(LOP)와 유의차가 없었으나, 2-200 실험군은 음성 대조군(LOP)에 비해서 유의적으로 장 이동 거리가 증가하였다.
1-L1-100 및 3-L1-100 실험군은 2-200 실험군의 1/2 양으로 투여했음에도 2-200 실험군과 유사한 장 이동 거리를 나타내었고, 1-200 및 2-200 실험군과 동일 양을 투여한 1-L1-200 및 3-L1-200 실험군은 2-200 실험군에 비해서 현저히 장 이동 거리가 늘어남을 확인하였다.
1-L1-200 및 3-L1-200 실험군은 양성대조군인 센노사이드 및 둘코락스에스와 동등하거나 그 이상의 장 이동 거리를 나타내었으며, 특히 3-L1-200 실험군은 정상 대조군(NOR)과 동등한 장 이동 거리를 나타내었다.
실험예 4: 발효 전 후 HPLC-IT/TOP MS 패턴비교
제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물 분말과 제조예 2의 결명자 에탄올 수용액 추출물 분말을 L1 균주로 발효시킨 제조예 3의 결명자 유산균 발효물 분말을 동일 농도로 HPLC-IT/TOP MS 기기(Shimadzu, 일본)를 이용하여 HPLC-IT/TOP MS를 실시하여 패턴을 비교하였다. Acquity UPLC C-18, 1.7m 2.1×100mm 컬럼으로, 유속 0.3 mL/min, 아세토니트릴 10% 수용액에서 70% 수용액으로 그래디언트로 측정하였다.
제조예 2의 결명자 에탄올수용액 추출물의 패턴을 도 6a에 제조예 3의 결명자 유산균 발효물의 패턴은 도 6b에 나타내었다. 상기 패턴 비교를 통해 제조예 2의 결명자 에탄올 수용액 추출물 패턴에서 다수의 피크가 발효를 통해 함량이 낮아지거나 사라지고, 대신 새로운 피크가 생성됨을 확인하였다.
실험예 5: Lactobacillus kefiri MJ90(L1) 균주의 동정
가. 균주의 분리
변비 개선 또는 예방 활성이 뛰어난 결명자 발효물 제조에 가장 뛰어났던 Lactobacillus kefiri MJ90 균주의 분리과정을 설명한다.
티벳버섯 1 조각을 표면 세척을 위하여, 멸균수로 수 회 반복하였다. 준비된 티벳버섯 1조각을 MRS 액체 배지에 37에서 150 rpm으로 24시간 진탕 배양 후 1 % CaCO3이 함유된 MRS평탄 배지에 멸균수로 10배씩 3회 희석하였다. 1×103배로 희석된 티벳버섯 배양 시료를 MRS고체 배지에 100L 분주 후 도말하였다. 도말된 배지는 항온 항습 배양기에서 36 내지 48시간 동안 배양하였다. 그리고 배양된 집락들 중 형태학적으로 상이한 것을 선택하여 MRS 아가에 평판 획선하여 배양하여 순수 분리하였다.
나. 16s-rDNA 서열분석을 통한 균주의 동정
서열 분석을 위해 분리된 Lactobacillus kefiri MJ90 균주를 Lactobacilli MRS broth에 배양하고 배양액 1.5 mL를 취해 원심 분리한 후 0.8% 멸균생리식염수로 수세하였다. 그리고 genomic DNA kit를 사용하여 chromosomal DNA를 추출하여 PCR을 위한 주형 DNA로 사용하였으며, 세균의 16s rRNA의 증폭을 위해 9 F (5'-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3 ')와 1412R (5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3') 프라이머를 사용하였다. PCR 수행 후 PCR 산물을 전기영동을 통해 증폭 산물을 확인하고 QIAquick PCR purification kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였다. 염기서열은 ABI PRISM Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, USA) and ABI PRISM 3730xl Analyzer (AppliedBiosystems) 사용하여 Geno Tech Co. (Daejeon, Korea)에서 실시하였다. 제공된 염기서열을 이용하여 NCBI에서 블라스트 검색을 실시하였으며, MEGA 5.0 프로그램을 사용하여 계통도를 조사하여 도 9에 나타내었고, 상기 균주는 락토바실러스 케피리로 동정되었다.
상기 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90의 16s rRNA 염기서열은 서열번호 1에 나타내었고, 상기 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90 균주는 한국미생물보존센터에 2014년 10월 1일자로 기탁하여 KCCM11575P 수탁번호를 부여받았다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11575P
수탁일자 : 20141001
Figure PCTKR2015011359-appb-I000001

Claims (15)

  1. 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결명자 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매의 추출물인 것을 특징으로 하는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품.
  3. 제2항에 있어서, 상기 건강기능식품은 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태의 제제인 것을 특징으로 하는 변비 개선 또는 예방용 건강기능식품.
  4. 결명자 유산균 발효물을 유효성분으로 하는 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 결명자 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매의 추출물인 것을 특징으로 하는 변비 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  6. 결명자 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 결명자 추출물에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계;를 포함하는 변의 개수, 변의 수분 함량 및 변의 중량 중에서 어느 하나 이상을 증가시키는 결명자 유산균 발효물의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스속, 비피도박테리움속, 류코노스톡속, 페디오코커스속, 엔테로코커스속 유산균 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유산균인 것을 특징으로 하는 결명자 유산균 발효물의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 케피리 또는 락토바실러스 애시도필러스인 것을 특징으로 하는 결명자 유산균 발효물의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 락토바실러스 케피리는 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90[기탁번호: KCCM11575P]인 것을 특징으로 하는 결명자 유산균 발효물의 제조방법.
  10. 제6항에 있어서, 결명자 또는 그 분쇄물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계; 및 상기 단계의 결명자 추출물에 유산균을 1×103 내지 1×106 CFU/㎖가 되도록 접종하여 30 내지 45 ℃에서 1 내지 7 일 동안 발효시키는 단계;를 포함하는 결명자 유산균 발효물의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 추출하는 단계는 결명자 분쇄물 1 중량부에 대하여 물 10 내지 50 중량부를 혼합한 후 정치 또는 교반하면서 0.5 내지 24 시간 추출하는 것을 특징으로 하는 결명자 유산균 발효물의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 추출하는 단계는 결명자 또는 그 분쇄물 1 중량부에 대하여 20 내지 80 중량%의 에탄올 수용액 5 내지 30 중량부 혼합하여 0.5 내지 24 시간 추출한 후, 상기 추출액을 건조하여 에탄올을 제거하는 것을 특징으로 하는 결명자 유산균 발효물의 제조방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 발효시키는 단계의 결명자 추출물에 유산균 영양원을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 결명자 유산균 발효물의 제조방법.
  14. 결명자를 발효시켜 변비 개선 또는 예방 활성을 증진시키는 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) MJ90[기탁번호: KCCM11575P].
  15. 변비 환자에게 유효량의 결명자 유산균 발효물을 투여하는 것을 포함하는 변비 환자의 치료 또는 예방을 위한 방법.
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