KR102577648B1

KR102577648B1 - 바실러스 서틸리스 sb051 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102577648B1
Application number: KR1020230069737A
Authority: KR
Inventors: 이아름
Original assignee: 이아름
Priority date: 2023-05-31
Filing date: 2023-05-31
Publication date: 2023-09-12

Abstract

본 발명은 바실러스 서틸리스 SB051 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 전통장류 발효식품으로부터 분리 및 동정한 바실러스 서틸리스 SB051 균주가 7종의 효소 분비능 및 지방축적 억제 활성이 있고, 바실러스 세레우스 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않으며, 본 발명의 SB051 균주를 이용한 콩 발효물을 고지방식이 동물모델에 투여하였을 때, 고지방식이로 인해 증가된 체중 및 지방조직의 무게가 감소되는 효과가 있다. 따라서 바실러스 서틸리스 SB051 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물은 항비만 관련 건강기능식품 또는 의약 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바실러스 서틸리스 SB051 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating obesity comprising Bacillus subtilis SB051 strain or fermented soybean using the same as effective component}

본 발명은 바실러스 서틸리스 SB051 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

비만은 에너지 섭취와 소비 간의 불균형으로 인해 과도하게 체지방이 축적되어 지방세포의 수와 크기가 증가하는 것으로, 체내 에너지는 지방세포에 중성지방(triglyceride) 형태로 저장되었다가 에너지원이 고갈되면 저장되었던 지방이 유리지방산과 글리세롤로 분해되어 에너지원으로 사용되게 되지만, 에너지의 과잉 섭취는 지방세포의 분화를 촉진하고 체내 저장 지방량을 증가시켜 비만의 직접적인 원인이 된다.

비만은 내장과 복부의 지방축적에 따른 체형의 변화뿐만 아니라 각종 질환의 발병률을 증가시키는 위험요소로 작용한다. 내장지방이 과도하게 쌓이게 되면 체내 당 대사에 문제가 생기게 되며, 호르몬 분비 이상, 사이토카인 분비 이상 등의 증상이 발생하게 된다. 비만으로 인해 중성지방과 LDL-콜레스테롤의 증가, HDL-콜레스테롤의 감소는 체내 지방 대사 이상을 가져오고, 조직에 존재하는 인슐린 수용체를 감소시키며, 인슐린 민감도 또한 감소시켜 세포 내로 이동되는 포도당의 운반이 억제되면서 고혈당, 당뇨병을 유발하기도 한다. 또한 비만은 고지혈증, 심혈관계 질환, 암, 호흡기 장애, 뇌졸중, 골관절염(osteoarthritis) 등의 대사질환의 발생과 관계가 깊은 것으로 알려져 있다.

지방세포는 지방전구세포로부터 분화하여 만들어지는데, 이러한 지방세포 분화 시 중성지방의 축적이 일어나고 지방세포 특이적 단백질(aP2, FAS, GLUT4, LPL, leptin)의 발현이 유도되며, 이에는 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ), C/EBP family(CCAAT/enhancer binding proteins; C/EBRα, C/EBRβ 및 C/EBRδ), ADD1/SREBP1c(adipocyte determination differentiation factor 1)/(sterol regulatory element binding protein 1c)라고 불리는 전사인자들이나 지방세포 신호전달물질(adipokines) 등이 중추적인 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

지방지방세포인 3T3-L1은 Green과 Meuth에 의해 처음으로 3T3 세포로부터 분리되었고, 생물학적 특성과 적절한 배양 조건으로 지방세포로 분화하는 성질이 밝혀진 후 지방세포의 분화과정과 축적된 지방의 분해에 대한 연구를 수행하는데 널리 이용되고 있다. 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 성숙 지방세포로 분화되면서 관련 유전자의 발현과 관련 효소 활성의 증가로 세포 내 중성지방을 축적하게 된다. 기능성 소재 개발 연구를 위해서 지방조직 내의 중성지방의 과도한 축적 저해를 목표로 3T3-L1 세포를 이용하여 분화 과정을 억제하거나 지방 분해를 촉진하는 소재를 탐색하는 방법이 널리 사용되고 있다.

기존의 오르리스타트(orlistat), 시부트라민(sibutramin) 등의 항비만 약물은 구토, 변비, 위장장애, 심혈관 질환 등 심각한 부작용을 지닌 것으로 알려졌기 때문에, 효과적이고 안전한 물질 개발 노력이 지속되고 있다. 레티놀, 비타민 E, 비타민 U, 산초나무 추출물 등이 지방 세포 분화를 억제 기능을 하는 물질로서 보고된 바 있으며, 안전하고 지속적인 섭취가 가능한 천연물 소재의 항비만제 개발 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

항비만 관련 기술로는 한국등록특허 제2328742호에 신규한 와이셀라 시바리아 균주 및 이의 유청 발효물을 포함하는 비만 또는 지방간 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제2522975호에 신규한 모나스커스 퍼퓨리우스 SL1을 이용하여 제조된 모링가 발효물을 유효성분으로 함유한 항비만용 조성물이 개시되어 있으나, 아직까지는 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB051 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 바실러스 서틸리스 SB051 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 전통장류 발효식품으로부터 분리 및 동정한 바실러스 서틸리스 SB051 균주가 7종의 효소 분비능 및 지방축적 억제 활성이 있고, 바실러스 세레우스 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않으며, 본 발명의 SB051 균주를 이용한 콩 발효물을 고지방식이 동물모델에 투여하였을 때, 고지방식이로 인해 증가된 체중 및 지방조직의 무게가 감소되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효소 분비능 및 지방축적 억제 활성이 있고, 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCTC19095P인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB051 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 이용하여 발효시킨 콩 발효물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 상기 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 상기 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 바실러스 서틸리스 SB051 균주 또는 이를 이용한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 전통장류 발효식품으로부터 분리 및 동정한 바실러스 서틸리스 SB051 균주가 7종의 효소 분비능 및 지방축적 억제 활성이 있고, 바실러스 세레우스 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않으며, 본 발명의 SB051 균주를 이용한 콩 발효물을 고지방식이 동물모델에 투여하였을 때, 고지방식이로 인해 증가된 체중 및 지방조직의 무게가 감소되는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB051 균주의 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 및 리파아제(lipase) 활성을 나타낸 결과이다. A는 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주이고, B는 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB051 균주이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB051 균주의 지방축적 억제 효과를 나타낸 결과이다. A는 분화된 지방세포를 Oil-red-O 용액으로 염색한 뒤 분화 정도를 현미경으로 촬영한 세포 사진이고, B는 ORO(Oil-red-O) 함량을 측정한 결과이다. PA(Preadipocyte)는 아무것도 처리하지 않은 정상군이고, Control은 지방분화 유도물질(0.25M dexamethasone, 10㎍/㎖ insulin, 0.5μM IBMX) 단독 처리군이고, KCTC 3014는 지방분화 유도물질 및 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주를 처리한 군이며, SB051은 지방분화 유도물질 및 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB051 균주를 처리한 군이다. a-d는 각 처리군 간에 유의한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 3은 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB051 균주를 3T3-L1 지방전구세포에 처리하였을 때, 지방분화 촉진 유전자(C/EBPα 및 PPARγ)의 발현 변화를 확인한 결과이다. Control은 지방분화 유도물질 단독 처리군이고, KCTC 3014는 지방분화 유도물질 및 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주를 처리한 군이며, SB051은 지방분화 유도물질 및 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB051 균주를 처리한 군이다. a-c는 각 처리군 간에 유의한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 4는 고지방식이 동물모델에서 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB051 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여하였을 때, 체중 변화를 나타낸 결과이다. NC은 일반식이군으로 정상군이고, HF은 고지방식이로 비만을 유도한 군이며, Non-DB은 고지방식이를 하며 균주를 접종하지 않은 콩 건조물을 투여한 군이고, KCTC 3014은 고지방식이를 하며 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여한 군이며, SB051은 고지방식이를 하며 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB051 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여한 군이다. *, **은 정상군(NC) 대비 비만 유도군(HF), 균주를 접종하지 않은 콩 건조물 투여군(Non-DB), 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주로 발효시킨 콩 발효물 투여군(KCTC 3014)의 체중이 유의미하게 증가하였다는 것으로, *은 p<0.05이고, **은 p<0.01이며, #은 비만 유도군(HF) 대비 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB051 균주로 발효시킨 콩 발효물 투여군(SB051)의 체중이 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 5는 고지방식이 동물모델에서 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB051 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여하였을 때, 부고환주위의 지방(epididymal adipose tissue), 피하지방(subcutaneous adipose tissue) 및 복대지방(retroperitoneal adipose tissue)의 무게 변화를 나타낸 것이다. NC은 일반 식이군으로 정상군이고, HF은 고지방식이로 비만을 유도한 군이며, Non-DB은 고지방식이를 하며 균주를 접종하지 않은 콩 건조물을 투여한 군이고, KCTC 3014은 고지방식이를 하며 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여한 군이며, SB051은 고지방식이를 하며 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB051 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여한 군이다. a-c는 각 처리군 간에 유의한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 6은 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB051 균주의 계통도를 나타낸 것이다.

본 발명은 효소 분비능 및 지방축적 억제 활성이 있고, 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCTC19095P인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB051 균주를 제공한다.

본 발명에서 메주 및 된장으로부터 균주를 분리하였고, 효소 분비능 및 지방축적 억제 활성이 있고, 독소 유전자 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 확인하였으며, 이를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB051 균주로 동정하여 한국생명공학연구원(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2023년 5월 12일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCTC19095P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 효소는 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase), 리파아제(lipase), 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리아파제(esterase lipase) 및 α-글루코시다아제(α-glucosidase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 독소 유전자는 용혈성 장독소(hemolytic enterotoxin), 비용혈성 장독소(non-hemolytic enterotoxin) 및 사이토톡신 K(Cytotoxin K) 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 유해효소는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 균주는 전술한 바와 같다.

상기 콩은 대두, 서리태(검은콩), 백태(노란콩), 강낭콩, 렌틸콩, 병아리콩, 밤콩 또는 동부콩일 수 있으며, 바람직하게는 백태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 콩 발효물은 당업계에서 콩 발효에 의해 생산될 수 있는 모든 형태(예컨대, 메주, 간장, 된장, 고추장, 청국장 및 낫토 등)를 포함한다.

본 발명의 콩 발효물은 콩 발효물 추출물, 콩 발효물 엑기스, 콩 발효물 농축액 또는 콩 발효물 분말일 수 있으며, 바람직하게는 콩 발효물 분말일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다..

상기 균주 및 콩 발효물은 전술한 바와 같다.

상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다. 상기 형개 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 캐러멜, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 즉, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기의 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 덱스트린, 사이클로 덱스트린과 같은 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 크게 중요하지 않지만, 본 발명의 조성물 100g에 대하여, 0.01~0.04g인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.02~0.03g을 포함하는 것이지만 이에 한정하지 않는다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 환제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 피부 외용으로 사용한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량의 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[재료 및 방법]

1. 균주 탐색 및 분리

순창지역 및 타 지역(전국 8도)에서 전통적인 방식으로 제조된 메주 및 된장 시료를 수집 및 구입하여 1.0g의 시료를 9.0㎖의 멸균된 생리 식염수(0.85% NaC)에 단계적으로 희석하여 고초균 LB 배지(Luria-bertani agar, Difco^TM,, USA)에 각각 도말한 후 미생물의 배양 조건에 따라 배양하면서 각 배지에서 자라는 세균의 콜로니의 형태학적으로 분리하여 새로운 배지에 2~3회 도말하여 순수분리하였다.

2. 효소 활성 확인

분리 균주의 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 및 리파아제(lipase) 활성을 분석하기 위해, Hole diffusion method를 사용하였다. 각 균주의 단일 콜로니를 LB 배지에 접종한 후 37℃, 150 rpm의 진탕배양기에서 24시간 동안 배양하였으며, 각 배양액을 13,000rpm으로 원심분리하여 상층액을 회수하여 분석 시험액으로 사용하였다.

아밀라아제 활성을 분석하기 위한 기질로 가용성 전분(soluble starch)을 선택하여 가용성 전분 1%가 포함된 1.5% 아가 배지를 제조하였으며, 배지에 8mm hole을 형성한 후 각 hole에 배양 상층액 100㎕를 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배지에 루골 용액(Lugol solution)을 처리한 후 용액을 제거하고, hole 주변에 형성된 투명환의 지름을 측정하여 아밀라아제 활성을 평가하였다.

프로테아제 활성을 분석하기 위한 기질로 탈지유(skim milk)를 선택하여 탈지유 2%가 포함된 1.5% 아가 배지를 제조하였으며, 배지에 8mm hole을 형성한 후 각 hole에 배양 상층액 100㎕를 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 hole 주변에 형성된 환의 지름을 측정하여 프로테아제 활성을 평가하였다.

셀룰라아제 활성을 분석하기 위한 기질로 CMC(Carboxylmethyl cellulose)를 선택하여 CMC 1.5%가 포함된 1.5% 아가 배지를 제조하였으며, 배지에 8mm hole을 형성한 후 각 hole에 배양 상층액 100㎕를 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배지에 0.5% 콩고 레드 용액(congo red solution)을 부어 15분간 배지를 염색시킨 후 1M NaOH 용액을 부어 탈색하고, hole 주변에 형성된 투명환의 지름을 측정하여 셀룰라아제 활성을 평가하였다.

리파아제 활성을 분석하기 위해, 기질로 1% TBN(tributyrin)를 선택하여 1% LB 아가 배지(1.5% agar)를 제조하였으며, 1시간 동안 초음파 처리하여 유화시킨 후 배지에 8mm hole을 형성하여 각 hole에 배양 상층액 100㎕를 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 hole 주변에 형성된 환의 지름을 측정하여 리파아제 활성을 평가하였다.

3. 3T3-L1 지방세포를 이용한 지방분화 억제능 확인

1) 지방축적 억제

3T3-L1 지방전구세포를 10% BCS(Bovine Calf Serum) 및 1% PEST(penicillin-streptomycin)를 함유한 high-glucose DMEM(Dulbecco’Modified Eagle’Media; Gibco) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 이후, 6웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 농도로 분주하였고, 100% 컨플루언트(confluent) 상태인 4일 후 10% FBS 및 1% PEST를 함유한 high-glucose DMEM에 지방전구세포의 분화 유도인자인 MDI[3-isobutyl-1-methylxanthine(0.25mM), dexamethasone(1μM), insulin(1㎍/㎖)]를 첨가하여 분화를 유도하였다. 분화 초기 3일 동안 매일 같은 배양액을 교환해 주었고, 분화 중기 3일 동안 배양액을 인슐린(1㎍/㎖)을 포함하는 DMEM으로 교환하였다. 이후 분화 후기 3일 동안은 DMEM 배양액으로 교환하여 실험에 사용하였다. 이때 시료는 분화 유도 시작과 동시에 같이 처리해주었다.

상기 세포 배양 및 분화 유도 프로토콜에 따라 분화시키면서 세포독성이 나타나지 않는 범위 내에서 SB051 선별 균주 및 비교 균주인 KCTC 3014 균주를 농도별로 분화초기(3일째), 분화중기(6일째), 분화후기(9일째)에 각각 처리하였다. 지방전구세포의 분화에 미치는 영향을 측정하기 위해, 분화초기, 분화중기, 분화후기에 각각 Oil red O 염색을 실시하였다. 10% 포르말린을 첨가하여 세포를 고정시킨 후, 60% 이소프로판올을 첨가하여 수세하고 Oil red O 용액을 첨가하여 60분 동안 지방구를 염색하였다. 염색 후 지방구의 세포 내 축적을 현미경을 이용하여 관찰하였다. 염색된 지방구 정량을 위해 잘 건조된 상태에서 100% 이소프로판올을 첨가하여 Oil red O 염료를 용출시킨 뒤 iMARK^TM 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 이용하여 560nm 파장에서 OD(optical density) 값을 측정하였다.

2) 지방분화 촉진 관련 유전자 발현

본 발명의 SB051 선별 균주의 지방분화 촉진 관련 유전자(C/EBPα 및 PPARγ) 발현 조절을 확인하기 위해, real-time PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 실시하였다. ICR 마우스의 지방세포를 초대배양 하기 위해, Biovision K583-5 Preadipocyte Isolation Kit를 통해 지방세포를 분리 배양하였으며, 배양 2일째에, 시료인 KCTC 3014 및 SB051 균주 분말을 24시간 동안 처리하였다. RNeasy mini kit(QIAGEN)를 이용하여 RNA를 추출한 뒤, iScript cDNA 생합성 키트를 활용하여 cDNA를 합성하였으며, 합성이 완료된 cDNA는 하기 표 1에 개시된 프라이머를 사용하여 real-time PCR을 진행하였다(iQ SYBR Green supermix, Biorad, USA).

본 발명에 사용된 프라이머 정보

유전자	프라이머 염기서열
C/EBPα	정방향 5'-GAGCTGAGTGAGGCTCTCATTCT-3'(서열번호 1)
C/EBPα	역방향 5'-TGGGAGGCAGACGAAAAAAC-3'(서열번호 2)
PPARγ	정방향 5'-GCCCACCAACTTCGGAATC-3'(서열번호 3)
PPARγ	역방향 5'-TGCGAGTGGTCTTCCATCAC-3'(서열번호 4)

4. 고지방식이 동물모델에서 체지방 감소 확인

1) 선별 균주를 이용한 콩 발효물 제조

전남 영광에서 구입한 백태(메주콩)를 수세 후, 24시간 동안 침지하여 약 1.8배 무게 증량을 실시하였다. 1kg씩 유리수기에 소분하여 121℃에서 15분간 습식멸균하여 콩을 익히고, 55℃ 온도에서 SB051 선별 균주 및 비교균주인 KCTC 3014의 배양액 각각을 0.5% 비율로 접종하여 37℃, 습도 80% 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 획득한 콩 발효물을 열풍 저온건조(45℃, 72시간)하고, 미세분쇄 및 균질화하여 실험동물에 투여하였다.

2) 고지방식이 동물모델 설계

실험동물로서 생후 5주령된 수컷 C57BL/6 마우스를 ㈜샘타코(SAMTACO, Korea)로부터 구입하여 동물 사육실에서 일정한 조건(온도: 22±2℃, 습도:50±5%, 명암: 12시간 light/dark cycle)으로 일주일간 적응시킨 후 사용하였다. 실험군은 일반 식이군으로 정상군(Cont), 고지방식이로 비만을 유도한 군(HF), 고지방식이를 하며 균주를 접종하지 않은 콩 건조물 200mg/kg을 투여한 군(Non-DB), 고지방식이를 하며 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주로 발효시킨 콩 발효물 200mg/kg을 투여한 군(KCTC 3014)이며, 고지방식이를 하며 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB051 균주로 발효시킨 콩 발효물 200mg/kg을 투여한 군(SB051)으로 나누었다.

적응기간 이후, 실험동물은 평균 몸무게가 동일하게 무작위 배정하여 상기 5군으로 군 분리를 실시하였으며, 총 4주간 매일 경구투여하였다. 정상군(Cont)과 비만 유도군(HF)은 물을 경구투여하였다. 투여 종료 시까지 일주일에 2회 이상 체중 및 식이섭취량을 측정하고, 실험 종료 시 실험동물 희생 후 지방조직을 적출하여 무게를 측정하였다.

5. 선별 균주의 16s rRNA 서열 분석을 통한 동정

선별 균주의 동정을 위하여 균주들의 균체는 아가 플레이트로부터 1 콜로니를 취하여 300㎕의 LB 액체배지에 접종 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 100℃에서 10분 동안 끓인 후 ice-cold 상태에서 10분 동안 반응 한 뒤 10,000rpm에서 10분동안 원심분리하였다. 상층액을 새로운 마이크로튜브에 옮겨준 뒤 -20℃에 냉동 보관하며 PCR에 사용하였다. 각 시료별 DNA 농도는 바실러스 하우스 키핑 유전자인 rpoB와 mdh 영역에 대한 PCR을 통해 확인하였다. 16S rRNA 유전자는 두 개의 알려진 유니버설 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: 정방향 프라이머(Forward primer)는 27F 프라이머(5'-AGAGTTTGA TCMTGGCTCAG-3', 서열번호 5) 및 역방향 프라이머(Reverse primer) 1492R 프라이머(5'-TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3', 서열번호 6). PCR을 위한 각 반응의 온도 조건은 다음과 같다: DNA의 변성(denaturation) 95℃에서 1분, 프라이머의 결합(annealing) 60℃에서 1분, DNA 가닥의 합성 72℃에서 1분 또는 2분의 과정을 35회 반복하는 조건을 사용하였다. 반응이 끝난 PCR 산물은 1.0% 아가로오스 겔(5 ㎕, X-gal 30mg/㎖)에서 전기영동한 후 밴드를 확인하였다. 증폭이 확인된 PCR 산물은 코스모진텍에 의뢰하여 균주를 동정하였다.

6. 선별 균주의 Bacillus cereu s 독소유전자(hb1 ACD, nhe ABC, cytK) 분석

바실러스 세레우스가 생성하는 것으로 알려진 용혈성 장독소(hemolytic enterotoxin, hb1 ACD), 비용혈성 장독소(non-hemolytic enterotoxin, nhe ABC) 및 사이토톡신 K(Cytotoxin K, CytK) 유전자에 대해 선별 균주의 보유 유무를 분석하기 위해, 특정 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 기기는 C1000 Thermal Cycler(Biorad)를 사용하으며, 이들 독소 검출용 프라이머 서열들은 하기 표 2와 같으며, PCR 조성물은 총 20㎕를 기준으로 TaKaRa사의 Emerald taq(2X) 10㎕ , DNA 시료 2㎕, 프라이머 세트 1㎕, 멸균증류수 7㎕를 혼합하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 초기 변성 후, 94℃ 1분간 변성, 56-58℃ 1분간 결합, 72℃ 1분간 증폭 과정을 30회 반복하고 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다.

Bacillus cereus 독소 유전자에 따른 프라이머

타겟유전자	정방향 염기서열(5'-3')	역방향 염기서열(5'-3')	생성물 사이즈(bp)
hblA	ACCAGTAGCGACTTTTGCAAGTGAA (서열번호 7)	TTTTGAGCTGCATTCTCAATATGCC (서열번호 8)	909
hblB	ATCAATACTCTCGCAACACCAATCG (서열번호 9)	ATGTGCTCGTTGCTCTGCTGTTAAT (서열번호 10)	957
hblC	GACTGAAGACAGCATTGGCTCAAAC (서열번호 11)	CGATGTCTTTCGAAATGAATTCTGC (서열번호 12)	1059
hblD	ATATGCGCAAAATGTAATTGCTCCA (서열번호 13)	TGCCTTCTTCAACATTTGTTTGAATTT (서열번호 14)	935
nheA	ACTTATGGCAGTATTTGCAGCAGGA (서열번호 15)	TGCAACGCTGTAATTGCAGTATCAA (서열번호 16)	972
nheB	GACCAGCAGGATTCCCAGATGTAAT (서열번호 17)	CCACGCCTTCATGTAATTTTTCTGT (서열번호 18)	930
nheC	CGGTAGTGATTGCTGGG (서열번호 19)	CAGCATTCGTACTTGCCAA (서열번호 20)	582
cytK	CCGCTGTTTTTGCTAGTAGTGCTGT (서열번호 21)	ACGTCTTTTACGTTGTTTCCAACCC (서열번호 22)	901

7. 선별 균주의 효소 및 기질 이용능 확인

선별 균주의 효소활성을 조사하기 위해 API ZYM 키트(bioMeriux Co., France)를 사용하여 19종의 효소 활성을 측정하였고, API CHB50 키트를 이용하여 선별 균주의 당 이용성을 확인하였다.

실시예 1. 분리 균주의 효소 활성 분석

전통장류 발효식품인 메주 및 된장 시료로부터 약 117종의 균주를 분리하였으며, 분리 균주의 아밀라아제, 프로테아제, 셀룰라아제 및 리파아제 활성을 분석하여 상호 비교분석을 통해 최종적으로 후보 균주 22종을 선발하였다. 22종 분리 균주의 효소 활성을 표 3에 나타내었으며, SB051 균주가 아밀라아제, 프로테아제, 셀룰라아제 및 리파아제의 활성이 높은 것을 확인하였다(도 1).

분리 균주의 효소 활성(단위: cm)

NO.	Strain No.	Protease	Amylase	Cellulase	Lipase
1	SB008	1.6	0.9	1.9	0
2	SB009	1.6	1.25	1.8	0
3	SB051	2.8	1.7	2.4	1.5
4	SB031	1.45	0	1.6	0
5	SB032	1.3	1.2	1.2	0
6	SB033	1.3	1.2	1.2	0
7	SB046	1.6	0	1.7	1.3
8	SB048	1.6	1.4	1.7	0
9	SB049	1.3	1.1	1.2	0
10	SB050	1.75	0	1.95	0
11	SB051	2.7	1.2	2.3	1.4
12	SB056	1	0	1.75	0
13	SB057	1.5	1.2	1.3	0
14	SB058	1.7	1.6	1.75	1.2
15	SB060	1.3	1.3	1.6	0
16	SB061	1.5	0	1.7	0
17	SB085	1.6	1.5	1.8	1.3
18	SB086	1.6	1.3	1.7	0
19	SB092	1.1	0	1.3	0
20	SB097	1.5	1.3	1.7	0
21	SB106	1.5	1	1.9	0
22	SB115	1	1	1	0
KCTC 3014		1.3	0	0.9	0

실시예 2. 3T3-L1 지방세포를 이용한 지방분화 억제능 확인

3T3-L1 지방전구세포에서 SB051 선별 균주 처리에 따른 지방축적 억제효과를 확인하기 위해 Oil-Red-O 염색을 실시하였다.

그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 정상군(PA, Preadipocyte)에 대비하여 지방분화 유도물질(0.25M dexamethasone, 10㎍/㎖ insulin, 0.5μM IBMX) 단독 처리군(Control)의 지방축적이 통계적으로 유의미하게 증가하였으며, 지방분화 유도물질 단독 처리군 대비 본 발명의 SB051 균주 처리군의 지방축적이 유의미하게 감소하였다.

실시예 3. 3T3-L1 세포에서 지방분화 촉진 유전자 억제능 확인

SB051 선별 균주의 투여에 따른 지방분화 촉진 관련 유전자의 발현량을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이, 지방분화 유도물질 처리에 의해 증가된 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 발현 수준이 본 발명의 SB051 균주 처리로 인해 유의미하게 감소하였다.

실시예 4. 고지방식이 동물모델에서 체지방 감소 확인

고지방식이 동물모델에서 SB051 선별 균주를 이용하여 제조한 콩 발효물 투여에 따른 체지방 감소 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이, 고지방식이로 비만을 유도한 군(HF), 고지방식이를 하며 균주를 접종하지 않은 콩 건조물을 투여한 군(Non-DB) 및 고지방식이를 하며 바실러스 서틸리스 KCTC 3014 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여한 군(KCTC 3014)의 경우, 정상군(NC)에 대비하여 체중이 유의미하게 증가한 반면, 고지방식이를 하며 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB051 균주로 발효시킨 콩 발효물을 투여한 군(SB051)에서 3주째부터 고지방식이로 비만을 유도한 군(HF)에 대비하여 체중이 유의미하게 감소한 것을 확인하였다.

또한, 해부 후, 부고환주위의 지방(epididymal adipose tissue), 피하지방(subcutaneous adipose tissue) 및 복대지방(retroperitoneal adipose tissue)을 분리하여 무게를 측정한 결과, 고지방식이에 의해 증가된 지방조직의 무게가 본 발명의 바실러스 서틸리스 SB051 균주로 발효시킨 콩 발효물 투여군에서 유의미하게 감소한 것을 확인하였다(도 5).

실시예 5. 선별 균주의 동정

최종 선발된 SB051 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 23) 분석 결과를 바탕으로 BLAST 검색한 결과, 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)와 99.86% 상동성을 나타내었다(도 6). 최종적으로 선발된 균주를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SB051 균주로 명명하였고, 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2023년 5월 12일자로 기탁번호 KCTC19095P로 기탁하였다.

실시예 6. 선별 균주의 Bacillus cereu s 독소 유전자 보유 유무 분석

최종 선발된 SB051 균주의 Bacillus cereus 독소 유전자 보유 유무를 확인하였다.

그 결과, 하기 표 4에 개시한 바와 같이 최종 선발된 SB051 균주가 바실러스 세레우스가 생성하는 것으로 알려진 8종의 독소 유전자를 보유하지 않는 것을 알 수 있었다.

SB051의 바실러스 세레우스 독소 유전자 분석 결과

Target	SB051
hblA	ND¹⁾
hblB	ND
hblC	ND
hblD	ND
nheA	ND
nheB	ND
nheC	ND
cytK	ND

ND : 미검출

실시예 7. 선별 균주의 효소 및 기질 이용능 확인

효소활성 시험 결과, 본 발명의 SB051 균주는 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리아파제(esterase lipase) 및 α-글루코시다아제(α-glucosidase)의 활성을 가지고 있으며, 유해효소인 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)를 생성하지 않는 것으로 나타났다(표 5).

또한, 본 발명의 SB051 균주의 당 이용성을 분석한 결과, 글리세롤(Glycerol), L-아라비노스(L-arabinose), 리보스(riose), D-리보스(D-ribose), 메틸β-D-자일로피라노시드(Methyl-β-D-xylopyranoside), D-갈락토스(D-galactose), D-글루코스(D-glucose), D-푸룩토스(D-fructose), 이노시톨(inositol), 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), α-메틸-D-글루코시드(α-Methyl-D-Glucoside), N-아세틸-글루코사민(N-Acethyl-Glucosamine), 에스쿨린(esculin), 말토스(mlatose), 수크로스(sucrose), 트레할로스(Trehalose), 라피노스(raffinose), 전분(Starch), 글리코겐(Glycogen)을 이용할 수 있다는 것을 확인하였다(표 6).

SB051 균주의 효소 활성 확인

NO.	Enzyme	SB051
1	Control	0
2	Alkaline phosphatase	0
3	Esterase (C4)	3
4	Esterase lipase (C8)	2
5	Lipase (C14)	0
6	Leucine arylamidase	0
7	Valine arylamidase	0
8	Cystine arylamidase	0
9	Trypisn	0
10	α-chymotrypsin	0
11	Acid phosphatase	0
12	Naphthol-AS-B1-phosphohydrolase	0
13	α-Galactosidase	0
14	β-Galactosidase	0
15	β-Glucuronidase	0
16	α-Glucosidase	4
17	β-Glucosidase	0
18	N-acetyl-β-glucosamidase	0
19	α-manosidase	0
20	α-fucosidase	0

한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)

KCTC19095P

20230512

Claims

아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase), 리파아제(lipase), 에스터라아제(esterase), 에스터라아제 리아파제(esterase lipase) 및 α-글루코시다아제(α-glucosidase) 분비능 및 지방축적 억제 활성이 있고, 용혈성 장독소(hemolytic enterotoxin), 비용혈성 장독소(non-hemolytic enterotoxin) 및 사이토톡신 K(Cytotoxin K) 유전자를 보유하지 않으며, β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCTC19095P인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SB051 균주.
삭제
제1항의 균주를 이용하여 발효시킨 콩 발효물.
제1항의 균주 또는 제3항의 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제1항의 균주 또는 제3항의 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.