KR102616412B1

KR102616412B1 - 비피도박테리움 애니말리스 락티스 mg741 균주를 포함하는 비만 또는 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102616412B1
Application number: KR1020210100648A
Authority: KR
Inventors: 백남수; 강창호; 박호영; 도문호
Original assignee: 주식회사 메디오젠; 한국식품연구원
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2023-12-21
Also published as: KR20230018758A

Abstract

본 발명은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주를 포함하는 비만 또는 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 선별된 유아의 분변으로부터 분리된 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주는 안전할 뿐만 아니라, 프로바이오틱스에 적합한 성질을 나타내며, 체중 및 체지방량을 감소시키고, 지질대사 관련 단백질 발현을 조절하는 효과가 우수한 바, 비만 또는 비알콜성 지방간의 예방, 개선 및 치료를 위한 다양한 분야에 널리 활용될 수 있다.

Description

비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주를 포함하는 비만 또는 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OBESITY OR NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER COMPRISING Bifidobacterium animalis lactis MG741}

본 발명은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741을 포함하는 비만 또는 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

유산균은 특별한 생리활성능력을 가지고 있으며, 일반적으로 안전한 균주 (GRAS, generally regarded as safe bacteria)로 취급되고 있다. 유산균은 다양한 발효식품의 생산에 사용하고 있을 뿐만 아니라, 기능성과 프로바이오틱스 특성을 가지는 유제품과 발효과채 제품에 널리 사용되고 있다. 최근에는 화학보조제를 대체하는 천연 보조제에 대한 소비자의 수요가 증가함에 따라 그 대안방안으로 부각되고 있다. 프로바이오틱스는 숙주동물의 건강에 매우 유익한 효과를 주는 살아있는 미생물로, 장내 미생물의 균형을 개선하고 영양분의 흡수를 증진시킨다. 또한, 프로바이오틱스는 장내환경에서 병원성미생물의 항균작용을 나타내는 특성을 가지고 있다. 프로바이오틱스에는 다양한 미생물이 포함되지만, 락토바실러스(Lactobacillus) 속과 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속이 가장 많은 분포를 차지하고 있다.

비만은 심장병, 암, 관절염, 당뇨병의 주요 원인으로 알려져 있으며, 비만을 해결하기 위한 대중의 인식은 증가 함에도 불구하고, 비만환자들은 지속적으로 증가하고 있는 추세이다. 비만은 지방분화 (adipogenesis)의 결과로 지방세포의 수가 증가하고 지방세포의 지질함량이 증가함에 따라 나타난다. 지방세포 (adipocyte)는 초과된 칼로리를 중성지방 (triglycerides)으로 합성하고 저장하는데 주요역할을 하며, 지방분화의 결과로 지방세포의 크기와 숫자가 증가하고 세포 내 지질축적이 가속화된다. 또한 비만은 지방 독성과 산화 스트레스를 유발하고 인슐린 저항성 상태를 유발하며, 이는 고혈당을 유발할 수 있어, 다양한 비만 관련 질환의 원인이 되고 있다.

또한, 비알코올성 지방간 질환 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 만성 간 질환 중에서 가장 흔한 질환으로, 제2형 당뇨병, 비만 및 대사증후군과 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다. 서구화된 식습관 및 비만, 당뇨병 인구의 증가로 우리나라에서도 비알코올성 지방간 질환 환자가 급격하게 증가하고 있으며, 글로벌데이터 (GlobalData) 사에 따르면 비알코올성 지방간 치료제 시장은 오는 2026년까지 약 253억달러 규모에 이를 것으로 전망된다. 이는 연평균 45%씩 성장하는 수치이다. 그러나, 비알코올성 지방간 질환은 정확한 병리기전이 규명되지 않았고, 현재까지 보고된 약물 치료의 효과도 연구 대상수가 충분하지 않으며, 아직까지 공식적인 승인치료제도 없는 실정이다. 따라서, 장기간 사용시에도 안정성이 확보되며, NAFLD에 대한 뚜렷한 치료 효과를 발휘할 수 있는 새로운 치료법이 필요하다.

그러나 종래의 치료제들은 심장질환, 호흡기질환, 신경계질환 등의 부작용과 함께 그 효능의 지속성도 낮아, 더욱 개선된 치료제의 개발이 필요하고, 현재 개발되고 있는 제품도 부작용 없이 만족할 만한 치료 효과를 가지는 치료제는 거의 없어 새로운 비만 및 비알콜성 지방간 치료제의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은 새로운 기능성의 프로바이오틱스를 획득하고자 연구를 수행한 결과, 유아의 분변에서 분리된 유산균이 프로바이오틱스에 적합한 성질을 나타내고, 비만 및 비알콜성 지방관의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 비만 또는 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 비만 또는 비알콜성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 비만 또는 비알콜성 지방간의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 비만 또는 비알콜성 지방간의 예방 또는 개선용 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 선별된 유아의 분변으로부터 분리된 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주는 안전할 뿐만 아니라, 프로바이오틱스에 적합한 성질을 나타내며, 체중 및 체지방량을 감소시키고, 지질대사 관련 단백질 발현을 조절하는 효과가 우수한 바, 비만 또는 비알콜성 지방간의 예방, 개선 및 치료를 위한 다양한 분야에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 마우스 모델에서 체성분 (A) 및 체지방량 (B) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 마우스 모델에서 체중증가량 (A) 및 부고환 지방량 (B) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 마우스 모델에서 마우스의 혈청 내 엔도톡신 (A), 총 콜레스테롤 (B) 및 LDL 콜레스테롤 (C) 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 마우스 모델에서 혈청 내 ALT (A) 및 AST (B) 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 마우스 모델에서 간 조직 무게 (A) 및 간 조직 내 중성지질 (B) 변화를 나타낸 도인다.
도 6은 마우스 모델의 간 조직에서 지질대사 관련 단백질 발현 변화 (A) 및 SREBP1 (B), ChREBP (C), FAS (D), ACC (E) 발현량 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 마우스 모델의 혈액 내 렙틴 (A), 공복혈당 (B), 인슐린 (C) 함량과 HOMA-IR (D) 수치를 나타낸 도이다.
도 8은 마우스 모델의 간 조직을 이용한 H&E 염색 및 지방증 분석 결과 (A), Oil red O 염색 및 지방량 정량 결과 (B), 부고환 백색지방의 H&E 염색 및 크기 분석 결과 (C)를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 비피도박테리움 애니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis sub sp. lactis) MG741 균주에 관한 것이다.

상기 균주는 유아의 분변으로부터 분리된 신규한 균주이며, 인체 유래 균주로 체내 섭취 시 안전한 균주임을 특징으로 하고, 특히 유아로부터 분리되었으므로, 성인 뿐만 아니라 유아가 안전하게 섭취할 수 있는 유산균임을 특징으로 한다.

본 발명의 비피도박테리움 애니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis sub sp. lactis) MG741 균주는 비만 또는 비알콜성 지방간을 예방, 치료 또는 개선할 수 있는 신규한 균주로서, 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 균주는 한국생명공학연구원에 2018년 1월 4일자로 기탁되였으며, 수탁번호 KCTC 13453BP를 부여받았다.

본 발명의 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주는 체중 및 체지방량을 감소시키고, 지질대사 관련 단백질 발현을 조절하는 효과가 우수하다.

이에 본 발명은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 비만 또는 비알콜성 지방간의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물, 건강기능식품 조성물, 사료 첨가용 조성물 등을 포함한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 비만 또는 비알콜성 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, "배양액"은 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하나, 균주 배양 후 균주를 제거한 상등액, 이들의 추출물 및 분획물을 모두 포함하는 개념이다. 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액" 또는 “무세포 상등액”이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 비만 또는 비알콜성 지방간의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하여 비만 관련 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어, "치료"란, 본 발명에 따른 조성물을 비만 또는 비알콜성 지방간의 발병 의심 개체에 투여하여 관련 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어, "개체"란, 비만 또는 비알콜성 지방간이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.

본 발명의 조성물은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주와 함께 비만 또는 비알콜성 지방간에 대한 항암 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란, 비만 또는 비알콜성 지방간의 예방, 개선 또는 치료 효과를 발휘하기에 충분한 양을 말한다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

또한 본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알 지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리 비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물 유 등이 있다. 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산 제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내 용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우 린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여 량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1~10,000㎎/㎏/day, 바람직하게는 1~200㎎/㎏/day의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 비만 또는 비알콜성 지방간의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품 조성물인 경우 상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다. 상기 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미이고, 상기 식품 조성물은 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.

본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임 식품(각 종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 용어, "건강기능식품"이란 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체 방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 질병의 예방 또는 건강의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있는 것을 말한다.

본 발명에 따른 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주를 건강기능식품으로 사용하는 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 이는 필요에 따라 선택하여 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주는 생체 안전성이 보장되며, 농도 비례하여 활성 증가 효과를 나타내므로, 특정범위로 제한하지 않고 적절한 양으로 사용할 수 있음은 자명하다.

또한, 본 발명에 따른 균주가 사용될 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 라면, 기타 면류, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료, 각종 스프, 육류, 소세지, 빵, 초코렛, 캔디류, 과자 류, 피자, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 또는 비타민 복합제 등이 있다.

또한, 본 발명은 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 상등액을 포함하는, 비만 또는 비알콜성 지방간의 예방 또는 개선용 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명 의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.

본 발명에서 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근 과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 유아 분변에서 균주 분리 동정

건강한 한국유아 (2~15 개월)의 분변을 채취하였다. 분변 1g에 0.85% 식염수(saline) 용액 9mL을 혼합하여 Stomacher(simple mixer, 3M)로 3분간 교반한 후, Whatman No.2 페이퍼를 통해 큰 입자나 잔류물을 제거하였다. 필터 후 1 mL을 취하여 0.85% 식염수 희석액으로 10⁸까지 십진희석한 후, Raffinose-bifidobacterium (RB) 아가에 부어 37℃에서 24시간동안 배양한 후 콜로니를 확인하였다. 형성된 콜로니를 BCP가 첨가된 MRS 배지에 접종하여 노란색 환을 형성하는지 확인한 후, 노란색 환을 형성한 콜로니는 그람염색(positive), 생화학 반응(catalase negative), 형태(rod)를 확인하였다. 이 후 API 50 CHL 키트를 통해 1차 균종을 확인하였다.

1차 분리된 균주 중 16S rRNA를 분석을 통해 신규한 Bifidobacterium animalis sub sp. lactis (이하, 비피도박테리움 애니말리스 락티스라고 함)로 동정하였으며, 이를 MG741로 명명하고 20% 글리세롤 스탁으로 제조하여 -80℃에서 보관하였다. 상기 MG741 균주의 16S rRNA 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다.

실시예 2. 균주 특성 평가

상기 실시예 1에서 분리 동정한 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주의 특성을 확인하기 위하여, API ZYM Kit (Biomeriux, Co. France)를 통해 효소 활성을 확인하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

Enzyme assayed for	Substrate	741
Control (Negative)		0
Alkaline phosphatase	2-naphthyl phosphate	1
Esterase (C4)	2-naphthyl butyrate	0
Esterase Lipase (C8)	2-naphthyl caprylate	0
Lipase (C14)	2-naphthyl myristate	0
Leucine arylamidase	L- leucyl-2-naphthylamide	4
Valine arylamidase	L-valyl-2-naphthylamide	0
Crystine arylamidase	L-cystyl-2-naphthylamide	1
Trypsin	N-benzoyl-DL-arginine-2-naphthylamide	0
α-chymotrypsin	N-glutaryl-phenylanine-2-naphthylamide	1
Acid phosphatase	2-naphtyl phosphate	0
Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase	Naphthol-AS-BI-phosphate	4
α-galactosidase	6-Br-2-naphthyl-α D-galactopyranoside	2
β-galactosidase	2-naphthyl-βD-galactopyranoside	3
β- glucuronidase	Naphthol-AS-BI- β	0
α-glucosidase	2-naphthyl- αD-glucopyranoside	2
β- glucosidase	6-Br-2-naphthyl- β	0
N -acetyl -βglucosaminidase	1-naphthyl-N-acetyl- β	0
α-mannosidase	6-Br-2-naphthyl- αD-mannopyranoside	0
α-fucosidase	2-naphthyl- αL-fucopyranoside	0

표 1에 나타낸 바와 같이, MG741 균주가 효소 활성 3 이상의 스코어를 나타낸 효소는 Leucine arylamidase, Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase 및 β-galactosidase임을 확인하였다.

다음으로, 탄수화물 발효 프로파일을 확인하기 위하여, API 50CHL 키트(Biomeriux, France)를 이용하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

Substrate	MG741	Substrate	MG741
Control (Negative)	-	Esculin	+
Glycerol	-	Salicin	+
Erythritol	-	D-cellobiose	-
D-arabinose	-	D-maltose	+
L-arabinose	+	D-lactose	+
D-ribose	+	D-melibiose	+
D-xylose	+	D-sucrose	+
L-xylose	-	D-trehalose	-
D-adonitol	-	Inulin	-
Methyl-β D-xylopyranoside	-	D-melezitose	-
D-galactose	+	D-raffinose	+
D-glucose	+	Starch	+
D-fructose	-	Glycogen	-
D-mannose	+	Xylitol	-
L-sorbose	+	Gentiobiose	+
L-rhamnose	-	D-turanose	-
Dulcitol	-	D-lyxose	+
Inositol	-	D-tagatose	-
D-mannitol	-	D-fucose	-
D-sorbitol	-	L-fucose	-
Methyl-α D-Mannoside	-	D-arabitol	-
Methyl-α D-glucoside	+	L-arabirol	-
N-acethyl-glucosamine	-	Gluconate	-
Amygdalin	+	2-keto-gluconate	-
Arbutin	+	5-keto-gluconate	-

표 2에 나타낸 바와 같이, MG741 균주는 L-아라비노스, D-리보스, D-자일로스, D-갈락토스, D-글루코스, D-만노스, D-소르보스, 메틸-알파-D-글루코사이드, 아미그달린, 아르부틴, 에스쿨린, 살리신, D-말토스, D-락토스, D-멜리비오스, D-수크로스, D-라피노스, 스타치, 겐티오비오스, D-릭소오스에 대해 발효 활성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 3. 비만 및 비알코올성 활성 평가 방법

3-1. 비만 및 비알코올성 지방간 모델 구축

6주령의 마우스 (C57BL/6J, 수컷) 45마리를 중앙실험동물에서 분양받아 1주일 동안 적응시켰다. 이후 마우스는 정상군(Normal diet group, ND), 실험대조군 (High fat diet group, HFD), 시료군(MG741, MD6)으로 나누어 12주간 각 물질을 경구투여 하였다. 시료군의 경우, 실시예 1에서 분리한 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주를 생리식염수에 녹여 10⁶CFU의 양으로 투여하였다. 정상군을 제외한 모든군은 고지방 식이를 제공하여 비만 및 비알코올성 지방간을 유도하였다. 실험 시작일부터 1주일 간격으로 체중 및 사료섭취량을 측정하였다.

3-2. 혈청학적 분석

상기 실시예 3-1에 따라 비만 및 비알코올성 지방간 유도 12주 후 실험동물을 18시간 절식시킨 후 마취하여 배대정맥에서 혈액을 채취하였으며 3,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 분석 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

혈청 내 아미노전이효소 (ALT), 아스파르트산 아미노전이효소 (AST) 함량은 Cell Biolabs, Inc. (Beverly, MA, USA) 로부터 kit를 구입하여 측정하였으며 총 콜레스테롤, High density lipoprotein (HDL) 콜레스테롤 및 간 내 중성지질 (Triglyceride) 함량은 Abcam (Cambridge, MA, USA)으로부터 kit를 구입하여 측정하였다. 내독소 (Enotoxin) 및 인슐린 (Insulin)의 함량은 Thermo fisher Waltham, MA, USA) 로부터 kit를 구입하여 측정하였다. HOMA-IR은 공복혈당 ×인슐린농도 ÷405로 계산하였다.

3-3. 웨스턴블랏을 통한 단백질 발현분석

비만 및 비알코올성 지방간 바이오마커의 분석을 위하여 마우스의 간 조직에 프로테아제 억제제가 포함된 용해 완충액(lysis buffer)을 첨가한 후, 균질화하여 10,000×g에서 5 분간 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 단백질을 정량한 후, 동량의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel (Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 전기영동 후, PVDF 멤브레인(Bio-Rad, CA, USA)에 트랜스퍼하였다. 5% skim milk(0.1% Tween 20 containing PBS, PBST) 용액에서 비 특이적 결합 위치를 블락킹한 후, 1차 항체(anti-β-actin, anti-SREBP1c, anti-ACC, anti-FAS, anti-ChREBP, Abcam)와 4℃에서 밤새 배양하고, 2차 항체(anti-rabbit IgG or anti-mouse IgG linked with horseradish peroxidase, Cell signaling Technology)와 상온에서 1시간동안 배양한 후, streptavidin-horseradish peroxidase와 ChemiDoc XRS device (Bio-Rad, USA)를 이용하여 검출하였다.

3-4 조직학적 분석

조직학적 분석을 위해 헤마톡 실린 및 에오신(H&E) 염색 및 오일 레드 O(ORO) 염색을 수행하였다. H&E 염색을 위해 간과 백색지방을 4 % 포름알데히드로 고정하고 파라핀화 하였다. 그 후 조직을 절단하고 H&E로 염색하였다. 또한, ORO 염색을 위해 간 조직을 OCT 용액으로 동결하고 절단하였다. 그 후 절편을 4 % 포름알데히드에 고정한 후 ORO로 염색하였다. 모든 슬라이드는 pannoramic 250 Flash III slide scanner (3DHistech, Ltd., Budapest, Hungary) 및 CaseViewer software (3DHistech, Ltd)를 사용하여 스캔 및 분석하였다.

3-5. 통계처리

실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며 실험군 간의 통계학적 분석은 SPSS Statistics 20 software (IBM Inc, Chicago, IL, USA)를 이용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) 분석을 실시하였으며, 유의차가 있은 항목에 대해서는 Tukey’multiple range test로 p<0.05의 수준에서 통계적 유의성을 검정하였다.

실시예 4. 비만 및 비알콜성 지방간에 대한 치료 효과 검증

4-1. 체중 및 체지방량에 미치는 영향

본 발명에 따른 MG741 균주가 체중 및 체지방량에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 체성분분석기를 이용하여 체지방량을 측정하였다. 또한 실험 기간 (8주) 동안 체중을 측정하고 실험 종료 후 실험동물의 백색 부고환 지방 조직을 적출하여 무게를 측정한 결과를 확인하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 체지방량 측정 결과 실험대조군은 정상군에 비해 111.2% 체지방량이 증가한데 반해, MG741 투여군(MD6)은 실험대조군에 비해 약 20.7% 감소된 체지방량을 나타냄을 확인하였다.

또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 실험 기간 동안 정상군의 체중은 6.6 g 증가한 반면 실험대조군은 24.2 g 증가하였고, MG741 투여군(MD6)은 실험대조군에 비해 약 22.4% 감소한 체중 증가량을 나타내었다. 또한, 실험동물에서 적출한 지방량은 정상군에 비해 실험대조군에서 무게가 증가한 반면 MD6 투여군은 실험대조군 대비 14.5% 감소하였다.

이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명의 MG741 균주는 체중 증가를 억제하고, 체지방량 및 지방 조직의 무게를 감소시키는 항비만 효과가 우수함을 확인하였다.

4-2. 혈청 엔도톡신 및 지질농도에 미치는 영향

혈청 내 엔도톡신 및 지질농도를 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3A에 나타낸 바와 같이, 정상군에 비해 실험대조군은 엔도톡신의 양이 164.0% 증가하였으나, MG741 투여군 (MD6)은 실험대조군에 비해 57.4% 감소됨을 확인하였다.

또한, 고지방 식이에 의해 큰 영향을 받는 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤의 농도를 측정한 결과, 도 3B 및 도 3C에 나타낸 바와 같이, 정상군에 비해 실험대조군은 총 콜레스테롤이 108.5% 증가하였으나, MG741 투여군 (MD6)은 실험대조군에 비해 15.9% 감소됨을 확인하였다. 또한, 정상군에 비해 실험대조군은 LDL 콜레스테롤이 198.2% 증가하였으나, MG741 투여군 (MD6)은 31.1% 감소하였다.

이를 통해, 본 발명에 따른 MG741 균주는 혈청 내 엔도톡신의 농도를 감소시켜 항비만 효과와 함께 염증을 감소시킬 수 있으며, 면역력을 강화하는데 도움을 줄수 있을 뿐만 아니라, 콜레스테롤 감소 효과가 우수함을 확인하였다.

4-3. 혈청 내 간기능 관련 효소 농도에 미치는 영향

혈중 간 기능 관련 효소의 변화를 관찰하기 위해 혈청의 ALT, AST 함량을 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 혈청의 ALT 수준은 정상군에 비해 실험대조군에서 554.3% 높았으며, MG741 투여군 (MD6)은 실험대조군에 비해 49.6% 감소하였다. 또한, 혈청의 AST 수준은 정상군에 비해 실험대조군에서 145.3% 높았으며, MG741 투여군 (MD6)은 실험대조군에 비해 36.0% 감소하였다.

이를 통해, 혈청 내 간기능 관련 효소의 농도가 MG741 투여군에서 감소하였으므로 비알코올성 지방간 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.

4-4. 간 조직에 미치는 영향

간 무게 및 중성지질(TG)을 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 간 조직의 무게는 정상군에 비해 실험대조군에서 145.9% 증가하였으며 MG741 투여군은 실험대조군 대비 21.7% 감소함을 확인하였다. 또한, 간 내 중성지질 농도는 정상군에 비해 실험 대조군에서 156.0% 증가하였으며, MG741 투여군은 실험대조군에 비해 35.0% 감소함을 확인하였다.

이를 통해,간 내 중성지질의 농도가 MG741 투여군에서 감소하였으므로 비알코올성 지방간 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.

4-5. 간 지질대사 관련 단백질 변화에 미치는 영향

웨스턴블랏을 통해 간 조직에서 지질대사 관련 단백질인 스테롤 조절요소 결합단백질 (sterol regulatory element binding protein-1, SREBP1), 탄수화물 반응요소 결합단백질 (carbohydrate response element binding protein, ChREBP), 아세틸조효소A 카르복실라아제(acetyl CoA carboxylase, ACC), 지방산합성효소(fatty acid synthase, FAS)의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 지방대사를 조절하는 전사인자인 스테롤 조절요소 결합단백질 (sterol regulatory element binding protein-1, SREBP1)과 지방합성을 촉진하는 단백질인 탄수화물 반응요소 결합단백질 (carbohydrate response element binding protein, ChREBP)은 실험대조군에 비해 MG741 CFU 투여군 (MD6)에서 각각 26.8%, 20.2% 감소하였다. 또한, 지방산 합성에 관여하는 효소인 ACC, FAS의 발현이 실험대조군에 비해 MG741 투여군에서 46.2%, 47.0%로 감소함을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 MG741 균주는 지질대사 관련 단백질의 발현 조절을 통해 비알코올성 지방간에 대한 개선 및 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.

4-6. 렙틴 및 인슐린 저항성에 미치는 영향

혈중 렙틴 함량, 공복혈당, 인슐린 및 HOMA-IR을 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 혈중 렙틴의 함량은 정상군에 비해 실험대조군에서 1927.0% 증가하였으며 MG741 투여군은 실험대조군 대비 37.3% 감소함을 확인하였다. 또한, 공복혈당은 정상군에 비해 실험대조군에서 185.5% 증가하였으며, MG741 투여군은 실험대조군 대비 18.9% 감소하였다. 또한, 혈중 인슐린 농도는 정상군에 비해 실험 대조군에서 775.4% 증가하였으며, MG741 투여군은 실험대조군 대비 61.2% 감소하였다. 마지막으로 인슐린 저항성은 정상군에 비해 실험대조군에서 1438.7% 증가하였으며, MG741 투여군은 실험대조군 대비 68.5% 감소하였다.

상기 결과를 토대로, 본 발명에 따른 MG741 균주는 혈중 렙틴의 농도를 감소시키고 공복 혈당 및 인슐린 농도를 감소시킴으로써 인슐린 저항성을 개선시켜 비알코올성 지방간의 치료에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.

4-7. 간 및 지방조직에 미치는 영향

장기간 고지방식이 섭취시 간조직 및 지방 조직에 미치는 영향을 확인하기 위하여 H&E 및 ORO 염색을 수행하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 간조직의 H&E 염색을 수행한 결과, 정상군 (score 0)에 비해 실험대조군에서 간 조직에 지방증이 심하게 유발된 것을 확인할 수 있었으며 (score 2.67), MG741 투여군은 실험대조군 대비 61.0% 감소된 상태를 나타냈다. 또한, 간조직의ORO 염색을 통해 지방구 염색정도를 확인한 결과, 정상군 대비 실험대조군에서 염색된 범위가 900.6% 증가한 것을 확인하였으며, MG741 투여군은 실험대조군 대비 70.3% 감소한 수치를 나타냈다.

다음으로, H&E 염색을 통한 지방조직의 팽창을 확인한 결과, 정상군 대비 실험대조군에서 367.0% 증가하였으며, MG741 투여군은 실험 대조군 대비 9.7% 감소한 크기를 나타내었다.

상기 실험을 통하여, 간 조직 내 지방축적 및 지방조직의 팽창이 본 발명에 따른 MG741 균주 투여를 통해 유의적으로 감소됨을 확인하였으며, 본 발명에 따른 MG741 균주가 비알코올성 지방간 및 비만 치료에 우수한 효과를 나타낼 것임을 확인하였다.

이상의 실험을 통해, 우수한 항비만 및 비알콜성 지방간 치료 효과를 나타낸 비피도박테리움 애니말리스 락티스 MG741 균주를 한국생명공학연구원에 2018년 1월 4일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KCTC 13453BP를 부여받았다.

한국생명공학연구원

KCTC13453BP

20180104

<110> MEDIOGEN Co.,Ltd. KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OBESITY OR NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER COMPRISING Bifidobacterium animalis lactis MG741 <130> 1-43 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1404 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bifidobacterium animalis lactis MG741 16S rRNA <400> 1 agtcgaacgg gatccctggc agcttgctgt cggggtgaga gtggcgaacg ggtgagtaat 60 gcgtgaccaa cctgccctgt gcaccggaat agctcctgga aacgggtggt aataccggat 120 gctccgctcc atcgcatggt ggggtgggaa atgcttttgc ggcatgggat ggggtcgcgt 180 cctatcagct tgttggcggg gtgatggccc accaaggcgt tgacgggtag ccggcctgag 240 agggtgaccg gccacattgg gactgagata cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg 300 gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcgacg ccgcgtgcgg gatggaggcc 360 ttcgggttgt aaaccgcttt tgttcaaggg caaggcacgg tttcggccgt gttgagtgga 420 ttgttcgaat aagcaccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggtgcga 480 gcgttatccg gatttattgg gcgtaaaggg ctcgtaggcg gttcgtcgcg tccggtgtga 540 aagtccatcg cctaacggtg gatctgcgcc gggtacgggc gggctggagt gcggtagggg 600 agactggaat tcccggtgta acggtggaat gtgtagatat cgggaagaac accaatggcg 660 aaggcaggtc tctgggccgt cactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga 720 ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac ggtggatgct ggatgtgggg ccctttccac 780 gggtcccgtg tcggagccaa cgcgttaagc atcccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct 840 aaaactcaaa gaaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgcgga ttaattcgat 900 gcaacgcgaa gaaccttacc tgggcttgac atgtgccgga tcgccgtgga gacacggttt 960 cccttcgggg ccggttcaca ggtggtgcat ggtcgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1020 gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc gccgcatgtt gccagcgggt gatgccggga 1080 actcatgtgg gaccgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggatgacgtc agatcatcat 1140 gccccttacg tccagggctt cacgcatgct acaatggccg gtacaacgcg gtgcgacacg 1200 gtgacgtggg gcggatcgct gaaaaccggt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac 1260 tgcgtgaagg cggagtcgct agtaatcgcg gatcagcaac gccgcggtga atgcgttccc 1320 gggccttgta cacaccgccc gtcaagtcat gaaagtgggt agcactccga agccggtggc 1380 ccgacccttg tggggggagc cgtc 1404

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