KR102297271B1

KR102297271B1 - 당뇨 및 고지혈증을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 락토바실러스 람노서스 nbm 17-4 균주

Info

Publication number: KR102297271B1
Application number: KR1020200165174A
Authority: KR
Inventors: 허철성; 류리; 박현준; 김원준; 최인석; 김병국; 정현채
Original assignee: 주식회사 종근당바이오; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2021-09-03

Abstract

본 발명은 수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주에 관한 것이다. 본 발명의 균주 및 이를 포함하는 조성물을 이용하는 경우, 고지혈증, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 고인슐린혈증 등을 포함하는 대사성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

당뇨 및 고지혈증을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 락토바실러스 람노서스 NBM 17-4 균주{Lactobacillus rhamnosus NBM 17-4 strain having preventive or therapeutic activity for metabolic disease including diabetes and hyperlipidemia}

본 발명은 수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주에 관한 것이다.

식습관 등 생활환경의 변화에 의해 내장지방형 비만이 증가하면서 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고인슐린혈증, 지방간, 지질대사이상, 당뇨병, 고혈압 등을 수반하는 대사성 질환의 발병이 점점 더 사회적인 문제로 되고 있다. 이들 질환은 상호간의 발생위험을 증가시키며, 노화, 스트레스 및 면역기능저하 등의 다원적인 생체대사 변화와 관련이 있는 공통 질환이다.

대사성 질환 중 하나인 당뇨병(diabetes)은 혈액 내에 존재하는 포도당이 소변을 통해 배출되는 질환으로, 인슐린의 분비결함 또는 인슐린 작용의 결함에 기인한 만성 고혈당증(hyperglycemia)의 특징을 나타내는 다중적 병인의 대사 장애를 말한다. 당뇨병은 크게 제 1 형 당뇨병(인슐린 의존형)과 제 2형 당뇨병(인슐린 비의존형)으로 구분할 수 있으며, 제 2 형 당뇨병의 병인은 두 가지 원인으로 인슐린 분비장애와 인슐린 저항성(insulin resistance)의 복합 장애로 알려져 있다.

현재 인슐린 비의존형 당뇨병의 치료법으로는, 식사요법, 운동요법, 약물요법 등이 있다. 약물요법에는 인슐린 분비기능을 증가시키는 설폰요소제(sulfonlurea)계통 약물, 인슐린 작용력을 향상시키는 PPAR-γ (peroxisome proliferator activated receptor gamma) 항진제 계통의 약물, 탄수화물의 소화흡수를 방해하여 식후 혈당의 상승을 방지하는 α-글루코시다아제 억제제 계통의 약물(예, acarbose), 세포에 포도당이 흡수되는 것을 촉진하는 비구아니드(biguanide)계통의 약물(예, metformin), 작용시간이 다양한 인슐린 등이 임상에 적용되고 있다.

그러나 이들 치료제들은 약효가 낮거나 간 기능 장애, 저혈당, 유산혈증 등과 같은 많은 부작용을 일으키는 문제점이 있다. 따라서 이와 같은 부작용을 줄이고 안전성이 우수한 당뇨병 치료제의 개발이 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-2166461호

본 발명자들은 부작용을 줄인 안전성이 우수한 새로운 당뇨병 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주가 당뇨병을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료에 효과적임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주를 제공한다.

삭제

본 발명의 락토바실러스 람노서스 NBM 17-4 균주는 신규한 균주로, 2020년 10월 6일자로 한국생명공학연구원생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 14324BP를 부여 받았다.

상기 락토바실러스 람노서스 NBM 17-4 균주는 건강한 성인의 분변으로부터 분리하여 동정하였으며, 상기 균주의 균체 성상은 다음과 같다:

그람 양성 막대모양 간균의 형태로, 유백색의 콜로니를 형성하며, 카탈레이즈 음성이다. 통성 헤테로발효 균종이며, 혐기 조건하에서 리보오스, D-갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, D-만노오스, 덜시톨, D-만니톨, D-소르비톨, 아미글란딘, 알부틴, 살리신, 에스큘린 페릭사이트레이트, D-말토오스, D-멜리바이오스, D-사카로할로오스, D-셀로비오스, D-트레할로오스, D-멜레지토오스, D-라피노오스, D-타우란노스, D-타가토오스, 및 L-푸코오스 등의 탄소원을 에너지원으로 사용한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 인슐린 저항성을 개선하는 활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 혈당을 감소하는 활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 혈중 콜레스테롤을 감소하는 활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 혈중 지질을 감소하는 활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 인슐린 신호전달 관련 유전자의 발현을 조절하는 활성을 갖고, 상기 인슐린 신호전달 관련 유전자는 IRS (Insulin receptor substrate), AMPK (AMP-activated protein kinase) 및 Akt2 (RAC-beta serine/threonine-protein kinase 2)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 균주는 IRS, AMPK 및 Akt2으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인슐린 신호전달 관련 유전자를 발현을 증가시키는 활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 글루코스 신생 관련 유전자의 발현을 조절하는 활성을 갖고, 상기 글루코스 신생 관련 유전자는 FOX01 (Forkhead box protein O1) 또는 G6P (Glucose 6-phosphatase)이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 균주는 FOX01 또는 G6P인 글루코스 신생관련 유전자의 발현량을 감소시키는 활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 염증 사이토카인 관련 유전자의 발현을 조절하는 활성을 갖고, 상기 염증 사이토카인 관련 유전자는 IL-6 (Interleukin-6), TNF-α (Tumor necrosis factor-alpha) 및 MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 균주는 IL-6, TNF-α 및 MCP-1으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염증 사이토카인 관련 유전자의 발현량을 감소시키는 활성을 갖는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 대사성 질환은 고지혈증, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 고인슐린혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 대사성 질환은 당뇨병이다.

당뇨병(diabetes)은 혈액 내에 존재하는 포도당이 소변을 통해 배출되는 질환으로, 인슐린의 분비결함 또는 인슐린 작용의 결함에 기인한 만성 고혈당증(hyperglycemia)의 특징을 나타내는 다중적 병인의 대사 장애를 말한다. 당뇨병은 크게 제 1 형 당뇨병(인슐린 의존형)과 제 2형 당뇨병(인슐린 비의존형)으로 구분할 수 있으며, 제 2 형 당뇨병의 병인은 두 가지 원인으로 인슐린 분비장애와 인슐린 저항성(insulin resistance)의 복합 장애로 알려져 있다.

인슐린 저항성이란, 분비된 인슐린이 혈류를 타고 표적장기에 도달했으나 그 표적세포에서 인슐린 작용 및 민감성이 저하된 상황을 말한다. 일반적으로 인슐린이 세포막 인슐린 수용체에 결합한 후에 발생되는 세포 내 신호가 어떤 원인에 의해서 그 세기가 감소되는 신호전달 장애로 생각된다. 인슐린 분비장애와 인슐린 저항성은 복합적으로 작용하여 당뇨병을 더 악화시킬 수 있다. 즉, 인슐린 저항성이 있으면 저항성을 극복하기 위해 더 많은 양의 인슐린이 분비되어야 하고, 반대로 인슐린 분비가 충분하지 않아 생긴 고혈당 자체가 다시 인슐린 저항성을 악화시킬 수 있다.

고지혈증은 콜레스테롤(cholesterol), 중성지방(triglyceride), 인지질, 유리지방산 등의 혈청 지질 가운데 하나 이상의 혈청 내 농도가 공복 시 혈청 지질의 정상범위는 중성지방 50-150 mg/dl, 인지질 150-250 mg/dl, 콜레스테롤 130-230 mg/dl, 유리지방산 5-10 mg/dl보다 높은 상태이다. 고지혈증을 방치할 경우 고혈압, 관상동맥 경화증(협심증, 심근경색), 뇌동맥 경화증(뇌경색) 등의 위독한 합병증을 초래할 가능성이 높아진다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물들의 유효성분인 상기 균주는 상기 균주를 분리 및/또는 정제한 균체 외에 균체를 포함하는 배양물, 균체의 추출물, 생균체 또는 사균체, 배양물 상층액, 이들의 농축액, 농축물, 건조물, 또한 필요에 따라서 희석액, 희석물 등이며, 배양액, 배양물을 처리하여 얻어지는 모든 상태의 것을 포함한다.

상기 균체의 배양법, 추출법, 분리법, 농축법, 건조법, 희석법 등은 특별히 한정되지 않는다.

균체를 배양하기 위한 배지로는 통상적으로 탈지유, 훼이, 카제인 등의 우유 단백질, 당류, 효모 엑기스 등을 포함하고 있으며, 배양 방법으로는 일반적인 각종 호기적 또는 혐기적인 방법을 적당히 사용할 수 있다.

배양 온도로는 예를 들어 30~40℃를 설정하고, 배양 중에는 수산화나트륨 등의 알칼리를 사용하여 배지의 pH를 중성으로부터 산성, 예를 들어 pH가 5~6정도가 되도록 유지하는 중화배양법을 사용할 수도 있다. 이와 같은 중화배양법 외에 회분배양법 등의 임의의 배양 방법을 사용할 수 있으며, 배양한 후에는 필요에 따라서 배양물이나 그 상층액을 농축, 건조, 희석 등을 할 수도 있다.

또한 원심분리법이나 막분리법을 사용하여 배양물의 상층액과 균체를 분리하여 균체를 농축한 상태로 회수할 수도 있다. 그리고 균체에 초음파 처리나 효소 처리 등을 행하여 균체 내의 성분을 추출하거나, 배양물이나 그 상층액, 균체나 그 추출물 등을 건조할 수도 있다. 이들은 본 발명의 상기 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 유산균뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 첨가성분은 예컨대 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물로는 모노사카라이드(예를 들어, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예를 들어 말토스, 수크로스, 올리고당 등) 및 폴리사카라이드(예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 상기 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액 또는 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 식품조성물은 식품, 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 상기 유산균 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 요거트, 발효유, 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제. 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있다. 이외에도 락토즈, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스. 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.

상기 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 락토바실러스 람노서스 NBM 17-4 균주는 i) 인슐린 저항성을 개선하는 효과, ii) 혈당을 감소하는 효과, iii) 혈중 콜레스테롤 및 지질을 감소하는 효과, 및 iv) 인슐린 신호전달 관련 유전자(IRS, AMPK, Akt2), 글루코스 신생 관련 유전자(FOX01, G6P), 염증 사이토카인 관련 유전자(IL-6, TNF-α, MCP-1)의 발현을 조절하는 효과를 통해 당뇨병을 포함하는 다양한 대사 질환에 대한 치료효과를 나타낸다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주를 제공한다.

(b) 본 발명은 수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(c) 본 발명은 수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

(d) 본 발명의 균주 및 이를 포함하는 조성물을 이용하는 경우, 고지혈증, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 고인슐린혈증 등을 포함하는 대사성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

도 1은 모든 선발 균주에 대해 측정한 TEER 결과를 나타낸다.
도 2는 저 글루코스 DMEM으로 배양한 세포 및 고 글루코스 DMEM으로 배양한 세포에 대해 측정한 TEER를 비교한 결과를 나타낸다.
도 3a는 라이브 셀(프로바이오틱스)을 처리한 세포에서의 TEER 변화값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3b는 CFS (cell free supernatant)를 처리한 세포에서의 TEER 변화값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3c는 CFE (cell free extract)를 처리한 세포에서의 TEER 변화값을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4a는 열에 의해 치사된 셀(프로바이오틱스)의 세포(Caco-2) 독성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4b는 CFS의 세포(Caco-2) 독성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4c는 CFE의 세포(Caco-2) 독성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 라이브 셀(프로바이오틱스)을 처리한 세포에서의 글루코스 흡수 능력을 평가한 결과를 나타낸다.
도 6a는 라이브 셀(프로바이오틱스)을 처리한 세포에서의 GLUT2 유전자 발현을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6b는 라이브 셀(프로바이오틱스)을 처리한 세포에서의 SGLT1 유전자 발현을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 CFS 또는 CFE의 세포(C2C12) 독성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 C2C12 세포에서 인슐린 저항성 세포 모델의 구축하기 위해, 팔미테이트 처리에 따른 phospho-AKT 발현량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9a는 C2C12 세포 인슐린저항성 모델을 사용하여 측정한 프로바이오틱스의 항 당뇨 및 인슐린 저항성 개선능을 웨스턴 블롯으로 평가한 결과를 나타낸다.
도 9b는 도 9a의 웨스턴 블롯 결과에서 pAKT/AKT 비율을 정량화한 결과를 나타낸다.
도 10은 프로바이오틱스의 당뇨병에 대한 효능 평가를 위한 동물 실험의 수행 방법에 대해 나타낸다.
도 11a는 NBM 17-4(프로바이오틱스 균주)의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 마우스의 체중을 측정한 결과를 나타낸다.
도 11b는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 마우스의 식이섭취량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 11c는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 마우스의 공복혈당을 측정한 결과를 나타낸다.
도 12는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 마우스를 12시간 공복시킨 후 글루코스로 자극한 뒤의 혈당을 측정한 결과를 나타낸다.
도 13a는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 마우스의 혈장 글루코스를 측정한 결과를 나타낸다.
도 13b는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 마우스의 혈장 인슐린을 측정한 결과를 나타낸다.
도 13c는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 마우스의 HOMA-IR (Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 13d는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 마우스의 혈장 C-펩타이드를 측정한 결과를 나타낸다.
도 13e는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 마우스의 혈장 GLP-1 (glucagon-like peptide-1)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 14a는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 마우스의 총 트리글리세라이드를 측정한 결과를 나타낸다.
도 14b는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 실험 동물의 총 콜레스테롤을 측정한 결과를 나타낸다.
도 14c는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 마우스의 GOT (Glutamic oxaloacetic transminase)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 15a는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 간에서의 IRS2(인슐린 신호전달 관련 유전자)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 15b는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 간에서의 AMPK(인슐린 신호전달 관련 유전자)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 16a는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 IRS2를 측정한 결과를 나타낸다.
도 16b는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 AMPK를 측정한 결과를 나타낸다.
도 16c는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 Akt2(인슐린 신호전달 관련 유전자)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 17a는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 간에서 FOXO1(글루코스 신생 관련 유전자)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 17b는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 간에서 G6P(글루코스 신생 관련 유전자)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 18은 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 간에서 IL-6(염증 사이토카인 관련 유전자)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 19a는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 IL-6를 측정한 결과를 나타낸다.
도 19b는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 TNF-α(염증 사이토카인 관련 유전자)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 19c는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 MCP-1(염증 사이토카인 관련 유전자)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 20a는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 렙틴(식욕 조절 호르몬 관련 유전자)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 20b는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 아디포넥틴(식욕 조절 호르몬 관련 유전자)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 21a는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 PPARγ(지방 대사 관련 유전자)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 21b는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 CD36(지방 대사 관련 유전자)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 21c는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 FABP4(지방 대사 관련 유전자)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 22a는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 PGC1α(미토콘드리아 신생 관련 유전자)을 측정한 결과를 나타낸다.
도 22b는 NBM 17-4의 당뇨병에 대한 효과를 평가하기 위해 부고환 지방에서 UCP1(미토콘드리아 신생 관련 유전자)을 측정한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

사용 균주

본 실험에 사용된 균주 목록은 다음과 같다 (표 1).

연번	균주	종
1	NBM 7-1	Bifidobacterium longum
2	NMC 5-3	Bifidobacterium pseudocatenulatum
3	NMC 3-4	Lactobacillus acidophilus
4	NM 5-3	Lactobacillus fermentum
5	NMC 15-1	Lactobacillus plantarum
6	NBM 17-4	Lactobacillus rhamnosus
7	NM 20-2	Lactobacillus sakei
8	NBM 5-5	Lactobacillus salivarius
9	NM 11-5	Lactococcus lactis
10	NT 13-2	Lactococcus lactis subsp. lactis
11	NM 11-3	Pediococcus pentosaceus

상기 균주 중 락토바실러스 람노서스 NBM 17-4는 건강한 성인(No. 17 정상인, 서울대병원, Female)의 분변으로부터 선택배지를 활용하여 균주를 분리하였다. 수집한 분변 시료를 0.85% NaCl에 10배 단계희석하여 Bifidobacterium selective medium (BSM) agar 배지에 도말하고, 37 ℃의 온도에서 24~48 시간 동안 혐기배양한 후 콜로니(colony)의 형태가 서로 다른 균주를 선발하였다.

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실시예 1: Caco-2 세포를 이용한 프로바이오틱스의 장벽 강화능 평가

프로바이오틱스의 장벽 강화능을 평가하고자 TEER (Transepithelial electric resistance) 분석을 수행하였다.

1-1. 세포의 배양방법

세포주는 인간 대장암세포(human epithelial colorectal adenocarcinoma cells) Caco-2를 이용하였다.

세포를 트랜스 12 웰 플레이트에 1 x 10⁵ cells/well로 분주하였으며 배지는 정단부(apical side)에 0.5 mL, 기저측부(basolateral side)에 1.5 mL을 넣어주었다.

배지는 DMEM (high glucose Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, Carlsbad, CA, USA) 배지[10% FBS (fetal bovine serum, Thermo Scientific, USA), 1% 페니실린 (100 U/mL)-스트렙토마이신 (100 μg/mL) (Gibco) 포함]를 사용하였으며 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하고, 배지는 매 48시간 마다 교체하였다.

또한, 각 배지에 고 글루코스 (25mM)가 아닌 저 글루코스 (5.5mM)를 포함하는 DMEM 배지를 처리하여 추가적인 실험군으로 사용하였다.

1-2. TEER 측정 방법

Caco-2 세포에 라이브 셀(Live cell, 프로바이오틱스), CFS (cell free supernatant), CFE (cell free extract)를 처리한 후 EVOM2 electrode (World Precision Instrumets, MA, USA)를 이용하여 TEER를 측정하였다. 음성대조군으로는 배지만 넣은 군을 사용하였으며, LGG (Lactobacillus rhamnosus GG)를 처리한 군은 양성대조군으로 사용하였다.

CFS (cell free supernatant)를 준비하기 위해, 배양된 프로바이오틱스를 원심분리(12,000rpm, 10 min, 4 ℃)하여 균체를 회수하고 1xPBS로 2회 세척하였다. 이를 DMEM 배지에 희석하여 흡광도(600nm)가 1.0이 되도록 하여 CFS로 사용하였다.

CFE (cell free extract)를 준비하기 위해, 프로바이오틱스를 흡광도 (600nm)가 1.0이 되도록 PBS에 희석한 후, 지름 0.1mm인 지르코니아 실리카 비드(zirconia siica bead)가 담겨있는 e-튜브에 세포를 담아 비트비터(MiniBeadBeater-16, BioSpec Products)로 5분간 세포를 파쇄하였다. 파쇄물은 4 ℃, 8,000 x g, 15분간 원심분리하여 세포 데브리스를 제거하였고, 유효 성분이 함유된 상층액을 0.2 μm 필터에 여과하여 CFE로 사용하였다.

Caco-2 세포는 DMEM으로 2회 세척하고, 라이브 셀 시료는 500 μl (1Х10⁸ CFU/ml)를 웰에 접종하였고, CFS와 CFE 시료는 배지에 5% (v/v)로 포함하도록 각 웰에 접종하였다. 실험 6시간 동안 2시간 간격으로 EVOM2 meter을 이용하여 세포의 저항값을 측정하였다. TEER은 다음 식 1을 이용하여 계산하였으며, TEER의 변화값은 다음 식 2를 이용하여 계산하였다.

식 1

TEER (Ω Х cm²) = (R_sample - R_blank) Х 1.12

식 2

TEER 변화값(%) = Test TEER(Ω·cm²) value/ Control TEER value (Ω·cm²) * 100(%)

예비 실험을 통해 모든 선발 균주가 TEER를 증가시키는 것을 확인하였고 본 실험을 진행하였다 (도 1).

본 실험 결과, 저 글루코스 DMEM으로 배양한 세포의 TEER 값이 고 글루코스 DMEM으로 배양한 세포보다 높게 나타났다 (도 2).

TEER 변화값을 분석한 결과, 라이브 셀 처리 시 NMC 5-3, NM 5-3, NBM 17-4, NM 20-2, NM11-5가 대조군 대비 TEER 변화값이 유의적으로 증가하였다 (도 3a).

CFS 처리 시 NMC 3-4, NM 11-3가 TEER 변화값이 대조군 대비 유의적으로 증가하였으며, 라이브 셀에서 변화값이 증가했던 NMC 5-3와 NM 5-3도 TEER 변화값이 증가하였다 (도 3b).

CFE 처리 시, NBM 7-1, NMC 5-3, NMC 3-4, NM 5-3. NM 20-2, NBM 5-5, NM 11-5, NT 13-2, NM 11-3에서 TEER 변화값은 유의적으로 증가하였다 (도 3c).

실시예 2: Caco-2 세포에 대한 프로바이오틱스의 세포 독성 평가

프로바이오틱스의 세포 독성을 평가 하기 위해, 세포 독성을 WST-8 cell viability assay kit (Quanti-Max, BIOMAX, Korea)분석법을 이용하여 측정하였다.

1Х10⁴ cells/well의 Caco-2 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 24시간 배양한 후 열에 의해 치사된 세포(프로바이오틱스), CFE, CFS를 각각 처리하였다. TEER 실험과 달리, 열에 의해 치사된 세포를 처리한 것은 장시간 라이브 세포를 처리하면 pH에 영향을 미치기 때문이다.

시료를 처리한 세포를 48시간 배양한 후 WST-8용액 10 μL를 첨가하여 2 시간 동안 37℃, 5 % CO₂ 배양 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

배지만 넣은 대조군의 흡광도를 기준으로 세포 생존율을 산출하였다 (식 3). 그 결과, 프로바이오틱스에서는 세포 독성을 나타내지 않았다 (도 4a 내지 도 4c).

식 3

세포 생존율(%)=(OD₅₇₀sample)/(OD₅₇₀control) x 100

실시예 3: 프로바이오틱스를 처리한 Caco-2 세포의 글루코스 흡수 확인

프로바이오틱스를 처리한 Caco-2 세포의 글루코스 흡수를 평가하기 위해, 글루코스 수송체를 통한 세포 내로 유입되는 글루코스를 측정하였다.

1Х10⁵ cells/well의 Caco-2 세포를 12 트랜스 웰 플레이트에 분주하고 20일간 배양하였다. 24시간 동안 글루코스 & 혈청 비포함 배지로 교체하여 starvation 시켰다. 이 후, 트랜스퍼 버퍼인 HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)로 2회 세척하였다. 각 웰에 라이브 세포를 약 1Х10⁶ cells이 되도록 접종하고, 2-NBDG (2-deoxy-2-[7-nitro2,1,3-benzoxadiazol-4-y] amino-D-glucose, 글루코스 민감 형광 트레이서)가 최종 100 μM이 되도록 추가한 후, 37 ℃에서 60분간 배양하였다. 반응을 종결시키기 위하여 ice-cold PBS로 2회 세척한 후, 96 웰 플레이트로 옮기기 위하여 트립신으로 처리하였다. 이 후, 세포를 원심분리하여 PBS에 현탁한 뒤 96 블랙 웰 플레이트에 옮겨 485nm-535nm에서 형광발광도를 측정하여 균주 미처리 세포 대비 값을 산출하였다.

그 결과, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4, 락토바실러스 사케이(L. sakei) NM20-2, 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius) NBM5-5, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) NT13-2, 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) NM11-3 처리 시, Caco-2세포의 글루코스 흡수가 유의적으로 감소함을 확인하였다 (도 5).

실시예 4: 프로바이오틱스를 처리한 Caco-2 세포의 글루코스 흡수 연관 유전자의 발현 확인

1Х10⁵ cells/well의 Caco-2 세포를 12 트랜스 웰 플레이트에 분주하고 20일간 배양하였다. 2시간 동안 글루코스 & 혈청 비포함 배지로 교체하여 starvation 시켰다. 각 웰에 균주 라이브 셀이 약 1Х10⁶ cells이 되도록 정단부(apical side)에 접종한 후, 6시간 동안 배양하였다. 다시 고 글루코스 DMEM을 넣고 20분 동안 글루코스로 자극하였다. 반응을 종결시키기 위하여 ice-cold PBS로 2회 세척한 후, 트리졸을 처리하고 RNA를 추출하였다. 유전자 발현은 real-time PCR을 이용하여 GLUT2와 SGLT1의 유전자 발현을 분석하였다.

GLUT2는 모든 균주에 의해 감소하지 않았으며 NBM7-1, NMC5-3, NM 5-3, NMC15-1, NM20-2, NT13-2에 의해 유의적으로 증가하였다 (도 6a).

또한, NM5-3에 의해 SGLT1 유전자발현은 증가하였고, NMC5-3, NM11-3에 의해 감소하였다 (도 6b).

글루코스 자극은 GLUT2 및 SGLT1 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 즉 상기 실험 조건으로 인해 GLTU2 및 SGLT1의 유전자는 발현이 증가하는 것이고, 균주의 처리를 통해 GLTU2 및 SGLT1의 유전자 발현이 유지 또는 감소된다면 그러한 균주는 당뇨병 치료를 위한 후보 균주로 선발될 수 있을 것으로 사료된다.

실시예 5: C2C12 세포에 대한 프로바이오틱스의 세포 독성 평가

세포 독성은 WST-8 cell viability assay kit (Quanti-Max, BIOMAX, Korea)분석법을 이용하여 평가하였다.

1Х10⁴ cells/well의 C2C12 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 24시간 배양한 후 CFE, CFS를 각각 처리하였다. Caco-2와 달리, 장내 대사된 후 CFE, CFS의 활성성분이 적용할 것으로 판단하여 CFE, CFS만 세포 독성 평가에 적용하였다. 샘플이 처리된 세포를 48시간 배양한 후 WST-8용액 10 μL를 첨가하여 2시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, 배지만 넣은 대조군의 흡광도를 기준으로 세포 생존율을 산출하였다 (식 3).

그 결과, 균주의 CFE, CFS 모두 C2C12 세포에 독성이 없는 것을 확인하였다 (도 7).

실시예 6: C2C12 세포에서 프로바이오틱스의 항 당뇨, 인슐린 저항 개선 효능 평가

6-1. C2C12 세포에서 당뇨, 인슐린 저항성 세포 모델의 구축

근육관련 세포주(C2C12)에서 인슐린 저항성 모델을 구축하기 위해서, 근육조직에서 인슐린 저항성을 유발하는 용인으로 잘 알려져 있는 팔미테이트(palmitate)를 사용하였다.

C2C12 세포를 6 웰 플레이트에 1 Х 10⁶ cells/ml로 접종한 후, 10% 열 불활성화 FBS와 (+) 110mg/L 피부르산 나트륨(sodium pyruvate), 페니실린 100 units/ml, 스트렙토마이신 100 μg/ml, Fungizone® (암포테리신 B) 0.25 μg/ml (Gibco, USA)이 첨가된 저 글루코스(5.5mM 글루코스) DMEM 배지로 1~2일간 37 ℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 80-90% 컨플루언스(confluence)될 때 분화 유도를 시작하였으며, 분화를 위해서 FBS에서 말 혈청 (2%), (-) 110 mg/L 피부르산 나트륨으로 교체하여 분화를 유도하였다.

분화 유도 6일째에 인슐린 저항성을 유도하기 위하여 성장 배지에 0.2mM 팔미테이트/BSA(bovine serum albumin) 접합체 또는 0.5mM 팔미테이트/BSA 접합체를 8시간 또는 12시간 반응시키고 세척 후 100nM의 인슐린을 30분간 배양기에서 반응시켰다. 반응을 종결시키기 위하여 ice-cold PBS로 2번 세척한 후 ice-cold RIPA 세포 용해 버퍼를 150 μL 첨가하여 냉장에서 20분간 방치한 후 세포들을 스크레이퍼로 모아 투명한 1.5 mL e-튜브에 담았다. 12,000 g로 4 ℃에서 20분간 원심 분리한 후 상층액만 분리하여 -80 ℃에 보관하였다.

단백질 양은 BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, IL, USA)를 사용하여 측정하였다. 각 시료는 25 μg이 되도록 2 Х 샘플 버퍼와 섞은 후 100 ℃에서 5분간 변성시킨 뒤 준비된 10% 겔에 로딩하여 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용하여 분리하였다.

전기영동을 통해 분리된 겔 단백질을 PVDF 막으로 100 V로 90분 동안 블롯팅하였다(전기흡착). 막에 제대로 단백질이 흡착되었는지 확인하기 위해 Ponceau S로 염색하여 단백질의 밴드가 막에 있는 것을 확인한 후 항체 반응을 시작하였다.

막의 비결합 부위를 블락시키기 위하여 블락 용액 (5% bovine serum albumin, BSA in PBST)에 1시간 동안 상온에서 rocking 시켜주었다. PBST로 5분씩 3번 세척한 후, TBST에 희석한 타겟 단백질의 일차 항체 [mouse anti-β actin, mouse anti-AKT, rabbit anti-pAKT (ser473)]와 4 ℃에서 16-72시간 동안 반응시켰다. 다시 PBST로 10분씩 3번 세척한 후, Horse radish peroxidase가 부착된 anti-rabbit, anti-mouse (Invitrogen, IL, USA)등의 이차 항체와 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 막을 ECL (Bio-rad, CA, USA) 용액으로 5분 동안 반응 후, Chemi-doc을 이용하여 각 단백질의 발현을 분석하였으며 결과는 다음과 같다.

Lane 2와 4, 6과 8을 비교 시, phospho-AKT 발현량이 팔미테이트 처리 여부에 따라 다른 것을 확인할 수 있으며, 0.2mM 팔미테이트에 의해 pAKT 발현이 감소하였다 (0.5mM 팔미테이트 처리는 독성을 보여 실험에서 제외하였다). 동일한 농도의 0.2mM 팔미테이트를 8시간과 12시간으로 각각 나눠 처리하여 단백질 발현을 비교하였으나 큰 차이를 보이지 않았다 (도 8).

상기 결과를 토대로, C2C12세포에서 인슐린저항성 모델을 구축하였으며 조건은 C2C12세포에 0.2mM 팔미테이트/BSA 접합체 8시간 처리 후 100nM 인슐린을 30분간 처리하는 것으로 통일하였다.

6-2. C2C12 세포에서 프로바이오틱스의 항당뇨, 인슐린 저항성 개선 효능 평가

실시예 6-1에서 구축한 C2C12 세포 인슐린저항성 모델을 사용하여, 선발 균주의 CFE와 CFS의 항 당뇨 및 인슐린 저항성 개선능을 평가하였다

실험 결과, 팔미테이트 처리에 의해 pAKT발현이 감소한 것을 다시 확인할 수 있었으며, CFS 처리 시 pAKT 발현이 증가하는 경향을 확인하였다 (도 9a). CFE 중에 NM 20-2, NBM 5-5, NM 11-5 처리 군에서 pAKT 발현이 급격히 감소하였다.

또한, 상기 결과를 수치로 정량화하였으며, 팔미테이트와 인슐린만을 처리한 대조군과 실험군의 AKT 및 pAKT의 단백질 발현을 정량화하였다. 이를 바탕으로 pAKT/AKT ratio를 산출함으로서 실험군 처리에 의한 AKT 인산화에 미치는 영향에 대하여 평가를 하기 위해 대조군과 실험군간 비교 분석 하였다.

CFE를 처리하는 경우, NBM7-1, NMC5-3, NMC15-1, NBM 17-4, NM11-3이 pAKT 발현이 증가하였다. CFS를 처리하는 경우, NMC5-3, NMC 15-1, NBM 17-4, NM20-2, NBM5-5, NM 11-5, NT13-2, NM 11-3이 pAKT 발현이 증가하였다 (도 9b).

CFS를 처리하는 경우와 CFE를 처리하는 경우 모두에서 pAKT 발현이 증가한 균주는 NMC5-3, NMC15-1, NBM 17-4, NM11-3이였다. 또한, pAKT 발현을 변화시키면서 TEER를 증가시킨 균주는 NBM 7-1, NMC 5-3, NBM 5-5이였다.

실시예 7: 동물 실험을 통한 프로바이오틱스의 당뇨병에 대한 효능 평가

7-1. 동물 모델 및 실험 설계

선발된 3개의 프로바이오틱스 균주(NBM7-1, NBM 17-4, NMC 15-1)의 항당뇨 효과를 당뇨 모델 동물을 이용하여 입증하고자 하였다. 실험은 도 10과 같이 진행하였다. 실험 동물은 당뇨병 동물 모델로 사용 가능한 db/db(+/+) 마우스(렙틴 수용체 돌연변이 마우스, 난징대학교 바이오 메디컬 연구소)를 사용하였다.

대조군으로는 이형접합자인 db/db(+/-) 마우스를 사용하였다.

양성대조군으로는 당뇨치료제인 로베글리타존(Lobeglitazone), 시타글립틴(Sitagliptin, DPP4-Inhibitor)을 사용하였다.

실험군으로 NBM 17-4 투여군(CKD-2)을 사용하였으며, NBM 17-4를 1.0Х10⁹ CFU/ml으로 8주간 경구 투여하였다.

7-2. 체중, 식이섭취량, 공복혈당 측정

체중은 매주 금요일에 측정하였다.

체중은 db/db(+/-) 그룹에 비하여 db/db(+/+) 그룹에서 유의적으로 증가하였고, db/db(+/+) 그룹과 비교하여, 양성대조군과 NBM 17-4 투여군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다 (도 11a).

식이섭취량은 매주 금요일, 토요일에 측정하였다. 식이섭취량은 0시간 대비 24시간에 먹이를 얼마나 섭취하였는지로 확인하였다.

db/db(+/-) 그룹은 3g ± 0.5g을 섭취하였고, db/db(+/+) 그룹은 6g ± 0.5g을 섭취하였다. 또한, 식이섭취량은 db/db(+/+) 그룹과 비교하여, 양성대조군과 NBM 17-4 투여군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다 (도 11b).

공복혈당은 2주 단위로 매주 월요일에 측정하였고, 12시간 공복시킨 후 마우스이 혈당을 측정하였다.

4주차 때부터 db/db(+/+) 그룹과 비교하여, 양성대조군 및 NBM 17-4 투여군에서 유의적으로 공복혈당이 감소하는 것으로 나타내었다 (도 11c).

상기 실험은 프로바이오틱스 균주(NBM 17-4)의 공복혈당을 감소시키는 효과를 나타낸다.

7-3. 경구 글루코스 내성 검사(Oral glucose tolerance test)

마우스를 12시간 공복을 시킨 후, 글루코스를 1 g/kg의 농도로 경구 투여 하고, 0, 30, 60, 90, 120분에 간 혈당측정기를 이용하여 혈당을 측정하였다.

그 결과, 60분에서는 db/db(+/+) 군에 비하여 양성대조군(로베글리타존)에서 글루코스 수준이 유의적으로 낮아짐을 확인하였다. 120분에서는 양성대조군 뿐만 아니라, NBM 17-4 처리군에서 유의적으로 공복혈당이 감소함을 확인하였다 (도 12).

상기 결과는 NBM 17-4의 글루코스 내성 완화 효과를 나타내며, 이러한 결과는 실시예 7-2의 공복 혈당에 관한 결과와 일치하는 것으로 보인다 (도 11c).

7-4. 인슐린 저항성의 측정

마우스를 18시간 공복을 시킨 다음, 해부하여 얻은 혈액을 헤파린 코팅 튜브(BD, USA)를 사용하여 원심분리(10,000xg, 15 min, LABOGENE, USA)하여 혈장을 얻고 사용하기 전까지 -80 ℃에 보관하였다.

혈장 글루코스는 γ-glucose assay kit (010201, Asanpharm, Korea)로 측정을 하였고, 인슐린, GLP-1, C-펩타이드는 (90080, 90050, 81508, Crystalchem, USA)를 이용하여 측정하였다.

혈장 글루코스는 db/db(+/+) 군과 비교하여 양성대조군(로베글리타존) 및 NBM 17-4 처리군에서 유의적으로 낮아짐을 확인하였다 (도 13a).

혈장 인슐린은 db/db(+/+) 군과 비교하여 양성대조군(로베글리타존) 및 NBM 17-4 처리군에서 유의적으로 낮아짐을 확인하였다 (도 13b).

인슐린 저항성을 나타내는 HOMA-IR (Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance)은 db/db(+/+) 군과 비교하여 양성대조군 및 프로바이오틱스 처리군에서 유의적으로 낮아짐을 확인하였다. NBM 17-4처리군은 양성대조군(로베글리타존)의 결과와 가장 유사한 결과를 나타내었다 (도 13c).

상기 결과는 NBM 17-4가 인슐린 민감도를 향상시켜, 글루코스 흡수를 증가시키는 효과가 있음을 나타낸다.

C-펩타이드는 인슐린의 생산을 나타내는 지표로 사용되며, 과량 분비 시 고인슐린혈증을 의심하는 지표로 사용하였다. C-펩타이드는 db/db(+/+) 군과 비교하여 양성대조군에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 또한, C-펩타이드는 NBM 17-4 처리군에서 유의적으로 낮아짐을 확인하였다. 이는 NBM 17-4이 인슐린 저항성을 낮춰줄 뿐만 아니라, 고인슐린혈증을 감소하는 효과가 있는 것으로 유추된다 (도 13d).

GLP-1 (glucagon-like peptide-1)은 인슐린의 생산을 감시하는 지표로 사용되며, 과량 분비 시, 고인슐린혈증를 의심하는 지표로도 사용되었다. GLP-1 (glucagon-like peptide-1)은 db/db(+/+) 군에 비하여 양성대조군에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 또한, GLP-1은 CNBM 17-4 처리군에서 유의적으로 낮아짐을 확인하였다 (도 13e).

따라서, NBM 17-4은 인슐린 민감도를 증가시켜 혈당을 낮춰주거나, 당뇨에 의한 고인슐린혈증을 완화시키는 효과를 나타내었다 (도 13a 내지 도 13e).

7-5. 지질 프로파일

총 글리세라이드는 Total glyceride assay kit (AM157S, Asanpharm, Korea)로 측정하였으며, 총 콜레스테롤은 (AM202-K, Asanpharm, Korea)를 이용하여 측정하였으며, GOT는 (AM103-K, Asanpharm, Korea)를 이용하여 측정하였다.

제2형당뇨와 관련하여, 고혈당증과 고지혈증은 양의 상관관계를 갖게 되는데, 이는 Ach (Acetyl-choline, 아세틸콜린) 신호전달과 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, Ach 신호전달이 감소하게 되면 고혈당증 및 고지혈증이 증가하는 것으로 알려져 있다. 즉, 인슐린 저항성에 의해서, Ach 신호전달이 하향 조절됨에 따라, 대사질환인 고혈당증 및 고지혈증의 발생이 증가된다.

총 트리글리세라이드는 db/db(+/+) 군과 비교하여 양성대조군 및 NBM 17-4 처리군에서 유의적으로 감소하였다 (도 14a).

총 콜레스테롤은 db/db(+/+) 군과 비교하여 양성대조군(로베글리타존) 및 NBM 17-4 처리군에서 유의적으로 감소하였다 (도 14b).

간의 손상 정도를 나타내는 GOT에서는 db/db(+/+) 군과 비교하여 양성대조군(로베글리타존) 및 NBM 17-4 처리군에서 유의적으로 감소하였다 (도 14c).

상기 결과는 선발된 프로바이오틱스 균주의 고지혈증 완화 효과를 나타내며, 상기 효과는 실시예 7-4에서 나타나는 프로바이오틱스 균주의 항 당뇨 기능성과 일치하는 것이다.

실시예 8: 인슐린 신호전달, 글루코스 신생, 지질 대사, 식욕 조절 호르몬 및 염증 관련 유전자 발현량 측정

실시예 7-1의 동물모델을 8시간 공복을 시킨 다음, 해부하여 얻은 간 및 부고환 지방 조직을 Trizole™ Reagent (15596018, Sigma, USA)를 이용하여, RNA를 분리하고, 분리한 RNA의 농도를 NanoDrop™ 2000 spectrophotometer (ND-2000, Sigma, USA)를 이용하여 측정하고, cDNA synthesis kit (FSQ-101, TOYOBO, Japan)를 이용하여 cDNA합성을 하고, SYBR Green Master Mix (170-8880, BIO-RAD, USA)의 프로토콜으로 표 2 내지 표 4의 프라이머를 이용하여 qRT-PCR 진행하였다.

유전자	프라이머	서열	서열번호
GAPDH	Forward	5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3'	2
GAPDH	Reverse	5'-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-3'	3
PPARγ	Forward	5'-CCTGAACATCGAGTGTCGAATAT-3'	4
PPARγ	Reverse	5'-GGTCTTCTTCTGAATCTTGCAGCT-3'	5
PGC1α	Forward	5'-AAGTGTGGAACTCTCTGGAACTG-3'	6
PGC1α	Reverse	5'-GGGTTATCTTGGTTGGCTTTATG-3'	7
SREBPF1c	Forward	5'-TAGTCCGAAGCCGGGTGGGCCGCGCCAT-3'	8
SREBPF1c	Reverse	5'-GATGTCGTTCAAAACCGCTGTGTGTCCAGTTC-3'	9
ACC	Forward	5'-GCCTCTTCCTGACAAACGAG-3'	10
ACC	Reverse	5'-TGACTGCCGAAACATCTCTG-3'	11
FAS	Forward	5'-GCTGCGGAAACATCTCTG-3'	12
FAS	Reverse	5'-GACTCGCTCTCAGATGCCCTAC-3'	13
CD36	Forward	5'-TGGTGGATGGTTTCCTAGCCTTTC-3'	14
CD36	Reverse	5'-TCGCCAACTCCCAGGTACAATC-3'	15
CPT1	Forward	5'-ATCTGGATGGCTATGGTCAAGGTC-3'	16
CPT1	Reverse	5'-GTGCTGTCATGCGTTGGAAGTC-3'	17

유전자	프라이머	서열	서열번호
UCP1	Forward	5'-AGATCTTCTCAGCCGGAGTTT-3'	18
UCP1	Reverse	5'-CTGTACAGTTTCGGCAATCCT-3'	19
UCP2	Forward	5'-ACCAAGGGCTCAGAGCATGCA-3;'	20
UCP2	Reverse	5'-TGGCTTTCAGGAGAGTATCTTG-3'	21
PPARα	Forward	5'-CCTGAACATCGAGTGTCGAGCA-3'	22
PPARα	Reverse	5'-GGTCTTCTTCTGAATCTTGCAGCT-3'	23
Leptin	Forward	5'-CTCCAAGGTTGTCCAGGGTT-3'	24
Leptin	Reverse	5'-AAAACTCCCCACAGAATGGG-3'	25
Adiponectin	Forward	5'-GCACTGGCAAGTTCTACTGCAA-3'	26
Adiponectin	Reverse	5'-GTAGGTGAAGAGAACGGCCTTGT-3'	27
IRS2	Forward	5'-TCTACACCCGAGACGAACACT-3'	28
IRS2	Reverse	5'-TGGGCCTTTGCCCGATTATG -3'	29
AMPK	Forward	5'-AAGATCGGACATACGTCCTG-3'	30
AMPK	Reverse	5'- TGCCACTTTATGGCCTGTCAA -3'	31
AKT2	Forward	5'-ACGTGGTGAATACATCAAGACC -3'	32
AKT2	Reverse	5'-ACCCAATGAAAGATCCATCACTC-3'	33

유전자	프라이머	서열	서열번호
FOXO1	Forward	5'-CCTGAGCCTGCTGGAGGAGAG -3'	34
FOXO1	Reverse	5'-GCACGCTCTTCACCATCCACTC-3'	35
G6PC	Forward	5'-AGGTCGTGGCTGGAGTCTTGTC-3'	36
G6PC	Reverse	5'-AATGCAGGCGAAGCGGAATGG -3'	37
TNF-α	Forward	5'-CCCAGACCCTCACACTCAGATC-3'	38
TNF-α	Reverse	5'-GCCACTCCAGCTGCTCCTC-3'	39
IL-6	Forward	5'-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3'	40
IL-6	Reverse	5'-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA -3'	41
MCP-1	Forward	5'-CCAACTCTCACTGAAGCCAGCTC-3'	42
MCP-1	Reverse	5'-TTGGGATCATCTTGCTGGTGAA-3'	43
FABP4	Forward	5'-TGGGAACCTGGAAGCTTGTCTC-3'	44
FABP4	Reverse	5'-GAATTCCACGCCCAGTTTGA-3'	45
IL-1β	Forward	5'-CTGTGTCTTTCCCGTGGACC-3'	46
IL-1β	Reverse	5'-CAGCTCATATGGGTCCGACA-3'	47

8-1. 인슐린 신호전달 관련 유전자 발현량 측정

인슐린 민감도의 변화에 따라, 인슐린 신호전달이 조절된다. 프로바이오틱스의 인슐린 신호전달 관련 유전자에 대한 영향을 평가하기 위해, 인슐린 신호전달 관련 유전자인 IRS2 (Insulin receptor substrate 2）와 AMPK (AMP-activated protein kinase), Akt2 (RAC-beta serine/threonine-protein kinase 2)의 유전자 발현을 분석하였다.

그 결과, IRS 및 AMPK 발현량은 간에서 db/db(+/-) 그룹과 비교하여 db/db(+/+) 그룹에서 감소하였으며, 양성대조군(로베글리타존) 및 NBM 17-4 처리군에서 유의적으로 증가하였다.

IRS2, AMPK, 및 Akt2의 발현량은 부고환 지방에서 db/db(+/-) 그룹과 비교하여, db/db(+/+) 그룹에서 감소하였으며, 양성대조군(로베글리타존) 및 NBM 17-4 처리군에서 증가하였다 (도 15, 16).

이는 양성대조군(로베글리타존) 및 선발된 NBM 17-4 처리군이 인슐린 저항성을 완화시키는 효과가 있음을 나타낸다.

8-2. 글루코스 신생 관련 유전자의 발현량 측정

인슐린 저항성이 증가함에 따라, 혈중 글루코스 수준이 증가하여, 고혈당증이 되며, 간에서 신체의 글루코스 수준이 낮아짐을 인식하고 다른 에너지원으로부터 글루코스를 생성하는 글루코스 신생(당 신생합성)이 발생한다.

프로바이오틱스의 글루코스 신생 관련 유전자에 대한 영향을 평가하기 위해, 글루코스 신생 관련 유전자인 간 FOXO1 (Forkhead box protein O1）와 G6P (Glucose 6-phosphatase)의 간 조직에서의 유전자 발현을 분석하였다.

글루코스 신생 관련 유전자의 발현량은 db/db(+/-) 그룹과 비교하여 db/db(+/+) 그룹에서 증가하였으며, 양성대조군(로베글리타존) 및 NBM 17-4 처리군에서는 유의적으로 감소하였다 (도 17).

이는 NBM 17-4가 인슐린 민감도를 상향 조절 시킴으로써 혈중 글루코스를 간으로 흡수하고, 간에서 글루코스 신생이 하향 조절되는 것을 나타낸다.

8-3. 염증 사이토카인 관련 유전자의 발현량 측정

프로바이오틱스의 염증 사이토카인 관련 유전자에 대한 영향을 평가하기 위해, 염증 관련 유전자인 IL-6 (Interleukin-6）와 TNF-α (Tumor necrosis factor-alpha), MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1)의 유전자 발현을 분석하였다.

간에서의 IL-6의 발현량은 db/db(+/-) 그룹과 비교하여 db/db(+/+) 그룹에서 증가하였으며, IL-6의 발현량은 양성대조군 및 NBM 17-4 처리군에서 유의적으로 감소하였다 (도 18).

상기 결과는 간에서는 글루코스 신생이 하향 조절되어, 염증 사이토카인의 생성이 감소하는 것을 나타낸다.

부고환 지방에서 IL-6, TNF-α, MCP-1 유전자 발현량은 db/db(+/-) 그룹과 비교하여 db/db(+/+) 그룹에서 증가하였으며, IL-6, TNF-α, MCP-1 유전자 발현량은 양성대조군(로베글리타존) 및 NBM 17-4 처리군에서 감소하였다(도 19).

상기 결과는 부고환 지방에서 지방세포의 형성이 하향 조절되어, 미토콘드리아의 합성과 관련된 지방산 산화가 상향 조절됨에 따라 염증 사이토카인의 생성이 감소되는 것을 나타낸다.

8-4. 식욕 조절 호르몬관련 유전자 발현량 측정

식욕조절에 관련된 호르몬은 렙틴과 아디포넥틴으로 서로 음성되먹임(negative feedback) 신호전달을 통해 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 이 중에서 아디포넥틴은 지방산, 포도당, 탄수화물 대사에 영향을 주며, 인슐린 저항성을 개선시키는 것으로도 알려져 있다.

프로바이오틱스의 식욕 조절 호르몬관련 유전자에 대한 영향을 평가하기 위해, 식욕조절 호르몬 관련 유전자인 렙틴과 아디포넥틴의 유전자 발현을 분석하였다.

그 결과, 부고환 지방에서 렙틴의 발현량은db/db(+/-) 그룹과 비교하여 db/db(+/+) 그룹에서 증가하였으며, 아디포넥틴의 발현량은 감소하였다. 양성대조군(로베글리타존) 처리시 렙틴의 발현량은 감소하였으며, 아디포넥틴의 발현량은 증가하였다.

NBM 17-4 처리군에서의 렙틴 발현량은 db/db(+/+) 그룹과 유의미한 차이가 나타나지 않았으며, 아디포넥틴의 발현량은 NBM 17-4 처리군에서 유의적으로 증가하였다 (도 20).

NBM 17-4 처리군에서 렙틴의 발현량이 변화가 없는 것은 사료 섭취량에 차이가 없음을 나타내고, 프로바이오틱스 처리로 인해 몸무게가 변화가 크지 않은 것으로 사료된다.

8-5. 지방 대사 관련 유전자 발현량 측정

지방 대사 관련 유전자의 발현량을 측정하기 위해, 지방 합성 및 미토콘드리아 신생관련 유전자인 PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), CD36 (Cluster of differentiation 36), FABP4 (Fatty acid-binding protein 4), PGC1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha), UCP1 (Uncoupling protein 1) 유전자 발현을 분석하였다.

지방 합성관련 유전자(CD36, FABP4)의 발현량은 db/db(+/-) 그룹과 비교하여 db/db(+/+) 그룹에서 증가하였으며, 양성대조군(로베글리타존) 처리시 감소하였다.

지방 산 흡수 관련 유전자(PPARγ 유전자)는 NBM 17-4 처리군에서 감소하는 경향성이 나타냈지만, 유의적인 차이를 나타내지는 않았다 (도 21).

미토콘드리아 신생관련 유전자(PGC1α, UCP1)의 발현량은 db/db(+/-) 그룹과 비교하여, db/db(+/+) 그룹에서 감소하였으며, 양성대조군(로베글리타존) 및 NBM 17-4 처리군에서 상기 유전자들의 발현은 증가하였다 (도 22).

결론

당뇨질환 마우스 모델(db/db mouse, background:C57BL/6)을 이용하여 프로바이오틱스 Lactobacillus rhamnosus NBM 17-4의 항당뇨 효과를 입증하였다.

NBM 17-4 균주의 투여로 인해, 간에서 인슐린 신호 전달 관련 유전자가 상향 조절되고, 이로 인해 인슐린 민감도가 상향 조절되어 글루코스 신생관련 유전자도 하향 조절되고, 결과적으로 혈중 글루코스의 수준이 감소한 것을 확인하였다.

또한, 당뇨 파라미터를 측정한 결과, NBM 17-4 균주의 투여는 인슐린 저항성을 완화하였다. NBM 17-4 균주의 투여는 부고환 지방 내 지질 대사관련 유전자인AMPK 신호전달을 상향 조절하고, 지방 산 흡수가 감소하였고, 미토콘드리아 신생 관련 유전자 발현량이 상향 조절되어 혈청 지질 파라미터(TG, TC)가 감소하였다.

또한, NBM 17-4 균주의 투여로 인해, 간과 부고환지방에서 염증 사이토카인 관련 유전자의 발현량이 감소하였다. 따라서, NBM 17-4는 간과 부고환지방에서 인슐린 신호전달을 상향 조절함으로써, 고혈당 및 고지혈증을 완화시키고, 글루코스 신생, 지질 대사관련 유전자들의 발현량이 감소하는 효과가 있었다.

결론적으로 락토바실러스 람노서스 NBM 17-4 균주는 i) 인슐린 저항성을 개선하는 효과, ii) 혈당을 감소하는 효과, iii) 혈중 콜레스테롤 및 지질을 감소하는 효과, 및 ⅳ) 인슐린 신호전달 관련 유전자(IRS, AMPK, Akt2), 글루코스 신생 관련 유전자(FOX01, G6P), 염증 사이토카인 관련 유전자(IL-6, TNF-α, MCP-1)의 발현을 조절하는 효과를 통해 당뇨병을 포함하는 다양한 대사 질환에 대한 치료효과를 나타낸다.

한국생명공학연구원

KCTC14324BP

20201006

<110> CKD Bio Corporation Seoul National University R&DB Foundation <120> Lactobacillus rhamnosus NBM 17-4 strain having preventive or therapeutic activity for metabolic disease including diabetes and hyperlipidemia <130> PN200317 <160> 47 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus rhamnosus NBM 17-4 16S rRNA <400> 1 ggcccgtggc gggctgctaa taatgcaagt cgaacgagtt ctgattattg aaaggtgctt 60 gcatcttgat ttaattttga acgagtggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc 120 cttaagtggg ggataacatt tggaaacaga tgctaatacc gcataaatcc aagaaccgca 180 tggttcttgg ctgaaagatg gcgtaagcta tcgcttttgg atggacccgc ggcgtattag 240 ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc aatgatacgt agccgaactg agaggttgat 300 cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct 360 tccacaatgg acgcaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ctttcgggtc 420 gtaaaactct gttgttggag aagaatggtc ggcagagtaa ctgttgtcgg cgtgacggta 480 tccaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa 540 gcgttatccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga 600 aagccctcgg cttaaccgag gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg 660 acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg 720 aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga 780 ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gatgaatgct aggtgttgga gggtttccgc 840 ccttcagtgc cgcagctaac gcattaagca ttccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg 900 aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 960 caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcttttgatc acctgagaga tcaggtttcc 1020 ccttcggggg caaaatgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080 gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt atgactagtt gccagcattt agttgggcac 1140 tctagtaaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc 1200 cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt acaacgagtt gcgagaccgc 1260 gaggtcaagc taatctctta aagccattct cagttcggac tgtaggctgc aactcgccta 1320 cacgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg 1380 ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac acccgaagcc ggtggcgtaa 1440 ccctttaggg agcgagccgt ctaaaggggg acaaaattgt tt 1482 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F primer <400> 2 caagttcaac ggcacagtca agg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R primer <400> 3 acatactcag caccagcatc acc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma F primer <400> 4 cctgaacatc gagtgtcgaa tat 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma R primer <400> 5 ggtcttcttc tgaatcttgc agct 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGC1 alpha F primer <400> 6 aagtgtggaa ctctctggaa ctg 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGC1 alpha R primer <400> 7 gggttatctt ggttggcttt atg 23 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBPF1c F primer <400> 8 tagtccgaag ccgggtgggc cgcgccat 28 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBPF1c R primer <400> 9 gatgtcgttc aaaaccgctg tgtgtccagt tc 32 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC F primer <400> 10 gcctcttcct gacaaacgag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC R primer <400> 11 tgactgccga aacatctctg 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS F primer <400> 12 gctgcggaaa catctctg 18 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS R primer <400> 13 gactcgctct cagatgccct ac 22 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36 F primer <400> 14 tggtggatgg tttcctagcc tttc 24 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36 R primer <400> 15 tcgccaactc ccaggtacaa tc 22 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT1 F primer <400> 16 atctggatgg ctatggtcaa ggtc 24 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT1 R primer <400> 17 gtgctgtcat gcgttggaag tc 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP1 F primer <400> 18 agatcttctc agccggagtt t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP1 R primer <400> 19 ctgtacagtt tcggcaatcc t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP2 F primer <400> 20 accaagggct cagagcatgc a 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP2 R primer <400> 21 tggctttcag gagagtatct tg 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR alpha F primer <400> 22 cctgaacatc gagtgtcgag ca 22 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR alpha R primer <400> 23 ggtcttcttc tgaatcttgc agct 24 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leptin F primer <400> 24 ctccaaggtt gtccagggtt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leptin R primer <400> 25 aaaactcccc acagaatggg 20 <210> 26 <211> 22 <212> 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<400> 34 cctgagcctg ctggaggaga g 21 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXO1 R primer <400> 35 gcacgctctt caccatccac tc 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G6PC F primer <400> 36 aggtcgtggc tggagtcttg tc 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G6PC R primer <400> 37 aatgcaggcg aagcggaatg g 21 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF alpha F primer <400> 38 cccagaccct cacactcaga tc 22 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF alpha R primer <400> 39 gccactccag ctgctcctc 19 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 F primer <400> 40 gaggatacca ctcccaacag acc 23 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 R primer <400> 41 aagtgcatca tcgttgttca taca 24 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 F primer <400> 42 ccaactctca ctgaagccag ctc 23 <210> 43 <211> 22 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Claims

수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주에 있어서, 상기 균주는 장벽 강화 효과가 있는 것인, 균주.
삭제
수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로, 상기 균주는 장벽 강화 효과가 있는 것인, 약제학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 대사성 질환은 고지혈증, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 및 고인슐린혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것인, 약제학적 조성물.
수탁번호 KCTC 14324BP인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) NBM 17-4 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로, 상기 균주는 장벽 강화 효과가 있는 것인, 식품 조성물.
제6항에 있어서, 상기 대사성 질환은 고지혈증, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 및 고인슐린혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 식품 조성물.
제7항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것인, 식품 조성물.