KR102279283B1 - 락토바실러스 헬베티커스 및 비피도박테리움 균주를 포함하는 비알코올성 지방간의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 헬베티커스 및 비피도박테리움 균주를 포함하는 비알코올성 지방간의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 섭취하는 경우 고지방 식이로 유발되는 지방간증 및 이로 인한 염증을 개선하는 효과가 있으므로, 본 발명의 조성물은 비알코올성 지방간증 및 지방간염의 개선 또는 치료용도의 제제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

락토바실러스 헬베티커스 및 비피도박테리움 균주를 포함하는 비알코올성 지방간의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, alleviating, or treating NAFLD comprising Lactobacillus helveticus and Bifidobacterium species}

본 발명은 락토바실러스 헬베티커스 및 비피도박테리움 균주를 포함하는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

비알코올성 지방간질환 (Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 대사증후군이 간 대사에 미치는 영향으로 인해 발생하는 세계적으로 가장 흔한 간 질환 중 하나이다. NAFLD를 비롯한 비만 및 그 관련 질환의 발생률은 전 세계 모든 연령층에서 급격히 증가하였다. NAFLD는 순 지방 경화증 (pure fatty steatosis: hepatocytes의 5 % 이상에 지방 침윤)에서부터 간경변 (cirrhosis), 간부전, 및 간세포암종 (hepatocellular carcinoma, HCC)으로 진행될 수 있는 비알코올성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis, NASH)을 포함한다. NAFLD의 병태생리는 포도당 및 지질 대사, 유전적 소인, 환경적 지방 축적 및 장의 미생물 인자를 포함한다. 간 질환으로 인한 사망 위험은 가교 섬유화 (bridging fibrosis) 또는 간경변 (cirrhosis)을 앓고 있는 진행성 섬유증 환자에서 현저히 증가한다. 인간의 장내 미생물은 약 1-2 kg의 총 질량을 가진 다양한 박테리아로 구성된 복잡한 생태계이다. 최근 인간의 장내 미생물총에 대한 지식과 기술의 발전은 인간의 질병과 치료에 대한 우리의 관점을 변화시켰다. 장내 미생물은 숙주와 긴밀한 관계를 유지하며 비타민 생산, 점막 면역계 및 박테리아 전위 (bacterial translocation)에 중요한 역할을 한다. 장은 간문맥을 통하여 간과 직접 연결되어 있으며, 간은 중요한 식이 영양소와 미생물-관련 구성 요소로 구성된 장 생산물 (gut products)의 주요 대사기관으로 장-간축 (gut-liver axis)이라는 용어로도 불리고 있어, 장내 미생물의 교란은 NAFLD를 포함한 간 질환으로 이어질 수 있다. NAFLD에 대한 치료법은 낮은 순응도, 효능 부족 또는 식이 요법 및 생활 습관의 변화로 인해 종종 비효율적이다. 이론적으로는, 프로바이오틱스의 투여를 통한 장내 미생물의 조절은 효과적 일 수 있으며 최근의 연구는 이 이론을 지지하는 몇 가지 장래성을 보여준 바 있다. 락토바실러스 헬베티커스는 장염, 염증 및 대사성 질환을 비롯한 다양한 질병에서 몸에 좋은 균주로 알려져 있다. 본 연구에서는 NAFLD 마우스 모델에서 락토바실러스 헬베티커스 및 비피도박테리움 균주와 이들의 조합의 효과를 평가하였다.

대한민국 등록특허 제10-1955276호

본 발명자들은 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료하기 위한 유산균 제제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명의 락토바실러스 헬베티커스 및 비피도박테리움 균주의 복합 조성물이 비알코올성 지방간증의 발생 및 염증의 발생을 현저하게 감소시킴을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 락토바실러스 헬베티커스 및 비피도박테리움 균주를 포함하는 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 헬베티커스 및 비피도박테리움 균주를 포함하는 비알코올성 지방간의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCTC 13670BP 인 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) CKDB001 균주를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간질환의 예방, 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KCTC 13670BP 인 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) CKDB001 균주를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간질환의 예방, 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.

본 발명자들은 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) CKDB001 균주 (수탁번호 : KCTC 13670BP)를 신규 분리하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 균주를 이용하여 동결건조 분말제제를 제조하였다. 상기 균주에 의해 제조된 분말제제를 고지방식이로 유도한 비알코올성 지방간 실험동물모델에 투여한 결과, 지방증 및 염증이 감소되어 비알코올성 지방간 질환에 대한 개선 또는 치료 효과가 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 용어 "비알코올성 지방간 질환 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)"은 알코올의 이외의 원인으로 인하여 발생하는 지방간 질환을 의미한다. 상기 비알코올성 지방간 질환은 알코올 이외의 원인으로 간세포에 지방이 축적된 상태인 "비알코올성 지방간증"과 "비알코올성 지방간성 간염", "비알코올성 지방간 연관 섬유화, 및 "비알코올성 지방간 연관 간경변증"을 포괄하는 용어이다.

본 명세서에서 “지방간”은 간 내 지방침착을 보이지만 간세포 손상 (풍선변성, ballooning degeneration) 및 섬유화의 손상은 없는 경우를 의미한다. "지방간성 간염" 또는 "지방간염"은 간 내 지방침착을 보이면서 간세포 손상(풍선변성)을 동반한 염증소견이 있는 경우를 의미한다. 지방간성 간염은 간 섬유화를 동반하기도 한다. "간경변증"은 조직학적으로 지방간이나 지방간염의 소견이 동반된 간경변증 또는 과거 조직학적으로 증명된 지방간 환자 또는 지방간염 환자에서 발생된 간경변증을 의미한다. 본 명세서에서 상기 지방간 질환과 관련된 용어의 정의는 지방간과 관련된 다양한 병태를 포함하기 위한 것일 뿐, 상기 용어에 따라 정의된 환자의 상태가 항상 명확하게 구별될 수 있는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) CKDB001 균주는 "한국생명공학연구원 미생물자원센터 (Korean Collection for Type Culture, KCTC)"에 수탁번호 "KCTC 13670BP"로 기탁된 것이다.

상기 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) CKDB001 균주의 균체 성상은 다음과 같다:

1) 균의 형태 : 그람 양성의 막대모양 또는 구형 간균

2) 생리적 성질 : 최적 생장온도는 30~40℃, 최적 pH는 5.5~5.8이고 통성혐기성이다. 운동성이 없고 포자를 형성할 수 없다.

3) 일반적으로 치즈에서 분리되며, 식품에 사용하는 것에 대해 안전하다고 여겨진다(probiotics와 유제품).

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 유효성분으로 비피도박테리움 속 균주를 추가적으로 포함한다.

상기 비피도박테리움 속 균주는 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 애니멀리스 락티스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 브레베 등이 있고, 보다 구체적으로는 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 브레베이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 비피도박테리움 롱검은 비피도박테리움 롱검 CKDB004 균주이고, KCTC에 수탁번호 "KCTC 13671BP"로 기탁된 것이다.

본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 비피도박테리움 브레베는 비피도박테리움 브레베 CKDB002 균주이고, KCTC에 수탁번호 "KCTC 13893BP"로 기탁된 것이다.

상기 비피도박테리움 롱검 균주의 균체 성상은 다음과 같다.

1) 균 형태 : 그람 양성 부정형의 간상형

2) 생리적 성질 : 최적 생장온도는 36~38℃, 최적 pH는 6.5~7.0이고 절대혐기성이다. 운동성과 젤라틴 액화력이 없고 내생포자를 만들지 못한다.

3) 사람의 소화장기 내에서 분리되며 출생 후 모유 수유를 하는 신생아의 장 내에서 가장 많이 발견되고 분리된다. 식품에 사용하는 것에 대해 안전하다고 여겨진다(probiotics와 유제품).

상기 비피도박테리움 브레베 균주의 균체 성상은 다음과 같다.

1) 균 형태 : 그람 양성 부정형의 간상형

2) 최적 생장온도는 36~38℃, 최적 pH는 6.5~7.0이고 절대혐기성이다. 운동성과 젤라틴 액화력이 없고 내생포자를 만들지 못한다.

3) 사람의 소화장기 내에서 분리되며 출생 후 모유 수유를 하는 신생아의 장 내에서 가장 많이 발견된다. 식품에 사용하는 것에 대해 안전하다고 여겨진다(probiotics와 유제품).

상술한 본 발명의 균주의 생화학적 특성은 하기 표 1에 나타내었으며, 각 균주의 16s rRNA 서열은 서열목록 제1서열 내지 제3서열에 나타내었다.

Source		L. helveticus	B. longum	B. breve
		CKDB001	CKDB004	CKDB002
Temoin	0	+	+	+
Glycerol	1	-	-	-
Erythritol	2	-	-	-
D-Arabinose	3	-	-	-
L-Arabinose	4	-	+	-
D-Ribose	5	-	-	-
D-Xylose	6	-	+	-
L-Xylose	7	-	-	-
D-Adonitol	8	-	-	-
Methyl-βD-Xylopyranoside	9	-	-	-
D-Galactose	10	+	+	+
D-Glucose	11	+	+	-
D-Fructose	12	+	+	-
D-Mannose	13	+	-	+
L-Sorbose	14	-	-	-
L-Rhamnose	15	-	-	-
Dulcitol	16	-	-	-
Inositol	17	-	-	-
D-Mannitol	18	-	+	-
D-Sorbitol	19	-	+	-
Methyl-αD-Mannopyranoside	20	-	-	-
Methyl-αD-Glucopyranoside	21	-	-	-
N-Acetylglucosamine	22	+	-	+
Amygdaline	23	-	-	-
Arbutine	24	-	-	-
Esculine, citrate de fer	25	-	-	-
Salicine	26	-	+	-
D-Cellobiose	27	-	-	-
D-Maltose	28	+	+	+
D-Lactose	29	+	+	+
D-Melibiose	30	-	+	+
D-Saccharose	31	-	+	+
D-Trehalose	32	+	-	-
Inuline	33	-	-	-
D-Melezitose	34	-	-	-
D-Raffinose	35	-	+	+
Amidon	36	-	-	-
Glycogene	37	-	-	-
Xylitol	38	-	-	-
Gentiobiose	39	-	-	+
D-Turanose	40	-	+	-
D-Lyxose	41	-	-	-
D-Tagatose	42	-	-	-
D-Fucose	43	-	-	-
L-Fucose	44	-	-	-
D-Arabitol	45	-	-	-
L-Arabitol	46	-	-	-
Potassium GlucoNaTe	47	-	-	-
Potassium 2-CetoGluconate	48	-	-	-
Potassium 5-CetoGluconate	49	-	-	-

본 발명의 조성물들의 유효성분인 상기 균주는 상기 균주를 분리 및/또는 정제한 균체 외에 균체를 포함하는 배양물, 균체의 추출물, 배양물 상층액, 이들의 농축액, 농축물, 건조물, 또한 필요에 따라서 희석액, 희석물 등이며, 배양액, 배양물을 처리하여 얻어지는 모든 상태의 것을 포함한다.

상기 균체의 배양법, 추출법, 분리법, 농축법, 건조법, 희석법 등은 특별히 한정되지 않는다.

균체를 배양하기 위한 배지로는 통상적으로 탈지유, 훼이, 카제인 등의 우유 단백질, 당류, 효모 엑기스 등을 포함하고 있으며, 배양 방법으로는 일반적인 각종 호기적 또는 혐기적인 방법을 적당히 사용할 수 있다.

배양 온도로는 예를 들어 30~40

를 설정하고, 배양 중에는 수산화나트륨 등의 알칼리를 사용하여 배지의 pH를 중성으로부터 산성, 예를 들어 pH가 5~6정도가 되도록 유지하는 중화배양법을 사용할 수도 있다. 이와 같은 중화배양법 외에 회분배양법 등의 임의의 배양 방법을 사용할 수 있으며, 배양한 후에는 필요에 따라서 배양물이나 그 상층액을 농축, 건조, 희석 등을 할 수도 있다.

또한 원심분리법이나 막분리법을 사용하여 배양물의 상층액과 균체를 분리하여 균체를 농축한 상태로 회수할 수도 있다. 그리고 균체에 초음파 처리나 효소 처리 등을 행하여 균체 내의 성분을 추출하거나, 배양물이나 그 상층액, 균체나 그 추출물 등을 건조할 수도 있다. 이들은 본 발명의 상기 조성물의 유효 성분으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 유산균뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 첨가성분은 예컨대 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물로는 모노사카라이드 (예를 들어, 포도당, 과당 등), 디사카라이드 (예를 들어 말토스, 수크로스, 올리고당 등) 및 폴리사카라이드 (예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 상기 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액 또는 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 식품조성물은 식품, 기능성 식품 (functional food), 영양보조제 (nutritional supplement), 건강식품 (health food) 및 식품 첨가제 (food additives) 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 상기 유산균 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 식품으로는 음료 (알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품 (예: 요거트, 발효유, 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료 (예: 된장, 간장, 소스 등) 등 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제. 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있다. 이외에도 락토즈, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스. 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.

상기 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 락토바실러스 헬베티커스 및 비피도박테리움 균주를 포함하는 비알코올성 지방간의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물을 섭취하는 경우 고지방 식이로 유발되는 지방간증 및 이로 인한 염증을 개선하는 효과가 있으므로, 본 발명의 조성물은 비알코올성 지방간증 및 지방간염의 개선 또는 치료용도의 제제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실험방법에 대한 설계를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 마우스에 일반식이 또는 서양식이를 먹이면서 본 발명의 단일 균주 또는 복합 균주를 9주간 투여한 후의 간/체중 비를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 마우스에 일반식이 또는 서양식이를 먹이면서 본 발명의 단일 균주 또는 복합 균주를 9주간 투여한 후의 조직병리학적 검사 결과를 나타낸 도이다 (도 3a: 지방 침윤정도, 도 3b: 염증 정도).
도 4a 및 도 4b는 마우스에 일반식이 또는 서양식이를 먹이면서 본 발명의 단일 균주 또는 복합 균주를 9주간 투여한 후의 혈청 내 간 효소 (AST 및 ALT)의 농도를 나타낸 도이다 (도 4a: AST, 도 4b: ALT).
도 5는 마우스에 일반식이 또는 서양식이를 먹이면서 본 발명의 단일 균주 또는 복합 균주를 9주간 투여한 후의 염증성 사이토카인(TNF-alpha, IL-1beta)의 분비 수준을 나타낸 도이다.
도 6은 마우스에 일반식이 또는 서양식이를 먹이면서 본 발명의 단일 균주 또는 복합 균주를 9주간 투여한 후의 장 상피세포의 치밀 이음부 주요 구성 물질인 occludin의 단백질 발현 수준을 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

사용된 균주

본 실험에 사용된 프로바이오틱스는 건강한 성인 분변, 신생아 분변으로부터 분리되었다. 본 발명에 사용된 균주 목록 및 분리원은 표 2에 나타내었다.

연번	균주명	약어	분리원
1	Lactobacillus helveticus CKDB001	LH	건강한 성인 분변
2	Bifidobacterium longum CKDB004	BLO	건강한 성인 분변
3	Bifidobacterium breve CKDB002	BBR	신생아 분변

프로바이오틱스 제조

종균 배양은 유산균 종균에 대한 MRS 또는 BL 브로스을 포함하는 플라스크에서 37

에서 24 시간 동안 수행하였다. 각 배양액을 발효조 (Bio Control & Science, MARADO-05D-PS)에서 최적화 된 배지에 접종 하였다. 발효는 배지에 NaOH 용액 (25 % w/v)을 자동적으로 첨가하도록 하여 pH를 5.5 ~ 6.0으로 일정하게 유지하였고, 120 rpm으로 교반하면서 37

에서 18 ~ 20 시간 동안 수행되었다. 40X 농축 세포의 동결 건조는 매뉴얼 (Cooling & Heating System, Lab-Mast 10)에 따라 수행되었다. 동결 건조 후, 각각의 프로바이오틱스 분말 1g 당 콜로니 형성 단위 (colony-forming unit, CFU)를 연속 희석법으로 측정하였다. 프로바이오틱스를 0.1 M PBS로 현탁시키고 사용하기 전에 10⁹ CFU/mL의 밀도로 조정하였다.

실험동물

6주령의 특정 병원체를 함유하지 않는 (specific-pathogen free, SPF) 수컷 C57BL/6J 마우스를 Dooyeol Biotech (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 모든 마우스는 12h/12h의 명암 주기로 22± 2 ℃의 강철 마이크로-절연체 케이지에 개별적으로 수용되었다. 마우스는 실험 전반에 걸쳐 물과 음식에 자유롭게 접근 할 수 있었고 매일 모니터링되었다. 1 주일간은 일반 식이를 급여하면서 실험 장소에 적응을 시켰고, 서양식이를 먹이는 군은 3일의 섭취 적응 기간을 가졌다. 동물들은 모두 인도적 치료를 받았으며, 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 보건 지침의 지침에 따라 수행되었다. 모든 절차는 한림 대학교 의과 대학 동물 보호 및 사용에 관한 위원회(2018-04)의 승인을 받아 이루어졌다.

실험설계

본 발명자들은 본 발명의 각 단일 균주 및 복합 균주의 비알코올성 지방간에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 6주령의 C57BL/6 마우스를 1개군당 5마리씩, 총 8개의 실험군을 디자인하여 실험을 수행하였다 (도 1 참조).

1. 일반식이 (normal chow diet, ND)

2. 서양식이 (western diet or HFD, 60% kcal 지방 포함)

3-6. 서양식이 및 단일 유산균 투여군 (L. rahmnosus GG (LGG) 투여군; L. heveticus (LH) 투여군; B. longum (BLO) 투여군; B. breve (BBR) 투여군)

7-8. 서양식이 및 복합 유산균 투여군 (LH+BLO, LH+BBR)

위 조건으로 9주간 실험을 진행하였고, 유산균 투여군은 10⁹ CFU/day의 유산균을 음수에 희석하여 투여하였고, 2종 복합 유산균 투여군은 각 균주를 1:1의 비율로 혼합하여 투여하였다.

실시예 1: 간/체중 비율(Liver/Body weight ratio, LB ratio)

실험 종료 후 각 군별로 마우스의 체중 및 간의 무게를 측정하여 간/체중 비율을 분석하였다. 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 모든 단일 균주 투여군에서 서양식이군 (HFD)에 비하여 LB ratio의 개선이 관찰되었고, 특히, LH 투여군에서 서양식이군에 비하여 유의한 개선효과가 관찰되었다. 복합 균주 투여군에서도 서양식이군에 비하여 LB ratio의 개선이 관찰되었으며, 특히, 복합 균주 투여군 중 LH+BLO 군에서 유의한 개선효과가 관찰되었다.

실시예 2: 간 조직학(지방증 및 염증 스코어)

조직 검체를 10% 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 포매한 후, 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신, Masson 's trichrome 및 reticulin 섬유 염색을 하였다.

지방간 (steatosis)은 0~3 등급 (0 : 5 %, 1 : 5 % -33 %, 2 : 34 % -66 %, 3 : 66 % 이상의 지방증)의 NAFLD에 관한 NASH 임상 연구 네트워크 채점 시스템으로 분류하였다. 염증 (hepatitis)은 0~3등급 (0 : 병소 없음, 1 : x20 필드당 1-2 병소, 2 : x20 필드당 2-4 병소, 3 : x20 필드당 4 병소 초과)으로 분류되었다. 모든 생검 검체는 간 병리학자에 의해 분석되었다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, LH 투여군에서 대조군 유산균주인 LGG투여군보다 지방간이 유의적으로 감소하였다. 모든 복합 균주 투여군에서 서양식이군에 비하여 지방간이 감소하였고, 특히 LH+BBR 투여군의 지방간 감소가 유의적인 것으로 나타났다.

도 3b에 나타낸 바와 같이, LH 투여군에서 대조군 유산균주인 LGG 투여군보다 염증 스코어가 유의적으로 감소하였다. 또한 모든 복합 균주 투여군 (LH+BLO, LH+BBR)에서 염증 스코어가 유의적으로 감소하였다.

따라서, 본 발명의 LH 균주는 비피도박테리움 속 균주, 특히 BLO 및 BBR과 복합 투여시 비알코올성 지방간염의 개선 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

실시예 3: 혈청내 간 효소( AST , ALT)

혈액 생화학 분석기 (KoneLab 20, Thermo Fisher Scientific, Waltham, 핀란드)를 사용하여 혈청 아스파테이트 아미노전이효소 (serum aspartate aminotransferase, AST), 알라닌 아미노 전이 효소 (alanine aminotransferase, ALT)를 분석하였다.

도 4a에 나타낸 바와 같이, 서양식이군에 비해LH 투여군에서 대조군 유산균주인 LGG투여군과 비슷하게 AST 수치가 유의적으로 감소하였다. 모든 복합 균주 투여군에서도 LH 투여군과 비슷한 수준으로 AST 수치가 감소하였다.

도 4b에 나타낸 바와 같이, 서양식이군에 비해 LH 투여군에서 ALT 수치가 유의적으로 감소하였다. 모든 복합 균주 투여군에서도 LH 투여군과 비슷한 수준으로 ALT 수치가 감소하였다.

따라서, 본 발명의 LH 균주는 비피도박테리움 속 균주, 특히 BLO 및 BBR과 복합 투여시도 AST 및 ALT 수치 개선 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

실시예 4: 염증성 사이토카인( TNF -alpha, IL- 1beta )

간 조직 균질액을 PRO-PREP^TM Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, Korea)과 함께 4 ℃에서 30 분간 배양한 후 10,000g에서 10 분간 원심분리 하였다. 생성된 상등액을 취하여 종양 괴사 인자(TNF)-α와 인터루킨 (IL)-1β를 포함하는 전-염증성 사이토카인의 수준을 제조 업체의 지시에 따라 효소-결합 면역 흡착 분석법 (R & D Systems, Minneapolis , MN)을 이용하여 분석 하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모든 복합 균주 투여군(LH+BLO, LH+BBR)에서는 일반식이군과 유사한 정도로 TNF-alpha의 수준이 감소되었다. 또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 복합 균주 투여군 중 LH+BBR 투여군에서 서양식이군에 비하여 IL-1beta의 수준이 유의적으로 감소되었다.

따라서, 본 발명의 복합 균주 투여군은 서양식이에 의해 유도되는 비알코올성 지방간염을 개선시키는 효과가 우수함을 알 수 있다.

실시예 5: 장 상피세포의 치밀 이음부(tight junction) 단백질 발현

장 조직 균질액을 PRO-PREP^TM Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, Korea)과 함께 4

에서 30 분간 배양한 후 10,000 g에서 10 분간 원심분리 하였다. 생성된 상등액을 취하여 Bradford assay를 이용하여 단백질을 정량하고 10 % sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel (SDS-PAGE)를 이용하여 전기영동하였다. Polyacryamide의 단백질은 PVDF (Polyvinylidene fluoride) membrane으로 이동시키고 5 % 탈지우유로 blocking해준다. TBS-T로 씻어주고 1차 항체는 rabbit anti-mouse occluding 항체를 사용하며, 2차 항체는 HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG 항체를 사용하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모든 복합 균주 투여군 (LH+BLO, LH+BBR)에서는 일반식이군과 유사한 정도로 occludin 단백질의 발현이 증가하였다.

따라서, 본 발명의 복합 균주 투여군은 서양식이에 의해 유도되는 장누수증후군을 개선시키는 효과가 우수함을 알 수 있다.

한국생명공학연구원 KCTC13670BP 20181023 한국생명공학연구원 KCTC13671BP 20181023 한국생명공학연구원 KCTC13893BP 20190719

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agaataagtc 600 tgatgtgaaa gccctcggct taaccgagga actgcatcgg aaactgtttt tcttgagtgc 660 agaagaggag agtggaattc catgtgtagc ggtggaatgc gtagatatat ggaagaacac 720 cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgcaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc 780 gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttgggag 840 gtttccgcct ctcagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg 900 caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960 attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc tagtgccatc ctaagagatt 1020 aggagttccc ttcggggacg ctaagacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080 gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt tattagttgc cagcattaag 1140 ttgggcactc taatgagact gccggtgata aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt 1200 catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagtac aacgagaagc 1260 gagcctgcga aggcaagcga atctctgaaa gctgttctca gttcggactg cagtctgcaa 1320 ctcgactgca cgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agaacgccgc ggtgaatacg 1380 ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatggaag tctgcaatgc ccaaagccgg 1440 tggcctaacc ttcgggaagg agccgtctaa gcaggcagat gactggggtg 1490 <210> 2 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA sequence of B. longum CKDB004 <400> 2 gctcaggatg aacgctggcg gcgtgcttaa cacatgcaag tcgaacggga tccatcaggc 60 tttgcttggt ggtgagagtg gcgaacgggt gagtaatgcg tgaccgacct gccccataca 120 ccggaatagc tcctggaaac gggtggtaat gccggatgct ccagttgatc gcatggtctt 180 ctgggaaagc tttcgcggta tgggatgggg tcgcgtccta tcagcttgac ggcggggtaa 240 cggcccaccg tggcttcgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cattgggact 300 gagatacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa 360 gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg gaggccttcg ggttgtaaac ctcttttatc 420 ggggagcaag cgagagtgag tttacccgtt gaataagcac cggctaacta cgtgccagca 480 gccgcggtaa tacgtagggt gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgta 540 ggcggttcgt cgcgtccggt gtgaaagtcc atcgcttaac ggtggatccg cgccgggtac 600 gggcgggctt gagtgcggta ggggagactg gaattcccgg tgtaacggtg gaatgtgtag 660 atatcgggaa gaacaccaat ggcgaaggca ggtctctggg 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<400> 3 gctcaggatg aacgctggcg gcgtgcttaa cacatgcaag tcgaacggga tccaggcagc 60 ttgctgcctg gtgagagtgg cgaacgggtg agtaatgcgt gaccgacctg ccccatgcac 120 cggaatagct cctggaaacg ggtggtaatg ccggatgctc catcacaccg catggtgtgt 180 tgggaaagcc tttgcggcat gggatggggt cgcgtcctat cagcttgatg gcggggtaac 240 ggcccaccat ggcttcgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac attgggactg 300 agatacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag 360 cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatgg aggccttcgg gttgtaaacc tcttttgtta 420 gggagcaagg cactttgtgt tgagtgtacc tttcgaataa gcaccggcta actacgtgcc 480 agcagccgcg gtaatacgta gggtgcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagggct 540 cgtaggcggt tcgtcgcgtc cggtgtgaaa gtccatcgct taacggtgga tccgcgccgg 600 gtacgggcgg gcttgagtgc ggtaggggag actggaattc ccggtgtaac ggtggaatgt 660 gtagatatcg ggaagaacac caatggcgaa ggcaggtctc tgggccgtta ctgacgctga 720 ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgg 780 tggatgctgg atgtggggcc cgttccacgg gttccgtgtc ggagctaacg cgttaagcat 840 cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaaga aattgacggg ggcccgcaca 900 agcggcggag catgcggatt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg ggcttgacat 960 gttcccgacg atcccagaga tggggtttcc cttcggggcg ggttcacagg tggtgcatgg 1020 tcgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caaccctcgc 1080 cccgtgttgc cagcggatta tgccgggaac tcacggggga ccgccggggt taactcggag 1140 gaaggtgggg atgacgtcag atcatcatgc cccttacgtc cagggcttca cgcatgctac 1200 aatggccggt acaacgggat gcgacagtgc gagctggagc ggatccctga aaaccggtct 1260 cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaaggcg gagtcgctag taatcgcgaa 1320 tcagcaacgt cgcggtgaat gcgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt caagtcatga 1380 aagtgggcag cacccgaagc cggtggccta acccctt 1417

Claims (6)

1. 수탁번호 KCTC 13670BP인 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) CKDB001 균주를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간증 (steatosis) 또는 비알코올성 지방간염 (steatohepatitis)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 수탁번호 KCTC 13671BP인 비피도박테리움 롱검 CKDB004 균주 또는 수탁번호 KCTC 13893BP인 비피도박테리움 브레베 CKDB002 균주를 추가적으로 포함하는 것인, 조성물.
   
3. 수탁번호 KCTC 13670BP인 락토바실러스 헬베티커스 (Lactobacillus helveticus) CKDB001 균주를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간증 (steatosis) 또는 비알코올성 지방간염 (steatohepatitis)의 예방 또는 개선용 식품조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 수탁번호 KCTC 13671BP인 비피도박테리움 롱검 CKDB004 균주 또는 수탁번호 KCTC 13893BP인 비피도박테리움 브레베 CKDB002 균주를 추가적으로 포함하는 것인, 조성물.
   
   
   
5. 삭제
6. 삭제

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