KR101937365B1 - 다양한 기능성을 가진 신규 유산균 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 김치 또는 사람의 분변에서 분리된 신규 락토바실러스속 균주, 신규 비피도박테리움속 균주 또는 이들의 혼합 유산균을 제공한다. 본 발명에 따른 특정 락토바실러스속 균주 또는 특정 비피도박테리움속 균주는 김치 또는 사람의 분변에서 분리되어 안전성이 높고 항산화 활성, 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성 또는 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성 등과 같은 다양한 생리활성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 특정 락토바실러스속 균주, 특정 비피도박테리움속 균주 또는 이들의 혼합 유산균은 장 손상, 간 손상, 알러지 질환, 염증 질환, 또는 비만 등을 예방, 개선 또는 치료하는데에 유용한 기능성 식의약 소재로 사용될 수 있다.

Description

다양한 기능성을 가진 신규 유산균 및 이의 용도{Novel lactic acid bacteria with various functionality and use thereof}
본 발명은 신규 유산균 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 김치 또는 사람의 분변에서 분리되고, 항산화 활성, 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성 또는 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성 등과 같은 다양한 생리활성을 가진 신규 유산균 또는 신규 혼합 유산균에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규 유산균 또는 신규 혼합 유산균의 다양한 식의약적 용도에 관한 것이다.
인류가 풍요로운 사회로 점점 발전해 감에 따라 생활습관이 급속하게 서구화되면서 질병의 양상도 크게 변하고 있다. 특히, 현대인에게는 육식 및 지방 위주의 서구화된 식생활, 불규칙한 식사, 과음, 운동 부족, 과도한 스트레스, 유해 환경에의 노출 등으로 인해 장내세균총의 교란, 장 누수 증후군, 대장염, 간질환, 알러지 질환, 비만 등이 급격하게 증가하고 있다.
장내세균총의 교란
우리 몸의 소화관에는 많은 세균들이 서식하고 있다. 우리 몸에는 정상세포가 약 10조 개가 있는 반면, 세균의 수는 그보다 10배쯤 더 많은 100조 개 정도이다. 그리고 이 세균들은 우리 장의 건강에 도움을 주는 유익균과 건강에 해로운 유해균으로 나눌 수 있다. 우리 몸은 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코쿠스(Pediococcus), 스포로락토바실러스(Sporolactobacilius) 등과 같은 유익균이 유해균보다 우세균으로 소화관에 서식하고 있을 때 건강을 유지할 수 있다. 그렇지 않으면, 비만, 장 누수 증후군, 간질환, 노화촉진, 장염 등과 같은 질환을 유발할 수 있다.
장 누수 증후군(Intestinal Permeability Syndrome)
우리 몸의 소화관은 점액질과 융모로 구성되어 있어서, 영양성분을 효율적으로 흡수하면서도 분자량이 큰 병원미생물이나 이들이 생산하는 독소들이 흡수되지 못하도록 관리한다. 또한, 우리 몸은 분자량이 큰 외부항원들이 체내로 침입하면 이를 방어할 수 있는 면역체계를 갖추고 있다. 그러나, 많은 병원미생물 또는 독소의 감염, 과다한 스트레스, 소화관 서식 유해세균을 증식시킬 수 있는 고지방식과 같은 음식물 섭취, 과다한 알코올 섭취, 약물(예를 들어, 항생물질) 남용 등에 의해 장내세균총이 교란되고 소화관의 면역체계에 이상이 발생하며, 밀착연접단백질(tight junction proteins들)의 발현이 억제된다. 밀착연접단백질(tight junction proteins들)의 발현이 억제되는 경우 장점막의 치밀도 결합이 느슨해지고, 이 느슨해진 틈과 면역체계의 이상으로 병원미생물 등과 같은 거대분자의 체내 침입이 쉬워진다. 장 누수 증후군(Intestinal Permeability Syndrome)은 새는 장 증후군(Leaky Gut Syndrome)이라고 하며, 위장관을 구성하는 상피세포의 밀착연접 방어체계가 원활이 작동되지 않아 소화가 덜된 음식물, 병원미생물, 독소 등과 같이 외부 물질이 혈액으로 계속 유입되는 상태를 말한다. 장 누수 증후군이 생기면 일반적으로 체내로 흡수되지않는 외부항원들이 체내로 들어오기 때문에 궤양성 대장염, 크론병, 간장해, 간기능 장애, 알러지 질환(천식 포함), 아토피, 자가면역질환, 지방변증, 소화흡수 장애, 여드름, 노화 촉진, 내독소혈증, 장 감염, 습진, 과민성장증후군, 만성피로증후군, 건선, 류머티스 관절염, 췌장기능 부전, 염증성 관절 질환 등이 발생한다.
대장염
종래, 궤양성 대장염 및 크론병의 발생율은 서양인에게 높다고 알려져 있었지만, 최근, 식습관 등의 생활습관의 변화로 인해 우리나라 등 동양에서도 환자수가 급증하고 있다. 그렇지만, 원인이 불분명한 이유도 있어 근본적 치료법은 확립되어 있지 않다. 이 때문에 완전한 치료를 목표로 하는 것이 아니라, 증상을 완해시키고, 이러한 상태를 가능한 한 장기간 유지하는 약제가 사용되고 있는 실정이다. 이러한 대증요법을 위한 약제로서, 주로 아미노살리실산제제, 부신피질 스테로이드제, 면역억제제 등이 사용되지만, 다양한 부작용이 보고되고 있다. 예를 들어, 아미노살리실산제제로서 자주 사용되는 살라조설파피리딘은 구역질, 구토, 식욕부진, 발진, 두통, 간장해, 백혈구 감소, 이상 적혈구, 단백뇨, 설사 등의 부작용이 보고되고 있다. 또한 부신피질스테로이드제는 일반적으로는 프레드니솔론의 경구투여, 관장, 좌약, 정맥 주사 등으로 사용되지만, 위궤양이나 장기사용에 의한 대퇴골두 괴사 등 부작용이 강하다. 그러나 투약의 중단은 증상을 재발시키기 때문에, 이들 약제는 계속적으로 사용하지 않을 수 없다. 따라서, 효과가 우수하면서도, 안전하고 부작용을 일으키지 않는 궤양성 대장염, 크론병 등의 장질환 치료제의 개발이 요구되고 있다. 과민성 대장염 증후군((irritable bowel syndrome, IBS)도 마찬가지로 그 원인이 명확하지 않은 만성 복부 질환이다. 현재, IBS의 근본적인 치료제는 존재하지 않으며, 각 타입의 증상 경감을 목적으로 한 대증요법이 행해지고 있다. 예를 들어, 하리형 IBS에 대해서는 평활근의 수축을 억제하는 진경작용을 갖는 항콜린제가 사용되며, 변비형 IBS에는 염류 하제, 대체형 IBS에는 약제로 조절하기 곤란하고, 기본적으로 소화관 운동기능 개선제가 사용되고 있다.
간질환
간은 우리 몸에서 에너지 대사(영양분의 처치, 저장 및 노폐물 배설), 독소의 해독, 혈청 단백질의 합성, 담즙 배설을 통한 장에서의 지방의 원활한 흡수와 같은 역할을 하며, 면역유지(신체방어작용) 및 비타민의 대사에도 중요하다. 그러나, 간염 바이러스의 감염, 알코올이나 고지질식의 과다 섭취에 의해 간염, 지방간 또는 간경변증 등과 같은 간질환이 발생한다. 또한, 약물(결핵약, 아스피린, 항생제, 마취제, 고혈압 치료제, 경구피임제 등), 선천적 대사이상, 심부전, 쇼크 등으로도 간질환이 유발될 수 있다. 간질환이 발생하면 피로감, 구토, 설사, 식욕부진, 황달, 우상복부통, 발열, 근육통이 나타나는 급성 간염으로 시작해서 만성 간염으로 발전할 수 있다.
알러지 질환
사회가 복잡해지고 산업과 문명의 발달로 인해 환경오염, 스트레스가 증가하고, 식생활이 변화되면서 알러지 질환 환자들이 매년 증가하고 있다. 1980년에 아토피, 아낙필락시스, 천식 등과 같은 알러지 질환 환자는 1% 미만이었으나, 2000년대에는 5% 이상으로 급증하고 있으며 잠재적인 환자까지 포함하면 10%가 넘는 것으로 추정되고 있다. 알러지 질환의 발생원인은 항원항체반응의 결과로 나타나는 생체의 과도한 면역반응이며, 알러지 질환은 반응시간 및 보체 관여의 유무에 따라 일반적으로 1~4형 과민반응으로 분류된다. 제1형 과민반응에는 아토피, 아나필락시스 쇼크, 기관지 천식, 두드러기, 화분증 등이 있고, 제2형 과민반응에는 부적합수혈, 자가 면역성 용혈성 빈혈, 약제에 의한 용혈성 빈혈, 과립구 감소증, 혈소판감소성 자반병 등이 있고, 제3형 과민반응에는 홍반, 림프선종창, 관절통, 관절염, 신염, 연쇄구균감염 뒤의 급성사구체신염 등이 있고, 제4형 과민 반응에는 만성 염증 등이 있다. 알러지 질환을 개선하기 위해 1차적으로는 샤워나 목욕 등을 하여 피부에 묻은 있는 알레르겐(집 먼지, 진드기 등)을 제거하고, 알레르겐의 섭취를 하지 않는 것이 좋다. 그러나, 알러지 질환이 개선되지 않는 경우 스테로이드, 항히스타민제, 면역억제제 등과 같은 약물을 사용하게 되는데, 이 약물들은 피부위축, 혈관확장, 탈색, 자반(스테로이드 제제), 졸림(항히타민제), 신부전(면역억제제) 등과 같은 부작용이 발생하기 쉽다. 지금까지 개발된 약물 중에 알레르기를 완치할 수 있는 약물은 없으며 증상개선을 기대하고 있으나 부작용이 크다는 문제점이 있다.
비만
비만은 열량의 섭취와 소비의 불균형으로 발생되는 대사성 질환이며, 형태학적으로 볼 때 체내 지방 세포의 크기 증가(hypertrophy) 또는 수의 증가(hyperplasia)에 의해 초래된다. 비만은 서구사회에서 가장 흔한 영양장애일 뿐만 아니라, 최근 우리나라에서도 경제발전에 의한 식생활의 향상과 생활 방식의 서구화로 비만의 빈도가 급속히 증가하는 추세에 있어서 그 치료와 예방에 대한 중요성이 크게 부각되고 있다. 비만은 심리적으로 개인을 위축시킬 뿐만 아니라 사회적으로도 여러 가지 성인병의 발병 위험을 증가시키는 중요한 요인이다. 비만이 2형 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심질환 등 여러 가지 성인병의 유병율 증가와 직접적인 관련이 있다고 알려져 있으며(Cell 87:377, 1999), 비만과 관련된 질환들을 함께 묶어서 대사증후군(metabolic syndrome) 또는 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)이라고 하며, 이들이 동맥경화증 및 심혈관질환의 원인으로 밝혀지고 있다. 현재까지 알려진 비만치료제로는 제니칼(Xenical, 로슈제약회사, 스위스), 리덕틸(Reductil, 에보트사, 미국), 엑소리제(Exolise, 아토파마, 프랑스) 등으로 크게 식욕억제제, 에너지소비 촉진제, 지방흡수억제제로 분류되며, 대부분의 비만치료제는 시상하부와 관련된 신경전달물질을 조절함으로써 식욕을 억제하는 식욕억제제이다. 그러나 종래의 치료제들은 심장질환, 호흡기질환, 신경계질환 등의 부작용과 함께 그 효능의 지속성도 낮아, 더욱 개선된 비만치료제의 개발이 필요하고 또한, 현재 개발되고 있는 제품도 부작용없이 만족할 만한 치료 효과를 가지는 치료제는 거의 없어 새로운 비만치료제의 개발이 요구되고 있다.
사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스(probiotics)라고 한다. 프로바이오틱스로서 효과가 있기 위해서는 경구로 섭취될 때, 대부분이 소장에 도달해서 장 표면에 부착되어야 하므로, 기본적으로 내산성, 내담즙성 및 장 상피세포 부착능력이 우수하여야 한다. 유산균은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질들을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당하기 때문에 프로바이오틱스로 사용된다. 유산균은 장내 정상균총의 유지, 장내 균총의 개선, 항당뇨 및 항고지혈증 효과, 발암 억제, 대장염 억제, 그리고 숙주의 면역체계의 비특이적 활성 등의 효과를 나타낸다고 보고되고 있다. 그 중에서도 락토바실러스 속 균주는 인체의 장내에 서식하는 정상 미생물 군집의 주요 구성원으로서, 건강한 소화기관과 질 내 환경을 유지하는 데 있어서 중요한 것으로 오래전부터 알려져 왔고 미국의 공중건강 가이드라인(U.S. Public Health Service guidelines)에 의하면, 현재 미국 균주 기탁기관(ATCC)에 기탁된 락토바실러스 균주 모두 인체나 동물에 질병을 유발할 잠재적 위험에 대해서는 알려진 것이 없다고 인정되는 '안정수준(Bio-safty Level) 1'로 분류되어 있다. 한편, 김치 유산균은 김치 발효에 관여하는 유산균으로서 면역증강, 항 미생물, 항산화, 항암 효과, 항비만 효과, 고혈압 예방 또는 변비 예방 효과 등이 있는 것으로 보고되고 있다[Hivak P, Odrska J, Ferencik M, Ebringer L, Jahnova E, Mikes Z. : One-year application of Probiotic strain Enterococcus facium M-74 decreases Serum cholesterol levels. : Bratisl lek Listy 2005; 106(2); 67-72; Agerholm-Larsen L. Bell ML. Grunwald GK. Astrup A. : The effect of a probiotic milk product on plasma cholesterol : a metaanalysis of short-term intervention studies ; Eur J Clin Nutr. 2000; 54(11) 856-860; Renato Sousa, Jaroslava Helper, Jian Zhang, Strephen J Lewis and Wani O Li ; Effect of Lactobacillus acidophilus supernants on body weight and leptin expression in rats ; BMC complementary and alternative medicine. 2008; 8(5)1-8].
이러한 유산균의 다양한 생리활성이 알려지면서, 최근 인체에 안전하면서도 기능이 우수한 유산균 균주를 개발하고 이를 의약품 또는 기능성 식품으로 적용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 예들 들어, 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0116051호에는 대장염 치료 및 예방 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HY7401이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2006-0119045호에는 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum) KACC91035, 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides) KCTC 3100 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KCTC 3498로 이루어진 군으로부터 선택된 아토피성 피부염 치료 또는 예방용 유산균이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0092182호에는 알코올 분해능이 우수한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HD-01[기탁번호: KACC91701P]을 함유하는 알코올성 간질환 예방용 또는 숙취해소용 건강기능식품이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0010015호에는 혈중 콜레스테롤 농도 저하 및 항 비만 활성을 갖는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) HFI 108 균주(KCTC 11356BP)가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0006509호에는 공액리놀레산(Conjugated Linoleic acid)을 생산하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CGB-C11(수탁번호 KCTC 11979BP) 균주를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있다.
그러나, 현대인에게 발병이 증가하고 있는 장내세균총의 교란, 장 누수 증후군, 대장염, 간질환, 알러지 질환, 비만 등을 총체적으로 개선하거나 치료할 수 있는 유산균 관련 기술은 출현하지 않고 있는바 다양한 기능성을 가진 새로운 균주의 스크리닝 및 이의 통한 의약품, 기능성 식품 등의 개발이 필요하다.
본 발명은 이러한 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 일 목적은 프로바이오틱스로서 요구되는 다양한 생리활성 또는 기능성을 가진 신규 유산균 및 이의 식의약적 용도를 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 다양한 생리활성 또는 기능성을 극대화할 수 있는 신규 유산균 혼합물 및 이의 식의약적 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자들은 김치 또는 사람 분변으로부터 무수한 유산균을 스크리닝하고, 이중 특정 락토바실러스속 균주, 특정 비피도박테리움속 균주 또는 이들의 혼합 유산균이 장 누수 증후군 등과 같은 장 손상, 지방간 등과 같은 간 손상, 아토피 피부염 등과 같은 알러지 질환, 대장염 등과 같은 염증 질환, 또는 비만 등에 우수한 개선 효과를 가진다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)에서 선택되는 유산균을 제공한다. 상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)은 항산화 활성, 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성 또는 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성을 갖는다. 또한, 본 발명의 일 예는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)에서 선택되는 유산균, 상기 유산균의 배양물, 상기 유산균의 파쇄물 또는 상기 유산균의 추출물을 유효성분으로 포함하고, 장 손상, 간 손상, 알러지 질환, 염증 질환, 또는 비만을 예방 또는 치료하기 위한 용도의 약학 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 일예는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)에서 선택되는 유산균, 상기 유산균의 배양물, 상기 유산균의 파쇄물 또는 상기 유산균의 추출물을 유효성분으로 포함하고, 장 손상, 간 손상, 알러지 질환, 염증 질환, 또는 비만을 예방 또는 개선하기 위한 용도의 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)으로 이루어진 군에서 2종 이상 선택되는 혼합 유산균 을 제공한다. 상기 혼합 유산균은 항산화 활성, 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성 또는 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성을 갖는다. 또한, 본 발명의 일 예는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)으로 이루어진 군에서 2종 이상 선택되는 혼합 유산균, 상기 혼합 유산균의 배양물, 상기 혼합 유산균의 파쇄물 또는 상기 혼합 유산균의 추출물을 유효성분으로 포함하고, 장 손상, 간 손상, 알러지 질환, 염증 질환, 또는 비만을 예방 또는 치료하기 위한 용도의 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)으로 이루어진 군에서 2종 이상 선택되는 혼합 유산균, 상기 혼합 유산균의 배양물, 상기 혼합 유산균의 파쇄물 또는 상기 혼합 유산균의 추출물을 유효성분으로 포함하고, 장 손상, 간 손상, 알러지 질환, 염증 질환, 또는 비만을 예방 또는 개선하기 위한 용도의 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 특정 락토바실러스속 균주 또는 특정 비피도박테리움속 균주는 김치 또는 사람의 분변에서 분리되어 안전성이 높고 항산화 활성, 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성 또는 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성 등과 같은 다양한 생리활성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 특정 락토바실러스속 균주, 특정 비피도박테리움속 균주 또는 이들의 혼합 유산균은 장 손상, 간 손상, 알러지 질환, 염증 질환, 또는 비만 등을 예방, 개선 또는 치료하는데에 유용한 기능성 식의약 소재로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 1차 실험에서, D-갈락토스아민(D-Galactosamine)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때 GOT 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 2는 본 발명의 1차 실험에서, D-갈락토스아민(D-Galactosamine)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때 GPT 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 3은 본 발명의 1차 실험에서, D-갈락토스아민(D-Galactosamine)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때 MDA 값의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 1차 실험에서 선별한 유산균들이 LPS(lipopolysaccharide)로 유도된 수지상 세포의 염증 반응에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 도 4에서 왼쪽의 그래프는 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하지 않은 세포에 유산균들이 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 오른쪽의 그래프는 LPS(lipopolysaccharide)를 처리한 세포에 유산균들이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 1차 실험에서, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57이 LPS(lipopolysaccharide)로 유도된 대식세포(macrophage)의 염증 반응에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 1차 실험에서, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23이 비장에서 분리된 T 세포의 Th17 세포 또는 Treg 세포로의 분화에 미치는 영향을 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 장치로 분석한 결과이다.
도 7은 본 발명의 1차 실험에서, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57 또는 이들의 혼합 유산균이 CaCO2 세포의 ZO-1 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 8은 본 발명의 1차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57이 미치는 영향을 대장의 외관 또는 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 등으로 나타낸 것이고, 도 9는 본 발명의 1차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57이 미치는 영향을 대장의 조직학적 사진으로 나타낸 것이며, 도 10은 본 발명의 1차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57이 미치는 영향을 염증 관련 사이토카인 등으로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 1차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23이 미치는 영향을 대장의 외관 또는 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 등으로 나타낸 것이고, 도 12는 본 발명의 1차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23이 미치는 영향을 대장의 조직학적 사진으로 나타낸 것이며, 도 13은 본 발명의 1차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23이 미치는 영향을 T 세포의 분화 양상으로 나타낸 것이고, 도 14는 본 발명의 1차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23이 미치는 영향을 염증 관련 사이토카인 등으로 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 1차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 대장의 외관 또는 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 등으로 나타낸 것이고, 도 16은 본 발명의 1차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 대장의 조직학적 사진으로 나타낸 것이며, 도 17은 본 발명의 1차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 염증 관련 사이토카인 등으로 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 1차 실험에서, 비만 유도 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 체중 변화량 등으로 나타낸 것이고, 도 19는 본 발명의 1차 실험에서, 비만 유도 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 대장의 외관, 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성, 대장의 조직학적 사진 등으로 나타낸 것이고, 도 20은 본 발명의 1차 실험에서, 비만 유도 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 염증 관련 사이토카인 등으로 나타낸 것이고, 도 21은 본 발명의 1차 실험에서, 비만 유도 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 염증 반응 지표 물질 등으로 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 2차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 유산균이 미치는 영향을 T 세포의 Th17 세포로의 분화 양상으로 나타낸 것이고, 도 23은 본 발명의 2차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 유산균이 미치는 영향을 T 세포의 Treg 세포로의 분화 양상으로 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 2차 실험에서, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 유산균이 미치는 영향을 염증 반응 지표 물질 등으로 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 사진으로 나타낸 것이고, 도 26은 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 총 위 병변 점수(gross gastric lesion score)로 나타낸 것이고, 도 27은 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 궤양 지수(ulcer index)로 나타낸 것이고, 도 28은 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 조직 활성 지수(Histological activity index)로 나타낸 것이다.
도 29는 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성으로 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 CXCL4의 발현 수준으로 나타낸 것이고, 도 31은 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 TNF-α의 발현 수준으로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "배양물"이란 미생물을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 미생물이 포함되는 개념이다.
본 발명에서 "약학적으로 허용가능한" 및 "식품학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 다양한 생리활성을 갖는 신규 유산균 또는 생리활성을 상승시킬 수 있는 신규 혼합 유산균에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 신규 유산균은 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)에서 선택되고, 항산화 활성, 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성 또는 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성을 갖는다. 상기 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)는 김치에서 분리된 혐기성 간균으로서, 그람 염색시 양성을 나타내고, 넓은 온도 범위, 낮은 pH, 높은 염 농도에 환경에서 생존할 수 있으며, 글루코시다제를 생산한다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)는 탄소원으로 D-리보스, D-자일로스, D-글루코스, D-프럭토스, 에스큘린(Esculin), 살리신(Salicin), 말토스, 멜리바이오스(Melibiose), 5-케토-글루코네이트(5-keto-gluconate) 등을 이용한다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)는 바람직하게는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23(수탁번호 : KCCM 11762P)이다. 상기 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)은 사람의 분변에서 분리된 혐기성 간균으로서, 그람 염색시 양성을 나타내고, 글루코시다제를 생산한다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)은 탄소원으로 D-갈락토스, D-글루코스, D-프럭토스 등을 이용한다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)은 바람직하게는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57(수탁번호 : KCCM 11764P)이다. 상기 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 김치에서 분리된 혐기성 간균으로서, 그람 염색시 양성을 나타낸다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 탄소원으로 D-리보스, D-갈락토스, D-글루코스, D-프럭토스, D-만노스, 만니톨, 솔비톨, N-아세틸-글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 에스큘린(Esculin), 살리신(Salicin), 셀로바이오스, 말토스, 멜리바이오스(Melibiose), 수크로스, 트레할로스, 멜레지토스 등을 이용한다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5(수탁번호 : KCCM 11800P)이다. 상기 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 김치에서 분리된 혐기성 간균으로서, 그람 염색시 양성을 나타낸다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 탄소원으로 L-아라비노스, D-리보스, D-글루코스, D-프럭토스, D-만노스, 만니톨, 솔비톨, N-아세틸-글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 에스큘린(Esculin), 살리신(Salicin), 셀로바이오스, 말토스, 락토스, 멜리바이오스(Melibiose), 수크로스, 트레할로스, 멜레지토스 등을 이용한다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27(수탁번호 : KCCM 11801P)이다. 상기 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)은 사람의 분변에서 분리된 혐기성 간균으로서, 그람 염색시 양성을 나타낸다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)은 탄소원으로 L-아라비노스, D-자일로스, D-글루코스, D-프럭토스, 에스큘린(Esculin), 말토스, 락토스, 멜리바이오스, 수크로스 등을 이용한다. 또한, 상기 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)은 바람직하게는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67(수탁번호 : KCCM 11802P)이다.
본 발명의 일 예에 따른 혼합 유산균은 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)으로 이루어진 군에서 2종 이상 선택된다. 본 발명의 일 예에 따른 혼합 유산균은 유산균들의 상승 작용을 고려할 때, 바람직하게는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 16S rDNA로 서열번호 3 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)의 조합으로 이루어진다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 혼합 유산균은 유산균들의 상승 작용을 고려할 때, 바람직하게는 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에서 선택되는 하나 이상의 락토바실러스속 균; 및 16S rDNA로 서열번호 7 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)의 조합으로 이루어진다. 상기 혼합 유산균은 특정 락토바실러스속 균주와 특정 비피도박테리움속 균주의 상승 작용에 의해 단일 유산균보다 높은 항산화 활성, 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성 또는 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성을 가지며, 기능성 식의약적 소재 측면에서 보다 유용하다. 본 발명의 일 예에 따른 혼합 유산균에서 상기 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23(수탁번호 : KCCM 11762P)이고, 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57(수탁번호 : KCCM 11764P)이고, 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5(수탁번호 : KCCM 11800P)이고, 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27(수탁번호 : KCCM 11801P)이고, 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67(수탁번호 : KCCM 11802P)인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 측면은 신규 유산균 또는 신규 혼합 유산균의 다양한 용도에 관한 것이다. 신규 유산균의 용도로, 본 발명은 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 또는 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)에서 선택되는 유산균, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하고, 장 손상, 간 손상, 알러지 질환, 염증 질환, 또는 비만을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 용도의 조성물을 제공한다. 또한, 신규 혼합 유산균의 용도로, 본 발명은 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 16S rDNA로 서열번호 3에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 16S rDNA로 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 16S rDNA로 서열번호 5에 기재된 염기서열을 포함하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 16S rDNA로 서열번호 7에 기재된 염기서열을 포함하는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)으로 이루어진 군에서 2종 이상 선택되는 혼합 유산균, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하고, 장 손상, 간 손상, 알러지 질환, 염증 질환, 또는 비만을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 용도의 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서 상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)의 기술적 특징은 전술한 바와 동일하므로 설명을 생략한다. 상기 장 손상은 장내세균총의 교란 등에 의해 장(특히 소장 또는 대장)의 기능이 정상적이지 않은 상태를 말하며, 바람직하게는 장 누수 증후군이다. 또한, 상기 간 손상은 외부적 요인이나 내부적 요인 등에 의해 간의 기능이 정상적이지 않은 상태를 말하며, 바람직하게는 간염, 지방간 또는 간 경변증에서 선택된다. 또한, 상기 간염은 비알코올성 간염 및 알코올성 간염을 모두 포함한다. 또한, 상기 지방간은 비알코올성 지방간 및 알코올성 지방간을 모두 포함한다. 또한, 상기 알러지 질환은 생체의 과도한 면역반응에 의해 발생하는 질환이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 바람직하게는 아토피 피부염, 천식, 인후염 또는 만성 피부염에서 선택된다. 또한, 상기 염증 질환은 염증 반응에 의해 유발되는 질환이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 바람직하게는 위염, 위궤양, 관절염 또는 대장염에서 선택된다. 또한, 상기 관절염은 류머티스 관절염을 포함한다. 또한, 상기 대장염은 세균 감염이나 장 내용물의 병적 발효 등으로 인해 대장에 염증이 발생한 상태를 말하며, 감염성 대장염과 비감염성 대장염을 포함하는 개념이다. 대장염의 구체적인 예로는 염증성 대장 질환 또는 과민성 대장염 증후군 등이 있다. 또한, 염증성 대장 질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 크론병(Crohn's disease) 등을 포함한다.
본 발명에서 유산균의 배양물 또는 혼합 유산균의 배양물은 소정의 균주 또는 혼합 균주를 배지에서 배양시켜 수득한 산물로서, 상기 배지는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 MRS 액체 배지, MRS 한천 배지, BL 한천 배지일 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 첨가제, 식품 조성물(특히 기능성 식품 조성물) 또는 사료 첨가제 등으로 구체화될 수 있다. 또한, 유효성분인 유산균 또는 혼합 유산균의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에서 유효성분인 신규 유산균, 신규 혼합 유산균, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 신규 유산균, 신규 혼합 유산균, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물 외에 장 손상, 간 손상, 알러지 질환, 염증 질환 또는 비만의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으나 바람직하게는 유효성분을 기준으로 할 때 0.1 내지 3000 ㎎/㎏이고, 더 바람직하게는 1 내지 2000 ㎎/㎏이며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 식품 조성물에서 유효성분인 신규 유산균, 신규 혼합 유산균, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.1~50 중량%, 더 바람직하게는 0.5~25 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물은 유효성분 외에 식품학적으로 허용 가능한 담체, 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
Ⅰ. 유산균 선별 및 효능 확인을 위한 1차 실험
1. 유산균의 분리 및 동정
(1) 김치로부터 유산균의 분리
배추 김치, 무 김치 및 파김치를 각각 파쇄하고, 파쇄액을 MRS 액체 배지(MRS Broth; Difco, USA)에 넣고 현탁하였다. 이후, 상등액을 취해 MRS 한천 배지(MRS agar medium; Difco, USA)에 이식하고 37℃에서 약 48시간 동안 혐기적으로 배양한 후, 콜로니(colony)를 형성한 균주들을 분리하였다.
(2) 사람 분변으로부터 유산균의 분리
사람 분변을 GAM 액체 배지(GAM broth; Nissui Pharmaceutical, Japan)에 넣고 현탁하였다. 이후, 상등액을 취해 BL 한천 배지(BL agar medium; Nissui Pharmaceutical, Japan)에 이식하고 37℃에서 약 48시간 동안 혐기적으로 배양한 후, 콜로니(colony)를 형성한 비피도박테리움속(Bifidobacterium sp.) 균주들을 분리하였다.
(3) 선별한 유산균의 동정
김치 또는 사람 분변으로부터 분리한 균주들의 생리학적 특성 및 16S rDNA 서열을 분석하여 균주의 종을 확정하고, 균주명을 부여하였다. 하기 표 1은 배추 김치, 무 김치, 파 김치 및 사람 분변에서 분리된 유산균의 관리번호 및 균주명을 나타낸 것이다.
관리번호 균주명 관리번호 균주명
1 Lactobacillus acidophilus CH1 31 Lactobacillus sakei CH31
2 Lactobacillus acidophilus CH2 32 Lactobacillus johnsonii CH32
3 Lactobacillus acidophilus CH3 33 Lactobacillus sakei CH33
4 Lactobacillus brevis CH4 34 Lactobacillus sakei CH34
5 Lactobacillus curvatus CH5 35 Lactobacillus plantarum CH35
6 Lactobacillus brevis CH6 36 Lactobacillus sanfranciscensis CH36
7 Lactobacillus casei CH7 37 Bifidobacterium pseudocatenulatum CH37
8 Lactobacillus planantrum CH8 38 Bifidobacterium pseudocatenulatum CH38
9 Lactobacillus sakei CH9 39 Bifidobacterium adolescentis CH39
10 Lactobacillus curvatus CH10 40 Bifidobacterium adolescentis CH40
11 Lactobacillus sakei CH11 41 Bifidobacterium adolescentis CH41
12 Lactobacillus curvatus CH12 42 Bifidobacterium animalis CH42
13 Lactobacillus plantarum CH13 43 Bifidobacterium animalis CH43
14 Lactobacillus fermentum CH14 44 Bifidobacterium bifidum CH44
15 Lactobacillus fermentum CH15 45 Bifidobacterium bifidum CH45
16 Lactobacillus gasseri CH16 46 Bifidobacterium breve CH46
17 Lactobacillus paracasei CH17 47 Bifidobacterium breve CH47
18 Lactobacillus helveticus CH18 48 Bifidobacterium breve CH48
19 Lactobacillus helveticus CH19 49 Bifidobacterium catenulatum CH49
20 Lactobacillus johnsonii CH20 50 Bifidobacterium catenulatum CH50
21 Lactobacillus johnsonii CH21 51 Bifidobacterium dentium CH51
22 Lactobacillus johnsonii CH22 52 Bifidobacterium infantis CH52
23 Lactobacillus brevis CH23 53 Bifidobacterium infantis CH53
24 Lactobacillus paracasei CH24 54 Bifidobacterium infantis CH54
25 Lactobacillus kimchi CH25 55 Bifidobacterium longum CH55
26 Lactobacillus gasseri CH26 56 Bifidobacterium longum CH56
27 Lactobacillus paracasei CH27 57 Bifidobacterium longum CH57
28 Lactobacillus pentosus CH28 58 Bifidobacterium longum CH58
29 Lactobacillus pentosus CH29 59 Bifidobacterium longum CH59
30 Lactobacillus reuteri CH30 60 Bifidobacterium longum CH60
상기 표 1에 기재된 균주들 중 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23은 그람 염색시 양성을 나타내는 혐기성 간균으로서, 포자를 형성하지 않고 호기적 조건에서도 생존성을 보였다. 또한, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23은 10~42℃에서 생존하였고, pH 2에서 2시간 동안 안정한 내산성 균주였다. 또한, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23은 2% 염화나트륨 용액에서도 생존하였고, 글루코시다제(glucosidase)를 활발하게 생산하였다. 또한, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 화학분류학적 특성으로 16S rDNA을 측정하였고, 그 결과 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 16S rDNA 염기서열을 Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST 검색으로 동정한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주는 검색되지 않았고, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주 FJ004의 16S rDNA 부분 서열과 99%의 상동성을 보였다.
상기 표 1에 기재된 균주들 중 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32는 그람 염색시 양성을 나타내는 혐기성 간균으로서, 포자를 형성하지 않고 호기적 조건에서도 생존성을 보였다. 또한, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32는 45℃까지 안정적으로 생존하였고, H 2에서 2시간 동안 안정한 내산성 균주였다. 또한, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32는 글루코시다제(glucosidase)를 활발하게 생산하였으나, 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)는 생산하지 않았다. 또한, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32의 화학분류학적 특성으로 16S rDNA을 측정하였고, 그 결과 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32의 16S rDNA 염기서열을 Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST 검색으로 동정한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) 균주는 검색되지 않았고, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) 균주 JCM 2012의 16S rDNA 부분 서열과 99%의 상동성을 보였다.
상기 표 1에 기재된 균주들 중 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57은 그람 염색시 양성을 나타내는 혐기성 간균으로서, 포자를 형성하지 않고 호기적 조건에서 생존성이 매우 낮았다. 또한, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57은 열에 불안정하였다. 또한, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57은 글루코시다제(glucosidase)를 활발하게 생산하였으나, 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)는 생산하지 않았다. 또한, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57의 화학분류학적 특성으로 16S rDNA을 측정하였고, 그 결과 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57의 16S rDNA 염기서열을 Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST 검색으로 동정한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주는 검색되지 않았고, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주 CBT-6의 16S rDNA 부분 서열과 99%의 상동성을 보였다.
또한, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57의 생리학적 특성 중 탄소원 이용성을 API Kit(모델명 : API 50 CHL; 제조사 : BioMerieux’s, USA)에 의한 당 발효 시험으로 분석하였다. 하기 표 2는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 탄소원 이용성 결과를 나타낸 것이고, 하기 표 3은 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32의 탄소원 이용성 결과를 나타낸 것이고, 하기 표 4는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57의 탄소원 이용성 결과를 나타낸 것이다. 하기 표 2, 표 3 및 표 4에서 "+"는 탄소원 이용성이 양성인 경우를 나타내고, "-"는 탄소원 이용성이 음성인 경우를 나타내고, "±"는 탄소원 이용성 여부가 모호한 경우를 나타낸다. 하기 표 2, 표 3 및 표 4에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57은 일부 탄소원에 대해서 동일 종의 균주와 다른 이용성을 보였다.
탄소원 균주명 탄소원 균주명
L. brevis 1 ) L. brevis CH23 L. brevis 1 ) L. brevis CH23
glycerol - - salicin + +
erythritol - - cellobiose + -
D-arabinose - - maltose + +
L-arabinose + - lactose + -
D-ribose + + melibiose - +
D-xylose + + sucrose + -
L-xylose - - trehalose + -
D-adonitol - - inulin + -
methyl-β-D-xylopyranoside - - melezitose + -
D-galactose + - raffinose - -
D-glucose + + starch - -
D-fructose + + glycogen - -
D-mannose + - xylitol - -
L-sorbose - - gentiobiose + -
L-rhamnose - - D-turanose + -
dulcitol + - D-lyxose - -
inositol - - D-tagatose + -
mannitol + - D-fucose - -
sorbitol + - L-fucose - -
α-methyl-D-mannoside - - D-arabitol - -
α-methly-D-glucoside - - L-arabitol - -
N-acetyl-glucosamine + ± gluconate + ±
amygdalin + - 2-keto-gluconate - -
arbutin + - 5-keto-gluconate - +
esculin + +
1) Suriasih K., Aryanta WR, MahardikaG, Astawa NM. Microbiological and Chemical Properties of Kefir Made of Bali Cattle Milk. Food Science and Quality Management 2012;6:112-22.
탄소원 균주명 탄소원 균주명
L. johnsonii 2) L. johnsonii CH32 L. johnsonii 2) L. johnsonii CH32
glycerol - - salicin - -
erythritol - - cellobiose + -
D-arabinose - - maltose - +
L-arabinose - - lactose - +
D-ribose - - melibiose + -
D-xylose - - sucrose + +
L-xylose - - trehalose + -
D-adonitol - - inulin - -
methyl-β-D-xylopyranoside - - melezitose - -
D-galactose - - raffinose + -
D-glucose - + starch - -
D-fructose - + glycogen - -
D-mannose + + xylitol - -
L-sorbose - - gentiobiose - +
L-rhamnose - - D-turanose - -
dulcitol - - D-lyxose - -
inositol - - D-tagatose - -
mannitol - - D-fucose - -
sorbitol - - L-fucose - -
α-methyl-D-mannoside - - D-arabitol - -
α-methly-D-glucoside - - L-arabitol - -
N-acetyl-glucosamine + + gluconate - -
amygdalin - - 2-keto-gluconate - -
arbutin - - 5-keto-gluconate - -
esculin - -
2) Pridmore RD, Berger B, Desiere F, Vilanova D, Barretto C, Pittet AC, Zwahlen MC, Rouvet M, Altermann E, Barrangou R, Mollet B, Mercenier A, Klaenhammer T, Arigoni F, Schell MA. The genome sequence of the probiotic intestinal bacterium Lactobacillus johnsonii NCC 533. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Feb 24;101(8):2512-7
탄소원 균주명 탄소원 균주명
B. longum 3 ) B. longum CH57 B. longum 3 ) B. longum CH57
glycerol ± - salicin ± -
erythritol - - cellobiose ± ±
D-arabinose - - maltose - -
L-arabinose - - lactose - -
D-ribose ± - melibiose - -
D-xylose - - sucrose + ±
L-xylose - - trehalose ± -
D-adonitol - - inulin - -
methyl-β-D-xylopyranoside - - melezitose - -
D-galactose + + raffinose - -
D-glucose + + starch - -
D-fructose + + glycogen - -
D-mannose - - xylitol - -
L-sorbose - - gentiobiose - -
L-rhamnose - - D-turanose - -
dulcitol - - D-lyxose - -
inositol - - D-tagatose - -
mannitol + - D-fucose - -
sorbitol - - L-fucose - -
α-methyl-D-mannoside - - D-arabitol - -
α-methly-D-glucoside - - L-arabitol - -
N-acetyl-glucosamine ± - gluconate ± -
amygdalin - - 2-keto-gluconate - -
arbutin ± - 5-keto-gluconate - -
esculin - -
3) Lukacova D, Karovucova J, Greifova M, Greif G, Sovcikova A, Kohhajdova Z. In vitro testing of selected probiotic characteristics of Lactobacillus plantarum and Bifidobacterium longum. Journal of Food and Nutrition Research 2006; 45: 77-83.
(4) 유산균의 수탁 정보
본 발명의 발명자들은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23을 2015년 9월 1일에 공인기탁기관인 한국미생물보존센터(주소 : 대한민국 서울 서대문구 홍제내 2가길 45 유림빌딩)에 특허기탁 하여 KCCM 11762P의 수탁번호를 부여받았다. 또한, 본 발명의 발명자들은 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32를 2015년 9월 1일에 공인기탁기관인 한국미생물보존센터(주소 : 대한민국 서울 서대문구 홍제내 2가길 45 유림빌딩)에 특허기탁 하여 KCCM 11763P의 수탁번호를 부여받았다. 또한, 본 발명의 발명자들은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57을 2015년 9월 1일에 공인기탁기관인 한국미생물보존센터(주소 : 대한민국 서울 서대문구 홍제내 2가길 45 유림빌딩)에 특허기탁 하여 KCCM 11764P의 수탁번호를 부여받았다.
2. 유산균의 장 손상 또는 장 누수 개선 효능 평가
김치 또는 사람 분변으로부터 분리한 유산균의 장 손상 또는 장 누수 개선 효능을 평가하기 위하여 유산균의 항산화 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성, 장내 유해 효소인 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성 및 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성을 측정하였다.
(1) 실험방법
* 항산화 활성
DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 에탄올에 0.2 mM 농도가 되도록 녹여 DPPH 용액을 제조하였다. 상기 DPPH 용액 0.1 ㎖에 유산균 현탁액(1×108 CFU/㎖) 또는 비타민 C 용액(1 g/㎖)을 넣고 20분간 37℃에서 배양하였다. 배양액을 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이후, 517 ㎚에서 상등액의 흡광도를 측정하고, 유산균의 항산화 활성을 계산하였다.
* 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성
사람의 신선한 분변 0.1 g을 0.9 ㎖의 멸균 생리식염수에 현탁하고, 일반 혐기성 배지로 100배 희석하여 분변 현탁액을 제조하였다. 멸균 일반혐기성배지(일본 Nissui 제약) 9.8 ㎖에 상기 분변 현탁액 0.1 ㎖ 및 유산균(1×104 또는 1×105 CFU) 0.1 ㎖를 이식하고 24시간 동안 혐기적으로 배양하였다. 이후, 배양액을 약 1시간 동안 초음파로 처리하여 균의 세포 외막을 파괴하고, 5000×g의 조건으로 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이후, 상등액에 존재하는 대표적인 내독소인 LPS(lipopolysaccharide)의 함량을 LAL(Limulus Amoebocyte Lysate) assay kit(제조사 : Cape Cod Inc., USA)로 측정하였다. 또한, 유산균의 대장균 증식 억제 활성을 평가하기 위해 동일한 실험을 통해 얻은 배양액을 천배 및 십만배로 희석하고, DHL 배지에 배양한 후 대장균수를 측정하였다.
* 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성
0.1 mM 농도의 p-니트로페닐-β-D-글루쿠로나이드(p-nitrophenyl-β-D-glucuronide) 용액 0.1 ㎖, 50 mM 농도의 인산완충용액 0.2 ㎖ 및 유산균 현탁액(유산균 배양액 5 ㎖를 집균한 후, 생리식염수 5 ㎖에 현탁하여 제조함) 0.1 ㎖를 반응기에 넣고 15분간 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 효소반응을 진행하고, 0.1 mM 농도의 NaOH 용액 0.5 ㎖를 넣어 반응을 정지시켰다. 이후, 반응액을 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이후, 405 ㎚에서 상등액의 흡광도를 측정하였다.
* 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성
한국 세포주 은행에서 분양받은 Caco2 세포를 RPMI 1640 배지에서 48시간 동안 배양한 후, Caco2 세포 배양액을 12-well 플레이트에 웰 당 2×106 cells의 양이 되도록 분주하였다. 이후, 각 웰에 LPS(lipopolysaccharide) 1 ㎍을 단독으로 처리하거나 LPS(lipopolysaccharide) 1 ㎍과 유산균 1×103 CFU를 같이 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후, 각 웰로부터 배양된 세포들을 긁어 모으고 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 밀착연접단백질(tight junction protein) ZO-1의 발현량을 측정하였다.
(2) 실험결과
김치 또는 사람 분변으로부터 분리한 유산균의 항산화 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성, 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성 및 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성을 측정하고, 그 결과를 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다. 하기 표 5 및 표 6에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) CH5, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CH11, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(Bifidobacterium pseudocatenulatum) CH38 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57 유산균은 항산화 활성이 우수하고, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 및 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 활성을 강하게 저해하였고, 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현을 강하게 유도하였다. 상기 유산균들은 항산화 효과, 염증발현 및 발암과 관련있는 장내세균총의 유해균 효소활성 억제 효과가 우수하고, 장내세균총의 유해균이 생산하는 내독소인 LPS(lipopolysaccharide)의 생성을 억제할 뿐만 아니라 밀착연접단백질(tight junction protein)의 발현을 유도하므로 장 누수 증후군(Intestinal permeability)을 개선시킬 수 있다.
관리번호 균주명 항산화 활성 베타-글루쿠로니다제 저해 활성 LPS 생성 억제 활성 밀착연접단백질 발현 유도 활성
1 Lactobacillus acidophilus CH1 + + - -
2 Lactobacillus acidophilus CH2 + + + -
3 Lactobacillus acidophilus CH3 + + + -
4 Lactobacillus brevis CH4 + + - -
5 Lactobacillus curvatus CH5 +++ + +++ ++
6 Lactobacillus brevis CH6 + + - -
7 Lactobacillus casei CH7 + + - -
8 Lactobacillus planantrum CH8 + + - -
9 Lactobacillus sakei CH9 - + - -
10 Lactobacillus curvatus CH10 - + - -
11 Lactobacillus sakei CH11 +++ + +++ ++
12 Lactobacillus curvatus CH12 - + - +
13 Lactobacillus plantarum CH13 - + - -
14 Lactobacillus fermentum CH14 - + - -
15 Lactobacillus fermentum CH15 +++ + ++ -
16 Lactobacillus gasseri CH16 + + - -
17 Lactobacillus paracasei CH17 + + - -
18 Lactobacillus helveticus CH18 + + - -
19 Lactobacillus helveticus CH19 + + - -
20 Lactobacillus johnsonii CH20 + + - +
21 Lactobacillus johnsonii CH21 + + - +
22 Lactobacillus johnsonii CH22 + + - +
23 Lactobacillus brevis CH23 +++ + ++ ++
24 Lactobacillus paracasei CH24 + + - -
25 Lactobacillus kimchi CH25 + + - -
26 Lactobacillus gasseri CH26 + + - -
27 Lactobacillus paracasei CH27 + + - +
28 Lactobacillus pentosus CH28 + + - -
29 Lactobacillus pentosus CH29 + + - -
30 Lactobacillus reuteri CH30 + - - -
호명관리번호 균주명 항산화 활성 베타-글루쿠로니다제 저해 활성 LPS 생성 억제 활성 밀착연접단백질 발현 유도 활성
31 Lactobacillus sakei CH31 - + - +
32 Lactobacillus johnsonii CH32 +++ + ++ ++
33 Lactobacillus sakei CH33 + + - +
34 Lactobacillus sakei CH34 + + - +
35 Lactobacillus plantarum CH35 + + + +
36 Lactobacillus sanfranciscensis CH36 + + + +
37 Bifidobacterium pseudocatenulatum CH37 - + - +
38 Bifidobacterium pseudocatenulatum CH38 +++ + ++ ++
39 Bifidobacterium adolescentis CH39 - + - +
40 Bifidobacterium adolescentis CH40 - + +++ +
41 Bifidobacterium adolescentis CH41 + + - +
42 Bifidobacterium animalis CH42 + + - -
43 Bifidobacterium animalis CH43 + + - -
44 Bifidobacterium bifidum CH44 + + - -
45 Bifidobacterium bifidum CH45 + + - -
46 Bifidobacterium breve CH46 + - - -
47 Bifidobacterium breve CH47 + + - +
48 Bifidobacterium breve CH48 + + - +
49 Bifidobacterium catenulatum CH49 + + - ++
50 Bifidobacterium catenulatum CH50 - + - -
51 Bifidobacterium dentium CH51 + - - -
52 Bifidobacterium infantis CH52 - + - -
53 Bifidobacterium infantis CH53 - + - -
54 Bifidobacterium infantis CH54 + + - -
55 Bifidobacterium longum CH55 + + - +
56 Bifidobacterium longum CH56 +++ + ++ +
57 Bifidobacterium longum CH57 +++ + +++ ++
58 Bifidobacterium longum CH58 + + + +
59 Bifidobacterium longum CH59 + + + +
60 Bifidobacterium longum CH60 + - + +
* 항산화 활성 측정시 유산균의 최종 농도 : 1×104 CFU/㎖; 베타-글루쿠로니다제 저해 활성 및 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성 측정시 유산균의 이식 농도 : 1×104 CFU/㎖; 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성 측정시 유산균 농도 : 1×104 CFU/㎖
* 유산균의 다양한 활성 측정시 기준 : very strongly (+++; >90%); strongly (++; >60-90%); weakly (+; >20-60%); not or less than 20%(-; <20%)
3. 유산균의 간 손상 개선 효과 평가
유산균의 장 손상 또는 장 누수 개선 효능 평가를 통해 총 7개의 균주인 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) CH5, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CH11, 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum) CH15, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(Bifidobacterium pseudocatenulatum) CH38 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57을 선별하고, 이들 단독 또는 혼합 유산균의 간 손상 개선 효과를 다양한 간 손상 모델동물을 이용하여 평가하였다.
(1) D-갈락토스아민(D-Galactosamine)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물 실험을 통한 유산균의 간 손상 개선 효과 측정
1) 실험방법
생쥐(C57BL/6, 웅성) 6마리를 한 군으로 하여, 정상군을 제외한 나머지 군의 실험동물에 D-갈락토스아민(D-Galactosamine)을 800 ㎎/㎏의 용량으로 복강투여 하여 간 손상을 유발하였다. D-갈락토스아민(D-Galactosamine)을 복강투여하고 2시간 후부터 정상군과 음성 대조군을 제외한 나머지 군의 실험동물에 유산균을 1×109 CFU의 양으로 하루 1회씩 3일간 경구투여하였다. 또한, 양성 대조군의 실험동물에는 유산균 대신 실리마린(silymarin)을 100 ㎎/㎏의 양으로 하루 1회씩 3일간 경구투여하였다. 약물을 마지막으로 투여하고 6시간 후에 심장채혈 하였다. 채취한 혈액을 상온에서 60분간 방치하고 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청의 GPT(glutamic pyruvate transaminase)와 GOT(glutamic oxalacetic transaminase)를 혈액분석 키트((ALT & AST 측정 키트; Asan Pharm. Co., 대한민국)를 이용하여 측정하였다.
또한, 실험동물의 간 조직을 적출하고 간 조직 내에 존재하는 말론다이알데하이드(malondialdehyde, MDA)의 양을 측정하였다. 말론다이알데하이드(malondialdehyde)는 지질과산화의 지표 물질이다. 구체적으로, 적출한 간 조직 0.5 g에 16배 용량의 RIPA 용액(0.21M Mannitol, 0.1M EDTA-2Na, 0.07M Sucrose, 0.01M Trizma base)을 가한 다음 호모게나이저(homogenizer)를 사용하여 균질화 하였다. 균질액을 다시 3,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 간 호모게네이트(liver homogenate)를 수득하였다. 간 호모게네이트(liver homogenate) 0.5 ㎖에 10% SDS 0.4 ㎖를 가하고 30분간 37℃에서 배양하고, 식힌 다음, 1% phosphate buffer 3 ㎖와 0.6% TBA 1 ㎖를 가하고 100℃의 수욕 상에서 45분간 가열하여 발색시켰다. 발색된 시료액에 n-butanol 4 ㎖를 가하고 혼합한 뒤, 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 수득한 상등액의 흡광도를 535 ㎚에서 측정하여 MDA를 정량하였다. 또한, MDA 측정을 위한 검량선은 1,1,3,3-tetraethoxypropane을 사용하여 작성하였다.
2) 실험결과
도 1은 D-갈락토스아민(D-Galactosamine)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때 GOT 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 2는 D-갈락토스아민(D-Galactosamine)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때 GPT 값의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 3은 D-갈락토스아민(D-Galactosamine)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때 MDA 값의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 1 내지 도 3에서 X축의 "Nor"은 정상군을 나타내고, "Con"은 D-갈락토스아민(D-Galactosamine)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물에 별도의 약물을 투여하지 않은 음성 대조군을 나타내고, "ch11"은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CH11 투여군을 나타내고, "ch15"는 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum) CH15 투여군을 나타내고, "ch23"은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23 투여군을 나타내고, "ch32"는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32 투여군을 나타내고, "ch38"은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(Bifidobacterium pseudocatenulatum) CH38 투여군을 나타내고, "ch57"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57 투여군을 나타내고, "ch57+ch11"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CH11을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균의 투여군을 나타내고, "ch57+ch23"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균의 투여군을 나타내고, "ch57+ch32"는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32를 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균의 투여군을 나타내고, "SM"은 유산균 대신 실리마린(silymarin)을 투여한 양성 대조군을 나타낸다.
도 1 내지 도 3에서 보이는 바와 같이 간 손상에 의해 GOT, GPT, MAD 값이 상승한 모델동물에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57을 투여하는 경우 간 손상이 개선되었고, 특히, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32의 혼합 유산균을 투여하는 경우 간 손상이 크게 개선되었다. 또한, 특정 유산균들 또는 이들에서 선택된 혼합 유산균은 간 손상 치료 약물로 사용되는 실리마린(silymarin)보다 간 손상 개선 효과가 더 우수하였다. 상기 결과로부터 특정 유산균들 또는 이들에서 선택된 혼합 유산균이 알코올 및 고지방식이에 의해 유도되는 지방간을 개선하거나 산화적 스트레스로부터 오는 간 질환을 개선하는데에 유용한 소재임을 알 수 있다.
(2) Tert-부틸퍼옥사이드(Tert-butylperoxide)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물 실험을 통한 유산균의 간 손상 개선 효과 측정
1) 실험방법
생쥐(C57BL/6, 웅성) 6마리를 한 군으로 하여, 정상군을 제외한 나머지 군의 실험동물에 Tert-부틸퍼옥사이드(Tert-butylperoxide)를 2.5 mmol/㎏의 용량으로 복강투여 하여 간 손상을 유발하였다. Tert-부틸퍼옥사이드(Tert-butylperoxide)를 투여하고 2시간 후부터 정상군과 음성 대조군을 제외한 나머지 군의 실험동물에 유산균을 2×109 CFU의 양으로 하루 1회씩 3일간 경구투여하였다. 또한, 양성 대조군의 실험동물에는 유산균 대신 실리마린(silymarin)을 100 ㎎/㎏의 양으로 하루 1회씩 3일간 경구투여하였다. 약물을 마지막으로 투여하고 6시간 후에 심장채혈 하였다. 채취한 혈액을 상온에서 60분간 방치하고 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청의 GPT(glutamic pyruvate transaminase)와 GOT(glutamic oxalacetic transaminase)를 혈액분석 키트((ALT & AST 측정 키트; Asan Pharm. Co., 대한민국)를 이용하여 측정하였다.
2) 실험결과
하기 표 7은 Tert-부틸퍼옥사이드(Tert-butylperoxide)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때 GOT, GPT 값의 변화를 나타낸 것이다. 하기 표 7에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57은 실리마린(silymarin)보다 우수한 간 손상 개선 효과를 보였고, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32의 혼합 유산균은 간 손상 개선 효과가 더 우수하였다.
실험군 GOT(IU/L) GPT(IU/L)
정상군 36.1 26.3
음성 대조준 84.1 96.1
CH23 투여군 58.0 74.2
CH32 투여군 53.0 70.5
CH57 투여군 57.6 71.2
CH57+CH23 투여군 48.6 64.3
CH57+CH32 투여군 51.2 68.4
실리마린(silymarin) 투여군 61.7 69.1
상기 표 7에서 "CH23"은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23을 나타내고, "CH32"는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32를 나타내고 "CH57"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57을 나타내고, "CH57+CH23"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 나타내고, "CH57+CH32"는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32를 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 나타낸다.
4. 유산균의 알러지 개선 효과 평가
(1) 유산균의 탈과립 저해율 측정
RBL-2H3 세포주(rat mast cell line, 한국세포주은행, Cat. No.22256)를 10% FBS(fetal bovine serum)과 L-글루타민을 포함하는 DMEM(Dulbeccos' modified Eagle's medium, Sigma사, 22256)을 이용하여 37℃, 가습화된(humidified) 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양액에 포함된 세포들을 트립신-EDTA 용액을 사용하여 부유시키고, 분리 및 회수하여 실험에 사용하였다. 회수된 RBL-2H3 세포들을 24-웰 플레이트에 웰 당 5×105 cells의 양이 되도록 분주한 후, 마우스 단클론성 IgE 0.5 ㎍/㎖를 넣고 12시간 동안 배양시키며 감작화(sensitization) 시켰다. 감작화된 세포들을 0.5 ㎖의 시라가니안 완충액(siraganian buffer; 119mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2, 25mM PIPES, 40mM NaOH, pH 7.2)으로 세척한 후에 다시 0.16 ㎖의 시라가니안 완충액(5.6mM 포도당, 1mM CaCl2, 0.1% BSA를 첨가)을 넣고 37℃에서 10분간 배양하였다. 이후, 세포 배양액에 시험약물인 유산균을 1×104 CFU/㎖의 농도가 되도록 첨가하거나 대조약물인 DSCG(disodium cromoglycate) 0.04 ㎖를 첨가한 다음 20분이 경과되었을 때 0.02 ㎖의 항원(DNP-BSA 1㎍/ml)으로 37℃에서 10분간 세포들을 활성화시켰다. 이후, 세포 배양액을 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 수득한 상등액 0.025 ㎖를 96-웰 플레이트로 옮기고, 기질액인 1mM p-NAG(0.1M 시트레이트 완충액에 p-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코스아미니드를 pH 4.5로 녹인 용액) 0.025 ㎖를 가한 후, 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이후, 0.1M Na2CO3/NaHCO3 0.2 ㎖를 반응액에 첨가하여 반응을 정지시키고 405 ㎚에서 ELISA 분석기로 흡광도를 측정하였다.
(2) 유산균의 소양 반응 저해율 측정
BALB/c 마우스 5마리를 한 군으로 하여, 정상군과 대조군을 제외한 나머지 실험군에 시험약물인 유산균을 1×109 CFU의 양으로 하루 1회씩 3일간 경구투여하거나 대조약물인 DSCG(disodium cromoglycate) 또는 Azelastine을 0.2 ㎎/mouse의 양으로 1회씩 3일간 경구투여하였다. 약물을 마지막으로 경구투여하고 1시간이 지난 후에 마우스를 관찰상자(24㎝×22㎝×24㎝)에 10분간 방치하여 환경에 순화시킨 뒤 머리뒷부분(경부배면)의 털을 제거하였다. 이후, 정상군 마우스에는 생리식염수를 주사하고, 다른 실험군 마우스에는 29 게이지 바늘을 이용하여 소양 유도제(50 ㎍의 compound 48/80; 시그마사, 미국)를 주사하였다. 이후, 마우스를 즉시 관찰상자에 한 마리씩 격리시킨 뒤 무인조건 하에서 8-㎜ 비디오 카메라(SV-K80, Samsung)로 1시간 녹화하여 소양행동을 관찰하였다. 소양행동은 뒷발로 주사부위를 긁는 행위를 인정하였으며, 그 이외 부분은 인정하지 않았다.
(3) 유산균의 모세혈관 투과성 저해율 측정
소양 유발 부위에서는 모세혈관 투과성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 다양한 화합물에 의해서 유발되는 모세혈관 투과성을 본 발명에 따른 유산균이 효율적으로 저해할 수 있는지를 알아보기 위해 수행되었다. 앞의 소양 반응 억제 활성 측정 실험과 같은 방법으로 동일한 마우스에 같은 방법으로 약물을 투여하였다. 이후, 정상군 마우스의 경부배면 부위에는 생리식염수를 피하주사하고, 다른 실험군 마우스의 경부배면 부위에는 소양 유도제(50 ㎍의 compound 48/80; 시그마사, 미국)를 피하주사 하였다. 이후, 1% Evans blue 용액(시그마사, 미국) 0.2 ㎖를 미정맥으로 투여하고 1 시간 후에 마우스를 치사시켰다. 이후, 피하주사 부위의 피부를 절개하여 1N KOH 1 ㎖에 넣은 뒤, 37℃에서 익일 반응시킨 다음, 0.6N 인산-아세톤(5:13) 혼합용액 4 ㎖를 첨가하여 혼합한 뒤, 3000 rpm에서 15 분간 원심분리한 다음, 상등액을 취하여 620 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 모세혈관 투과성 저해율(%)은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
저해율 (%) = {1- [약물 및 소양 유도제 처리한 부위의 흡광도 - 소양 유도제 처리하지 않은 부위의 흡광도]/[소양 유도제 처리한 부위의 흡광도 - 소양 유도제 처리하지 않은 부위의 흡광도]} ×100
(4) 실험결과
하기 표 8은 유산균의 탈과립 저해율, 소양 반응 저해율 및 모세혈관 투과성 저해율을 측정한 결과이다. 하기 표 8에서 "CH5"는 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) CH5를 나타내고, "CH11"은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CH11을 나타내고, "CH15"는 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum) CH15를 나타내고, "CH23"은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23을 나타내고, "CH32"는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32를 나타내고, "CH38"은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(Bifidobacterium pseudocatenulatum) CH38을 나타내고, "CH57"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57을 나타내고, "CH57+CH11"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CH11을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 나타내고, "CH57+CH23"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 나타내고, "CH57+CH32"는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32를 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 나타낸다.
표 8에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus) CH5, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23, 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57은 호염구의 탈과립을 효과적으로 억제하였고, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57은 소양 반응과 모세혈관 투과성을 매우 강하게 저해하였다. 또한, 단독 유산균보다는 이들의 혼합 유산균, 특히 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32의 혼합 유산균에서 더 높은 탈과립 저해율, 소양 반응 저해율 및 모세혈관 투과성 저해율을 보였다. 따라서, 상기 유산균 또는 유산균 혼합물은 알러지로부터 유발되는 아토피, 천식, 인후염 또는 만성 피부염 등을 매우 효과적으로 개선할 수 있다.
처리 약물 저해율(%)
탈과립 소양 반응 모세혈관 투과성
없음 0 2 1
CH5 53 46 45
CH11 47 46 45
CH15 48 42 42
CH23 54 47 47
CH32 52 45 46
CH38 44 45 42
CH57 55 55 52
CH57+CH11 59 56 54
CH57+CH23 63 62 61
CH57+CH32 61 58 56
DSCG(disodium cromoglycate) 62 25 37
Azelastine - 65 68
5. 유산균의 항염 및 장 누수 억제 효과 평가(in vitro)
(1) 수지상 세포의 분리 및 염증 지표 측정
C57BL/6 생쥐(male, 20-23 g)의 골수에서 10% FBS, 1% antibiotics, 1% glutamax, 0.1% mercaptoethanol을 함유한 RPMI 1640을 이용하여 면역세포들을 분리하고, RBC lysis buffer를 처리하고, 세척한 후, 24웰-플레이트의 각 웰에 분주하고 GM-CSF 및 IL-4를 1:1000의 비율로 처리하고 배양하였다. 배양 5일째 되는 날에 새로운 배지로 교환해주고, 8일째 되는 날에 수거하여 수지상 세포로 사용하였다. 이후, 24-well 플레이트에 수지상 세포를 각 well당 0.5×106의 수로 깔고, 시험 물질인 유산균과 염증 반응 유도 물질인 LPS(lipopolysaccharide)를 2시간 또는 24시간 동안 처리한 후 상등액 및 세포를 수득하였다. 수득한 상등액으로부터 IL-10, IL-12의 발현량을 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 측정하였다.
도 4는 본 발명에서 선별한 유산균들이 LPS(lipopolysaccharide)로 유도된 수지상 세포의 염증 반응에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 도 4에서 왼쪽의 그래프는 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하지 않은 세포에 유산균들이 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 오른쪽의 그래프는 LPS(lipopolysaccharide)를 처리한 세포에 유산균들이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 또한, 도 4에서 X축의 "Nor"은 시험 물질인 유산균 및 염증 반응 유도 물질인 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하지 않은 경우를 나타내고, "LPS"는 염증 반응 유도 물질인 LPS(lipopolysaccharide)를 처리한 경우를 나타내고, "ch11"은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CH11 처리군을 나타내고, "ch15"는 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum) CH15 처리군을 나타내고, "ch23"은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23 처리군을 나타내고, "ch32"는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32 처리군을 나타내고, "ch38"은 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(Bifidobacterium pseudocatenulatum) CH38 처리군을 나타내고, "ch57"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57 처리군을 나타내고, "ch57+ch11"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CH11을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균의 처리군을 나타내고, "ch57+ch23"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균의 처리군을 나타내고, "ch57+ch32"는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32를 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균의 처리군을 나타낸다.
도 4에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) CH11, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23 및 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32는 골수에서 분리하여 분화시킨 수지상 세포의 IL-10 생산을 유도하고, LPS(lipopolysaccharide)에 의해 유도된 IL-12의 생산을 효과적으로 억제하였으며, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과의 병용에 의해 그 효과는 증가하였다. 특히, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균은 염증 반응 억제 효과가 가장 우수하였다. 수지상 세포를 제어하는 경우 Treg 세포(Regulatory T cell)를 효율적으로 제어할 수 있기 때문에, 본 발명에서 선별한 유산균들은 대장염과 같은 만성염증 질환, 류마티스성 관절염과 같은 자가면역질환 등을 효과적으로 개선할 수 있다.
(2) 대식세포의 분리와 염증 지표 측정
6주령 C57BL/6J 수컷 생쥐(20-23g)를 라운바이오㈜로부터 구입하였다. 생쥐의 복강에 멸균된 4% thioglycolate 2 ㎖를 투여하고, 96시간이 지난 뒤에 생쥐를 마취시키고, 다시 생쥐 복강에 RPMI 1640 배지 8 ㎖를 투여하고 5~10분이 지난 뒤에 생쥐 복강 내의 RPMI 배지(대식세포를 포함)를 다시 뽑아내고 1000 rpm의 조건에서 10분간 원심분리하고 다시 RPMI 1640 배지로 2회 세척하였다. 24-well 플레이트에 대식세포를 각 well당 0.5×106의 수로 깔고, 시험 물질인 유산균과 염증 반응 유도 물질인 LPS(lipopolysaccharide)를 2시간 또는 24시간 동안 처리한 후 상등액 및 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 buffer(Gibco사)에 넣고 균질화 하였다. 수득한 상등액으로부터 TNF-α, IL-1β와 같은 사이토카인의 발현량을 ELISA kit로 측정하였다. 또한, 수득한 세포로부터 p65(NF-카파B), p-p65(phosphor-NF-카파B) 및 β-actin의 발현량을 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 측정하였다. 구체적으로 상등액 50㎍을 취해 SDS 10%(w/v) polyacrylamide gel에서 1시간 30분간 전기영동을 하였다. 전기영동한 샘플을 니트로셀룰로스지에 100V, 400㎃의 조건에서 1시간 10분간 트랜스퍼(transfer) 하였다. 샘플이 트랜스퍼된 니트로셀로로스지를 5% skim milk로 30분간 blocking 한 후, 5분씩 3회에 걸쳐 PBS-Tween으로 세척하고, 1차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:100의 비율로 하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 2차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:1000의 비율로 하여 1시간 20분간 반응시켰다. 이후, 15분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 형광발색 시킨 후 현상하였다.
도 5는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57이 LPS(lipopolysaccharide)로 유도된 대식세포(macrophage)의 염증 반응에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 도 5에서 보이는 바와 같이 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57은 LPS(lipopolysaccharide)로 유도된 염증 반응을 효과적으로 억제하였다.
(3) 비장으로부터 T 세포의 분리와 Th17 세포 또는 Treg 세포로의 분화능 측정
C56BL/6J 생쥐의 비장을 분리하고, 적당하고 분쇄하고, 10% FCS 함유 RPMI 1640 배제에 현탁하고 CD4 T cell isolation kit(MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일)를 사용하여 CD4 T 세포를 분리하였다. 분리한 CD4 T 세포를 12-웰 플레이트에 각 웰당 5×105 수로 분주하고, 여기에 anti-CD3(1 ㎍/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일) 및 anti-CD28(1 ㎍/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일)을 넣거나, anti-CD3(1 ㎍/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일), anti-CD28(1 ㎍/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일), recombinant IL-6(20 ng/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일) 및 recombinant transforming growth factor beta(1 ng/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일)를 넣고 세포를 배양하면서 유산균을 웰당 1×103 또는 1×105 CFU의 양으로 넣고 4일간 배양하였다. 이후, 배양액의 세포를 anti-FoxP3 또는 anti-IL-17A 항체로 염색하고 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 장치(C6 Flow Cytometer® System, San Jose, CA, USA)를 이용하여 Th17, Treg의 분포를 분석하였다.
도 6은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23이 비장에서 분리된 T 세포의 Th17 세포 또는 Treg 세포로의 분화에 미치는 영향을 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 장치로 분석한 결과이다. 도 6에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23은 T 세포의 Th17 세포(T helper 17 cell)로의 분화를 저해하고 Treg 세포로의 분화를 촉진하였다. 상기 결과에 의할 때 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23은 대장염, 관절염과 같은 염증 질환을 효과적으로 개선할 수 있다.
(4) CaCO2 세포의 ZO-1 단백질 발현에 대한 유산균의 효과 측정
한국 세포주 은행에서 분양받은 Caco2 세포를 RPMI 1640 배지에서 48시간 동안 배양한 후, Caco2 세포 배양액을 12-well 플레이트에 웰 당 2×106 cells의 양이 되도록 분주하였다. 이후, 각 웰에 LPS(lipopolysaccharide) 1 ㎍을 단독으로 처리하거나 LPS(lipopolysaccharide) 1 ㎍과 유산균 1×103 CFU 또는 1×105 CFU를 같이 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후, 각 웰로부터 배양된 세포들을 긁어 모으고 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 밀착연접단백질(tight junction protein) ZO-1의 발현량을 측정하였다.
도 7은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57 또는 이들의 혼합 유산균이 CaCO2 세포의 ZO-1 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 도 7에서 "CH23"은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23을 나타내고, "CH57"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57을 나타내고, "mix"는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32를 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 나타낸다. 도 7에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57을 처리하는 경우 밀착연접단백질(tight junction protein) ZO-1의 발현이 증가하였고, 피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) CH32의 혼합 유산균을 처리하는 경우 밀착연접단백질(tight junction protein) ZO-1의 발현이 상승적으로 증가하였다. 밀착연접단백질의 발현이 증가하는 경우 독성물질이 체내로 유입되는 것을 차단하여 대장염, 관절염, 간 손상의 악화를 막을 수 있다.
6. 유산균의 항염 및 대장염 개선 효과 평가(in vivo )
(1) 실험동물
5주령 C57BL/6 수컷 생쥐(24-27g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하고, 습도 50±10%, 온도 25±2℃, 조명은 12시간 킨 후 12시간 끄는 것을 반복하는 조절된 환경 조건에서 일주일 동안 사육한 후 실험에 사용하였다. 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험에서 한 군은 6마리로 하였다.
(2) TNBS에 의한 대장염 유발 및 시료 투여
실험동물 중 한 군을 정상군으로 하고, 나머지 군의 실험동물에 대해서는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)으로 급성 대장염을 유발하였다. 구체적으로 실험동물을 가볍게 에테르로 마취한 후 TNBS(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) 용액 2.5g을 50% 에탄올 100㎖에 혼합한 용액을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1㎖씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 염증을 유발하였다. 반면, 정상군에는 생리식염수 0.1㎖를 경구투여하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 3일간 시험시료인 유산균 또는 혼합 유산균을 생리식염수에 현탁하여 2.0×109 CFU의 양으로 경구투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 실험동물을 이산화탄소로 질식시켜 죽이고 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하여 사용하였다. 또한, 정상군의 실험동물에는 유산균 대신 생리식염수만을 경구투여하였다. 또한, 음성 대조군의 실험동물에도 TNBS에 의한 대장염 유발 후 유산균 대신 생리식염수만을 경구투여하였다. 또한, 양성 대조군의 실험동물에는 유산균 대신 대장염 치료 약물인 설파살라진(sulfasalazine)을 50 ㎎/㎏의 양으로 경구투여하였다.
(3) 대장의 외관 분석
적출한 대장의 길이와 외관을 관찰하고 하기 표 9의 기준(Hollenbach 등, 2005 대장염 정도에 대한 기준)에 따라 점수로 매겨 외관 분석을 하였다. 대장 조직은 대장 내용물을 모두 제거하고, 생리 식염수에 세척한 후 일부는 병리조직용 샘플로 사용하기 위해 4% 포름알데히드 고정액으로 고정하였으며, 나머지는 분자생물학적 분석을 위해 영하 80℃에서 냉동보관하면서 사용하였다.
외관 점수(Macroscopic Score) 기준
0 어떠한 궤양과 염증도 발견되지 않음
1 출혈이 없는 충혈이 발견됨
2 충혈이 있는 궤양이 발견됨
3 한 곳에서만 궤양과 염증이 발견됨
4 궤양과 염증이 2곳 이상에서 발견됨
5 궤양이 2㎝ 이상으로 확대되어 있음
(4) 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
대장조직 100㎎에 0.5% hexadecyl trimethyl ammonium bromide 함유 10 mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 200㎕를 넣고 균질화(homogenization) 하였다. 이후, 4℃ 및 10,000×g의 조건에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액 50 ㎕를 0.95 ㎖ 의 반응액(1.6mM tetramethyl benzidine과 0.1mM H2O2 함유)에 넣고 37℃에서 반응시키면서 650 ㎚에서 경시적으로 흡광도를 측정하였다. 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성은 반응물로서 생긴 peroxide 1 μmol/㎖를 1 unit로 계산하였다.
(5) 염증 지표 측정
웨스턴블롯팅 방법을 이용하여 p-p65, p65, iNOS, COX-2, β-actin 과 같은 염증 반응 지표 물질을 측정하였다. 구체적으로, 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정 실험과 동일한 방법으로 상등액을 얻었다. 이후, 상등액 50㎍을 취해 SDS 10%(w/v) polyacrylamide gel에서 1시간 30분간 전기영동을 하였다. 전기영동한 샘플을 니트로셀룰로스지에 100V, 400㎃의 조건에서 1시간 10분간 트랜스퍼(transfer) 하였다. 샘플이 트랜스퍼된 니트로셀로로스지를 5% skim milk로 30분간 blocking 한 후, 5분씩 3회에 걸쳐 PBS-Tween으로 세척하고, 1차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:100의 비율로 하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 2차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:1000의 비율로 하여 1시간 20분간 반응시켰다. 이후, 15분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 형광발색 시킨 후 현상하였다.
또한, ELISA kit를 이용하여 TNF-α, IL-1β 등과 같은 염증 관련 사이토카인을 측정하였다.
(6) 실험결과
도 8은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57이 미치는 영향을 대장의 외관 또는 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 등으로 나타낸 것이고, 도 9는 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57이 미치는 영향을 대장의 조직학적 사진으로 나타낸 것이며, 도 10은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57이 미치는 영향을 염증 관련 사이토카인 등으로 나타낸 것이다. 도 8 내지 도 10에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "TNBS"는 음성 대조군을 나타내고, "CH57"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57 투여군을 나타내고, "SS50"은 설파살라진(sulfasalazine) 투여군을 나타낸다. 도 8 내지 도 10에서 보이는 바와 같이 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 체중, 대장염 지표, 대장 길이, 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 등에 기초할 때 대장염을 효과적으로 개선하는 것으로 나타났고, 설파살라진보다 개선 효과가 더 우수한 것으로 나타났다. 또한, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 염증성 사이토카인 생산을 억제하고 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생산을 증가시켰다.
도 11은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23이 미치는 영향을 대장의 외관 또는 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 등으로 나타낸 것이고, 도 12는 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23이 미치는 영향을 대장의 조직학적 사진으로 나타낸 것이며, 도 13은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23이 미치는 영향을 T 세포의 분화 양상으로 나타낸 것이고, 도 14는 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23이 미치는 영향을 염증 관련 사이토카인 등으로 나타낸 것이다. 도 11 내지 도 14에서 "N"은 정상군을 나타내고, "TNBS"는 음성 대조군을 나타내고, "CH23"은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23 투여군을 나타내고, "SS"는 설파살라진(sulfasalazine) 투여군을 나타낸다. 도 11 내지 도 14에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 체중, 대장염 지표, 대장 길이, 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 등에 기초할 때 대장염을 효과적으로 개선하는 것으로 나타났고, 설파살라진보다 개선 효과가 더 우수한 것으로 나타났다. 또한, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 억제하고 Treg 세포로의 분화를 유도하였다. 또한, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 염증성 사이토카인 생산을 억제하고 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생산을 증가시켰다.
도 15는 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 대장의 외관 또는 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 등으로 나타낸 것이고, 도 16은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 대장의 조직학적 사진으로 나타낸 것이며, 도 17은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 염증 관련 사이토카인 등으로 나타낸 것이다. 도 15 내지 도 17에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "TNBS"는 음성 대조군을 나타내고, "BL"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균의 투여군을 나타내고, "SS50"은 설파살라진(sulfasalazine) 투여군을 나타낸다. 도 15 내지 도 17에서 보이는 바와 같이 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 감소된 체중, 증가한 대장염 지표, 짧아진 대장 길이, 증가한 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성을 크게 개선하였고 설파살라진보다 대장염 개선 효과가 훨씬 우수한 것으로 나타났다. 또한, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 염증성 사이토카인 생산을 크게 억제하고 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생산을 극적으로 증가시켰다.
7. 유산균의 비만 개선 및 항염 효과 평가(in vivo )
(1) 실험방법
C57BL6/J 마우스를 라운바이오㈜에서 구입하고 총 24 마리를 온도 20±2 ℃, 습도 50±10 %, 12 hr light/12 hr dark cycle의 조건 아래 chow diet (Purina)로 1 주일간 적응시켰다. 이후, 실험동물을 8마리씩 3개의 군(LFD, HFD, HFD+BL)으로 나누어, LFD 군에는 4주간 정상식이(LFD, 10% of calories from fat; Research, NJ, USA)를 공급하였고 HFD 군 및 HFD+BL 군에는 4주간 고지방식이(HFD, 60% of calories from; Research, NJ, USA)를 공급하였다. 그 다음 LFD 군에는 4주간 정상식이를 공급함과 동시에 PBS를 경구투여 하였다. 또한, HFD 군에는 4주간 고지방식이를 공급함과 동시에 PBS를 경구투여 하였다. 또한, HFD+BL 군에는 4주간 고지방식이를 공급함과 동시에 혼합 유산균을 PBS에 현탁하여 2×109 CFU의 양으로 경구투여 하였다. 혼합 유산균은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23을 동량으로 혼합하여 제조한 것이다.
(2) 혼합 유산균의 항비만 효과 및 항염 효과 분석
혼합 유산규의 항비만 효과는 체중 변화를 통해 분석하였다. 또한, 혼합 유산균의 항염 효과는 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물 실험에서 측정한 방법과 동일한 방법을 사용하여 분석하였다.
(3) 실험결과
도 18은 비만 유도 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 체중 변화량 등으로 나타낸 것이고, 도 19는 비만 유도 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 대장의 외관, 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성, 대장의 조직학적 사진 등으로 나타낸 것이고, 도 20은 비만 유도 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 염증 관련 사이토카인 등으로 나타낸 것이고, 도 21은 비만 유도 모델동물에 대해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균이 미치는 영향을 염증 반응 지표 물질 등으로 나타낸 것이다. 도 18 내지 도 21에서 보이는 바와 같이 고지방식이에 의한 비만이 유도된 모델동물의 증가한 체중, 증가한 대장염 지표, 증가한 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성을 크게 감소시켰고 대장염의 발생을 억제하였다. 또한, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23의 혼합 유산균은 고지방식이에 의해 비만이 유도된 모델동물에 대해 염증성 사이토카인 생산을 크게 억제하고 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생산을 증가시켰다.
Ⅱ. 유산균 선별 및 효능 확인을 위한 2차 실험
1. 유산균의 분리 및 동정
(1) 김치로부터 유산균의 분리
배추 김치, 무 김치 및 파김치를 각각 파쇄하고, 파쇄액을 MRS 액체 배지(MRS Broth; Difco, USA)에 넣고 현탁하였다. 이후, 상등액을 취해 MRS 한천 배지(MRS agar medium; Difco, USA)에 이식하고 37℃에서 약 48시간 동안 혐기적으로 배양한 후, 콜로니(colony)를 형성한 균주들을 모양에 따라 분리하였다.
(2) 사람 분변으로부터 유산균의 분리
사람 분변을 GAM 액체 배지(GAM broth; Nissui Pharmaceutical, Japan)에 넣고 현탁하였다. 이후, 상등액을 취해 BL 한천 배지(BL agar medium; Nissui Pharmaceutical, Japan)에 이식하고 37℃에서 약 48시간 동안 혐기적으로 배양한 후, 콜로니(colony)를 형성한 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주들을 분리하였다.
(3) 선별한 유산균의 동정
김치 또는 사람 분변으로부터 분리한 균주들의 그람 염색, 생리학적 특성 및 16S rDNA 서열을 분석하여 균주의 종을 확정하고, 균주명을 부여하였다. 하기 표 10은 배추 김치, 무 김치 및 파 김치에서 분리된 유산균의 관리번호 및 균주명을 나타낸 것이고, 하기 표 11은 분변에서 분리된 유산균의 관리번호 및 균주명을 나타낸 것이다.
관리번호 균주명 관리번호 균주명
1 Lactobacillus plantarum LC1 26 Lactobacillus plantarum LC26
2 Lactobacillus plantarum LC2 27 Lactobacillus plantarum LC27
3 Lactobacillus plantarum LC3 28 Lactobacillus plantarum LC28
4 Lactobacillus plantarum LC4 29 Lactobacillus plantarum LC29
5 Lactobacillus plantarum LC5 30 Lactobacillus plantarum LC30
6 Lactobacillus plantarum LC6 31 Lactobacillus plantarum LC31
7 Lactobacillus plantarum LC7 32 Lactobacillus plantarum LC32
8 Lactobacillus plantarum LC8 33 Lactobacillus plantarum LC33
9 Lactobacillus plantarum LC9 34 Lactobacillus plantarum LC34
10 Lactobacillus plantarum LC10 35 Lactobacillus plantarum LC35
11 Lactobacillus plantarum LC11 36 Lactobacillus plantarum LC36
12 Lactobacillus plantarum LC12 37 Lactobacillus plantarum LC37
13 Lactobacillus plantarum LC13 38 Lactobacillus plantarum LC38
14 Lactobacillus plantarum LC14 39 Lactobacillus plantarum LC39
15 Lactobacillus plantarum LC15 40 Lactobacillus plantarum LC40
16 Lactobacillus plantarum LC16 41 Lactobacillus plantarum LC41
17 Lactobacillus plantarum LC17 42 Lactobacillus plantarum LC42
18 Lactobacillus plantarum LC18 43 Lactobacillus plantarum LC43
19 Lactobacillus plantarum LC19 44 Lactobacillus plantarum LC44
20 Lactobacillus plantarum LC20 45 Lactobacillus plantarum LC45
21 Lactobacillus plantarum LC21 46 Lactobacillus plantarum LC46
22 Lactobacillus plantarum LC22 47 Lactobacillus plantarum LC47
23 Lactobacillus plantarum LC23 48 Lactobacillus plantarum LC48
24 Lactobacillus plantarum LC24 49 Lactobacillus plantarum LC49
25 Lactobacillus plantarum LC25 50 Lactobacillus plantarum LC50
관리번호 균주명 관리번호 균주명
51 Bifidobacterium longum LC51 76 Bifidobacterium longum LC76
52 Bifidobacterium longum LC52 77 Bifidobacterium longum LC77
53 Bifidobacterium longum LC53 78 Bifidobacterium longum LC78
54 Bifidobacterium longum LC54 79 Bifidobacterium longum LC79
55 Bifidobacterium longum LC55 80 Bifidobacterium longum LC80
56 Bifidobacterium longum LC56 81 Bifidobacterium longum LC81
57 Bifidobacterium longum LC57 82 Bifidobacterium longum LC82
58 Bifidobacterium longum LC58 83 Bifidobacterium longum LC83
59 Bifidobacterium longum LC59 84 Bifidobacterium longum LC84
60 Bifidobacterium longum LC60 85 Bifidobacterium longum LC85
61 Bifidobacterium longum LC61 86 Bifidobacterium longum LC86
62 Bifidobacterium longum LC62 87 Bifidobacterium longum LC87
63 Bifidobacterium longum LC63 88 Bifidobacterium longum LC88
64 Bifidobacterium longum LC64 89 Bifidobacterium longum LC89
65 Bifidobacterium longum LC65 90 Bifidobacterium longum LC90
66 Bifidobacterium longum LC66 91 Bifidobacterium longum LC91
67 Bifidobacterium longum LC67 92 Bifidobacterium longum LC92
68 Bifidobacterium longum LC68 93 Bifidobacterium longum LC93
69 Bifidobacterium longum LC69 94 Bifidobacterium longum LC94
70 Bifidobacterium longum LC70 95 Bifidobacterium longum LC95
71 Bifidobacterium longum LC71 96 Bifidobacterium longum LC96
72 Bifidobacterium longum LC72 97 Bifidobacterium longum LC97
73 Bifidobacterium longum LC73 98 Bifidobacterium longum LC98
74 Bifidobacterium longum LC74 99 Bifidobacterium longum LC99
75 Bifidobacterium longum LC75 100 Bifidobacterium longum LC100
표 10에 표시된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5는 그람 염색시 양성을 나타내는 혐기성 간균으로서, 이의 16S rDNA는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5의 16S rDNA 염기서열을 Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST 검색으로 동정한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주는 검색되지 않았고, Lactobacillus plantarum strain KF9의 16S rDNA 서열과 99%의 상동성을 보였다. 또한, 표 10에 표시된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27은 그람 염색시 양성을 나타내는 혐기성 간균으로서, 이의 16S rDNA는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27의 16S rDNA 염기서열을 Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST 검색으로 동정한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주는 검색되지 않았고, Lactobacillus plantarum strain JL18의 16S rDNA 서열과 99%의 상동성을 보였다. 또한, 표 10에 표시된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC28은 그람 염색시 양성을 나타내는 혐기성 간균으로서, 이의 16S rDNA는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC28의 16S rDNA 염기서열을 Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST 검색으로 동정한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주는 검색되지 않았고, Lactobacillus plantarum strain USIM01의 16S rDNA 서열과 99%의 상동성을 보였다.
표 11에 표시된 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67은 그람 염색시 양성을 나타내는 혐기성 간균으로서, 이의 16S rDNA는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67의 16S rDNA 염기서열을 Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST 검색으로 동정한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주는 검색되지 않았고, Bifidobacterium longum strain CBT-6의 16S rDNA 서열과 99%의 상동성을 보였다. 또한, 표 11에 표시된 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68은 그람 염색시 양성을 나타내는 혐기성 간균으로서, 이의 16S rDNA는 서열번호 8의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68의 16S rDNA 염기서열을 Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST 검색으로 동정한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주는 검색되지 않았고, Bifidobacterium longum strain IMAUFB067의 16S rDNA 서열과 99%의 상동성을 보였다.
또한, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68의 생리학적 특성 중 탄소원 이용성을 API Kit(모델명 : API 50 CHL; 제조사 : BioMerieux’s, USA)에 의한 당 발효 시험으로 분석하였다. 하기 표 12는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27의 탄소원 이용성 결과를 나타낸 것이고, 하기 표 13은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68의 탄소원 이용성 결과를 나타낸 것이다. 하기 표 12 및 표 13에서 "+"는 탄소원 이용성이 양성인 경우를 나타내고, "-"는 탄소원 이용성이 음성인 경우를 나타내고, "±"는 탄소원 이용성 여부가 모호한 경우를 나타낸다. 하기 표 12 및 표 13에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68은 일부 탄소원에 대해서 동일 종의 공지된 균주와 다른 이용성을 보였다.
탄소원 균주명 탄소원 균주명
L. plantarum LC5 L. plantarum LC27 L. plantarum LC5 L. plantarum LC27
glycerol - - salicin + +
erythritol - - cellobiose + +
D-arabinose - - maltose + +
L-arabinose - + lactose - +
D-ribose + + melibiose + +
D-xylose - - sucrose + +
L-xylose - - trehalose + +
D-adonitol - - inulin - -
methyl-β-D-xylopyranoside - - melezitose + +
D-galactose + ± raffinose ± -
D-glucose + + starch - -
D-fructose + + glycogen - -
D-mannose + + xylitol - -
L-sorbose - - gentiobiose + +
L-rhamnose - ± D-turanose - +
dulcitol - - D-lyxose - -
inositol - - D-tagatose - -
mannitol + + D-fucose - -
sorbitol + + L-fucose - -
α-methyl-D-mannoside - ± D-arabitol - -
α-methly-D-glucoside - - L-arabitol - -
N-acetyl-glucosamine + + gluconate - -
amygdalin + + 2-keto-gluconate - -
arbutin + + 5-keto-gluconate - -
esculin + +
탄소원 균주명 탄소원 균주명
B. longum LC67 B. longum LC68 B. longum LC67 B. longum LC68
glycerol - - salicin - -
erythritol - - cellobiose - -
D-arabinose - - maltose + +
L-arabinose + + lactose + +
D-ribose - - melibiose + +
D-xylose + ± sucrose + ±
L-xylose - - trehalose - ±
D-adonitol - - inulin - -
methyl-β-D-xylopyranoside - - melezitose - +
D-galactose ± + raffinose + +
D-glucose + + starch - -
D-fructose + + glycogen - -
D-mannose - - xylitol - -
L-sorbose - - gentiobiose + ±
L-rhamnose - - D-turanose ± ±
dulcitol - - D-lyxose - -
inositol - - D-tagatose - -
mannitol ± + D-fucose - -
sorbitol ± + L-fucose - -
α-methyl-D-mannoside - - D-arabitol - -
α-methly-D-glucoside ± ± L-arabitol - -
N-acetyl-glucosamine - - gluconate - -
amygdalin - ± 2-keto-gluconate - -
arbutin - - 5-keto-gluconate - -
esculin + +
(4) 유산균의 수탁 정보
본 발명의 발명자들은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5를 2016년 1월 11일에 공인기탁기관인 한국미생물보존센터(주소 : 대한민국 서울 서대문구 홍제내 2가길 45 유림빌딩)에 특허기탁 하여 KCCM 11800P의 수탁번호를 부여받았다. 또한, 본 발명의 발명자들은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27을 2016년 1월 11일에 공인기탁기관인 한국미생물보존센터(주소 : 대한민국 서울 서대문구 홍제내 2가길 45 유림빌딩)에 특허기탁 하여 KCCM 11801P의 수탁번호를 부여받았다. 또한, 본 발명의 발명자들은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 2016년 1월 11일에 공인기탁기관인 한국미생물보존센터(주소 : 대한민국 서울 서대문구 홍제내 2가길 45 유림빌딩)에 특허기탁 하여 KCCM 11802P의 수탁번호를 부여받았다.
2. 유산균의 장 손상 또는 장 누수 개선 효능 평가
김치 또는 사람 분변으로부터 분리한 유산균의 장 손상 또는 장 누수 개선 효능을 평가하기 위하여 유산균의 항산화 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성, 장내 유해 효소인 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성 및 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성을 측정하였다.
(1) 실험방법
* 항산화 활성
DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 에탄올에 0.2 mM 농도가 되도록 녹여 DPPH 용액을 제조하였다. 상기 DPPH 용액 0.1 ㎖에 유산균 현탁액(1×108 CFU/㎖) 또는 비타민 C 용액(1 g/㎖)을 넣고 20분간 37℃에서 배양하였다. 배양액을 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이후, 517 ㎚에서 상등액의 흡광도를 측정하고, 유산균의 항산화 활성을 계산하였다.
* 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성
사람의 신선한 분변 0.1 g을 0.9 ㎖의 멸균 생리식염수에 현탁하고, 일반 혐기성 배지로 100배 희석하여 분변 현탁액을 제조하였다. 멸균 일반혐기성배지(일본 Nissui 제약) 9.8 ㎖에 상기 분변 현탁액 0.1 ㎖ 및 유산균(1×104 또는 1×105 CFU) 0.1 ㎖를 이식하고 24시간 동안 혐기적으로 배양하였다. 이후, 배양액을 약 1시간 동안 초음파로 처리하여 균의 세포 외막을 파괴하고, 5000×g의 조건으로 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이후, 상등액에 존재하는 대표적인 내독소인 LPS(lipopolysaccharide)의 함량을 LAL(Limulus Amoebocyte Lysate) assay kit(제조사 : Cape Cod Inc., USA)로 측정하였다. 또한, 유산균의 대장균 증식 억제 활성을 평가하기 위해 동일한 실험을 통해 얻은 배양액을 천배 및 십만배로 희석하고, DHL 배지에 배양한 후 대장균수를 측정하였다.
* 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성
0.1 mM 농도의 p-니트로페닐-β-D-글루쿠로나이드(p-nitrophenyl-β-D-glucuronide) 용액 0.1 ㎖, 50 mM 농도의 인산완충용액 0.2 ㎖ 및 유산균 현탁액(유산균 배양액 5 ㎖를 집균한 후, 생리식염수 5 ㎖에 현탁하여 제조함) 0.1 ㎖를 반응기에 넣고 15분간 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 효소반응을 진행하고, 0.1 mM 농도의 NaOH 용액 0.5 ㎖를 넣어 반응을 정지시켰다. 이후, 반응액을 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이후, 405 ㎚에서 상등액의 흡광도를 측정하였다.
* 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성
한국 세포주 은행에서 분양받은 Caco2 세포를 RPMI 1640 배지에서 48시간 동안 배양한 후, Caco2 세포 배양액을 12-well 플레이트에 웰 당 2×106 cells의 양이 되도록 분주하였다. 이후, 각 웰에 LPS(lipopolysaccharide) 1 ㎍을 단독으로 처리하거나 LPS(lipopolysaccharide) 1 ㎍과 유산균 1×103 CFU를 같이 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후, 각 웰로부터 배양된 세포들을 긁어 모으고 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 밀착연접단백질(tight junction protein) ZO-1의 발현량을 측정하였다.
(2) 실험결과
김치 또는 사람 분변으로부터 분리한 유산균의 항산화 활성, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성, 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 저해 활성 및 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성을 측정하고, 그 결과를 하기 표 14 내지 표 16에 나타내었다. 하기 표 14 내지 표 16에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC15, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC17, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC25, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC28, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC55, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC65, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68 유산균은 항산화 활성이 우수하고, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 및 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase) 활성을 강하게 저해하였고, 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현을 강하게 유도하였다. 특히, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67은 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성이 가장 우수하였다. 상기 유산균들은 항산화 효과, 염증발현 및 발암과 관련있는 장내세균총의 유해균 효소활성 억제 효과가 우수하고, 장내세균총의 유해균이 생산하는 내독소인 LPS(lipopolysaccharide)의 생성을 억제할 뿐만 아니라 밀착연접단백질(tight junction protein)의 발현을 유도하므로 장 누수 증후군(Intestinal permeability)을 개선시킬 수 있다.
관리번호 균주명 항산화 활성 베타-글루쿠로니다제 저해 활성 LPS 생성 억제 활성 밀착연접단백질 발현 유도 활성
1 Lactobacillus plantarum LC1 ++ + + -
2 Lactobacillus plantarum LC2 ++ ++ + -
3 Lactobacillus plantarum LC3 +++ ++ + -
4 Lactobacillus plantarum LC4 +++ ++ + +
5 Lactobacillus plantarum LC5 +++ +++ ++ ++
6 Lactobacillus plantarum LC6 ++ +++ + -
7 Lactobacillus plantarum LC7 +++ ++ + -
8 Lactobacillus plantarum LC8 ++ +++ + -
9 Lactobacillus plantarum LC9 ++ ++ + +
10 Lactobacillus plantarum LC10 ++ +++ + +
11 Lactobacillus plantarum LC11 ++ ++ + -
12 Lactobacillus plantarum LC12 ++ +++ + +
13 Lactobacillus plantarum LC13 ++ ++ + +
14 Lactobacillus plantarum LC14 ++ ++ + -
15 Lactobacillus plantarum LC15 +++ +++ ++ ++
16 Lactobacillus plantarum LC16 + +++ + -
17 Lactobacillus plantarum LC17 +++ +++ ++ ++
18 Lactobacillus plantarum LC18 ++ ++ + +
19 Lactobacillus plantarum LC19 ++ +++ + +
20 Lactobacillus plantarum LC20 ++ ++ + -
21 Lactobacillus plantarum LC21 ++ ++ + -
22 Lactobacillus plantarum LC22 ++ +++ - -
23 Lactobacillus plantarum LC23 +++ ++ - -
24 Lactobacillus plantarum LC24 +++ + - -
25 Lactobacillus plantarum LC25 +++ +++ ++ ++
26 Lactobacillus plantarum LC26 ++ + + +
27 Lactobacillus plantarum LC27 +++ +++ ++ ++
28 Lactobacillus plantarum LC28 +++ +++ ++ ++
29 Lactobacillus plantarum LC29 ++ + - -
30 Lactobacillus plantarum LC30 ++ + + -
31 Lactobacillus plantarum LC31 +++ ++ + -
32 Lactobacillus plantarum LC32 +++ ++ + -
33 Lactobacillus plantarum LC33 +++ ++ + -
34 Lactobacillus plantarum LC34 ++ ++ + +
35 Lactobacillus plantarum LC35 ++ ++ + +
관리번호 균주명 항산화 활성 베타-글루쿠로니다제 저해 활성 LPS 생성 억제 활성 밀착연접단백질 발현 유도 활성
36 Lactobacillus plantarum LC36 ++ ++ ++ -
37 Lactobacillus plantarum LC37 +++ ++ + +
38 Lactobacillus plantarum LC38 ++ ++ + -
39 Lactobacillus plantarum LC39 ++ + + -
40 Lactobacillus plantarum LC40 +++ + - -
41 Lactobacillus plantarum LC41 ++ ++ - +
42 Lactobacillus plantarum LC42 +++ + - +
43 Lactobacillus plantarum LC43 ++ + - +
44 Lactobacillus plantarum LC44 ++ + - +
45 Lactobacillus plantarum LC45 ++ ++ - +
46 Lactobacillus plantarum LC46 ++ + - +
47 Lactobacillus plantarum LC47 +++ + - +
48 Lactobacillus plantarum LC48 ++ ++ - +
49 Lactobacillus plantarum LC49 ++ +++ + +
50 Lactobacillus plantarum LC50 +++ ++ + -
51 Bifidobacterium longum LC51 ++ ++ + -
52 Bifidobacterium longum LC52 +++ +++ + -
53 Bifidobacterium longum LC53 ++ +++ - +
54 Bifidobacterium longum LC54 +++ ++ + +
55 Bifidobacterium longum LC55 +++ +++ ++ ++
56 Bifidobacterium longum LC56 +++ ++ + +
57 Bifidobacterium longum LC57 ++ + - +
58 Bifidobacterium longum LC58 +++ + - +
59 Bifidobacterium longum LC59 ++ + - -
60 Bifidobacterium longum LC60 +++ + - -
61 Bifidobacterium longum LC61 ++ + + -
62 Bifidobacterium longum LC62 +++ + + -
63 Bifidobacterium longum LC63 ++ ++ ++ -
64 Bifidobacterium longum LC64 +++ + - -
65 Bifidobacterium longum LC65 +++ +++ ++ ++
66 Bifidobacterium longum LC66 ++ + + +
67 Bifidobacterium longum LC67 +++ +++ ++ +++
68 Bifidobacterium longum LC68 +++ +++ ++ ++
69 Bifidobacterium longum LC69 +++ + - -
70 Bifidobacterium longum LC70 ++ + - +
관리번호 균주명 항산화 활성 베타-글루쿠로니다제 저해 활성 LPS 생성 억제 활성 밀착연접단백질 발현 유도 활성
71 Bifidobacterium longum LC71 ++ + - +
72 Bifidobacterium longum LC72 +++ ++ - +
73 Bifidobacterium longum LC73 ++ ++ + -
74 Bifidobacterium longum LC74 ++ +++ + -
75 Bifidobacterium longum LC75 +++ + - +
76 Bifidobacterium longum LC76 ++ + - +
77 Bifidobacterium longum LC77 ++ ++ + +
78 Bifidobacterium longum LC78 ++ + + +
79 Bifidobacterium longum LC79 +++ + + +
80 Bifidobacterium longum LC80 ++ + + +
81 Bifidobacterium longum LC81 ++ + + +
82 Bifidobacterium longum LC82 ++ ++ - +
83 Bifidobacterium longum LC83 +++ + - +
84 Bifidobacterium longum LC84 ++ ++ - -
85 Bifidobacterium longum LC85 +++ ++ - +
86 Bifidobacterium longum LC86 ++ + + -
87 Bifidobacterium longum LC87 ++ ++ + -
88 Bifidobacterium longum LC88 ++ +++ + +
89 Bifidobacterium longum LC89 ++ ++ + +
90 Bifidobacterium longum LC90 ++ ++ + +
91 Bifidobacterium longum LC91 +++ +++ + +
92 Bifidobacterium longum LC92 +++ ++ + +
93 Bifidobacterium longum LC93 ++ ++ + +
94 Bifidobacterium longum LC94 ++ ++ - +
95 Bifidobacterium longum LC95 ++ +++ - -
96 Bifidobacterium longum LC96 ++ + - -
97 Bifidobacterium longum LC97 ++ + - -
98 Bifidobacterium longum LC98 ++ ++ - -
99 Bifidobacterium longum LC99 ++ ++ - -
100 Bifidobacterium longum LC100 ++ ++ - +
* 항산화 활성 측정시 유산균의 최종 농도 : 1×104 CFU/㎖; 베타-글루쿠로니다제 저해 활성 및 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성 측정시 유산균의 이식 농도 : 1×104 CFU/㎖; 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성 측정시 유산균 농도 : 1×104 CFU/㎖
* 유산균의 다양한 활성 측정시 기준 : very strongly (+++; >90%); strongly (++; >60-90%); weakly (+; >20-60%); not or less than 20%(-; <20%)
3. 유산균의 간 손상 개선 효과 평가
유산균의 장 손상 또는 장 누수 개선 효능 평가를 통해 총 10개의 균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC15, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC17, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC25, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC28, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC55, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC65, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68을 선별하였다. 이후, 선별한 유산균 단독 또는 혼합 유산균의 간 손상 개선 효과를 Tert-부틸퍼옥사이드(Tert-butylperoxide)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물을 이용하여 평가하였다.
(1) 실험방법
생쥐(C57BL/6, 웅성) 6마리를 한 군으로 하여, 정상군을 제외한 나머지 군의 실험동물에 Tert-부틸퍼옥사이드(Tert-butylperoxide)를 2.5 mmol/㎏의 용량으로 복강투여 하여 간 손상을 유발하였다. Tert-부틸퍼옥사이드(Tert-butylperoxide)를 투여하고 2시간 후부터 정상군과 음성 대조군을 제외한 나머지 군의 실험동물에 유산균을 2×109 CFU의 양으로 하루 1회씩 3일간 경구투여하였다. 또한, 양성 대조군의 실험동물에는 유산균 대신 실리마린(silymarin)을 100 ㎎/㎏의 양으로 하루 1회씩 3일간 경구투여하였다. 약물을 마지막으로 투여하고 6시간 후에 심장채혈 하였다. 채취한 혈액을 상온에서 60분간 방치하고 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청의 GPT(glutamic pyruvate transaminase)와 GOT(glutamic oxalacetic transaminase)를 혈액분석 키트((ALT & AST 측정 키트; Asan Pharm. Co., 대한민국)를 이용하여 측정하였다. 또한, 실험동물로부터 적출한 간 조직 1g을 생리식염수에 넣고 호모게나이저를 이용하여 균질화한 후 상등액을 ELISA kit로 분석하여 TNF-α의 양을 측정하였다.
(2) 실험결과
하기 표 17은 Tert-부틸퍼옥사이드(Tert-butylperoxide)에 의해 간 손상이 유발된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때 GOT, GPT, TNF-α 값의 변화를 나타낸 것이다. 하기 표 17에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC28, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68은 실리마린(silymarin)보다 우수한 간 손상 개선 효과를 보였고, 이들의 혼합 유산균은 간 손상 개선 효과가 더 우수하였다.
실험군 GOT(IU/L) GPT(IU/L) TNF-α(pg/g)
정상군 42.4 6.2 140.4
음성 대조군 103.1 28.0 298.0
LC5 투여군 36.9 5.4 115.7
LC15 투여군 60.3 6.2 154.3
LC17 투여군 65.8 6.8 136.7
LC25 투여군 64.6 11.3 132.4
LC27 투여군 35.3 3.3 157.1
LC28 투여군 42.0 1.0 185.7
LC55 투여군 55.6 17.6 251.4
LC65 투여군 61.4 17.3 127.6
LC67 투여군 50.8 3.8 150.5
LC68 투여군 40.8 5.7 82.4
LC5+LC67 투여군 32.7 3.1 115.9
LC5+LC68 투여군 36.8 5.6 105.4
LC27+LC67 투여군 30.5 2.3 121.2
LC27+LC68 투여군 35.4 3.2 112.8
LC28+LC67 투여군 32.5 2.8 128.2
실리마린(silymarin) 투여군 52.9 5.9 93.8
상기 표 17에서 "LC5"는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5를 나타내고, "LC15"는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC15를 나타내고, "LC17"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC17을 나타내고, "LC25"는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC25를 나타내고, "LC27"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27을 나타내고, "LC28"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC28을 나타내고, "LC55"는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC55를 나타내고, "LC65"는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC65를 나타내고, "LC67"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 나타내고, "LC68"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68를 나타내고, "LC5+LC67"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5와 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 나타내고, "LC5+LC68"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5와 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 나타내고, "LC27+LC67"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 나타내고, "LC27+LC68"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 나타내고, "LC28+LC67"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC28과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 나타낸다. 이하의 실험 결과를 나타낸 표들에서 단독 유산균 또는 혼합 유산균에 대해 동일한 기호를 사용하였다.
4. 유산균의 알러지 개선 효과 평가
(1) 유산균의 탈과립 저해율 측정
RBL-2H3 세포주(rat mast cell line, 한국세포주은행, Cat. No.22256)를 10% FBS(fetal bovine serum)과 L-글루타민을 포함하는 DMEM(Dulbeccos' modified Eagle's medium, Sigma사, 22256)을 이용하여 37℃, 가습화된(humidified) 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양액에 포함된 세포들을 트립신-EDTA 용액을 사용하여 부유시키고, 분리 및 회수하여 실험에 사용하였다. 회수된 RBL-2H3 세포들을 24-웰 플레이트에 웰 당 5×105 cells의 양이 되도록 분주한 후, 마우스 단클론성 IgE 0.5 ㎍/㎖를 넣고 12시간 동안 배양시키며 감작화(sensitization) 시켰다. 감작화된 세포들을 0.5 ㎖의 시라가니안 완충액(siraganian buffer; 119mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2, 25mM PIPES, 40mM NaOH, pH 7.2)으로 세척한 후에 다시 0.16 ㎖의 시라가니안 완충액(5.6mM 포도당, 1mM CaCl2, 0.1% BSA를 첨가)을 넣고 37℃에서 10분간 배양하였다. 이후, 세포 배양액에 시험약물인 유산균을 1×104 CFU/㎖의 농도가 되도록 첨가하거나 대조약물인 DSCG(disodium cromoglycate) 0.04 ㎖를 첨가한 다음 20분이 경과되었을 때 0.02 ㎖의 항원(DNP-BSA 1㎍/ml)으로 37℃에서 10분간 세포들을 활성화시켰다. 이후, 세포 배양액을 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 수득한 상등액 0.025 ㎖를 96-웰 플레이트로 옮기고, 기질액인 1mM p-NAG(0.1M 시트레이트 완충액에 p-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코스아미니드를 pH 4.5로 녹인 용액) 0.025 ㎖를 가한 후, 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이후, 0.1M Na2CO3/NaHCO3 0.2 ㎖를 반응액에 첨가하여 반응을 정지시키고 405 ㎚에서 ELISA 분석기로 흡광도를 측정하였다.
(2) 실험결과
하기 표 18은 유산균의 탈과립 저해율을 측정한 결과이다. 표 18에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC28, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68 및 이들의 혼합 유산균은 호염구의 탈과립을 효과적으로 억제하였다. 따라서, 상기 유산균 또는 유산균 혼합물은 알러지로부터 유발되는 아토피, 천식, 인후염 또는 만성 피부염 등을 매우 효과적으로 개선할 수 있다.
처리 약물 탈과립 저해율(%)
없음 0
LC5 65
LC15 45
LC17 43
LC25 48
LC27 52
LC28 54
LC55 38
LC65 42
LC67 65
LC68 61
LC5+LC67 65
LC5+LC68 60
LC27+LC67 65
LC27+LC68 59
LC28+LC67 62
DSCG(disodium cromoglycate) 62
5. 유산균의 항염 및 면역조절 효과 평가(in vitro)
(1) 대식세포의 분리와 염증 지표 측정
6주령 C57BL/6J 수컷 생쥐(20-23g)를 라운바이오㈜로부터 구입하였다. 생쥐의 복강에 멸균된 4% thioglycolate 2 ㎖를 투여하고, 96시간이 지난 뒤에 생쥐를 마취시키고, 다시 생쥐 복강에 RPMI 1640 배지 8 ㎖를 투여하고 5~10분이 지난 뒤에 생쥐 복강 내의 RPMI 배지(대식세포를 포함)를 다시 뽑아내고 1000 rpm의 조건에서 10분간 원심분리하고 다시 RPMI 1640 배지로 2회 세척하였다. 24-well 플레이트에 대식세포를 각 well당 0.5×106의 수로 깔고, 시험 물질인 유산균과 염증 반응 유도 물질인 LPS(lipopolysaccharide)를 2시간 또는 24시간 동안 처리한 후 상등액 및 세포를 수득하였다. 이때, 유산균 처리 농도는 1×104 CFU/㎖ 이었다. 수득한 세포를 buffer(Gibco사)에 넣고 균질화 하였다. 수득한 상등액으로부터 TNF-α와 같은 사이토카인의 발현량을 ELISA kit로 측정하였다. 또한, 수득한 세포로부터 p65(NF-카파B), p-p65(phosphor-NF-카파B) 및 β-actin의 발현량을 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 측정하였다. 구체적으로 상등액 50㎍을 취해 SDS 10%(w/v) polyacrylamide gel에서 1시간 30분간 전기영동을 하였다. 전기영동한 샘플을 니트로셀룰로스지에 100V, 400㎃의 조건에서 1시간 10분간 트랜스퍼(transfer) 하였다. 샘플이 트랜스퍼된 니트로셀로로스지를 5% skim milk로 30분간 blocking 한 후, 5분씩 3회에 걸쳐 PBS-Tween으로 세척하고, 1차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:100의 비율로 하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 2차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:1000의 비율로 하여 1시간 20분간 반응시켰다. 이후, 15분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 형광발색 시킨 후 현상하고, 발색밴드의 강도(Intensity)를 측정한 후, 저해율을 아래와 같은 식으로 계산하였다. 하기 식에서 정상군은 대식세포에 생리식염수만 처리한 군을 나타내고, LPS 처리군은 대식세포에 LPS만 처리한 군을 나타내고, 유산균 처리군은 대식세포에 LPS 및 유산균을 모두 처리한 군을 나타낸다.
Figure 112018078553102-pat00001
하기 표 19는 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 염증 반응이 유도된 대식세포에 유산균을 처리하였을 때 NF-카파B 활성화 저해 수준과 TNF-α 발현 저해 수준을 영향을 나타낸 것이다. 하기 표 19에서 보이는 바와 같이 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC28, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68 및 이들의 혼합 유산균은 LPS(lipopolysaccharide)로 유도된 염증 반응을 효과적으로 억제하였다.
처리 유산균 TNF-α 발현 저해율(%) p-p65/p65 활성화 저해율(%)
LC5 71 73
LC15 54 55
LC17 61 55
LC25 52 65
LC27 70 72
LC28 74 71
LC55 63 62
LC65 65 68
LC67 76 77
LC68 75 71
LC5+LC67 78 72
LC5+LC68 76 72
LC27+LC67 81 75
LC27+LC68 77 73
LC28+LC67 77 73
(2) 비장으로부터 T 세포의 분리와 Th17 세포 또는 Treg 세포로의 분화능 측정
C56BL/6J 생쥐의 비장을 분리하고, 적당하고 분쇄하고, 10% FCS 함유 RPMI 1640 배제에 현탁하고 CD4 T cell isolation kit(MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일)를 사용하여 CD4 T 세포를 분리하였다. 분리한 CD4 T 세포를 12-웰 플레이트에 각 웰당 5×105 수로 분주하고, 여기에 anti-CD3(1 ㎍/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일) 및 anti-CD28(1 ㎍/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일)을 넣거나, anti-CD3(1 ㎍/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일), anti-CD28(1 ㎍/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일), recombinant IL-6(20 ng/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일) 및 recombinant transforming growth factor beta(1 ng/㎖, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, 독일)를 넣고 세포를 배양하면서 유산균을 웰당 1×103 또는 1×105 CFU의 양으로 넣고 4일간 배양하였다. 이후, 배양액의 세포를 anti-FoxP3 또는 anti-IL-17A 항체로 염색하고 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 장치(C6 Flow Cytometer® System, San Jose, CA, USA)를 이용하여 Th17 세포 및 Treg 세포의 분포를 분석하였다.
하기 표 20은 비장에서 분리된 T 세포에 anti-CD3, anti-CD28, IL-6 및 TGF-β를 처리한 후 유산균을 처리하였을 때 Th17 세포로의 분화 수준을 나타낸 것이고, 하기 표 21은 비장에서 분리된 T 세포에 anti-CD3 및 anti-CD28을 처리한 후 유산균을 처리하였을 때 Treg 세포로의 분화 수준을 나타낸 것이다. 하기 표 20 및 표 21에서 보이는 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC28, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68 및 이들의 혼합 유산균은 T 세포의 Th17 세포(T helper 17 cell)로의 분화를 저해하고 Treg 세포로의 분화를 촉진하였다. 상기 결과에 의할 때 상기 유산균 또는 유산균 혼합물은 대장염, 관절염과 같은 염증 질환을 효과적으로 개선할 수 있다.
T 세포 처리 방법 Th17 세포로의 분화율(%)
anti-CD3, anti-CD28, IL-6 및 TGF-β를 처리 여부 유산균 처리 여부
무처리 무처리 12.2
처리 무처리 25.6
처리 LC5 처리 14.2
처리 LC15 처리 19.6
처리 LC17 처리 17.9
처리 LC25 처리 18.2
처리 LC27 처리 15.1
처리 LC28 처리 14.9
처리 LC55 처리 18.8
처리 LC65 처리 17.9
처리 LC67 처리 15.9
처리 LC68 처리 15.7
처리 LC5+LC67 처리 14.2
처리 LC5+LC68 처리 14.5
처리 LC27+LC67 처리 13.9
처리 LC27+LC68 처리 14.4
처리 LC28+LC67 처리 14.1
T 세포 처리 방법 Treg 세포로의 분화율(%)
anti-CD3 및 anti-CD28 처리 여부 유산균 처리 여부
무처리 무처리 9.1
처리 무처리 11.4
처리 LC5 처리 22.9
처리 LC15 처리 15.8
처리 LC17 처리 16.9
처리 LC25 처리 18.4
처리 LC27 처리 21.8
처리 LC28 처리 21.4
처리 LC55 처리 19.5
처리 LC65 처리 19.2
처리 LC67 처리 21.6
처리 LC68 처리 20.5
처리 LC5+LC67 처리 21.8
처리 LC5+LC68 처리 21.8
처리 LC27+LC67 처리 22.0
처리 LC27+LC68 처리 21.5
처리 LC28+LC67 처리 21.9
6. 유산균의 항염 및 대장염 개선 효과 평가(in vivo )
(1) 실험동물
5주령 C57BL/6 수컷 생쥐(24-27g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하고, 습도 50±10%, 온도 25±2℃, 조명은 12시간 킨 후 12시간 끄는 것을 반복하는 조절된 환경 조건에서 일주일 동안 사육한 후 실험에 사용하였다. 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험에서 한 군은 6마리로 하였다.
(2) TNBS에 의한 대장염 유발 및 시료 투여
실험동물 중 한 군을 정상군으로 하고, 나머지 군의 실험동물에 대해서는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)으로 급성 대장염을 유발하였다. 구체적으로 실험동물을 가볍게 에테르로 마취한 후 TNBS(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) 용액 2.5g을 50% 에탄올 100㎖에 혼합한 용액을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1㎖씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 염증을 유발하였다. 반면, 정상군에는 생리식염수 0.1㎖를 경구투여하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 3일간 시험시료인 유산균 또는 혼합 유산균을 생리식염수에 현탁하여 2.0×109 CFU의 양으로 경구투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 실험동물을 이산화탄소로 질식시켜 죽이고 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하여 사용하였다. 또한, 정상군의 실험동물에는 유산균 대신 생리식염수만을 경구투여하였다. 또한, 음성 대조군의 실험동물에도 TNBS에 의한 대장염 유발 후 유산균 대신 생리식염수만을 경구투여하였다. 또한, 양성 대조군의 실험동물에는 유산균 대신 대장염 치료 약물인 설파살라진(sulfasalazine)을 50 ㎎/㎏의 양으로 경구투여하였다.
(3) 대장의 외관 분석
적출한 대장의 길이와 외관을 관찰하고 하기 표 22의 기준(Hollenbach 등, 2005 대장염 정도에 대한 기준)에 따라 점수로 매겨 외관 분석을 하였다. 대장 조직은 대장 내용물을 모두 제거하고, 생리 식염수에 세척한 후 일부는 병리조직용 샘플로 사용하기 위해 4% 포름알데히드 고정액으로 고정하였으며, 나머지는 분자생물학적 분석을 위해 영하 80℃에서 냉동보관하면서 사용하였다.
외관 점수(Macroscopic Score) 기준
0 어떠한 궤양과 염증도 발견되지 않음
1 출혈이 없는 충혈이 발견됨
2 충혈이 있는 궤양이 발견됨
3 한 곳에서만 궤양과 염증이 발견됨
4 궤양과 염증이 2곳 이상에서 발견됨
5 궤양이 2㎝ 이상으로 확대되어 있음
(4) 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
대장조직 100㎎에 0.5% hexadecyl trimethyl ammonium bromide 함유 10 mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 200㎕를 넣고 균질화(homogenization) 하였다. 이후, 4℃ 및 10,000×g의 조건에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액 50 ㎕를 0.95 ㎖ 의 반응액(1.6mM tetramethyl benzidine과 0.1mM H2O2 함유)에 넣고 37℃에서 반응시키면서 650 ㎚에서 경시적으로 흡광도를 측정하였다. 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성은 반응물로서 생긴 peroxide 1 μmol/㎖를 1 unit로 계산하였다.
(5) 염증 지표 측정
웨스턴블롯팅 방법을 이용하여 p-p65, p65, iNOS, COX-2, β-actin 과 같은 염증 반응 지표 물질을 측정하였다. 구체적으로, 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정 실험과 동일한 방법으로 상등액을 얻었다. 이후, 상등액 50㎍을 취해 SDS 10%(w/v) polyacrylamide gel에서 1시간 30분간 전기영동을 하였다. 전기영동한 샘플을 니트로셀룰로스지에 100V, 400㎃의 조건에서 1시간 10분간 트랜스퍼(transfer) 하였다. 샘플이 트랜스퍼된 니트로셀로로스지를 5% skim milk로 30분간 blocking 한 후, 5분씩 3회에 걸쳐 PBS-Tween으로 세척하고, 1차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:100의 비율로 하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 2차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:1000의 비율로 하여 1시간 20분간 반응시켰다. 이후, 15분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 형광발색 시킨 후 현상하였다.
또한, ELISA kit를 이용하여 TNF-α, IL-17, IL-10 등과 같은 염증 관련 사이토카인을 측정하였다.
(6) 면역조절 지표 분석
적출한 대장을 2.5 mM EDTA 용액으로 2회 세척하였다. 이후, 1 ㎎/㎖ 농도로 collagenase type Ⅷ(Sigma)가 함유된 RPMI 배지에 세척한 대장을 넣고 30℃에서 20분간 흔들어 처리하고, 여과하여 Lamina propria를 분리하였다. 이후, Lamina propria를 30-100% 퍼콜액으로 처리하고 원심분리하여 T 세포를 분리하였다. 이후, 분리한 T 세포를 anti-FoxP3 또는 anti-IL-17A 항체로 염색하고 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 장치(C6 Flow Cytometer® System, San Jose, CA, USA)를 이용하여 Th17, Treg의 분포를 분석하였다.
(7) 실험결과
하기 표 23은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때, 유산균이 대장의 무게, 대장의 외관, 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성, 염증 관련 사이토카인의 함량 변화에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 하기 표 23에서 보이는 바와 같이 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 경우 몸무게, 대장염의 외관 지수, 대장 길이가 감소하고 MPO 활성이 증가하였다. 그러나, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때 상기 지표들이 모두 개선되었다. 특히, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 단독으로 투여하거나 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5의 혼합 유산균을 투여하는 경우 대장염 개선 효과가 매우 우수하였다. 또한, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 경우 TNF-α, IL-17가 증가하고 IL-10이 감소하였다. 그러나, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때 상기 지표들이 모두 개선되었다. 특히, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 단독으로 투여하거나 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5의 혼합 유산균을 투여하는 경우 TNF-α, IL-17의 양이 크게 감소하고 IL-10의 양이 크게 증가하였다.
실험군 Weight gain(g) Macroscopic score Colon length(㎝) MPO 활성
(μU/㎎)		 TNF-α
(pg/㎎)		 IL-17
(pg/㎎)		 IL-10
(pg/㎎)
정상군 0.64 5.9 0.14 0.42 35.1 18.4 61.2
음성 대조군 -2.46 4.2 2.32 1.54 95.5 65.2 30.7
LC5 투여군 -1.90 4.65 1.30 0.91 75.5 52.8 43.9
LC27 투여군 -1.0 4.56 1.08 0.82 67.2 50.4 44.0
LC67 투여군 -0.28 4.92 0.50 0.43 48.5 38.5 54.6
LC 68 투여군 -1.02 4.5 1.34 1.04 54.4 50.5 48.1
LC5+LC67 투여군 -0.3 5.08 0.84 0.42 45.1 37.3 55.3
LC27+LC68 투여군 -1.15 4.8 1.17 0.78 59.8 45.0 50.0
양성 대조군 -0.91 4.58 1.43 0.95 58.2 48.5 45.5
도 22는 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 유산균이 미치는 영향을 T 세포의 Th17 세포로의 분화 양상으로 나타낸 것이고, 도 23은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 유산균이 미치는 영향을 T 세포의 Treg 세포로의 분화 양상으로 나타낸 것이다. 도 22 및 도 23에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "TNBS"는 음성 대조군을 나타내고, "LC5"는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5 투여군을 나타내고, "LC27"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27 투여군을 나타내고, "LC67"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 투여군을 나타내고, "LC68"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68 투여군을 나타내고, "LC5+LC67"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5와 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균 투여군을 나타내고, "LC27+LC68"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균 투여군을 나타내고, "SS"는 설파살라진(sulfasalazine) 투여군을 나타낸다. 도 22 및 도 23에서 보이는 바와 같이 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 경우 T 세포의 Th17 세포로의 분화가 촉진되고 T 세포의 Treg 세포로의 분화가 억제되었다. 그러나, TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 유산균을 투여하였을 때 T 세포의 Th17 세포로의 분화가 억제되고 T 세포의 Treg 세포로의 분화가 촉진되었다. 특히, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 단독으로 투여하거나 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5의 혼합 유산균을 투여하는 경우 T 세포의 Th17 세포로의 분화가 크게 억제되고 T 세포의 Treg 세포로의 분화가 크게 촉진되었다.
도 24는 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 대해 유산균이 미치는 영향을 염증 반응 지표 물질 등으로 나타낸 것이다. 도 24에서 "Nor"은 정상군을 나타내고, "T"는 음성 대조군을 나타내고, "LC5"는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5 투여군을 나타내고, "LC27"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27 투여군을 나타내고, "LC67"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 투여군을 나타내고, "LC68"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68 투여군을 나타내고, "LC5+LC67"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5와 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균 투여군을 나타내고, "LC27+LC68"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC68을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균 투여군을 나타내고, "SS"는 설파살라진(sulfasalazine) 투여군을 나타낸다. 도 24에서 보이는 바와 같이 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 경우 NF-κB가 활성화(p-p65)되고 COX-2 및 iNOS의 발현량이 증가하였으나, 유산균 투여에 의해 NF-κB가 활성화(p-p65)가 억제되고 COX-2 및 iNOS의 발현량의 증가도 감소하였다. 특히, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 단독으로 투여하거나 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67과 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5의 혼합 유산균을 투여하는 경우 NF-κB가 활성화(p-p65) 억제 효과 및 COX-2 및 iNOS의 발현 증가 억제 효과가 우수하였다.
7. 유산균의 알코올 유도성 위궤양 개선 효과 평가(in vivo )
(1) 실험동물
5주령 C57BL/6 수컷 생쥐(24-27g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하고, 습도 50±10%, 온도 25±2℃, 조명은 12시간 킨 후 12시간 끄는 것을 반복하는 조절된 환경 조건에서 일주일 동안 사육한 후 실험에 사용하였다. 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험에서 한 군은 6마리로 하였다.
(2) 알코올에 의한 위궤양 유도 및 시료 투여
1개의 실험군에는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27을 생리식염수에 현탁하여 매일 1회씩 1×109 CFU의 양으로 3일 동안 경구투여하고 1개의 실험군에는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 생리식염수에 현탁하여 매일 1회씩 1×109 CFU의 양으로 3일 동안 경구투여하고, 1개의 실험군에는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 생리식염수에 현탁하여 매일 1회씩 1×109 CFU의 양으로 3일 동안 경구투여하였다. 또한, 양성 대조군에는 상업적인 위궤양 치료제인 라니티딘(Ranitidine)을 매일 1회씩 50 ㎎/㎏의 양으로 3일 동안 경구투여하였다. 또한, 정상군 및 음성 대조군에는 생리식염수를 매일 1회씩 0.2㎖의 양으로 3일 동안 경구투여하였다. 시료를 3일 동안 경구투여한 후, 18시간 동안 실험 생쥐를 절식 및 절수시켰다. 실험 4일째에 시료 또는 생리식염수를 투여하고 1시간이 지난 후 정상군을 제외한 모든 실험군의 생쥐에게 99% 순도의 에탄올 0.2㎖를 경구투여하여 위궤양을 유발하였다. 또한, 정상군에는 에탄올 대신 생리식염수 0.2㎖를 경구투여하였다.
(3) 위 손상 관련 거시적 지표 측정
에탄올 투여 후 3시간이 경과하였을 때 실험 생쥐를 희생시켜 위 조직을 떼어내고 세로로 갈라 PBS(phosphate buffer saline) 용액으로 세척한 뒤 위 손상 정도를 육안 또는 현미경으로 관찰하고 손상 정도에 따라 점수를 부여하였다(참고문헌 : Park, S.W., Oh, T.Y., Kim,Y.S., Sim, H., et al., Artemisia asiatica extracts protect against ethanol-induced injury in gastric mucosa of rats. J. Gastroenterol. Hepatol. 2008, 23, 976?984.).
(4) 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
위 조직 100㎎에 0.5% hexadecyl trimethyl ammonium bromide 함유 10 mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 200㎕를 넣고 균질화(homogenization) 하였다. 이후, 4℃ 및 10,000×g의 조건에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액 50 ㎕를 0.95 ㎖ 의 반응액(1.6mM tetramethyl benzidine과 0.1mM H2O2 함유)에 넣고 37℃에서 반응시키면서 650 ㎚에서 경시적으로 흡광도를 측정하였다. 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성은 반응물로서 생긴 peroxide 1 μmol/㎖를 1 unit로 계산하였다.
(5) 염증 지표 측정
위 조직을 Qiagen RNeasy Mini Kit로 정제하여 mRNA 2㎍을 분리하고, Takara Prime Script Rtase를 이용하여 cDNA를 만들었다. 이후, quantitative real time polymerase chain reaction(Qiagn thermal cycler, Takara SYBER premix agent, Thermal cycling conditions: activation of DNA polymerase for 5 min at 95℃, followed by 40 cycles of amplification for 10 s at 95℃ and for 45 s at 60℃)을 이용하여 CXCL4[chemokine (C-X-C motif) ligand 4] 및 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)의 발현량을 측정하였다. 하기 표 24는 quantitative real time polymerase chain reaction에 사용된 프라이머(primer) 서열을 분석 대상 사이토카인(cytokine)별로 나타낸 것이다.
분석 대상 사이토카인 프라이머 종류 프라이머 염기서열
TNF-α Forward 5'-CTGTAGCCCACGTCGTAGC-3'
Reverse 5'-TTGAGATCCATGCCGTTG-3'
CXCL4 Forward 5'-AGTCCTGAGCTGCTGCTTCT-3'
Reverse 5'-GATCTCCATCGCTTTCTTCG-3'
(6) 실험결과
도 25는 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 사진으로 나타낸 것이고, 도 26은 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 총 위 병변 점수(gross gastric lesion score)로 나타낸 것이고, 도 27은 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 궤양 지수(ulcer index)로 나타낸 것이고, 도 28은 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 조직 활성 지수(Histological activity index)로 나타낸 것이다. 또한, 도 29는 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성으로 나타낸 것이다. 또한, 도 30은 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 CXCL4의 발현 수준으로 나타낸 것이고, 도 31은 본 발명의 2차 실험에서, 에탄올에 의해 위궤양이 유발된 생쥐의 위점막(stomach mucosa)에 대해 유산균이 미치는 영향을 TNF-α의 발현 수준으로 나타낸 것이다. 도 30 및 도 31에서 정상군을 제외한 실험군들의 CXCL4 발현 수준 및 TNF-α 발현 수준은 정상군의 발현량을 기준으로 하여 배수(fold change)로 나타내었다. 도 25 내지 도 31에서 "Nor"은 정상군을 나타내고, "Ethanol"는 에탄올에 의해 위궤양이 유발되고 시료로 생리식염수가 투여된 음성 대조군을 나타내고, "Ethanol+Ranitidine"은 에탄올에 의해 위궤양이 유발되고 시료로 라니티딘(Ranitidine)이 투여된 실험군을 나타내고, "Ethanol+LC27"은 에탄올에 의해 위궤양이 유발되고 시료로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27이 투여된 실험군을 나타내고, "Ethanol+LC67"은 에탄올에 의해 위궤양이 유발되고 시료로 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67이 투여된 실험군을 나타내고, "Ethanol+LC27/LC67"은 에탄올에 의해 위궤양이 유발되고 시료로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균이 투여된 실험군을 나타낸다. 도 25 내지 도 29에서 보이는 바와 같이 내고, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27 또는 이들의 혼합 유산균은 에탄올에 의해 유발된 위 손상 또는 위궤양을 효과적으로 개선하였다. 또한, 도 30 및 도 31에서 보이는 바와 같이 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27 또는 이들의 혼합 유산균은 에탄올에 의해 위 손상 또는 위궤양이 유발된 생쥐의 염증 지표 수준을 크게 경감시켰다.
8. 유산균의 알코올 유도성 간 손상 개선 효과 평가(in vivo )
(1) 실험동물
5주령 C57BL/6 수컷 생쥐(24-27g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하고, 습도 50±10%, 온도 25±2℃, 조명은 12시간 킨 후 12시간 끄는 것을 반복하는 조절된 환경 조건에서 일주일 동안 사육한 후 실험에 사용하였다. 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험에서 한 군은 6마리로 하였다.
(2) 알코올에 의한 간 손상 유도 및 시료 투여
1개의 실험군에는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27을 생리식염수에 현탁하여 매일 1회씩 1×109 CFU의 양으로 3일 동안 경구투여하고 1개의 실험군에는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 생리식염수에 현탁하여 매일 1회씩 1×109 CFU의 양으로 3일 동안 경구투여하고, 1개의 실험군에는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균을 생리식염수에 현탁하여 매일 1회씩 1×109 CFU의 양으로 3일 동안 경구투여하였다. 또한, 양성 대조군에는 상업적인 간 손상 치료제인 실리마린(silymarin)을 매일 1회씩 50 ㎎/㎏의 양으로 3일 동안 경구투여하였다. 또한, 정상군 및 음성 대조군에는 생리식염수 용액을 매일 1회씩 0.1㎖의 양으로 3일 동안 경구투여하였다. 시료 또는 생리식염수를 3일 동안 경구투여하고 3시간 후에 정상군을 제외한 모든 실험군의 생쥐에게 에탄올을 6 ㎖/㎏의 양으로 복강투여하여 간 손상을 유발하였다. 또한, 정상군에는 에탄올 대신 생리식염수를 6 ㎖/㎏의 양으로 복강투여하였다. 이후, 실험 생쥐를 12시간 동안 절식 및 절수시킨 후 희생시켜 심장채혈을 하였다.
(3) 간 기능 지표 측정 및 결과
채취한 혈액을 상온에서 60분간 방치하고 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청의 GPT(glutamic pyruvate transaminase)와 GOT(glutamic oxalacetic transaminase)를 혈액분석 키트((ALT & AST 측정 키트; Asan Pharm. Co., 대한민국)를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 하기 표 25에 나타내었다. 하기 표 25에서 보이는 바와 같이 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27 또는 이들의 혼합 유산균은 에탄올에 의해 유발된 간 손상을 효과적으로 개선하였고, 특히 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67은 상업적인 간 손상 치료제인 실리마린(silymarin)보다 우수한 효과를 보였다.
실험군 구분 GOT(IU/L) GPT(IU/L)
정상군 52.1 42.2
음성 대조군 107.7 156.3
에탄올 및 LC27을 투여한 군 82.3 95.4
에탄올 및 LC67을 투여한 군 62.5 65.8
에탄올 및 LC27/LC67을 투여한 군 71.4 78.3
에탄올 및 실리마린을 투여한 군 79.5 87.5
* LC27 : 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27* LC67 : 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67
* LC27/LC67 : 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC27과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67을 동량으로 혼합하여 제조한 혼합 유산균
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11762P 20150901 한국미생물보존센터(국외) KCCM11763P 20150901 한국미생물보존센터(국외) KCCM11764P 20150901 한국미생물보존센터(국외) KCCM11800P 20160111 한국미생물보존센터(국외) KCCM11801P 20160111 한국미생물보존센터(국외) KCCM11802P 20160111
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Novel lactic acid bacteria with various functionality and use thereof <130> DP-16-672 <150> KR 10-2015-0130124 <151> 2015-09-15 <150> KR 10-2016-0005018 <151> 2016-01-15 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1132 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 16S rDNA of Lactobacillus brevis CH23 <400> 1 agggataaca cttggaaaca ggtgctaata ccgtataaca acaaaatccg catggatttt 60 gtttgaaagg tggcttcggc tatcacttct ggatgatccc gcggcgtatt agttagttgg 120 tgaggtaaag gcccaccaag acgatgatac gtagccgacc tgagagggta atcggccaca 180 ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat 240 ggacgaaagt ctgatggagc aatgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaaact 300 ctgttgttaa agaagaacac ctttgagagt aactgttcaa gggttgacgg tatttaacca 360 gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 420 cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccttc 480 ggcttaaccg gagaagtgca tcggaaactg ggagacttga gtgcagaaga ggacagtgga 540 actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc 600 tgtctagtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac 660 cctgstagtc catgccgtaa acgatgagtg ctaagtgttg gagggtttcc gcccttcagt 720 gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa 780 aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agctacgcga 840 agaaccttac caggtcttga catcttctgc caatcttaga gataagacgt tcccttcggg 900 gacagaatga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 960 tcccgcaacg agcgcaaccc ttattatcag ttgccagcat tcagttgggc actctggtga 1020 gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1080 acctgggcta cacacgtgct acaatggacg gtacaacgag tcgcgaagtc gt 1132 <210> 2 <211> 1258 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 16S rDNA of Lactobacillus johnsonii CH32 <400> 2 gtaacttgcc caagagactg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc ggataacaac 60 actagacgca tgtctagagt ttgaaagatg gttctgctat cactcttgga tggacctgcg 120 gtgcattagc tagttggtaa ggtaacggct taccaaggca atgatgcata 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atccgcgccg 540 ggtacgggcg ggcttgagtg cggtagggga gactggaatt cccggtgtaa cggtggaatg 600 tgtagatatc gggaagaaca ccaatggcga aggcaggtct ctgggccgtt actgacgctg 660 aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 720 gtggatgctg gatgtggggc ccgttccacg ggttccgtgt cggagctaac gcgttaagca 780 tcccgcctgg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa gaaattgacg ggggcccgca 840 caagcggcgg agcatgcgga ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tgggcttcac 900 atgttcccga cggtcgtaga gatacggctt cccttcgggg cgggttcaca ggtggtgcat 960 ggtcgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc 1020 gccccgtgtt gccagcggat tatgccggga actcacgggg gaccgccggg gttaactcgg 1080 aggaaggtgg ggatgacgtc agatcatcat gccccttacg tccagggctt cacgcatgct 1140 acaatggccg gtacaacggg atgcgacgcg gcgacgcgga gcggatccct gaaaaccggt 1200 ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagg cggagtcgct agtaatcgcg 1260 aatcagcaac gtcgcggtga atgcgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcaagtcat 1320 gaaagtgggc agcacccgaa gccggtgg 1348 <210> 4 <211> 1421 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 16S rDNA of Lactobacillus plantarum LC5 <400> 4 ctggtattga ttggtgcttg catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt 60 aacacgtggg aaacctgccc agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg 120 cataacaact tggaccgcat ggtccgagct tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga 180 tggtcccgcg gcgtattagc tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta 240 gccgacctga gagggtaatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg 300 aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag 360 tgaagaaggg tttcggctcg taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac 420 tgttcaggta ttgacggtat ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg 540 gttttttaag tctgatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg 600 aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat 660 atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa 720 agtatgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac gatgaatgct 780 aagtgttgga 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tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1020 cccgcaacga gcgcaaccct tattatcagt tgccagcatt aagttgggca ctctggtgag 1080 actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1140 cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt tgcgaactcg cgagagtaag 1200 ctaatctctt aaagccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc 1260 ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1320 caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa caccca 1356 <210> 6 <211> 1325 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 16S rDNA of Lactobacillus plantarum LC28 <400> 6 catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg aaacctgccc 60 agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact tggaccgcat 120 ggtccgagtt tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga tggtcccgcg gcgtattagc 180 tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta gccgacctga gagggtaatc 240 ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 300 ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg 360 taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta ttgacggtat 420 ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 480 cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 540 agccttcggc tcaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga 600 cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 660 aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag caaacaggat 720 tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag ggtttccgcc 780 cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga 840 aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900 tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat tagacgttcc 960 cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1020 ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa gttgggcact 1080 ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1140 ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgaactcgcg 1200 agagtaagct aatctcttaa agccattctc 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gattcgcgat tactagcgac tccgccttca cgcagtcgag 120 ttgcagactg cgatccgaac tgagaccggt tttcagggat ccgctccgcg tcgccgcgtc 180 gcatcccgtt gtaccggcca ttgtagcatg cgtgaagccc tggacgtaag gggcatgatg 240 atctgacgtc atccccacct tcctccgagt taaccccggc ggtcccccgt gagttcccgg 300 cataatccgc tggcaacacg gggcgagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc 360 tcacgacacg agctgacgac gaccatgcac cacctgtgaa cccgccccga agggaagccg 420 catctctacg accgtcggga acatgtcaag cccaggtaag gttcttcgcg ttgcatcgaa 480 ttaatccgca tgctccgccg cttgtgcggg cccccgtcaa tttctttgag ttttagcctt 540 gcggccgtac tccccaggcg ggatgcttaa cgcgttagct ccgacacgga acccgtggaa 600 cgggccccac atccagcatc caccgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660 tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc agtaacggcc cagagacctg ccttcgccat 720 tggtgttctt cccgatatct acacattcca ccgttacacc gggaattcca gtctccccta 780 ccgcactcaa gcccgcccgt acccggcgcg gatccaccgt taagcgatgg actttcacac 840 cggacgcgac gaaccgccta cgagcccttt acgcccaata attccggata acgcttgcac 900 cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccggt gcttattcaa cgggtaaact 960 cactctcgct tgctccccga taaaagaggt ttacaacccg aaggcctcca tccctcacgc 1020 ggcgtcgctg catcaggctt gcgcccattg tgcaatattc cccactgctg cctcccgtag 1080 gagtctgggc cgtatctcag tcccaatgtg gccggtcgcc ctctcaggcc ggctacccgt 1140 cgaagccacg gtgggccgtt accccgccgt caagctgata ggacgcgacc ccatcccata 1200 ccgcgaaagc tttcccagaa gaccatgcga tcaactggag catccggcat taccacccgt 1260 ttccaggagc tattccggtg tatggggcag gtcggtcacg cattactcac ccgttcgcca 1320 ctctcaccac caagcaaagt ctc 1343

Claims (17)

  1. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 (수탁번호 : KCCM 11802P).
  2. 제1항에 있어서, 상기 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 (수탁번호 : KCCM 11802P)은 항산화 활성, 베타-글루쿠로니다제 저해 활성, 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS) 생성 억제 활성 및 밀착연접단백질(tight junction protein) 발현 유도 활성으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 특징을 가지는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 (수탁번호 : KCCM 11802P).
  3. 제1항에 있어서, 상기 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 (수탁번호 : KCCM 11802P)은 서열번호 7의 16S rDNA 서열을 포함하는 것인 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 (수탁번호 : KCCM 11802P).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 (수탁번호 : KCCM 11802P)의 배양물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 (수탁번호 : KCCM 11802P)의 파쇄물.
  6. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 (수탁번호 : KCCM 11802P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 장 손상, 간 손상, 알러지 질환 및 염증 질환으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 약학 조성물은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23 (수탁번호 : KCCM 11762P), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57 (수탁번호 : KCCM 11764P) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5 (수탁번호 : KCCM 11800P)로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유산균, 이들의 배양물, 이들의 파쇄물 또는 이들의 추출물을 더 포함하는 약학 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 장 손상은 장누수 증후군인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 간 손상은 간염, 지방간 및 간 경변증에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 알러지 질환은 아토피 피부염, 천식, 인후염 및 만성 피부염에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 상기 염증 질환은 위염, 위궤양, 대장염 및 관절염에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  12. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) LC67 (수탁번호 : KCCM 11802P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는, 장 손상, 간 손상, 알러지 질환 및 염증 질환으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 식품 조성물은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CH23 (수탁번호 : KCCM 11762P), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CH57 (수탁번호 : KCCM 11764P) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) LC5 (수탁번호 : KCCM 11800P)로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유산균, 이들의 배양물, 이들의 파쇄물 또는 이들의 추출물을 더 포함하는 식품 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 장 손상은 장누수 증후군인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 간 손상은 간염, 지방간 및 간 경변증에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 상기 알러지 질환은 아토피 피부염, 천식, 인후염 및 만성 피부염에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  17. 제12항에 있어서, 상기 염증 질환은 위염, 위궤양, 대장염 및 관절염에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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