CN113018320A - 约氏乳杆菌bs15在制备预防和/或治疗慢性氟中毒导致的肠道损伤药物中的应用 - Google Patents
约氏乳杆菌bs15在制备预防和/或治疗慢性氟中毒导致的肠道损伤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物应用的技术领域,本发明提供了一种约氏乳杆菌BS15在制备预防和/或治疗慢性氟中毒导致的肠道损伤药物中的应用。本发明的约氏乳杆菌BS15已经于2013年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址:中国武汉武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M2013663。约氏乳杆菌BS15的摄入显著降低了慢性氟中毒对肠道菌群、肠组织发育和肠壁通透性造成的不良影响,促进了肠道上皮细胞紧密连接蛋白的分泌,减少了致病菌对肠道上皮细胞的粘附,改善了肠道微生物生态环境和肠道菌群结构。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用的技术领域,尤其涉及一种约氏乳杆菌BS15在制备预防和/或治疗慢性氟中毒导致的肠道损伤药物中的应用。
背景技术
氟作为卤族元素之一,化学性质极为活泼。它是人类和其它动物正常生长所必需的微量元素,适量的氟可以有效增强机体的骨骼和牙齿硬度,对神经系统的兴奋性具有促进效果,还可以促进某些酶的正常生物活性。但是如果机体摄入过量的氟,就必然会引起氟中毒。长期过量摄入氟化物除引起氟斑牙和氟骨症外,还会造成软组织损伤,例如脊髓、心脏、肝脏、肺、肾脏以及大脑等的损伤。
目前国内针对高氟地区人与动物氟中毒的预防和治疗还没有统一的特效药出现。从对症治疗角度出发,对于出现氟中毒症状的患者多给予适量非甾体类镇痛剂(阿司匹林、吲哚美辛);对于出现骨骼畸形甚至椎管梗阻或截瘫的患者建议尽早进行手术以防止畸形加剧并解除神经压迫。
在现代医学中,多种支持治疗或辅助治疗对氟中毒病人的症状缓解十分重要。氟康宁和氟康痛都可以作为临床中治疗氟中毒的药物。其中,氟康宁是目前治疗中、重度氟中毒的有效药物之一。其治疗氟骨症的机制来源于药的主成分——马钱子。该成分对脊髓神经有选择性兴奋作用,可以提高骨骼肌的紧张度,使挛缩僵直的关节得到改善,从而改善氟中毒引起的弯腰、驼背和肢体畸形。另外,还可能通过大脑皮层反射作用,促使运动神经、自主神经和内分泌功能改善全身血液循环和营养状态,进一步促进病变组织的修复,一些酶活性增高,通过体液循环的调节,机体内环境达到新的平衡。但该药会导致部分患者出现轻度抽搐或轻微出汗,严重的心脑血管病患者应慎用。
此外,钙剂、镁剂、铝剂和硼剂等也是目前较常应用的抗氟中毒药物。钙与氟具有较强的亲和力,在肠道内两者可形成溶解性较差的CaF2随粪便排出,因此可使氟吸收减少。钙剂对疏松型、软化型和伴有钙吸入不足的氟骨症治疗有效,但长期应用钙剂可使骨硬化和软组织钙化加重,对硬化型氟骨症的治疗可能是不利的;饮水中镁的含量与体内氟的吸收呈反比。镁是某些酶的激活物,体内氟与镁结合形成镁氟磷酸盐复合物后,导致体内镁减少,酶的活性受到抑制。增加镁的摄入,可使镁的抑制作用减轻。蛇纹石是一种自然生成的镁硅酸盐,能使骨中的氟释出,不同地区产生的蛇纹石,结构有所不同,排氟效果也不同,同时它也是上述氟康痛胶囊或片剂的主成分之一。但蛇纹石常含有石棉成分,而该成分是人类致癌物质,对其使用安全的问题一直都存在着争议;铝是氟的强力络合剂,肠道中40%~60%的氟可被铝结合,小剂量的氢氧化铝可增加粪氟的排出。值得注意的是,体内铝增加后不易排出,而且可影响钙磷代谢,导致血磷降低,骨磷释放,出现骨软化症;硼能在骨骼和胃肠道内与氟形成BF4复合物,降低氟的毒性。BF4经消化道吸收,储存在内脏和骨骼中,然后由肾脏排出体外,降低血氟浓度。除了上述药物外,部分中医中药也以补肾、强筋骨、活血和止痛的目的来缓解氟中毒带来的表征和机体损伤。
但由于我国地域广大,幅员辽阔,各个地区由于存在不同的营养水平、饮水中的化学成分、个体差异、生活和饮食习惯等诸多因素,想要综合全面的进行高氟污染治理和氟中毒的预防与治疗仍存在诸多困难,而上述手段对于氟中毒个体的预防和治疗也都还存在一定的局限性。
益生菌被定义为获得经过严格筛选的菌体,在剂量充足时能够给宿主带来健康的益处。广泛的研究发现益生菌通过在肠道内形成有抗菌作用的物质 (如乙酸和脂肪酸),分泌丁酸为肠道上皮细胞提供营养成分,增强肠上皮细胞的紧密性,降低肠道黏膜的通透性,促进胃肠蠕动,以及促进肠道上皮细胞黏蛋白的分泌,减少致病菌对肠道上皮细胞的黏附从而改善肠道内环境和肠道菌群结构。
约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)属于厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌纲(Bacilli)乳杆菌目(Lactobacillales)乳杆菌科(Lactobacillaceae) 乳杆菌属(Lactobacillus)。约氏乳杆菌BS15(Lactobacillusjohnsonii BS15,以下简称为约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663)是由四川农业大学动物医学院动物微生态研究中心自四川省阿坝藏族自治州红原草原的的牧民土制酸奶中分离得到,在前期的研究中证实其具有良好的预防小鼠非酒精性脂肪肝的效果。后经验证BS15不仅可以成功定植于人类、大鼠、小鼠、鱼、猪和鸡的肠道中,而且还具有改善肉鸡鸡肉品质的作用。但是,关于约氏乳杆菌与预防和治疗慢性氟中毒导致的肠道损伤之间的联系,从未有过任何研究报道。
发明内容
鉴于对现有防治技术的上述不足,本发明的目的在于公开约氏乳酸杆菌 BS15在制备预防和/或治疗慢性氟中毒引起的肠道损伤药物中的应用。旨在利用该菌株消除由于长期高氟摄入引起的肠道菌群结构破坏、肠组织发育水平和肠壁通透性等方面的不利影响,为寻找一种安全有效、副作用小,成本较低的全新治疗方法奠定理论基础。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种约氏乳杆菌BS15在制备预防和/或治疗慢性氟中毒导致的肠道损伤药物中的应用。
优选的,所述药物为约氏乳杆菌BS15菌液。
优选的,所述约氏乳杆菌BS15菌液的浓度为2×107~2×109CFU/0.2mL。
本发明提供了约氏乳杆菌BS15在制备预防和/或治疗慢性氟中毒导致的肠道损伤药物中的应用。约氏乳杆菌BS15的摄入显著降低了慢性氟中毒对肠道菌群、肠组织发育和肠壁通透性造成的不良影响,促进了肠道上皮细胞紧密连接蛋白的分泌,减少了致病菌对肠道上皮细胞的粘附,改善了肠道微生物生态环境和肠道菌群结构。
附图说明
图1为用约氏乳酸杆菌BS15预防慢性氟中毒导致的肠道损伤的试验设计流程图;
图2为实施例1对照组小鼠十二指肠、空肠和回肠的H&E染色图;
图3为实施例1高氟饮水组小鼠十二指肠、空肠和回肠的H&E染色图;
图4为实施例1高氟饮水+益生菌组小鼠十二指肠、空肠和回肠的H&E 染色图;
图5为实施例1各组小鼠回肠(门和属水平)中肠道菌群之间物种相对丰度柱形累加图;
图6为实施例1各组小鼠结肠(门和属水平)中肠道菌群之间物种相对丰度柱形累加图;
图7为实施例1各组小鼠回肠物种Alpha多样性差异图(Observed Species和Shannon指数);
图8为实施例1各组小鼠结肠物种Alpha多样性差异图(Observed Species和Shannon指数);
图9为实施例1各组小鼠回肠物种Beta多样性差异图(加权距离分析);
图10为实施例1各组小鼠结肠物种Beta多样性差异图(加权距离分析);
图11为实施例1各组小鼠回肠组织紧密连接蛋白的基因表达水平差异性比较;
图12为实施例1各组小鼠回肠组织紧密连接蛋白ZO-1表达水平;
图13为实施例1各组小鼠回肠组织紧密连接蛋白Occludin表达水平;
图14为实施例1各组小鼠回肠组织紧密连接蛋白Claudin1表达水平。
保藏说明
约氏乳杆菌BS15,已经保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址:中国武汉武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M2013663,保藏时间为2013 年12月13日。
具体实施方式
本发明提供了一种约氏乳杆菌BS15在制备预防和/或治疗慢性氟中毒导致的肠道损伤药物中的应用。
在本发明中,所述约氏乳杆菌BS15由四川农业大学动物医学院动物微生态研究中心提供。
在本发明中,所述药物优选为约氏乳杆菌BS15菌液。
在本发明中,所述约氏乳杆菌BS15菌液优选按照如下方法制备得到:将活化3代后的约氏乳杆菌BS15按照2%(体积比)的比例接种于无菌MRS 液态培养基中,37℃厌氧培养36h后进行活菌计数,将培养液以3000r/min 离心15min后弃去上清液,得到菌体,根据活菌计数结果,用PBS(PH7.0) 缓冲液稀释菌体,得到约氏乳杆菌BS15菌液,置-20℃保存备用。
在本发明中,所述约氏乳杆菌BS15菌液的浓度优选为2×107~2×109 CFU/0.2mL,进一步优选为2×108CFU/0.2mL。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本发明采用30只3周龄的雄性ICR小鼠进行饲喂实验。试验设计流程图如图1,由图1可以看出,小鼠适应期为7天,正试期为98d(即14周),在正试期开始后的14周内高氟饮水+益生菌组小鼠灌胃约氏乳杆菌BS15菌液,对照组和高氟饮水组小鼠灌胃PBS缓冲液(pH7.0),各组饲喂纯净水;从试验的第35天开始到结束,高氟饮水组和高氟饮水+益生菌组饲喂氟 (NaF)含量为100mg/L的高氟水,其它条件不变。
具体的实验分组及饲喂方式见表1,分为对照组、高氟饮水组和高氟饮水+益生菌组,每组10只小鼠。小鼠适应期7d,正试期为98d(正试期分为前期0~28d和后期29~98d),各组每天8:00补充饮水(纯净水),自由采食饲料,并进行灌胃。动物房温度为23±2℃,控制12h光照,12h黑暗,每3d更换一次垫料。
表1实验分组及饲喂
本实施例中约氏乳酸杆菌BS15菌液的制备方法如下:将活化过3次后的约氏乳酸杆菌BS15按2%(体积比)的接种量接种MRS液体培养基,37℃厌氧静置培养36h后活菌计数,3000r/min离心15min弃上清液,得到菌体,用pH7.0的磷酸盐(PBS)缓冲液将菌体稀释为2×108CFU/0.2ml,置-20℃保存备用,试验的每周按照上述方法制备一次菌液,灌胃前将菌液置25℃温水活化后使用。
本发明中使用的高氟饮水氟(NaF)含量为100mg/L。
本实施例中的试验动物(ICR雄性小鼠)和饲料均购自成都达硕生物科技有限公司。
在试验采样后利用H&E染色镜检小肠(十二指肠、空肠和回肠)的组织发育水平;通过16S rDNA扩增子测序技术检测各组动物的小肠回肠和大肠结肠的菌群多样性以及物种组成情况;使用实时荧光定量PCR和免疫组化的方法判断小肠紧密连接蛋白的基因表达和蛋白水平的变化,以此来判断约氏乳酸杆菌BS15是否具有预防和治疗慢性氟中毒的作用。检测结果如下:
(1)对照组、高氟饮水组和高氟饮水+益生菌组的H&E染色镜检小肠 (十二指肠、空肠和回肠)的结果如图2、图3和图4所示。由图2、图3 和图4可以看出,高氟饮水组小鼠在单独接触高氟饮水98天后,小肠各个肠段(十二指肠、空肠和回肠)的绒毛长度和隐窝深度与对照组相比发生明显改变,具体表现为绒毛长度减小,隐窝深度增加,肠道发育状况不佳;而高氟饮水+益生菌组在约氏乳杆菌BS15菌液的作用下与单独高氟饮水组相比,肠道发育水平获得了明显改善,从图中可以看出高氟饮水+益生菌组各个肠段的绒毛长度增加,隐窝深度减小。
(2)通过16S rDNA扩增子测序技术检测各组小鼠的小肠回肠和大肠结肠的菌群多样性以及物种组成情况。
根据物种注释结果,选取每个组中门和属水平上丰度排名靠前的物种,生成的物种相对丰度柱形累加图(图5和图6),以便直观的观察各组在不同分类水平上,相对丰度较高的物种及其比例。由图5和图6可以看出,在对照组(Ctrl)小肠回肠和大肠结肠的物种组成中,厚壁菌门(Firmicutes,门水平)和乳杆菌属(Lactobacillus,属水平)可以作为两个肠段的绝对优势物种;而高氟饮水组(F)在高氟饮水的单独作用下,厚壁菌门(Firmicutes)和乳杆菌属(Lactobacillus)在整个物种组成中所占比例明显减少,而回肠中的放线菌门(Actinobacteria,门水平)和Romboutsia(属水平)以及结肠中的拟杆菌门(Bacteroidetes,门水平)和拟杆菌属(Bacteroidetes,属水平)在整个物种组成中所占比例明显增加;而高氟饮水+益生菌组(Prob)在益生菌的介入下有助于恢复回肠和结肠中的菌群结构接近于对照组水平。
由图7和图8分别为各组小鼠回肠物种Alpha多样性差异图(Observed Species和Shannon指数);和各组小鼠结肠物种Alpha多样性差异图 (Observed Species和Shannon指数)。由图7和图8可以看出,与对照组相比,小鼠回肠和结肠的Alpha多样性ObservedSpecies和Shannon指数在高氟饮水单独作用下均发生极显著增加;高氟饮水+益生菌组小鼠回肠的 Observed Species和Shannon指数在约氏乳杆菌BS15的作用下出现极显著降低,并接近对照组正常水平。注:箱型图可以直观的反映组内物种多样性的中位数、离散程度、最大值、最小值和异常值,同时,通过wilcox秩和检验分析组间物种多样性的差异显著性。“**”表示P<0.01,差异极显著;“*”表示P<0.05,差异显著。
基于Weighted Unifrac距离来进行主坐标分析(PCoA),并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图展示。由图9可以看出,回肠中对照组和高氟饮水+益生菌组的样本距离接近,表示这两个组的物种组成结构相似,而高氟饮水组与其它两个组的样本距离较远,表现出了不同的物种组成结构;由图 10可以看出,结肠中对照组与高氟饮水组的物种组成结构差异较大,而高氟饮水+益生菌组的物种组成结构介于其它两组之间,但更接近于对照组的物种组成结构。
(3)使用实时荧光定量PCR判断小肠紧密连接蛋白的基因表达水平,结果如图11所示,从图11可以看出,高氟饮水组的ZO-1mRNA水平明显低于其它两组,而其它两组无明显差异。与对照组相比,高氟饮水组和高氟饮水+益生菌组的Claudin-1、Occludin mRNA表达水平明显降低。高氟饮水组与高氟饮水+益生菌组的Claudin-1mRNA水平无显著差异。高氟饮水+益生菌组Occludin mRNA水平略高于F组。通过免疫组化方法检测回肠紧密连接蛋白的表达水平,结果也呈相同趋势,如图12、图13和图14所示。
由以上实施例可知,约氏乳杆菌BS15在高氟饮水环境下能够促进肠道上皮细胞紧密连接蛋白的分泌,减少致病菌对肠道上皮细胞的粘附,从而改善肠道微生物生态环境和肠道菌群结构。约氏乳杆菌BS15的摄入显著降低了慢性氟中毒对肠道菌群、肠组织发育和肠壁通透性造成的不良影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.约氏乳杆菌BS15在制备预防和/或治疗慢性氟中毒导致的肠道损伤药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物为约氏乳杆菌BS15菌液。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述约氏乳杆菌BS15菌液的浓度为2×107~2×109CFU/0.2mL。
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