CN101314763B - 具有抗胃肠道致病菌、抗氧化和降血压作用的短双歧杆菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的具有优异益生作用的短双歧杆菌。本发明的菌株从新疆和田地区长寿老人的排泄物中筛选获得，具有突出的耐酸和耐胆汁酸盐能力，对肠道上皮细胞具有粘附特性，并具有优异的抗菌特性、优良的抗氧化能力，以及降血压功能，食用安全，从而可广泛用于功能性添加物、乳品、饮料、功能食品及药品生产等领域。

Description

具有抗胃肠道致病菌、抗氧化和降血压作用的短双歧杆菌及其用途

技术领域

本发明属于微生物学领域，更具体的，本发明涉及一种新颖的具有抗胃肠道致病菌、抗氧化和降血压功能的短双歧杆菌，以及包含该菌株或其代谢产物的食物组合物或药物组合物。

背景技术

双歧杆菌为革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动，严格厌氧，形态多变，不同种或同种不同龄，不同生长环境而呈现弯曲杆状、V和Y形等多种形态，并由此得名双歧杆菌。双歧杆菌于1899年由法国巴斯德研究所的Tisser首次在母乳喂养婴儿粪便中发现并分离出来，后继续研究又发现，在人体消化道中，其数量随年龄增大呈动态变化，并与机体的许多生理、病理现象关系密切，因此引起了包括微生物学、医学、免疫学、营养学等领域学者们的广泛兴趣，并对双歧杆菌进行了更广泛的研究，其中包括双歧杆菌的生理、生化特性，分类，对宿主的生理作用机制的研究等。

近来大量的研究资料表明，具有优良特性的双歧杆菌必须来源于人类，因此在人体内寻找出优势双歧杆菌加以利用，对于维持人体健康、促进机体正常功能、延缓衰老等，将较其它来源的双歧杆菌具有更强大的功能。

尽管目前本领域已经分离了多种双歧杆菌且这些双歧杆菌均具有一定的功能，然而有些双歧杆菌并非分离自人体，服用后可能会对人体造成一定的安全威胁；并且，大多双歧杆菌的对致病菌的抑制作用不够强，益生效果不够明显。因此，本领域迫切需要找到一种具有益生作用且安全性好、功效明显的双歧杆菌。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的来源于人体的短双歧杆菌，该菌株可很好地粘附到胃和肠粘膜上，并可抵抗酸、胆汁，对病原性微生物(如幽门螺旋杆菌和大肠杆菌(更特别的为埃希氏大肠杆菌))具有良好的抗性，且具有良好的抗氧化和降血压功能。

本发明的另一目的是提供所述短双歧杆菌或其代谢产物的用途。

本发明的另一目的是提供含有所述短双歧杆菌或其代谢产物的组合物。

在本发明的第一方面，提供一种短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)，所述的短双歧杆菌或其代谢产物具有血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性。

在另一优选例中，所述的短双歧杆菌或其代谢产物具有降血压作用，其血管紧张素转换酶抑制活性超过30％；更优选的，所述的短双歧杆菌或其代谢产物的血管紧张素转换酶抑制活性超过40％。

在另一优选例中，所述的短双歧杆菌接种到牛乳中，37±1℃条件下发酵21±3小时(活菌数约为1×10⁸cfu/ml)后，发酵乳的ACE抑制活性超过30％，更优选地为超过40％。

在另一优选例中，所述的短双歧杆菌具有强的抗酸和抗胆盐能力，在PH2.0，0.6％胆汁酸中放置5小时，活菌数量超过10⁶cfu/ml。

在另一优选例中，所述的短双歧杆菌具有强的抗氧化能力。

在另一优选例中，所述的短双歧杆菌具有强的抑制胃肠道致病菌(如幽门螺杆菌和大肠杆菌(更特别的为埃希氏大肠杆菌))的能力。

在另一优选例中，所述的短双歧杆菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.1993。

在本发明的第二方面，提供所述的短双歧杆菌或其代谢产物的用途，用于制备预防或治疗血管紧张素转换酶异常活化相关疾病的组合物。

在另一优选例中，所述的血管紧张素转换酶异常活化相关疾病包括(但不限于)：心血管疾病，如高血压等。

在另一优选例中，所述的短双歧杆菌或其代谢产物用于制备抑制胃肠道致病菌的组合物；或用于制备预防或治疗细菌性消化道疾病的组合物。

在另一优选例中，所述的细菌性消化道疾病包括(但不限于)：胃炎、胃溃疡、十二指肠炎、大肠炎、小肠炎、结肠炎或直肠炎。

在另一优选例中，所述的短双歧杆菌或其代谢产物用于制备抗氧化的组合物。

在本发明的第三方面，提供一种组合物，所述组合物含有：

(1)有效量的所述的短双歧杆菌或其代谢产物，以及

(2)食品学上或药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物含有10⁴-10¹²cfu/ml或10⁴-10¹²cfu/g的所述的短双歧杆菌。

在另一优选例中，所述的组合物含有10⁵-10¹⁰cfu/ml或10⁵-10¹⁰cfu/g的所述的短双歧杆菌；更优选的，所述的组合物含有10⁶-10⁸cfu/ml或10⁶-10⁸cfu/g的所述的短双歧杆菌。

在另一优选例中，所述的组合物中还含有：

有效量的嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或其它各种适用于食品、药品或保健品开发的菌株。

在另一优选例中，所述的组合物为食物组合物，所述的食物组合物选自：固体、乳品、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。

在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物，所述的药物组合物选自：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A和1B显示了XJH301菌株经革兰氏染色的情况。其中，图1A为1000倍显微拍摄的革兰氏染色图片；图1B为光学电镜拍摄的图片。

图2显示了使用双歧杆菌的特异性引物(Bif1和Bif2)对XJH301菌株进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖电泳的结果。泳道1为重蒸水的电泳结果，泳道2为卷曲乳杆菌的电泳结果，泳道3为植物乳杆菌的电泳结果，泳道4为DL2000Marker的电泳结果，泳道5为本发明菌株的电泳结果，泳道6为短双歧杆菌C101的电泳结果。

图3显示了XJH301菌株中的16S rRNA的部分核苷酸序列测定结果。

图4显示了XJH301菌株中的16S rRNA的部分核苷酸序列。

图5显示了采用引物BF1和BF2扩增XJH301菌株的16S rRNA后，扩增产物的1％琼脂糖电泳结果；其中，泳道M为DL2000，泳道1为空白，泳道2-10为双歧杆菌的扩增结果。

图6显示了XJH301菌株粘附到人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞的体外粘附性试验的观察结果。

图7显示了XJH301菌株对致病性埃希氏大肠杆菌的抑制效果。

图8显示了XJH301菌株对幽门螺旋杆菌的抑制效果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和实验，最终找到了一株具有优异的抗细菌特性、抗氧化功能和降血压功能的短双歧杆菌菌株(保藏号为：CGMCCNo.1993)，本发明人将该菌株命名为“短双歧杆菌XJH301”。多种试验表明，所述的短双歧杆菌具有抗致病菌以及降血压功能，具有耐受低pH值和高胆汁酸盐的能力，并具有很强的消化道粘附能力和降血压能力。基于此完成了本发明。

如本文所用，术语“本发明的短双歧杆菌”，“本发明的菌株”，“短双歧杆菌XJH301”，“菌株XJH301”可互换使用，都指保藏号为CGMCC No.1993的短双歧杆菌。

菌株筛选

本发明的短双歧杆菌是通过以下方法、经过长期的分析和筛选而获得：(1)从新疆和田地区长寿老人粪便中分离获得500多株细菌；(2)对分离获得的细菌进行产酸和牛乳发酵试验，获得301株产酸、凝乳菌株；(3)选用特异性培养基、结合生长特性等，初步确定为乳酸菌类群；(4)从初步确定的乳酸菌中，比较它们的加工和生长特性，筛选具有优异的抗细菌特性、耐酸和胆汁酸盐能力、抗氧化能力、降血压功能的安全乳酸菌，从而获得所述菌株。

菌株鉴定

本发明采用以下途径对所述菌株进行鉴定：(1)利用生理、生化特性进行分析；(2)进行糖发酵分析；(3)通过进行16S rRNA序列分析，将本发明的菌株与标准的菌株进行比较，以便确切证实所述细菌菌株。结果，鉴别出所述菌株是一种新的短双歧杆菌。

本发明的短双歧杆菌具有如下生理生化特征：呈革兰氏阳性菌，为无芽孢，棒状或分枝，大小为1.0-1.5μm。这是双歧杆菌的典型特征。本发明的短双歧杆菌具有如下培养特征：在MRS琼脂平板上长成直径为1-2mm的乳脂色菌落，最佳培养温度在37℃。

使用双歧杆菌特异性的引物进行PCR时，本发明的菌株和标准的双歧杆菌中都发现了大约600bp的类似片段，这证明了本发明的菌株属于双歧杆菌。通过使用16S rRNA测序和核苷酸序列BLAST分析，所述菌株以95.5％以上的精确度被证实属于短双歧杆菌，然后使用糖发酵分析，与《伯杰氏细菌鉴定手册》比较，进一步证实所述菌株属于短双歧杆菌。

另一方面，BLAST核苷酸序列比较显示，本发明的菌株与目前已知的其它所有短双歧杆菌的相应序列皆不同，但具有一定的同源性。与标准菌株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)JCM1273(其16S rRNA序列参见Genebank登录号：AF491832)比较16S rRNA序列的结果显示，本发明的菌株与所述标准菌株存在序列上的不同。因此可见，本发明的菌株是一种以往未被分离的新的短双歧杆菌。

菌株的安全性及有益功能

A.安全性

本发明的菌株是分离自健康人体的，因此具有良好的安全性。

为了进一步证实所述菌株的安全性，本发明人选择ICR小鼠作为实验动物，观察小鼠在服用了本发明的菌株后的反应。结果发现，小鼠在服用期间和服用后未出现不适症状，在整个观察期间精神状态良好，心、肝、脾、肺、肾等内脏器官也均未见任何异常。

B.耐酸和胆汁酸盐能力

本发明的短双歧杆菌还具有耐低pH值和高胆汁酸盐能力。试验证明，本发明的菌株可以在pH2、含0.6％胆汁酸的MRS培养基中放置5小时活菌数量超过10⁶cfu/mL，说明具有很强的抵抗酸和胆盐双重能力。

C.粘附能力

本发明的短双歧杆菌菌株还具有较强的粘附能力。为了检测菌株的粘附能力，本发明人采用一种典型的肠道上皮细胞(人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞)进行了的体外粘附性试验，并与标准菌株短双歧杆菌作比较。结果证实本发明的菌株具有比标准菌株更强的肠道上皮细胞粘附能力。

此外，本发明人还测定本发明的菌株对致病性大肠杆菌(更特别的为埃希氏大肠杆菌)粘附的竞争性粘附抑制作用，并与其它多株短双歧杆菌比较，结果发现本发明的菌株的竞争性粘附抑制作用最强。

D.抑菌能力

本发明的短双歧杆菌还具有抑制胃肠道致病菌的作用。所述的胃肠道致病菌比如幽门螺旋杆菌、埃希氏大肠杆菌。

在本发明的实例中，本发明人培养了幽门螺杆菌和埃希氏大肠杆菌，在含有幽门螺杆菌和埃希氏大肠杆菌的培养基平板上打孔注入本发明的短双歧杆菌，观察产生的抑菌圈，并以标准菌株短双歧杆菌作对照。结果发现，本发明的菌株具有比标准菌株更强的致病菌抑制作用。

本领域人员均了解，幽门螺杆菌是导致胃肠炎症的主要致病菌，其生长和繁殖可引起胃炎、胃溃疡、十二指肠炎等的发生。大肠杆菌是导致肠道炎症的重要致病菌，其生长和繁殖可引起大肠炎、小肠炎、结肠炎或直肠炎等的发生。因此可见，本发明的短双歧杆菌可被应用于防治细菌性消化道疾病，如胃炎、胃溃疡、十二指肠炎、肠炎、结肠炎或直肠炎。

E.抗氧化能力

本发明的短双歧杆菌菌株还具有显著的抗氧化的能力。在本发明的实例中，本发明人利用ICR小鼠灌胃菌株培养物，连续8天，末次灌胃后1小时，摘眼球取血，分离血清测试SOD活力和MDA含量，结果发现该菌株培养物能够显著提高小鼠抗氧化能力，减少体内脂质过氧化物的生成。

F.降血压功能

本发明的短双歧杆菌菌株具有降血压功能，具体为在热处理的原料乳中加入5-10％的本发明菌株发酵剂，在37℃发酵17-24小时，体外测定发酵乳的血管紧张素转化酶抑制(ACEI)的活性，结果发现，本发明菌株的发酵乳具有明显抑制血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)活性的功能，其血管紧张素转换酶抑制活性超过30％；更优选的超过40％。

本领域人员均了解，血管紧张素转化酶在血压调节过程中起着非常重要的作用。ACE可以水解无活性的血管紧张素I形成有活性的血管紧张素II，血管紧张素II是已知最强的缩血管物之一，具有收缩血管平滑肌的效应，可以导致血管收缩，引发高血压等心血管疾病。由上述机制可见，抑制ACE的活性可防止血管紧张素I水解为血管紧张素II，从而防止高血压等心血管疾病的发生或发展。因此，本发明的短双歧杆菌可通过抑制ACE的活性而达到防止高血压发生或发展、降低血压的效果。

短双歧杆菌的代谢产物

所述的“短双歧杆菌的代谢产物”是指在本发明的短双歧杆菌生长或繁殖过程中产生的、具有抗氧化、抑菌或降血压活性的代谢物质。例如，所述的代谢产物包括但不限于：所述短双歧杆菌的发酵产物(如发酵乳、发酵液)；所述短双歧杆菌产生的活性成分(如有机酸、胞外糖苷酶)。所述的代谢产物还可以是从菌株培养物中分离出来的一类活性成分或活性成分混合物。

实验证实，双歧杆菌的抑菌作用主要是细胞代谢产生的有机酸使肠道pH值降低，抑制了致病菌的生长繁殖。此外，双歧杆菌产生的胞外糖苷酶，可以降解肠粘膜上皮细胞的杂多糖，由于这些糖既是潜在致病菌的受体也是结合细菌毒素的受体，所以通过这种酶可阻止潜在致病菌及其毒素在肠粘膜上皮细胞的粘附，对宿主起到保护作用。

组合物

本发明还提供一种组合物，所述组合物含有：(1)有效量本发明的短双歧杆菌或其代谢产物，以及(2)食品学上或药学上可接受的载体。所述的组合物具有抑菌、抗氧化以及降血压功能。

本发明的组合物可以是：药物组合物、食物组合物或保健品组合物。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，“药学上可接受的”或“食品上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”或“食品上可接受的载体”是用于将本发明的短双歧杆菌或其代谢产物传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持短双歧杆菌或其代谢产物活性的载体。

所述的短双歧杆菌或其代谢产物可与一种或多种食品上或药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服施用：片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05％-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10％-50％糖)、和酏剂(含有约20％-50％乙醇)。

作为本发明的一种方式，所述的组合物为食物组合物，所述的食物组合物选自：固体、乳品、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。例如，所述食物组合物可以是含有所述短双歧杆菌或其培养产物的发酵乳产品，粉末状食品，冷冻食品，饮料等等。作为本发明的另一种方式，所述的组合物为药物组合物，所述的药物组合物选自：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。

“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。作为本发明的优选方式，所述的组合物含有10⁴-10¹²cfu/ml或10⁴-10¹²cfu/g的所述的短双歧杆菌。更优选的，所述的组合物含有10⁵-10¹⁰cfu/ml或10⁵-10¹⁰cfu/g的所述的短双歧杆菌；进一步优选的，所述的组合物含有10⁶-10⁸cfu/ml或10⁶-10⁸cfu/g的所述的短双歧杆菌。

为了达到更好的效果，本发明的短双歧杆菌还可与其它菌株(如其它益生菌)联用。因此，所述的组合物中还可含有其它功能性菌株，例如嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖杆菌等。

当用于制备药物组合物时，所用的短双歧杆菌或其代谢产物的有效剂量可随施用的模式、施用的人群或待治疗的疾病的严重程度而变化。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约10⁴-10¹²cfu/g的活性短双歧杆菌或其代谢产物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

所述的短双歧杆菌或其代谢产物可通过口服等途径给予。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：培养基、聚乙二醇、非离子型表面活性剂，只要适合短双歧杆菌或其代谢产物特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。

本发明的主要优点在于：

(a)本发明的短双歧杆菌具有优异的抗细菌特性、具有优异的耐酸和胆汁酸盐能力、以及具有降血压功能，从而可广泛用于乳品加工、功能食品生产、增进健康的添加剂及新药开发等。

(b)本发明的短双歧杆菌具有预防和治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎以及由致病性大肠杆菌和其它肠道致病性细菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎的功能。

(c)本发明的短双歧杆菌分离自健康长寿人的体内，因此安全有效，对人体没有任何毒副作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照《微生物：实验手册》(James Cappuccino和Natalie Sherman编，Pearson Education出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：样品的来源和采集

本发明菌株来源于中国的长寿村—新疆和田地区长寿老人粪便。

和田位于新疆最南端，古称于阗，藏话意思为“产玉石的地方”。是丝绸之路南道上的重镇。和田地区总面积为24.8万平方公里，人口150万。其中维吾尔族占总人口的97％以上。早在商周时期，古于阗就和中原有过物质交流。公元前68年，汉宣帝“遣卫司护鄯以西之诸国”，于阗正式纳入汉朝中央政府的统辖之下。古于阗是西域最早的佛教中心，有丰厚的佛文化遗产；许多著名高僧如晋时法显、唐时玄奘都曾涉足和田。而浓郁、独特的民俗风情，更使人耳目一新，饱领异域风采。和田气候温暖，特产丰富，民风淳朴，素以“金玉之邦、粮棉之仓、丝绸之路、瓜果之乡著称于世。并以玉石、地毯、丝绸等传统物产享誉海内外。这里有世界第二大沙漠的胜景，两千年历史的丝绸古迹，以及人与大自然搏斗创造的沙漠绿洲、千里葡萄长廊等人文景观。

样品采自于新疆和田地区周边50公里范围内，分布在3个区的18位90岁以上的长寿老人。

实施例2：从长寿老人粪便中分离出乳酸菌

菌种筛选共进行了6年(2000-2005)，将新疆和田长寿老人(90岁以上)的26个粪便样品浸入MRS肉汤培养物中，在37℃培养24小时。将该培养物涂布在MRS琼脂平板上，然后在37℃培养3天。培养后，收集在琼脂培养基上出现的菌落，并进一步纯化，利用菌落形态筛选共获得301株产酸菌，通过对其产物测定获得乳酸菌，根据生长特点、代谢特征，并选用特异性培养基，获得优势乳酸菌。从优势乳酸菌中，根据其特性，获得优良特性乳酸菌一株。所述的短双歧杆菌(命名为：短双歧杆菌XJH301)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1993，保藏日为2007年4月6日。

检测细菌特征，包括生理生化反应，以及如下文所述的革兰氏染色、糖发酵能力等(特性鉴定方法如下文所述)。

分离菌株添加10％脱脂乳的肉汤培养物，培养、冻干、保存在-18℃，然后用于检测细菌各种特征试验。

实施例3：革兰氏染色和培养特征

采用革兰氏染色法检测菌株的特征。革兰氏染色的结果如图1A和图1B所示，所述的菌株XJH301呈革兰氏阳性菌，为无芽孢，棒状或分枝，长度为1.0-1.5μm，这是双歧杆菌的典型特征。

然后，研究该菌，以阐明其培养特征。结果是，该菌种在MRS琼脂平板上长成直径为1-2mm的乳脂色菌落，最佳培养温度在37℃。所述的菌株XJH301遗传性状稳定，经数代培养，未发现性状的变异。

实施例4：总基因组DNA的抽提

将所述的菌株XJH301接种到脱脂乳培养基活化，平板划线分离(MRS琼脂培养基)，挑取单菌落接种液体培养基，置于CO₂恒温箱深层厌氧培养(温度37℃，浓度10％)，48小时后收集试管底部的乳酸菌细胞，用于基因组DNA的抽提。

取1.5mL细胞培养液于离心管，6000g离心5min弃上清；沉淀用3mL生理盐水(85％NaCl)洗涤菌体细胞3-5次；沉淀细胞加1200μL抽提缓冲液，并使之悬浮，250μL10％SDS和750μL氯化苄。振荡混匀，60℃振荡水浴保温40min，期间每隔10min颠倒混匀数次，可适当延长时间至1小时，效果更好；超声波处理10min；加入750μL3M的Na₂Ac(pH5.0)，冰浴20min；8000g离心10min收集上清，加0.8倍体积的异丙醇10000g离心10min沉淀；得到的DNA用70％的乙醇洗涤，溶于150μL的TE缓冲液，加入RNase在37℃消化1小时进一步去除RNA。

将提取的乳酸菌基因组DNA样品，各取10uL用1％的琼脂糖进行凝胶电泳，EB染色后，在凝胶成像系统上观测，分析纯度和基因组DNA的完整性。然后将提取的乳酸菌基因组DNA样品在紫外分光光度计上测量OD260nm和OD280nm，对DNA浓度进行定量。

实施例5：双歧杆菌属特异性的分子鉴定

采用一对肠道双歧杆菌属特异性引物Bif₁和Bif₂(见表1)对初步鉴定的菌株XJH301进行常规聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增，特异性引物的PCR扩增程序为：将前述制备的细菌的基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用50μL反应体系进行PCR扩增。其中模板DNA5μL(大约100ng)、2.5mM dNTPs4μL、10×缓冲液5μL、50uM引物Bif₁、Bif₂各1μL，Taq DNA聚合酶1.5U，以ddH₂O补至50μL。PCR循环参数如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火45s，72℃延伸1min；72℃延伸8min。

表1  引物

接着，对PCR产物进行电泳鉴定，通过观察产物电泳图谱是否有一条600bp的特异性条带来判断其是否属于双歧杆菌。以标准双歧杆菌菌株1(短双歧杆菌C101，购自扬州大学乳品研究所)为阳性对照；以重蒸水、卷曲乳杆菌(卷曲乳杆菌072，购自扬州大学乳品研究所)、植物乳杆菌(植物乳杆菌189，购自扬州大学乳品研究所)为阴性对照。

电泳结果如图2所示，本发明的菌株XJH301与标准双歧杆菌菌株1均有一条约600bp的特异性条带(见泳道5和6)，而卷曲乳杆菌072(泳道2)、植物乳杆菌189(泳道3)在相应的位置均没有条带，表明本发明的菌株XJH301属于双歧杆菌。

实施例6：16S rRNA测序分析

由于对于细菌来说，16S rRNA是比较稳定的，因此16S rRNA的序列分析是细菌鉴定的很好方法。

将提取的实验菌株的基因组DNA作为模板用于PCR扩增16S rRNA序列。

用于本发明双歧杆菌的16S rRNA分析的引物为：

上游引物(BF1)：5’-AGGGTTCGATTCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物(BF2)：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO：4)。

PCR反应体系组成为：PCR反应的总体积50μL，其中含10×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/L dNTPs4.0μL，5U/μL Tag酶2.0μL，50pmol/μL上游引物4.0μL，50pmol/μL下游引物4.0μL，20ng/μL模板DNA5.0μL，ddH2O26μL。

PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性1min，64℃退火50s，72℃延伸1min30次循环；72℃后延伸10min1次循环。

扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳分离，用0.5μg/mL的溴化乙锭染色，在凝胶成像系统上观察分析后用凝胶抽提试剂盒(购自上海博彩生物工程公司)，扩增产物的电泳结果见图5。回收1500bp大小的DNA片段，常规方法克隆到pEGM-T载体(购自申能博彩公司)中，按分子克隆手册上提供的方法转化DH5α大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的IPTG/X-gal LB平板上进行筛选，挑取阳性克隆经鉴定后，测定16S rRNA序列。部分测序结果见图3，16S rRNA部分序列见图4(SEQ ID NO：5)。

实施例7：使用BLAST分析核苷酸序列数据

将上述测定的菌株XJH301的16S rRNA序列使用BLAST程序(美国生物信息中心网站，NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov)同已知的多种短双歧杆菌进行同源性比较，根据获得的遗传距离值，建立系统发育树。

结果发现，本发明的菌株XJH301的16S rRNA序列与目前已知的其它所有短双歧杆菌的相应序列皆不同，有多株短双歧杆菌与本发明菌株同源性值在90％以上，说明本发明的菌株是一种以往未被分离的新短双歧杆菌。

实施例8：本发明菌株和短双歧杆菌JCM1273 DNA的核苷酸序列比较

将本发明的菌株XJH301和标准双歧杆菌菌株2(短双歧杆菌JCM1273)的16S rRNA核苷酸序列比较。

结果发现，本发明菌株与短双歧杆菌JCM1273的16S rRNA存在部分核苷酸序列的差异。

实施例9：属内种水平糖发酵鉴定

在37℃，在厌氧条件下将本发明的菌株XJH301在MRS琼脂平板上培养48小时，然后用悬浮培养基将所得培养物悬浮，然后，将该培养细胞接种到厌氧菌专用糖发酵管中，在其上层覆盖一层无菌石蜡，以便观察糖的发酵能力。将结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》(R.E布坎南、W.E吉木斯著，北京科学出版社出版(1984))比较，糖反应的结果见表2。该结果进一步证实本发明的菌株属于短双歧杆菌。

表2糖反应

注：表中+表示待测菌株阳性，-表示待测菌株阴性

实施例10：本发明菌株对ICR小鼠的安全性

为了检测本发明的菌株XJH301的安全性，选择使用ICR小鼠作为实验动物。具体是，将菌株XJH301接种到11％脱脂乳中培养24小时(浓度为5×10⁹cfu/mL)，取健康小鼠20只，雌雄各半，体重20±2g，饲养观察一日，活动正常，进食状况良好，实验前禁食12小时后称重，分别按0.4mL/10g灌服样品，给药后即对动物的精神状态、毛色、自主活动、呼吸、饮食、二便、口鼻分泌物等一般状况及死亡情况进行观察，连续喂养7天，2个月后检测其安全性。以未给药的同种小鼠作为对照。结果如表3所示。

表3本发明的乳酸菌的安全性

结果可见，给药后小鼠未出现不适症状，小鼠活动有所减少，其它情况基本正常，在整个观察期间精神状态良好、毛色光洁、活动自如、呼吸均匀、口鼻内无异常分泌物，动物饮食量正常，便软，小便无异常。观察一周后，称体重，周体重增长率为：25.1％。于2个月后脱颈椎处死动物，并对所有动物进行尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等内脏器官均未见任何异常。

将给药小鼠的胃、小肠和大肠中的粘液涂布到NPNL琼脂平板上，于37℃培养48小时，从给药组中分离出大量的短双歧杆菌菌株，但是在对照组中未检测到。

实施例11：本发明菌株的耐酸及耐胆盐能力

研究了菌株XJH301的耐酸和耐胆盐能力，将MRS培养基分别调节成pH2.0MRS培养基、pH3.0MRS培养基，在pH2.0MRS培养基、pH3.0MRS培养基中各加入0.2％、0.4％、0.6％的胆汁酸盐。

在不同的培养基中，按2％的接种量(约1.2×10⁸cfu/mL)接种试验菌的培养液，置37℃分别厌氧培养1h、2h、3h、4h、5h、6h、16h，以0h为对照，检测活性短双歧杆菌数。

结果表明，菌株XJH301可以在pH2、0.6％胆汁酸中放置5小时，活菌数量超过10⁶cfu/mL，证明本发明菌株具有很强的耐酸及耐胆盐能力。

实施例12：短双歧杆菌对人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞的体外粘附性试验

为了检测本发明的菌株XJH301的粘附能力，本发明人进行了人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞(购自中科院上海生化细胞所，是一种肠道上皮细胞)的体外粘附性试验，以标准短双歧杆菌1(短双歧杆菌C101)作为对照。将Caco-2细胞与本发明的菌株或短双歧杆菌C101共同培养。结果发现，在Caco-2细胞表面紧密粘附了大量的菌株XJH301(见图6)。通过计数发现，每个Caco-2细胞表面粘附的菌株XJH301平均达到11.2±2.21个/细胞，平均较短双歧杆菌C101高出约1.0个/细胞。

同时，本发明人还测定了菌株XJH301对致病性埃希氏大肠杆菌粘附的竞争性抑制作用，并与其它多株短双歧杆菌作了比较。结果发现，本发明菌株竞争性粘附抑制作用最强。

实施例13：短双歧杆菌的抗氧化能力

本实施例中，研究菌株XJH301对实验小鼠抗氧化能力的影响。采用正常ICR小鼠分别灌胃给予受试品(菌株XJH301的发酵乳，活菌数5×10⁸cfu/ml，设三个剂量组)和阳性对照品维生素E(VitE)，以同时灌胃生理盐水的小鼠为对照组(NS)，每组小鼠10只。连续灌胃8天，末次灌胃后1小时摘眼球取血，分离血清测试SOD活力和MDA含量。按黄嘌呤氧化酶法(SOD试剂盒购自南京聚力生物制品公司)测定血清中的SOD含量；按硫代巴比妥酸法(MDA试剂盒购自南京聚力生物制品公司)测定血清中的MDA。

结果显示，给予菌株XJH301发酵乳以及对照品维生素E的小鼠的SOD活力增高，MDA含量降低，且与对照组比较差异非常显著，如表4所示。说明本发明的菌株XJH301可显著增强小鼠的抗氧化能力，显著减少体内脂质过氧化产物的生成。

表4短双歧杆菌抗氧化功能试验测定结果

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

实施例14：短双歧杆菌对致病性埃希氏大肠杆菌的抑制作用

将致病性埃希氏大肠杆菌013(购自扬州大学医学院)接种于营养肉汤中，37℃培养18小时后，平板计数法计活菌数。控制其活菌数在10⁶cfu/mL，此浓度易致病。吸取大肠杆菌菌液0.5mL于相应固体培养基平板上，用无菌涂抹棒，于超净工作台内通无菌空气，放置1小时待表面的菌液固定在平板的表面后打孔，孔的直径4mm。孔深3mm，将调整好浓度(5×10⁸cfu/ml)的菌株XJH301菌液注至满孔，不可溢出孔外，于各自生长环境培养48小时观察结果、测量抑菌圈直径。测量标准短双歧杆菌1(短双歧杆菌C101)在相同条件下的抑菌情况作为对照。

菌株XJH301对致病性大肠杆菌013的抑菌圈平均直径为11.6mm，如图7所示。而短双歧杆菌C101对致病性大肠杆菌013的抑菌圈平均直径为9.2mm，表明菌株XJH301对致病性大肠杆菌具有很强的抑制作用。

实施例15：短双歧杆菌对幽门螺旋杆菌的抑制作用

将冻融后的幽门螺旋杆菌11637(购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所)吸取少量于Skirrow氏培养基表面，稍推开后，置于密封罐中37℃培养，密封罐内创造微氧环境(85％N₂，10％CO₂，5％O₂)。培养72h后，用生理盐水将培养皿表面的菌落洗脱下来，同麦氏标准比浊管进行比浊，确定菌数，使其浓度控制在10⁵cfu/mL。吸取菌液0.5mL于相应固体培养基平板上，用无菌涂抹棒，于超净工作台内通无菌空气，放置1小时待表面的菌液固定在平板的表面后打孔，孔的直径4mm。孔深3mm，将调整好浓度(5×10⁸cfu/ml)的菌株XJH301菌液注至满孔，不可溢出孔外，于各自生长环境培养48小时观察结果并测量抑菌圈直径。测量标准双歧杆菌1(短双歧杆菌C101)在相同条件下的抑菌情况作为对照。

本发明菌株对幽门螺旋杆菌抑菌圈直径为11.6mm(图8)，而短双歧杆菌C101平均仅为8.6mm，表明本发明的短双歧杆菌对幽门螺旋杆菌具有很强的抑制作用。

实施例16：短双歧杆菌降血压作用

将活化的菌株XJH301接种到热处理后的牛乳中，在37℃条件下发酵18-24小时(活菌数约为1×10⁸cfu/ml)，测定发酵乳的ACE抑制活性(ACEI)，具体测定方法和操作步骤如表5所示。

表5ACE抑制活性测定

取a、b、c、d四只试管，依据表4向各管依次加入相应试剂，37℃水浴预热5分钟，再加入ACE，37℃水浴反应30分钟，反应结束后各管加入1mol/L HCl以终止反应，然后于各试管中加入乙酸乙酯1.5mL吸收反应产生的马尿酸，旋涡混合后4000g离心10分钟；吸取1mL乙酸乙酯层移入另一试管中，放入烘箱100℃挥发溶剂30分钟，冷却后加入2.5mL去离子水，旋涡混合半分钟后在228nm下测定其吸光值，计算公式如下：

式中，A：样a的光密度值，样a在反应中不加抑制剂，反应结束后添加抑制剂以维持整个反应体系平衡，是ACE与HHL完全反应的对照；

B：样b的光密度值，样b在反应中不加抑制剂，在反应前先失活ACE，反应结束后添加抑制剂以维持整个反应体系平衡，是样a反应的空白；

C：样c的光密度值，样c在反应中加抑制剂，是ACE与HHL同时反应的样品；

D：样d的光密度值，样d在反应中加抑制剂，在反应前先失活ACE，是样c反应的空白。

结果测得，菌株XJH301发酵乳的ACEI活性达到43.2％。

实施例17：含短双歧杆菌的食物组合物

原料配比如表6所示。

表6原料配料表

原料	质量百分比(％)
		鲜牛奶	92.0
白砂糖	8.0

按表6配方比例，将鲜奶加热到50℃以上，加入白砂糖搅拌至完全，预热到60-65℃，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌5-10分钟，冷却至40-43℃，接种。接种数量为：每1g上述混合物接种嗜热链球菌(如嗜热链球菌ATCC14485)1-500×10⁶cfu/mL、保加利亚乳杆菌(如保加利亚乳杆菌ATCC11842)1-500×10⁶cfu/mL、短双歧杆菌XJH3011-5000×10⁶cfu/mL。

40-42℃发酵至pH值为4.2-4.5，搅拌，冷藏，即制成含活性短双歧杆菌酸奶。

实施例18：含短双歧杆菌的药物组合物

原料配比如表7所示。

表7原料配料表

原料	质量百分比(％)
		脱脂奶粉	10.0％
乳糖	5.0％
		酵母粉	1.0％
蛋白胨	1.0％
		纯净水	83.0％

按照比例将脱脂奶粉、乳糖、酵母粉、蛋白胨以纯净水混合均匀，预热到60-65℃，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌20-30分钟，冷却至36-38℃，接种入短双歧杆菌XJH301活菌(1-50×10⁶cfu/mL)，36-38℃发酵至pH值为4.2-4.5，离心，冷冻干燥至水份含量小于3％。即制备成短双歧杆菌冷冻干燥物，称取1.5克短双歧杆菌冷冻干燥物与麦芽糊精等量混合后装入胶囊中，即制成含短双歧杆菌XJH301的药物组合物。

菌种保藏

本发明的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)XJH301已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京)，保藏号为CGMCC No.1993，保藏日为2007年4月6日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>统一企业(中国)投资有限公司

统一企业(中国)投资有限公司昆山研究开发中心

<120>具有抗胃肠道致病菌、抗氧化和降血压作用的短双歧杆菌及其用途

<130>073001

<160>5

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

<210>5

<211>961

<212>DNA

<213>Bifidobacterium breve

<220>

<221>misc_feature

<223>16S rRNA

<400>5

Claims (9)

1.一种短双歧杆菌(Bifidobacterium.breve)，其特征在于，所述的短双歧杆菌或其代谢产物具有血管紧张素转换酶抑制活性，所述短双歧杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.1993。

2.权利要求1所述的短双歧杆菌或其代谢产物的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗血管紧张素转换酶异常活化相关疾病的组合物。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血管紧张素转换酶异常活化相关疾病是心血管疾病。

4.权利要求1所述的短双歧杆菌或其代谢产物的用途，其特征在于，用于制备抑制胃肠道致病菌的组合物；或用于制备预防或治疗细菌性消化道疾病的组合物，

其中，所述胃肠道致病菌选自：大肠杆菌和幽门螺旋杆菌；所述细菌性消化道疾病选自：由幽门螺旋杆菌引起的胃炎、胃溃疡或十二指肠炎；以及由大肠杆菌引起的大肠炎或小肠炎。

5.如权利要求4所述的短双歧杆菌或其代谢产物的用途，其特征在于，所述大肠炎选自：结肠炎或直肠炎。

6.权利要求1所述的短双歧杆菌或其代谢产物的用途，其特征在于，用于制备提高血清SOD活力和/或降低MDA含量的组合物。

7.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有：

(1)有效量的权利要求1所述的短双歧杆菌或其代谢产物，以及

(2)食品学上或药学上可接受的载体。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的组合物含有10⁴-10¹²cfu/ml或10⁴-10¹²cfu/g的权利要求1所述的短双歧杆菌。

9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的组合物中还含有有效量的：

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，

保加利亚乳杆菌(Lac tobacillus bulgaricus)，和/或

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。

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