ITMI20091034A1 - Specie probiotica di bifidobacterium breve - Google Patents

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ITMI20091034A1
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Patrizio Cagnasso
Paolo Merusi
Marco Ventura
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Parmalat Spa
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Description

Descrizione dell'invenzione avente per titolo:
"SPECIE PROBIOTICA DI BIFIDOBACTERIUM BREVE"
CAMPO DI APPLICAZIONE
La presente invenzione è relativa ad un microrganismo appartenente alla specie Bifidobacterium breve, a composizioni probiotiche comprendenti detto batterio, specialmente prodotti alimentari ed al loro uso nel trattamento di malattie gastrointestinali, disordini uro-genitali, stati allergici, disordini infiammatori così come nell'obesità, aterosclerosi, nella modulazione del sistema immunitario umano e nell'abbassamento della quantità di colesterolo libero.
STATO DELLA TECNICA
Tutti i membri del genus Bifidobacterium sono microorganismi Gram-positivi, non mobili, non sporificanti, che non producono gas, anaerobi e saccaroclasti appartenenti al tipo Actinobacteria, al cui interno essi formano un ordine distinto (Ventura et a., 2007). I bifidobatteri furono isolati e descritti per la prima volta da Tissier già intorno al 1900 (Tissier 1900). Le cellule di bifidobatteri sono morfologicamente bifide od a bastoncello a multipla ramificazione e in condizioni di crescita avverse esse mostrano un elevato pleomorfismo cellulare. Al momento, il genus Bifidobacterium include 32 specie e nove sottospecie, che sono raggruppate in sei differenti nicchie ecologiche: l'intestino umano, il cavo orale, il cibo, il tratto gastrointestinale animale (GIT), l'intestino degli insetti e le acque di rifiuto. Le specie comunemente isolate dall'intestino o da materiale fecale di umano (ad esempio il "gruppo bifidobatteri umano") includono Bifidobacterium breve seguito da Bifidobacterium longum subsp. longum, Bifidobacterium longum subsp. infantis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium adolescentis . In aggiunta, anche Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium pseudolongum e Bifidobacterium dentium sono rilevati ma meno frequentemente (Scardovi 1984; Scardovi & Crociani 1974, Lauer & Kandler 1983). Altre specie di bifidobatteri sono state isolate dal GIT di animali (ad esempio "il gruppo bifidobatteri animale"). Questi includono bifidobatteri che sono stati isolati dalle feci suine (Bifidobacterium animalis subsp. animalis, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium aerophilum, Bifidobacterium psychroaerophilum, Bifidobacterium thermoacidophilum subsp. porcinum e Bifidobacterium boum), così come bifidobatteri isolati da feci di vitello, mucca e gallina (Bifidobacterium animalis subsp. animalis, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium globosum, Bifidobacteriuro merycicum, Bifidobacterium rumìnantium, Bifidobacterium saeculare, e Bifidobacterium cuniculi). Inoltre, tre specie di Bifidobacterium sono state isolate dall'intestino caudale delle api da miele (Lauer & Kandler 1983) e solamente due sono state isolate dalle acque di rifiuto (Scardovi & Trovatelli 1974; Ventura et al., 2004). In quest'ultimo caso una sospetta contaminazione fecale potrebbe essere stata la fonte. In modo simile, Bifidobacterium lactis (Meile et al. 1997) è stato originariamente isolato da latte fermentato il che ha sollevato la questione se questo fosse il suo ambiente originario od una contaminazione da un'altra fonte. Bifidobatteri che vivono nell'intestino umano sono oggetto di un crescente interesse per le loro proprietà probiotiche e prebiotiche. Infatti, i bifidobatteri così come la maggior parte della microflora batterica enterica sono capaci di idrolizzare una gran varietà di oligosaccaridi nel GIT, alcuni dei quali non vengono digeriti dal loro ospite umano ed i quali sono commercialmente usati per aumentare il numero di bifidobatteri e/o l'attività nel GIT, una pratica a cui ci si riferisce come il concetto prebiotico.
La microflora intestinale è un ecosistema estremamente complesso la composizione del quale è ancora lungi dall'essere completamente capita ed esplorata. Investigazioni ecologiche basate sia su metodi di coltivazione così come saggi indipendenti dalla coltura sono stati effettuati per indagare la diversità microbica che si incontra nel GIT umano. La flora di microorganismi intestinale umana è formata da componenti batteriche transienti o luminali (anche note come contaminanti), le quali sono batteri ingeriti con il cibo o derivate dai compartimenti superiori del GIT ( ad esempio, il cavo orale ) e da una più stabile comunità microbica, la quale è aderente alla mucosa e costituisce la flora di microrganismi intestinale autoctona .
Gran parte dei correnti studi ecologici che sono diretti ad esplorare la composizione della flora di microrganismi dell ' intestino umano sono maggiormente basati sui campioni fecali piuttosto che biopsie colonscopiche . Comunque , è necessario sottolineare che i batteri che costituiscono la comunità aderente alla mucosa sono molto differenti da quelli identificati in campioni fecali . Quindi , la flora di microrganismi fecale umana non può semplicemente essere considerata come un riflesso diretto della f lora di microrganismi intestinale . Rispetto al contributo dei bif idobatteri alla flora di microrganismi intestinale , è stata evidenziata l ' enorme complessità della popolazione di bif idobatteri associata all ' intestino , con un ' alta variabilità inter-individuale , ma con una considerevole stabilità di queste popolazioni bif idobatteriche all ' interno delle differenti regioni intestinali ( ad esempio , colon ascendente , contro discendente o retto) nello stesso soggetto (bassa variabilità intra-soggetto) . In più, è stata descritta una grande differenza nella composizione tra comunità bifidobatteriche fecali ed aderenti alla mucosa.
E' stato mostrato che i bifidobatteri diventano i batteri prominenti nelle feci di neonati allattati al seno nella prima settimana dopo la nascita, dopodiché calano a seguito del periodo dello svezzamento ma sono stabili durante l'adolescenza, seguita da una riduzione nella popolazione anziana (Hopkins et al. 2001). Nei neonati allattati al seno i bifidobatteri predominano mentre in neonati allattati mediante formula si sviluppa una flora di microrganismi maggiormente diversa. Le specie rilevate più di frequente nelle feci di neonati allattati al seno così come da latte materno sono B. breve, seguita da B. longum subsp. infantis , mentre nei campioni di mucosa da adulti le specie maggiormente rilevate sono B. longum subsp. longum e B. catenulatum.
Nell'ambiente intestinale umano, la co-evoluzione adattativa di umani e batteri ha portato allo sviluppo dì una relazione commensale, in cui nessun partner è svantaggiato, o una relazione simbiotica dove sono previste attività metaboliche uniche od altri benefici. La flora di microrganismi intestinale contribuisce alla nutrizione dell'ospite ed ha impatto sulla proliferazione e differenziazione cellulare intestinale, pH, lo sviluppo del sistema immunitario e risposta innata ed acquisita a patogeni. Le modifiche nella composizione della flora di microrganismi intestinale sono state associate ad una varietà di condizioni che vanno dalla Malattia Infiammatoria Intestinale all'allergia ed obesità. Tra i costituenti variabili della flora di microrganismi vi sono specie indigene che promuovono la salute (o flora di microrganismi aderente alla mucosa). I batteri probiotici includono microorganismi che sono consumati come supplementi dietetici vivi e conferiscono benefici di salute all'ospite.
I meccanismi mediante i quali i microorganismi probiotici beneficiano la salute umana sono tipicamente divisi in un numero di categorie generali, che includono il rafforzamento della barriera intestinale, la modulazione della risposta immunitaria e l'antagonismo di patogeni, o mediante la produzione di composti antimicrobici oppure attraverso la competizione per i siti di legame della mucosa. Sebbene ci sia una evidenza che suggerisce ciascuna di queste attività funzionali, i meccanismi molecolari rimangono in gran parte sconosciuti .
La genomica offre la possibilità di accelerare le ricerche tra i batteri probiotici. Negli anni recenti, il sequenziamento genomico dei commensali intestinali e simbionti è arrivato ad una prima linea, correntemente rappresentata dallo sviluppo di una nuova disciplina scientifica, chiamata probiogenomica, che tende a fornire una comprensione della diversità ed evoluzione di batteri probiotici/commensali ed a rivelare le basi molecolari per le loro attività di promozione della salute (Ventura et al., 2009).
Recentemente, gli sforzi della genomica, diretti ad esplorare il contenuto del genoma di differenti ceppi bif idobatterici che risiedono nell'intestino umano, ovvero B. longum subsp. longum NCC2705 (Shell et al., 2002), B. longum subsp. longum DJO10A (Lee et al., 2008) and B. longum subsp. infantis (Seia et al., 2008), indicano la loro capacità di sintetizzare un ricco arsenale di enzimi dedicati alla rottura di zuccheri complessi derivati dalla dieta che sfuggono la digestione degli enzimi dell ' ospite . Molti di questi carboidrati che sfuggono la digestione degli enzimi dell 'ospite sono canditati composti probiotici ed includono f rutto-oligosaccaridi (FOS ) , galattooligosaccaridi (GOS ) , gluco-oligosaccaridi, xilooligosaccaridi , lattulosio e raffinosio. Tutti questi composti dietetici probiotici sarebbero stati persi se l ' intestino distale dei mammiferi non fosse stato colonizzato da diverse comunità di microbiche anaerobiche , comprendendo i bif idobatteri . In questa relazione mutualistica, l ' ospite umano guadagna carbonio ed energia, attraverso la catena corta degli acidi grassi, ed i microbi sono previsti con un ricco buffet di glicani ed un ambiente protetto anossico . Da notare che specifici carboidrati ( ad esempio inulina e FOS ) sono usati come componenti alimentari dietetici probiotici per manipolare il metabolismo dell ' intestino e le popolazioni batteriche in una direzione che è ritenuta di beneficio per l ' ospite . Nello sviluppo della prossima generazione di bif idobatteri probiotici è obbligatoria una conoscenza completa del loro make-up genetico .
Inoltre, è importante che qualsiasi nuovo Bifidobacterium probiotico sviluppato debba essere geneticamente adatto a sopravvivere nella nicchia ecologica intestinale. Tali requisiti prevedranno che questi batteri abbiano capacità geneticamente determinate di interagire sia con l'ospite umano, sia con gli altri componenti indigeni della microflora intestinale, consentendo ad essi quindi di esercitare il loro effetto(i) di promozione della salute (ad esempio, ruolo probiotico).
Inoltre, i bif idobatteri probiotici adatti geneticamente a vivere nella nicchia intestinale umana codificheranno verosimilmente "difese biologiche" per contrastare lo stabilirsi di microrganismi potenzialmente pericolosi.
Quindi, l'isolamento di bifidobatteri probiotici dalla flora di microrganismi intestinale aderente alla mucosa deve provvedere a tali requisiti ed alla capacità di essere altamente stabile nel GIT umano .
Sfortunatamente, un gran numero dei bifidobatteri probiotici usati correntemente non sembra soddisfare tali requisiti e quindi si ritiene che la loro sopravvivenza in un ambiente complesso e selettivo come l'intestino umano sia bassa.
Pertanto è desiderabile che la prossima generazione di bifidobatteri probiotici abbia origine ecologica strettamente umana, cioè sia isolata da un ambiente intestinale umano tipico (ad esempio batteri isolati da biopsie intestinali umane) piuttosto che da un ambiente fecale umano generale.
Scopo della presente invenzione è, pertanto, quello di fornire bifidobatteri probiotici aventi una origine ecologica strettamente umana. In particolare, qui, ci si rivolge alle capacità genetiche uniche e specifiche ed alla origine ecologica del ceppo Bifidobacterium breve 246B che rendono questo microrganismo un batterio che potenzialmente promuove la salute, nello sviluppo di molti nuovi alimenti funzionali.
Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato la presente invenzione.
ESPOSIZIONE DELL'INVENZIONE
La presente invenzione è espressa e caratterizzata nelle rivendicazioni indipendenti.
Le relative rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche della presente invenzione, o varianti dell'idea di soluzione principale.
in accordo con un primo aspetto della presente invenzione, viene fornito un ceppo Bifidobacterium breve 246B depositato presso il DSMZ — Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in data 02 Giugno 2009 con numero di accesso DSM 22640, oppure un suo omologo, discendente o mutante .
Si deve considerare che un omologo di Bifidobacterium breve 246B sarà da intendersi come riferimento a qualsiasi ceppo bifidobatterico avente una omologia di sequenza, determinata a livello genomico completo, maggiore del 40% con la sequenza del Bifidobacterium breve 246B inclusa nella presente domanda (d'ora in avanti riferito come "246B"). Preferibilmente, un omologo 246B è uno che possiede una omologia di sequenza con 246B maggiore del 70%, più preferibilmente maggiore del 85%, ancor più preferibilmente maggiore del 90%, specialmente preferibile maggiore del 95%, ancor più specialmente preferibile maggiore del 99% (o qualsiasi intervallo tra qualsiasi dei suddetti valori ).
Si apprezzerà inoltre che l'omologia di sequenza può essere sperimentata come qui descritto per mezzo di analisi di confronto delle sequenze genomiche complete. Altri esperimenti che potrebbero essere usati per identificare 246B includono le specifiche sequenze del gene 16s rRNA e le Internally Transcribed Spacer Sequencese (d'ora in avanti riferite come ITS).
246B rappresenta un nuovo ceppo isolato appartenente alla specie Bifidobacterium breve. I termini 246B, Bifidobacterium 246B e B. breve 246B sono utilizzati in modo intercambiabile per riferirsi a questo nuovo ceppo di Bifidobacterium.
II genoma completo di B. breve 246B è stato decodificato e le sequenze sono qui allegate come SEQ ID: No. 1. Un aspetto della presente invenzione è quindi B. breve 246B avente sequenza genomica come in SEQ ID: No. 1.
B. breve 246B è stato isolato della mucosa intestinale di una donna sana ottenuta attraverso pratica di biopsia colonscopica. Quindi, 246B appartiene al componente aderente alla mucosa o autoctono o membro indigeno della flora di microrganismi intestinale umana.
E' da notare che ceppi omologhi di B. breve 246B sono stati isolati da varie mucose intestinali di individui sani, suggerendo che il ceppo 246B possiede una appropriatezza ecologica superiore per adattarsi a differenti ospiti e varie possibili nicchie ecologiche. Quindi, B. breve 246B possiede strategie di acquisizione nutrienti molto efficienti, con le quali questo microrganismo può competere efficacemente ed adattarsi all'ambiente intestinale di tipo adulto e stabilire relazioni simbiotiche forti con il loro ospite.
B. breve 246B ha il vantaggio chiave di essere la prima specie bifidobatterica probiotica isolata dalla mucosa intestinale, mentre i precedenti bifidobatteri probiotici hanno avuto origine dall'intestino umano o da alimenti fermentati, quindi il fatto che il ceppo di B. breve 246B sia un componente autoctono della flora di microrganismi intestinale renderà più semplice lo stabilirsi di 246B all'interno dell'intestino umano che gli altri bifidobatteri probiotici.
Si è, inoltre, trovato che B. breve 246B è termotollerante a basse temperature. Il vantaggio chiave di resistere dopo lunga conservazione (fino a 30 giorni) a temperatura bassa come 4 °C è che il ceppo 246B verosimilmente sopravvive a basse temperature rispetto alla maggior parte di altri bifidobatteri probiotici, il che estenderebbe, pertanto, la conservabilità.
Un ulteriore vantaggio di 246B è che questo ceppo è aero-tollerante, mentre la maggior parte dei bifidobatteri enterici necessitano di strette condizioni anaerobiche per moltiplicarsi e sopravvivere.
Altri vantaggi di B. breve 246B sono che fornisce una buona resistenza all'esposizione a basso pH in ambienti naturali (ad esempio durante il passaggio attraverso la barriera dello stomaco) così come in habitat alimentari quali nel latte fermentato (ad esempio yogurt) o succhi di frutta.
Il B. breve 246B possiede un'elevata capacità di deconiugare i sali biliari ed esso mostra, in contrasto con altri bifidobatteri probiotici commerciali, un elevato tasso di riduzione del colesterolo libero, il che rende questo microrganismo un potente agente ipocolesterolemico potenziale.
Un ulteriore vantaggio chiave di B. breve 246B è rappresentato dalla sua abilità di produrre l'isomero di acido linoleico coniugato cis-9, trans-11 (d'ora in avanti riferito come CLA) dall'acido linoleico libero. Gli effetti di promozione della salute che si ascrivono a CLA, quali anticangerogenicità, immuno-modulazione, attività antiarterosclerotica ed antiobesità, suggeriscono che B. breve 246B può essere considerato come il primo ceppo probiotico B. breve che mostra effetti terapeutici in obesità, aterosclerosi, cancro e coliti necrotizzanti.
Un'altra caratteristica chiave di promozione della saluta (probiotica) di B. breve 246B riguarda la sua abilità di modulare le risposte immunitarie attraverso la maturazione, elevata produzione IL-10 e sopravvivenza prolungata di cellule dendritiche. Tutte queste risposte immunitarie svolte da 246B potrebbero avere effetti terapeutici in disordini allergici ed infiammatori.
246B è inoltre capace di produrre vitamine quali folato, nicotinato e tiamina. In contrasto con altri ceppi probiotici B. breve, 246B è il primo ceppo appartenente a questo taxon che possiede tale caratteristica di promuovere la salute.
B. breve 246B è capace di idrolizzare una gran varietà di oligosaccaridi del latte umano (HMO). Quindi, questa caratteristica metabolica rende 246B un bifidobatterio probiotico adatto ad essere addizionato come componente vivente ad alimenti funzionali per neonati.
B. breve 246B possiede tutte le capacità genetiche (ad esempio, la presenza del gene sialidasi assieme ad un sistema nan) per utilizzare un altro componente principale del latte umano, quale l'acido sialico. Quindi, la capacità di 246B di catabolizzare tale substrato, rende questo ceppo un ceppo probiotico appropriato per essere aggiunto ad alimenti funzionali per neonati.
B. breve 246B possiede la capacità di degradare una varietà di glicococoniugati derivati dall'ospite comprendendo mucina oligosaccaridi e glicosfingolipidi . Il genoma di B. breve 246B contiene un operone coinvolto nel metabolismo degli zuccheri mucinici ed include un gene latto-N-bioso fosforilasi. In più, B. breve 246B codifica un 1,2-alfa-L-fucosidasi, la quale è coinvolta nella degradazione della mucina. In questo modo lo stesso ospite può fornire substrati a 246B, rappresentando così una rimarchevole relazione sinergica (alimenti funzionali naturalmente simbiotici).
B. breve 246B nel suo ambiente naturale, cioè il GIT umano, è capace di sintetizzare bio-peptidi. Inoltre, assieme agli altri componenti microbici della flora di microrganismi intestinale umana modula la disponibilità di minerali.
Come secondo aspetto di questa invenzione vi è una composizione probiotica o miscela comprendente B. breve 246B come fin qui definito ed uno o più eccipienti accettabili o carrier.
Gli eccipienti accettabili sono quelli normalmente usati nella pratica di preparazione di una miscela probiotica. Alcuni esempi di questo tipo di eccipienti includono: carboidrati quali saccarosio, carboidrati isomerizzati, glucosio, fruttosio, palatinosio, xilosio, trealosio e lattosio; zuccheri d' alcol, cioè xilitolo, sorbitolo, eritrolo, palatinolo, lattinolo, sciroppo di amido ridotto e sciroppo di maltosio glutinoso ridotto; emulsif icanti , cioè esteri di saccarosio di acidi grassi , esteri di glicerina di acidi grassi e lecitina; acidi grassi quali acido oleico, acido linoleico ed acido linolenico; ispessenti o stabilizzanti quali carragene , gomma xantana, gomma di guar, pectina e gomma di carruba; acidificanti quali acido citrico, acido lattico ed acido malico; succhi di frutta quali tutti i succhi derivati da frutta o tutte le combinazioni di differenti succhi derivati da frutta; vitamine, quali tutte le vitamine idrosolubili e liposolubili; minerali quali calcio, ferro, manganese , magnesio e zinco; ed antiossidanti quali omega 3.
La composizione dell'invenzione può essere preparata mediante miscelazione, in modo idoneo a temperatura ambiente e pressione atmosferica, o in condizioni di atmosfera modificata, che sono adatte per preparazione orale o somministrazione vaginale. Tali composizioni possono essere nella forma di compresse, capsule, preparazioni liquide orali, preparazioni liquide vaginali, prodotti alimentari convenzionali, polveri, granuli, pasticche, polveri ricostituibili o sospensioni, pomata, unguento e collutorio.
Compresse, capsule, confetti, chewing-gum, pomate per somministrazione orale o vaginale possono contenere uno o più eccipienti convenzionali (ad esempio, agenti leganti, agenti di riempimento, pastigliatori, lubrificanti, disintegranti ed umettanti). Inoltre, tutti i prodotti sopra menzionati possono contenere tutti gli eccipienti necessari comprendendo quelli usati comunemente nella pratica farmaceutica.
Preparazioni liquidi orali così come vaginali possono essere nella forma di, ad esempio, sospensioni acquose od oleose, soluzioni, sciroppi in emulsioni oppure elisir, o possono essere nella forma di un prodotto secco da ricostituire con acqua od altro veicolo adatto prima dell'uso. Tutte queste preparazioni liquide possono contenere additivi convenzionali (ad esempio, agenti di sospensione, agenti emulsionanti, veicoli non liquidi, conservanti ed infine aromi o coloranti comunemente usati).
La composizione dell'invenzione è formulata anche come un prodotto alimentare convenzionale. Questo includerà più preferibilmente un prodotto a base casearia, quale latte vaccino, latte animale, latte fermentato, latte vegetale, latte di soia, burro, formaggio, yogurt. Comunque, altre formulazioni di prodotto alimentare comprendono succo di frutta, succo vegetale, prodotti da forno o da cucina (biscotti), prodotti derivati dal cioccolato o caramelle. La composizione è preferibilmente formulata come un alimento o bevanda per adulti o neonati umani od animali. In una forma di realizzazione alternativa, la composizione è formulata come una polvere liofilizzata o essiccata a spray.
I bifidobatteri sono generalmente capaci di varie attività di promozione della salute e per questa ragione essi sono usati nel trattamento e/o nella profilassi di una grande varietà di disordini comprendendo malattie gastrointestinali (malattia infiammatoria dell'intestino (IBD), malattia di Crown (CD), coliti ulcerative (UC), enteriti microbiche, diarrea associata ad antibiotici e diarrea nosocomiale), colesterolo, obesità aterosclerosi cancro, coliti necrotizzanti allergie e malattie infiammatorie. Inoltre, il loro effetto è stato mostrato nel mantenere un equilibrio ben bilanciato nella flora di microrganismi intestinale e vaginale umana.
I bifidobatteri sono stati riportati inoltre per ridurre significativamente le malattie virali associate al GIT. Ulteriormente, si è dimostrato che i bifidobatteri contrastano l'azione di vari patogeni che causano infezioni urovaginali nel GIT così come nell'ambiente vaginale.
Quindi, come un ulteriore aspetto dell'invenzione, Bifidobacterium breve 246B è fornito per l'utilizzo come medicamento.
Un altro aspetto della presente invenzione coinvolge l'utilizzo di Bifidobacterium breve 246B nella preparazione di un medicamento.
Vantaggiosamente, viene fornito B. breve 246B per l'uso come una sostanza terapeutica, in particolare nel trattamento e/o nella profilassi dei disordini sopra menzionati, cioè malattia infiammatoria dell'intestino (IBD) , malattia di Crown (CD), coliti ulcerative (UC), enteriti microbiche, diarrea associata ad antibiotici e diarrea nosocomiale, colesterolo, obesità, aterosclerosi, cancro, coliti necrotizzanti, allergie e malattie infiammatorie e malattìe urovaginali, malattie del GIT causate da virus o da batteri patogeni quali Listeria spp., Salmonella spp., e Campylobacter spp. .
Grazie alla produzione di bipeptidi di B. breve 246B ed alla sua azione sinergica con la microflora intestinale, questo ceppo può essere usato come un carrier di minerale nel trattamento della demineralizzazione ossea così come nell'abbassamento degli effetti dello stress, agendo come batterio promuovente calmativo.
Il B. breve 246B può essere usato da solo od in combinazione con altri agenti terapeutici che sono convenzionalmente usati nel trattamento e/o profilassi di tutti i disordini sopra indicati. Di conseguenza, come un ulteriore aspetto dell'invenzione, viene fornita una combinazione comprendente 246B insieme con un ulteriore agente/i terapeutico/ i.
Le combinazioni sopra riferite possono convenientemente essere presentate per l'uso nella forma di una composizione probiotica e, quindi, rappresentano un altro aspetto dell'invenzione le miscele probiotiche comprendenti una combinazione come sopra definita, assieme con uno o più eccipienti. I componenti individuali di tali miscele possono essere somministrati o sequenzialmente oppure simultaneamente in miscele probiotiche separate o combinate.
In una forma di realizzazione preferita, B. breve 246B è combinato con altri batteri appartenenti al genus Bifidobacterium quali: Bifidobacterium adolescentis , Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium angolatum, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium gallicum, Bi fidobacterium longum subsp. infantis, Bifidobacterium longum subsp. longum , Bifidobacterium longum subsp. suis, Bifidobacterium pseudocatenulatum , Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium animalis subsp. animalis , Bifidobacterium boum, Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium gallinarum, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum, Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseudolongum, Bifidobacterium pullorum, Bifidobacterium ruminantium, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium aerophilum, Bifidobacterium psychroaerophilum, Bifidobacterium thermacidophilum subsp. porcinum e Bifidobacterium crudilactis o altri batteri probiotici quali Lactobacillus casei, Lactobacillus paracaseifLactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus zeae, Lactobacillus<'>amylovorous, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus buchneri. Inoltre, batteri appartenenti al genus Lactococcus quali Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris; batteri appartenenti al genus Bacillus quali Bacillus subtilis, e lieviti appartenenti al genus Saccharomyces, Torulspora e Candida, quali Saccharomyces cerevisiae, Torulspora delbrueckii e Candida kefir.
ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI
Queste ed altre caratteristiche della presente invenzione appariranno chiare dalla seguente descrizione di una forma preferenziale di realizzazione, fornita a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui:
- la fig. 1 mostra l'albero filogenetico delle sequenze di Bifidobacterium 16S rDNA comprendendo il ceppo 246B. Gli allineamenti delle sequenze sono stati fatti usando il programma MultiAlign ed il pacchetto Clustal-W. L'analisi filogenetica e gli alberi sono stati calcolati usando il pacchetto software PHYLIP, versione 3.5c e visualizzati mediante NJplot. Gli alberi sono stati calcolati usando il metodo "neighbour-joining" con il modello a due parametri di Kimura come modello di sostituzione. I valori di bootstrap sono stati calcolati paragonando 1000. Gli alberi sono stati radicati usando Nocardia farcinica. I blocchi ombreggiati indicano i differenti cluster filogenetici di bifidobatteri.
- la fig. 2 illustra l'albero filogenetico delle sequenze dì Bìfìdobacterium 16S-23S ITS comprendendo il ceppo 246B. Gli allineamenti sono stati fatti usando il programma MultiAlign ed il pacchetto Clustal-W. L'analisi filogenetica e gli alberi sono stati calcolati usando il pacchetto software PHYLIP, versione 3.5c e visualizzati mediante NJplot. Gli alberi sono stati calcolati usando il metodo "neighbour-joining" con il modello a due parametri di Kimura come modello di sostituzione. I valori di bootstrap sono stati calcolati paragonando 1000. Gli alberi sono stati radicati usando Nocardia farcinica. I blocchi ombreggiati indicano i differenti cluster filogenetici di bifidobatteri.
- la fig. 3 illustra la mappa genomica circolare di B. breve 246B. Dal cerchio più interno, il cerchio (1) illustra la deviazione GC (G-C/G+C), valori >0 sono in rosso e <0 in verde. Il cerchio (2) evidenzia la deviazione G+C% dalla media (58,54%). Il cerchio (3) indica gli rRNA e tRNA. Il cerchio (4) mostra le regioni di codifica per filamento con colore corrispondente all'assegnazione COG funzionale. Il cerchio (5) evidenzia le distribuzioni ORF per filamento. - la fig. 4 mostra il confronto dei contenuti del gene del genoma di B. breve 246B contro quello di B. longum subsp. longum NCC2705, B. longum subsp. infantis ATCC15697, B. adolescentis ATCC15703, B. dentium Bdl, e B. breve UCC2003. Dall'interno all'esterno: l'anello 1, deviazione GC; anello 2, contenuto G+C; anello 3, atlante di B. breve 246B; anello 4, confronto con la sequenza genomica di B. breve UCC2003; anello 5, confronto con la sequenza genomica di B. longum subsp. infantis ATCC15697; anello 6, confronto con la sequenza genomica di B. longum subsp. longum NCC2705; anello 7, confronto con la sequenza genomica di B. dentium Bdl; anello 8, confronto con la sequenza genomica di B. adolescentis ATCC15703; il verde indica omologie > del 95%.
le figg. 5a — 5f illustrano la colinearità genomica di B. breve 246B con B. dentium Bdl (panel fig. 5a), B. adolescentis ATCC15703 (panel fig.
5b), B. longum subsp. longum NCC2705 (panel fig. 5c), B. longum subsp. longum DJOIOA (panel fig. 5d), B. longum subsp. infantis ATCC15697 (panel fig. 5e) e B. animalis subsp. lactis ADOll (panel fig. 5f). I grafici a punti sono stati disegnati usando il software di plotting di identità percentuale PipMaker(http://pipmaker.bx .psu.edu/p ipmaker).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Isolamento di B. breve 246B B. breve 246B è stato isolato da un campione di mucosa originato da una donna sana ottenuto tramite pratica di biopsia colonscopica. L'identificazione di questo ceppo è stata possibile nell'ambito di un ampio progetto mirato ad effettuare un censimento tra le popolazioni bifidobatteriche da campioni della mucosa intestinale umana e fecali mediante inoculazione su piastra su mezzo selettivo accoppiata ad analisi molecolare del rRNA delle sequenze geniche [gene 16S rRNA e spaziatore di sequenze Internally Transcribed Spacer (ITS) 16S-23S] di colonie isolate. Cinquantanove volontari sani sono stati selezionati per questo studio. Questi individui non avevano avuto alcun recente intervento chirurgico, non stavano assumendo alcuna medicazione e non avevano disturbi gastrointestinali. Inoltre, essi non osservavano diete speciali e non avevano assunto probiotici né antibiotici per due mesi prima del campionamento. I campioni prelevati o raccolti da questi volontari comprendevano 30 campioni colonici di mucosa da adolescenti od adulti e 29 campioni fecali da neonati. I campioni freschi sono stati raccolti in contenitori sterili, trasportati al laboratorio in giare anaerobiche contenenti Anaerocult A (Oxoid), e sono state immediatamente processate al loro ricevimento. Le biopsie sono state prelevate durante colonscopia con forcipi da biopsia sterilizzati (colonscopio PCF 160 AL e forcipi da biopsia FB2441, Olympus GmbH, Germania). Il tempo trascorso tra il prelievo bioptico ed il recupero del campione è stato tra 20 e 30 secondi. Il canale bioptico è stato lavato con soluzione salina sterile dopo avere prelevato ciascun campione. Due biopsie sono state raccolte per ciascuna posizione e sono state lavate vigorosamente in 900 microlitri di soluzione salina ridotta [0,25% cisteina (Sigma Chemical co., St. Louis, MO, USA), 10 microgrammi/litro di vitamina K1 (Sigma) e 0,02 g/litro di emina (Sigma)]. Diluizioni seriali dei supernatanti derivati dai campioni di mucosa e fecali sono stati inoculati su piastra mediante versamento su agar selettivo Bifidobacterium (BSM) per la crescita selettiva dei bifidobatteri. Il mezzo selettivo BSM è stato preparato mediante aggiunta ad agar MRS (Scharlau Chemie, Barcelona, Spagna) di idrocloruro di L-cisteina 0,05% (w/v) e 50 mg di mupirocina (Delchimica, Italia) per litro di MRS come precedentemente descritto (Simpson et al., 2004, J. Microbiol. Methods). Le piastre di agar sono state incubate anaerobicamente (giare aanaerobiche con Anaerocult A gas packs; Oxoid) a 37 °C per 72 hr. Per analizzare la popolazione dominante di Bifidobacterìum di ciascun soggetto, circa 100 — 200 colonie (da 20 a 30 colonie per ciascuna piastra), scelte sulla base di differente morfologia e dimensione, sono state selezionate casualmente per ciascun campione, e subcoltivate in Eugon Agar (Oxoid, Italia) e brodo MRS per 24 — 48 hr. Il DNA è stato estratto da ciascun isolato mediante rapida lisi cellulare meccanica come precedentemente descritto (Ventura et al., 2001, Appi. Environ. Microbiol.).
Tali studi ecologici hanno portato all'isolamento di un totale di 900 ceppi dei quali 704 appartenenti ai bifidobatteri.
Rilevamento di B. breve 246B mediante sequenziamento del gene 16S rRNA e Intergenic Transcribed Sequences (ITS)
1) Preparazione dei target DNA.
L'estrazione del DNA è stata effettuata usando un protocollo modificato descritto da Sambrook et al. (Sambrook et al. 2001). Brevemente, DNA cromosomico è stato isolato da una aliquota di 100 mi di colture di B. breve 246B cresciute a 37 °C per 16 hr in condizioni anaerobiche. Le colture sono state centrifugate a 5000 rpm per 10 minuti ed i pellet di cellule batteriche sono stati lavati risospendendoli in 100 mi di acqua. Dopo centrifugazione, i pellet cellulari sono stati risospesi in 10 mi di buffer TES [0,1M Tris-HCl, 0,05M EDTA e saccarosio 20% (w/vol), pH 8] contenente 30 mg/ml di lisozoma (Sigma) e 50 microlitri di Mutanolisina (Sigma) da uno stock di 1 mg/ml, seguito da incubazione a 37 °C per 3 hr. Dopo queste reazioni enzimatiche sono stati raccolti i protoplasti centrifugando a 10000 rpm per 10 minuti. I protoplasti sono stati risospesi in 10 mi di lx TE. La lisi cellulare completa è stata ottenuta addizionando 500 microlitri di SDS (SIGMA) 10% da uno stock 15,6 mg/ml. La miscela è stata incubata per 2 hr a 56 °C alla presenza di 120 microlitri di Proteinasi K (SIGMA). Il DNA è stato purificato effettuando doppie estrazioni con 10 mi di fenolo pH 7,5-8,0 seguite da una estrazione con 10 mi di cloroformio-isoamil-alcool (24:1). Il DNA è stato precipitato mediante l'aggiunta di 20 mi di etanolo più 3 mi di acetato di sodio pH 5,2, incubato a -20 °C per 3 hr e seguito da una centrifugazione a 10000 rpm per 15 minuti. L'etanolo è stato aspirato ed essiccato con aria a pellet per 10 minuti. Infine, i pellet di DNA sono stati reidratati in 250 microlitri di DNAasi free water a 4 °C per 16 hr. La qualità e quantità di DNA è stata valutata mediante spettrofotometro ad OD260 e OD280. Inoltre, per controllare l'integrità dei campioni di DNA, un'aliquota di DNA cromosomico di circa 2 microgrammi è stata separata con elettroforesi in 0,8% (w/v) di gel di agarosio ad un voltaggio costante di 4 V/cm e visualizzata mediante bromuro di etidio con colorazione a 254 nm.
2) Sequenziamento del gene parziale 16S rRNA e ITS
La PCR è stata usata per amplificare il terminale 3' di 16S e sequenze (ITS) del B. breve 246B investigato. Un frammento di DNA di 1440 bp corrispondente alla regione 16S e ITS è stato amplificato usando oligonucleotidi specifici BIF (5'-GGTGTGAAAGTCCATCGCT-3 ') e 23S_bif (5'-GTCTGCCAAGGCATCCACCA-3 ').
Ciascuna miscela di PCR (25 microlitri) conteneva 1,5 mM di MgCl2; 20 mM di Tris-HCl, 50 mM di KC1; 200 micromoli di ciascun trifosfato deossinucleoside; 25 pmol di ciascuno dei due primer; 1 U di Taq DNA polimerasi (Taq PCR Master Mix Kit-QUIAGEN, UK) e 50 ng di stampo DNA. Ciascun ciclo di programma di PCR consisteva di un iniziale passo di denaturazione di 3 minuti a 94 °C seguita da amplificazione per 35 cicli come segue: denaturazione (30 secondi a 94 °C), riassociazione (30 sec a 56,5 °C) ed estensione (1 min a 72 °C). La reazione di PCR è stata completata con un singolo passo di allungamento (10 min a 72 °C). I segmenti di sequenza amplificati risultanti sono stati separati su gel di agarosio 0,8% seguito da colorazione etidio bromuro. I frammenti di PCR sono stati purificati usando il kit di purificazione PCR (Qiagen, UK) e successivamente sequenziati. Il sequenziamento dei nucleotidi di entrambi i filamenti dai segmenti di sequenza amplificati PCR è stato effettuato mediante Agencourt Bioscience Corporation (USA) usando primer bif-sec (5-CATGCCCCTACGTCCAG-3) e 23S-seq (5'-CAAGGCATCCACCATACGC-3 '). L'assieme di dati di sequenza e l'analisi è stata effettuata usando il software DNASTAR (versione 5.05 DNAstar, Madison, USA).
3) Analisi filogenetica di B. breve 246B basata su regione 16S - ITS
La sequenza 16S rDNA-ITS generata dal DNA cromosomico di 246B è stata soggetta a ricerca BLASt su GenBank. La sequenza 16S rDNA-ITS di 246B ottenuta ha mostrato più del 98% di identità di sequenza con la specie Bifidobacterium breve. In accordo con Bergery's Manual of Systematic Bacteriology, un nuovo isolato verrà classificato in una specie batterica se mostrerà una similarità 16S rDNA con il tipo di ceppo di quella specie oltre il 98%. Pertanto, l'elevato livello di similarità di sequenza 16S rDNA del 98,6% tra 246B e il tipo di ceppo di Bifidobacterium breve ha fornito le prove che 246B appartiene alla specie Bifidobacterium breve.
Inoltre, è stata effettuata una analisi filogenetica basata sulle sequenze di gene 16S rRNA del tipo di ceppo, 246B più altri ceppi (dove disponibili) di ciascuna specie e sottospecie riconosciuta del genus Bifidobacterium. Questa analisi è risultata in un albero filogenetico (fig.
1), il quale indica chiaramente il vicino clustering filogenetico di 246B con il tipo di ceppo di B. breve.
Comunque, la velocità di evoluzione della sequenza 16s rRNA nei bifidobatteri è troppo lenta per fornire informazioni utili per delineare una speciazione tra taxa correlati da vicino così come per misurare relazioni intra-specie. Al contrario, le analisi delle sequenze 16S - 23S ITS sono state descritte come essere maggiormente appropriate per verificare la relazione filogenetica intra-specie nei bifidobatteri (Leblond et al., 1996).
Le analisi filogenetiche, comprendendo le sequenze 16S-23S ITS di tutti i tipi di ceppi, ceppo 246B più altri ceppi (dove disponibili) di ciascuna specie e sottospecie riconosciuta del genus Bifidobacterium, hanno mostrato chiaramente che anche i cluster 246B nel gruppo ospitante tutti i membri della specie B. breve differiscono significativamente da ogni altro ceppo B. breve fin ora descritto (fig. 2). Quindi, questo indica che 246B è un nuovo ceppo appartenente alla specie Bifidobacterium breve mai precedentemente descritto.
Caratterizzazione del genoma di B, breve 246B 1) Sequenziamento genomico e raggruppamento di B. breve 246B
La sequenza genomica B. breve 246B è stata determinata usando un approccio shotgun del genoma completo. Due librerie shotgun del genoma completo sono state costruite; una libreria small-insert (24 kb) ed una libreria fosmide (40-50 kb). La libreria small-insert è stata costruita tagliando casualmente 3 microgrammi di DNA genomico usando un Hydroshear (GeneMachines) e riparando i terminali usando T4 DNA Polymerase e frammento Klenow (New England Biolabs). I frammenti riparati ai terminali sono stati dimensionalmente selezionati da gel agarosio e purificati sfruttando il QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Circa 200 ng di DNA tagliato sono stati "ligati" in 100 ng di vettori linearizzati appropriati (ad esempio, pUC18 o pGEM-T) a 14 °C per 2 hr. Una porzione del prodotto di "ligazione" è stata sottoposta ad elettroporazione in cellule elettrocompetenti ElectroMAXDHlOB e inoculata su piastre agar contenenti ampicillina. Le colonie bianche sono state raccolte usando il raccoglitore di colonie robotizzato QPIX (Genetix) e cresciute in un mezzo contenente glicerolo per fornire riserve per i sequenziamenti successivi. Le librerie fosmide sono state costruite usando il sistema vettore CopyControl pCC2FOS™ (Epicentre Technlogies, Madison, WI). Il DNA è stato tagliato e la dimensione dei frammenti è stata selezionata su un gel di agarosio a campo pulsato, tolto via e purificato prima della "ligazione" nel vettore pCCqFOS. Il vettore "ligato" è stato impacchettato usando il MaxPlanx Lambda Packaging Extractor (Epicentre Technologies) ed usato per trasdurre E. coli (EP300).
II DNA per il sequenziamento è stato prodotto usando Templiphi (GE Healthcare) su aliquote di subcloni cresciuti in piastre a 384 pozzetti in accordo con le specifiche di prodotto. Brevemente, le cellule sono state posizionate in un buffer di denaturazione e la miscela è stata riscaldata a 95 °C per 5 minuti e raffreddata a 4 °C prima di aggiungere il reagente Templiphi. Sono stati effettuati cicli standard di sequenziamento da entrambi i terminali dei subcloni sfruttando primer universali, con BigDye Terminators (Applied Biosystems) e risolti su un sequenziatore a capillare ABI Prism 3730x1. Il ciclo termico è stato effettuato usando Termocyclers 384 pozzetti (ABI).
Le reazioni di sequenziamento sono state purificate usando il kit Agencourt's CleanSeq<R>dyterminator removai.
Tutte le letture sono state processate usando il software Phred base calling e monitorando costantemente contro la qualità metrica usando Phred Q20. Il punteggio di qualità per ciascuna corsa è stato monitorato attraverso un sistema Agencourt's Galaxy LIMS. Qualsiasi deviazione sostanziale dal normale intervallo è stata investigata immediatamente.
Un totale di 11.907.009 letture terminali sono state compiute per l'assieme del genoma. Le letture di sequenza sono state raggruppate usando Arachne Whole Genome Assembler da Institute of MIT e Harvard, accoppiate con Agencourt's LIMS System e RepeatMasker (AFA. Smit, R. Hubley, & P. Green, http;//www .repeatmasker.orq) per raggruppare il genoma ed è stato usato CONSED (Gordon, 2003) per vedere l'assieme. Letture di finitura sono state eseguite per risolvere cattivi raggruppamenti, intervalli vicini e migliorare la qualità. Per migliorare la qualità complessiva della sequenza del genoma 246B, è stata effettuato un sequenziamento di copertura di 15 volte usando la tecnologia Pyrosequencing. I 454 dati di sequenziamento generati sono stati integrati con i dati Sanger usando Arachne Assembler. La sequenza genomica finale è stata editata ad un valore di fiducia Phrap di 40 o più. Questo è considerato essere lo Standard Bermuda riconosciuto in tutti i maggiori centri di sequenziamento. Basandosi sul consenso del punteggio di qualità finale, è stato stimato un tasso di errore complessivo di meno di un errore per IO<4>nucleotidi.
2) Analisi di sequenza genomica ed annotazione di B. breve 246B
Gli "open reading frames" (ORFs) che codificano proteine sono stati predetti usando una combinazione dei metodi Glimmer (Delcher et al., 1999) e FrameD (Schiex et al., 2003) usando impostazioni di default che permettono la sovrapposizione di geni ed usando ATG, GTG e TTG come codoni di partenza potenziali. I risultati dai programmi "gene finder" sono stati combinati manualmente ed è stata condotta una analisi BLASTP (Altschul et al., 1990) contro una base di dati di proteine non ridondanti fornita dal National Centre for Biotechnology Information. Artemis (Rutherford et al., 2000) è stato usato per ispezionare i risultati dei "finder" combinati di geni ed gli associati risultati BLASTP. Una ispezione manuale è stata condotta per verificare o, se necessario, ridefinire la partenza e lo stop di ciascuna regione predetta di codifica.
L'annotazione ha fatto uso della caratteristica GC frame plot di Artemis, delle informazioni di siti di legame ribosomico ottenute da RBS finder (Suzek et al., 2001), allineamenti con ORF similari da altri organismi e analisi di contenuto G+C. Il set gene/proteina rivisto è stato cercato nei database Swiss-Prot/TrEMBL, PRIAM, protein family (Pfam), TIGRFam, Interpro, KEGG e COGs, in aggiunta a BLAST vs. NR. Da questi risultati, si sono fatte le assegnazioni di prodotto. Correzioni manuali alle assegnazioni funzionali automatiche sono state completate su una base individuale gene per gene come necessitato. Sono stati usati HMMTOP e TMHMM (Tusnady Simon 2001, Krogh et al., 2001) per predirre le sequenze transmembrana e SignalP (Bendtsen et al., 2004) è stato usato per la predizione dei peptidi di segnale. I geni RNA ribosomiali sono stati rilevati sulla base di ricerche BLASTN ed annotati manualmente. I geni RNA di trasferimento sono stati identificati usando tRNAscanSE (Lowe and Eddy, 1997). Gli elementi di inserzione di sequenza sono stati identificati usando IS finder (http://www-is.biotoul.fr). Gli enzimi carboidrato-attivi sono stati identificati sulla base di similarità con gli entry del database degli enzimi carboidrato-attivi (CAZy) (Coutinho e Henrissat, 1999) e la classificazione trasportatore è stata effettuata in accordo con lo schema TC-DB (Bush e Saier, 2002).
La ricostruzione metabolica della sequenza del genoma di 246B è stata effettuata usando una combinazione del database KEGG (Kanehisa e Goto, 2000) e del software Pathway Tool (Karp et al., 1999).
3) Analisi comparativa di B. breve 246B
I confronti di genoma complessivo di B. breve 246B sono stati effetuati con allineamenti appaiati BLASTN (soglia attesa=10) contro B. longum subsp. longum NCC2705, B. longum subsp. longum DJO10A, B. longum subsp. infantis ATCC15697, B. adolescentis ATCC15703, B. dentium Bdl, B. animalis subsp. lactis ADOll. I risultati di questi confronti sono stati visualizzati usando Artemis Comparison tool (Carver et al., 2005). Inoltre, gli interi genomi sono stati comparati a livello nucletidico usando Dotter (Sonnhammer e Durbin, 1995) e programmi MUMmer (Delcher et al., 1999) con valori di default.
4) Caratteristiche generali del genoma di B. breve 246B
Il genoma di B. breve 246B, allegato come SEQ ID: No. 1, consiste di un singolo cromosoma circolare di 2.397.248 paia di basi (bp) con un contenuto medio G+C di 59% (fig. 3). Sono stati rilevati 2189 ORFs in questa sequenza. L'origine verosimile della replicazione è stata identificata sulla base di caratteristiche comuni a corrispondenti regioni in altri cromosomi. Queste comprendono la colocalizzazione di quattro geni (rpmH, dnaA, dnaN e recF) vicino all'origine, la presenza di dnaA-box multipli e sequenze ricche di AT a monte del gene dnaA, un distinto sfalsamento di orientazione ORF ed un'analisi di deviazione nucleotidica GC [(G-C)/(G+C)]. Due operoni RNA ribosomiali (rRNA) sono stati identificati nel genoma di 246B. Entrambi i loci rRNA sono orientati nella stessa direzioneverso e sono in fase con la direzione predetta della replicazione DNA. Sono stati identificati 54 transfer rRNA (tRNAs) dentro al genoma di B. breve 246B, rappresentativi di tutti i venti amminoacidi, con tRNA ridondante per tutti gli amminoacidi eccetto cisteina, istidina, isoleucina, fenilalanina e triptofano. Elementi di inserzione di sequenza (IS) intatti sono stati identificati in B. breve 246B, in aggiunta sono stati inoltre identificati nel genoma molti relativi elementi IS che erano interrotti o frammentati.
Le differenze nel contenuto del gene tra B. breve 246B ed altre specie Bifidobacterium sono distribuite attraverso l'intero cromosoma e sono aree di particolare interesse poiché esse riflettono la specializzazione genomica (ad esempio, codificazione di enzimi coinvolti nell'utilizzazione di sostanze prebiotiche) (fig.
4). Per esaminare la sintenia tra B. breve 246B ed altri genomi bifidobatterici completamente disponibili, è stata effettuata una comparazione dotplot a livello nucletidico dei genomi. Tale analisi mostra un elevato grado di conservazione e sintonia attraverso l'intero genoma con B. longum subsp. longum NCC2705, B. longum subsp. longum DJOIOA e B. longum subsp. infantis ATCC15697 (figg.
5c, 5d, 5e).
Comunque, ci sono anche varie regioni breakpoint come risultato di inversioni o di inserzioni/delezioni di DNA. Invece, un grado minore di conservazione genica e di sintenia è stato rilevato con B. dentium Bdl, B. adolescentis ATCC15703, B. animalis subsp. lactis ADOll (figg.
5a, 5b, 5f).
Caratteristiche fisiologiche di B. breve 246B 1) Crescita e sopravvivenza in prodotti alimentari
B. breve 246B è stato subcoltivato in brodo MRS addizionato con cisteina 0,1% a 37°C per 24 hr in condizioni anaerobiche. La concentrazione iniziale in brodo è stata di 5*IO<8>CFU/ml. Questa quantità di cellule è stata aggiunta a 100 mi di latte intero, yogurt e differente succo di frutta. Il numero di cellule inoculate nel prodotto è stato 5*IO<6>CFU/ml. Tali colture sono state incubate per 7, 15, 30, 45 giorni in condizioni refrigerate (condizioni aerobiche, temperature tra 6 °C e 8 °C). Ad ogni tempo di incubazione, la conta cellulare è stata determinata inoculando su piastra su MRS aggiunta di cisteina 0,1%.
I tassi di sopravvivenza di 246B nei differenti prodotti alimentari sono descritti nella tabella 1, dove i valori di densità cellulare sono espressi in CFU/ml. in accordo con la letteratura, un tasso maggiore di IO<6>o IO<7>CFU/ml di probiotici nel prodotto è richiesta per consentire l'osservazione di effetti positivi. I risultati mostrano una sopravvivenza molto buona nel latte e yogurt per conservabilità ( "shelf-life") di 45 giorni o più. Nel succo di frutta, la densità cellulare è buona per 30 giorni in banana ed arancia e per 15 giorni nella pesca.
Tabella 1
2) Crescita di B. breve 246B in latte addizionato di differenti tipi di frutto-olisaccaridi (FOS) I frutto-olisaccaridi (FOS) sono noti per le loro proprietà di aumentare la crescita di ceppi probiotici, in particolare Bifidobacteria. I FOS possono avere differente influenza sulla crescita di Bifidobacteria dipendendo dal grado di polimerizzazione (numero di molecole di fruttosio che formano la catena, "Degree of Polymerization" DP). B. breve 246B è stato inoculato in tre
campioni di latte addizionato con inulina (DP = 3 -60), oligofruttosio da cicoria (DP = 2 - 8) e oligofruttosio da saccarosio (DP = 3 - 5) rispettivamente. Il numero di cellule di B. breve 246B inoculate nel prodotto è stato di 5*10<6>CFU/ml. I prodotti sono stati incubati per 8 ore a 40 °C e dopo i campioni sono stati immagazzinati in condizioni refrigerate (temperature tra 6 °C e 8 °C).
La densità cellulare è stata misurata dopo il tempo di incubazione e dopo 7, 15, 40, 45 giorni in condizioni di refrigerazione ed i risultati sono descritti in tabella 2 (densità cellulare espressa in CFU/ml).
È chiaro che, sebbene la presente invenzione sia
stata descritta con riferimento ad alcuni esempi specifici, una persona esperta del ramo potrà senz'altro realizzare molte altre forme equivalenti di specie probiotica di Bifidobacterium breve, aventi le caratteristiche espresse nelle rivendicazioni e quindi tutte rientranti nell'ambito di protezione da esse definito.

Claims (18)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Bifidobacterium breve 246B depositato presso DSMZ — Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in data 02 Giugno 2009 con numero di accesso DSM 22640, oppure un suo omologo, discendente o mutante.
  2. 2. Ceppo di Bifidobacterium avente un'omologia di sequenza DNA, determinata a livello di genoma completo, maggiore del 40% rispetto a Bifidobacterium breve 246B, in cui Bifidobacterium breve 246B è stato depositato presso DSMZ — Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in data 02 Giugno 2009 con numero di accesso DSM 22640.
  3. 3. Composizione probiotica comprendente un ceppo di Bifidobacterium come definito nella rivendicazione 1 o 2 ed uno o più eccipienti o carrier accettabili.
  4. 4. Composizione probiotica come nella rivendicazione 3 in cui detta composizione è un prodotto alimentare.
  5. 5. Composizione probiotica come nella rivendicazione 4 in cui detto prodotto alimentare è un prodotto a base casearia quale latte vaccino, latte animale, latte fermentato, latte vegetale, latte di soia, burro, formaggio, yogurt e/o altre formulazioni di prodotto alimentare quali succhi di frutta, succo vegetale, prodotti da forno o culinari (biscotti), prodotti derivati da cioccolato e caramelle.
  6. 6. Composizione probiotica come nella rivendicazione 3, 4 o 5 per l'uso nella promozione di un equilibrio bilanciato della flora di microrganismi del tratto gastrointestinale animale (GIT).
  7. 7. Prodotto alimentare comprendente una composizione probiotica come nella rivendicazione 3, 4 o 5.
  8. 8. Composizione probiotica come nella rivendicazione 3 in cui detta composizione è un prodotto farmaceutico.
  9. 9. Prodotto farmaceutico comprendente una composizione probiotica come nella rivendicazioni 3 o 8.
  10. 10. Ceppo di Bifidobacterium come nella rivendicazione 1 o 2 per l'uso come medicamento.
  11. 11. Uso di un ceppo di Bifidobacterium come definito nella rivendicazione 1 o 2 nella preparazione di un medicamento.
  12. 12. Ceppo di Bifidobacterium come nella rivendicazione 1 o 2 per l'uso nel trattamento e/o profilassi di disordini comprendenti malattie gastrointestinali, quali malattia infiammatoria dell'intestino (IBD), malattia di Crown (CD), coliti ulcerative (UC), enteriti microbiche, diarrea associata ad antibiotici e diarrea nosocomiale, colesterolo, obesità, aterosclerosi, cancro, coliti necrotizzanti, allergie e malattie infiammatorie e malattie urovaginali.
  13. 13. Ceppo di Bifidobacterium come definito nella rivendicazione 1 o 2 per l'uso nel trattamento di malattie del tratto gastrointestinale animale (GIT) causate da virus o da batteri patogeni quali Listeria spp., SalmoneIla spp., e Campylobacter spp..
  14. 14. Uso di un ceppo di Bifidobacterium come definito nella rivendicazione 1 o 2 per la preparazione di un medicamento per il trattamento e/o la profilassi di disordini comprendenti malattie gastrointestinali, quali malattia infiammatoria dell'intestino (IBD), malattia di Crown (CD), coliti ulcerative (UC), enteriti microbiche, diarrea associata ad antibiotici e diarrea nosocomiale, colesterolo, obesità, aterosclerosi, cancro, coliti necrotizzanti, allergie e malattie infiammatorie e malattie urovaginali, malattie del tratto gastrointestinale animale (GIT) causate da virus o da batteri patogeni quali Listeria spp., Salmonella spp., e Campylobacter spp..
  15. 15. Uso di un ceppo di Bifidobacterium come definito nella rivendicazione 1 o 2 per il trattamento e/o la profilassi di disordini comprendenti malattie gastrointestinali, quali malattia infiammatoria dell'intestino (IBD), malattia di Crown (CD), coliti ulcerative (UC), enteriti microbiche, diarrea associata ad antibiotici e diarrea nosocomiale, colesterolo, obesità, aterosclerosi, cancro, coliti necrotizzanti, allergie e malattie infiammatorie e malattie urovaginali, malattie del tratto gastrointestinale animale (GIT) causate da virus o da batteri patogeni quali Listeria spp., Salmonella spp., e Campylobacter spp..
  16. 16. Ceppo di Bifidobacterium come definito nella rivendicazione 1 o 2 per l'uso nel trattamento di condizioni di carico di stress, quali ipertensione.
  17. 17. Ceppo di Bifidobacterium come definito nella rivendicazione 1 o 2 per l'uso nel trattamento di demineralizzazione acuta delle ossa.
  18. 18. Combinazione comprendente un ceppo di Bifidobacterium come definito nella rivendicazione 1 o 2 con ulteriore/i agente/i terapeutico/i.
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