CN112410241A - 用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物及其用途 - Google Patents

用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物及其用途。具体地，本发明提供一种选自以下至少其中之一经分离的乳酸菌菌株或其发酵物：长双歧杆菌长双歧亚种OLP‑01菌株、短双歧杆菌Bv‑889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI‑02菌株、动物双歧杆菌CP‑9菌株、两歧双歧杆菌Bf‑688菌株、罗伊氏乳酸杆菌GL‑104菌株、唾液乳酸杆菌AP‑32菌株以及鼠李糖乳酸杆菌bv‑77菌株，其具有抗氧化的功能，且以食品组合物或医药组合物的形式存在。

Description

用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物及其用途
技术领域
本发明是有关一种组合物及其用途，特别是一种用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物及其用途。
背景技术
老化是人体器官最大的杀手，器官老化会导致慢性肾病、失智症、心血管疾病、糖尿病、癌症或其他慢性疾病，严重时可导致个体死亡。而身体所产生的自由基(freeradicals)则是造成器官老化的重要元凶，身体所产生的自由基主要分为活性氧类(reactive oxygen species)以及活性氮类(reactive nitrogen species)。活性氧类是生物正常代谢中会产生的副产品，包含一些氧离子、过氧化氢等等，这些活性氧物质在细胞信号传导、对抗微生物感染和保持机体恒常性中扮演着很重要的角色。而活性氮类则是在病原菌入侵时，大量被免疫细胞产生，主要用于杀死入侵的病原菌。血管内皮细胞也会分泌少量的活性氮物质，来促进血管扩张及讯息传导。因此，调节并维持良好的自由基平衡对人体非常重要。
当身体调节自由基的机转丧失或失衡，过量的自由基产生则会破坏细胞DNA，改变细胞内蛋白质结构，攻击细胞膜，最后导致体细胞的死亡。慢性肾病(chronic kidneydisease)的其中一个原因则是因为慢性发炎而肾脏累积了过多的活性氧物质，造成肾细胞的死亡，使得肾器官逐渐丧失其生理功能，到了末期患者只能洗肾度日。阿兹海默症则是脑内类淀粉的堆积造成慢性发炎，而发炎所产生的自由基诱发神经元细胞死亡，最后造成失智症。皮肤老化也是因为长时间暴露于紫外线(UV exposure)或热源(heat exposure)下，诱发活性氧的量急剧增多，导致皮肤暗沉、皮肤癌等疾病。
综上所述，发展出一种安全且可长期使用，以抗氧化的营养补充品有其迫切性。而乳酸菌一般来说是安全的，因此，找出具有抗氧化功能的乳酸菌菌株或其发酵物便是目前极需努力的目标。
发明内容
本发明提供一种含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物，其具有抗氧化效果，因而能够减少自由基浓度，以抑制器官老化。
本发明一实施例的用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物包含具有抗氧化活性效果的乳酸菌菌株或其发酵物以及赋形剂、稀释剂或载体，其中乳酸菌菌株选自以下至少其中之一经分离的乳酸菌菌株：长双歧杆菌长双歧亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.longum)OLP-01菌株，保藏编号为CGMCC No.17345(其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC；保藏日期2019年03月18日；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)Bv-889菌株，保藏编号为CGMCC No.16145(其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC；保藏日期2018年07月23日；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)BLI-02菌株，保藏编号为CGMCC No.15212(其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC；保藏日期2018年01月15日；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)；动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis)CP-9菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2014588(其保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC；保藏日期2014年11月24日；地址为中国武汉武汉大学，430072)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)Bf-688菌株，保藏编号为CGMCC No.17953(其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC；保藏日期2019年06月18日；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104菌株，保藏编号为CCTCC NO：M209138(其保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC；保藏日期2009年08月07日；地址为中国武汉武汉大学，430072)、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2011127(其保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC；保藏日期2011年04月10日；地址为中国武汉武汉大学，430072)以及鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)bv-77菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2014589(其保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC；保藏日期2014年11月24日；地址为中国武汉武汉大学，430072)。
本发明另一实施例的以含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物作为抗氧化功效的用途，其中含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物包含具有抗氧化活性效果的乳酸菌菌株或其发酵物以及赋形剂、稀释剂或载体，且乳酸菌菌株选自以下至少其中之一经分离的乳酸菌菌株：长双歧杆菌长双歧亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)OLP-01菌株，保藏编号为CGMCC No.17345、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)Bv-889菌株，保藏编号为CGMCC No.16145、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02菌株，保藏编号为CGMCC No.15212；动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)CP-9菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2014588、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)Bf-688菌株，保藏编号为CGMCC No.17953、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104菌株，保藏编号为CCTCC NO：M209138、唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius subsp.salicinius)AP-32菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2011127以及鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)bv-77菌株，保藏编号为CCTCCNO：M2014589，上述乳酸菌菌株分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心以及中国典型培养物保藏中心。
以下通过具体实施例配合所附的附图详加说明，当更容易了解本发明的目的、技术内容、特点及其所达成的功效。
附图说明
图1为本发明的乳酸菌活性菌株自由基清除能力分析的试验结果。
图2为本发明的乳酸菌菌株的发酵物自由基清除能力分析的试验结果。
图3为本发明的乳酸菌活性菌株还原能力分析的试验结果。
图4为本发明的乳酸菌的发酵物还原能力分析的试验结果。
图5为本发明的乳酸菌菌株诱发人类肠上皮细胞产生超氧化物歧化酶的活性分析结果。
图6为本发明的乳酸菌菌株诱发人类肠上皮细胞产生过氧化氢酶的活性分析结果。
图7为本发明的10％乳酸菌发酵物所含的超氧化物歧化酶的活性分析结果。
用于专利程序的培养物保藏：
1、本发明的OLP-01菌株
保藏日期：2019年03月18日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101
保藏编号：CGMCC No.17345
分类命名：长双歧杆菌长双歧亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)
2、本发明的Bv-889菌株
保藏日期：2018年07月23日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101
保藏编号：CGMCC No.16145
分类命名：短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)
3、本发明的BLI-02菌株
保藏日期：2018年01月15日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101
保藏编号：CGMCC No.15212
分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)
4、本发明的CP-9菌株
保藏日期：2014年11月24日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072
保藏编号：CCTCC NO：M2014588
分类命名：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)
5、本发明的Bf-688菌株
保藏日期：2019年06月18日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101
保藏编号：CGMCC No.17953
分类命名：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)
6、本发明的GL-104菌株
保藏日期：2009年08月07日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072
保藏编号：CCTCC NO：M209138
分类命名：罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)
7、本发明的AP-32菌株
保藏日期：2011年04月10日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072
保藏编号：CCTCC NO：M2011127
分类命名：唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)
8、本发明的bv-77菌株
保藏日期：2014年11月24日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072
保藏编号：CCTCC NO：M2014589
分类命名：鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)
具体实施方式
以下将详述本发明的各实施例，并配合附图作为例示。除了这些详细说明之外，本发明亦可广泛地施行于其它的实施例中，任何所述实施例的轻易替代、修改、等效变化都包含在本发明的范围内，并以请求保护范围为准。在说明书的描述中，为了使读者对本发明有较完整的了解，提供了许多特定细节；然而，本发明可能在省略部分或全部特定细节的前提下，仍可实施。此外，众所周知的步骤或组件并未描述于细节中，以避免对本发明形成不必要的限制。附图中相同或类似的组件将以相同或类似符号来表示。特别注意的是，附图仅为示意的用，并非代表组件实际的尺寸或数量，有些细节可能未完全绘出，以求附图的简洁。
本发明所述的乳酸菌菌株的冷冻干燥培养物已分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)以及中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址为中国武汉武汉大学，430072)。保藏的详细资料如表1所示：
表1乳酸菌菌株的保藏资料
Figure BDA0002176509130000061
如表1所列已保藏的乳酸菌菌株中，长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01菌株及其发酵物、短双歧杆菌Bv-889菌株及其发酵物、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株及其发酵物、动物双歧杆菌CP-9菌株及其发酵物、两歧双歧杆菌Bf-688菌株及其发酵物、罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株及其发酵物、唾液乳酸杆菌AP-32菌株及其发酵物、鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株及其发酵物被发现具有抗氧化以及清除自由基的活性效果。因此，表1所列的乳酸菌菌株或其发酵物可作为抗氧化以及清除自由基的用途。
本发明一实施例的用于抗氧化及清除自由基的含乳酸菌菌株或发酵物的组合物包含乳酸菌菌株或其所发酵产生的发酵物以及赋形剂、稀释剂或载体。该乳酸菌菌株选自以下至少其中之一经分离的乳酸菌菌株：长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01菌株，保藏编号为CGMCC No.17345、短双歧杆菌Bv-889菌株，保藏编号为CGMCC No.16145、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株，保藏编号为CGMCC No.15212、动物双歧杆菌CP-9菌株，保藏编号为CCTCCNO：M2014588、两歧双歧杆菌Bf-688菌株，保藏编号为CGMCC No.17953、罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株，保藏编号为CCTCC NO：M209138、唾液乳酸杆菌AP-32菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2011127以及鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2014589。上述乳酸菌菌株分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心以及中国典型培养物保藏中心。于一实施例中，赋形剂、稀释剂或载体可为生理上可接受的赋形剂、稀释剂或载体，使本发明的含乳酸菌菌株或发酵物的组合物作为一食品组合物使用。或者，赋形剂、稀释剂或载体可为医药上可接受的赋形剂、稀释剂或载体，使本发明的含乳酸菌菌株或发酵物的组合物作为一医药组合物使用。
于食品组合物的实施例中，生理上可接受的赋形剂、稀释剂或载体可为一食品。举例而言，食品可包含但不限于乳制饮品、茶、咖啡、口香糖、洁牙糖(例如口含片、咀嚼锭、软糖等)或以上的组合，其中乳制饮品可包含发酵乳、优格、奶酪或乳制饮品乳粉等。医药组合物可为口服剂型或皮肤外用剂型。举例而言，口服剂型可为锭剂、胶囊、溶液剂及粉剂等。
于含乳酸菌菌株的组合物的实施例中，乳酸菌菌株为具有活性的菌株。举例而言，乳酸菌菌株的数量为106CFU以上；较佳者，乳酸菌菌株的数量为1010CFU以上。于含乳酸菌发酵物的组合物的实施例中，发酵物可包含去活性菌株或去除菌体的发酵液或其干燥粉末。举例而言，发酵液可为发酵上清液或乳清发酵液等。于一实施例中，乳酸菌发酵物的粉剂含量为0.5％以上；或者，乳酸菌发酵物的溶液含量为2.5％以上。
实施例1：本发明的乳酸菌菌株的形态学以及一般性质
根据16S rDNA序列分析以及API细菌鉴定系统分析结果来确认菌株在分类学上的特征。上述菌株在形态学及一般性质上的特征详细列于表2：
表2本发明的乳酸菌菌株的形态学及一般性质特征
Figure BDA0002176509130000081
Figure BDA0002176509130000091
Figure BDA0002176509130000101
实施例2：乳酸菌菌株的收集、培养与保存
申请人所收集的乳酸菌菌株是以20％甘油保存于-80℃。使用前，以含有0.05％cysteine的MRS broth(DIFCO)，37℃下活化(24小时)二次后使用。使用于研究的本发明乳酸菌菌株中，长双歧杆菌长双岐亚种OLP-01菌株以及罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株分离自人类肠道；短双歧杆菌Bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株、动物双歧杆菌CP-9菌株、两歧双歧杆菌Bf-688菌株以及鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株分离自人类母乳；唾液乳酸杆菌AP-32菌株分离自人类粪便。本发明的乳酸菌菌株所发酵产生的发酵物是以上述乳酸菌菌株至少其中之一进行发酵以产生其发酵物，再经由离心、过滤、加热杀菌等步骤，最后纯化出发酵液。依据需求，发酵液可进一步干燥成乳酸菌发酵物粉末。发酵液的粉剂或水溶液可保存于常温。
实施例3：乳酸菌菌株的自由基清除能力分析
DPPH(di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium)是稳定自由基分子，DDPH自由基在甲醇溶液中在波长517nm下有最高的吸收值。当DPPH自由基与抗氧化物质作用后，抗氧化物质提供氢质子而清除自由基，而DPPH自由基就会失去本身蓝紫色的特性而造成吸光值的下降。利用测定OD517值的下降来测定受测乳酸菌菌株的自由基清除能力。
乳酸菌菌株的自由基清除能力的检测方法如下。将本发明的乳酸菌菌株的菌株悬浮液(约为2×109CFU)、参考乳酸菌菌株：副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)GL-156菌株、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06菌株、约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)MH-68菌株以及鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)F-1菌株的菌株悬浮液(约为2×109CFU)、2.5μg/ml维生素C(阳性对照组，positivecontrol)、不具抗氧化活性效果的嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)SY-66菌株(约为2×109CFU，阴性对照组，negative control)及二次水(空白组，blank)分别与0.2mMDPPH在甲醇溶液中1：1混合。混和均匀后，在黑暗室温下反应30分钟。接着于4℃离心(12000rpm，2min)后，取200μl到96孔盘中并测定OD517值。自由基清除能力的计算公式如下：
自由基清除能力＝(ODblank-ODsample)/ODblank×100％
其中ODsample为受测样品的吸光值，ODBlank为空白组的吸光值。
请参照图1，以说明本发明的乳酸菌菌株清除自由基能力分析(DPPH assay)的试验结果，其中符号***表示p值<0.005；符号**表示p值<0.01，亦即统计学上具有非常显著的差异；符号NS表示无明显差异。由图1的试验结果可知，相较于不具抗氧化能力的嗜热链球菌SY-66菌株，本发明的长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01菌株、短双歧杆菌Bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株、动物双歧杆菌CP-9菌株、两歧双歧杆菌Bf-688菌株、罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株、唾液乳酸杆菌AP-32菌株及鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株皆具有明显较高的清除自由基的能力。
实施例4：乳酸菌发酵物的自由基清除能力分析
乳酸菌发酵物的自由基清除能力的检测方法如下。分别将本发明的乳酸菌发酵物粉剂1％水溶液、参考乳酸菌菌株：副干酪乳酸杆菌GL-156菌株、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株、约氏乳酸杆菌MH-68菌株以及鼠李糖乳酸杆菌F-1菌株的发酵物粉剂1％水溶液、8.5μg/ml维生素C(阳性对照组，positive control)、不具抗氧化活性效果的嗜热链球菌SY-66菌株的发酵物粉剂1％水溶液(阴性对照组，negative control)及二次水(空白组，blank)分别与0.2mM DPPH在甲醇溶液中1：1混合。混和均匀后，在黑暗室温下反应30分钟。接着于4℃离心(12000rpm，2min)后，取200μl到96孔盘中并测定OD517值。自由基清除能力的计算公式如前所述。
请参照图2，以说明本发明的乳酸菌发酵物(0.5％)清除自由基能力分析(DPPHassay)的试验结果，其中符号***表示p值<0.005；符号**表示p值<0.01，亦即统计学上具有非常显著的差异。由图2的试验结果可知，相较于嗜热链球菌SY-66菌株的发酵物，本发明的长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01菌株、短双歧杆菌Bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株、动物双歧杆菌CP-9菌株、两歧双歧杆菌Bf-688菌株、罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株、唾液乳酸杆菌AP-32菌株及鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株的发酵物皆具有明显较高的清除自由基的能力。
实施例5：乳酸菌菌株的还原力分析。
抗氧化还原力活性分析(Ferric-reducing ability of power，FRAP assay)是一种普遍用来测试抗氧化剂还原力活性的一种方法，以样品整体的还原能力作为抗氧化力。于酸性环境(pH 3.6以下)下，FRAP试剂中的三价铁(Fe3+)会被抗氧化物如维生素C还原成二价铁(Fe2+)，而造成颜色的改变。利用TPTZ(2,4,6-Tri-(2-pyridyl)-5-triazine)的呈色特性可测得样品的还原能力。当Fe3+-TPTZ复合物被还原成Fe2+-TPTZ时，会由黄色转为藍色，藍色越深表示抗氧化力越强。因此，检测OD593值即可计算出抗氧化剂的还原能力，也就是抗氧化能力。
本次实验是将本发明乳酸菌的菌株悬浮液(约为2×109CFU)、参考乳酸菌菌株：副干酪乳酸杆菌GL-156菌株、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株、约氏乳酸杆菌MH-68菌株以及鼠李糖乳酸杆菌F-1菌株的菌株悬浮液(约为2×109CFU)、1.25μg/ml维生素C(阳性对照组，positive control)、不具抗氧化活性效果的嗜热链球菌SY-66菌株的菌株悬浮液(约为2×109CFU，阴性对照组，negative control)和Fe3+-TPTZ做反应，并检测OD593值。所测的值和所制备的已知浓度的FeSO4标准液混合FRAP试剂所得到的标准检量线做比对。利用检量线公式计算出含乳酸菌菌株悬浮液的还原力(μg/ml,Fe2+)。
请参照图3，其为本发明的乳酸菌菌株还原力分析(FRAP assay)的试验结果，其中符号***表示p值<0.005，符号**表示p值<0.01，亦即统计学上具有非常显著的差异；符号*表示p值<0.05，亦即统计学上具有显著的差异；符号NS表示无明显差异。由图2的试验结果可知，相较于嗜热链球菌SY-66菌株，本发明的长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01菌株、短双歧杆菌Bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株、动物双歧杆菌CP-9菌株、两歧双歧杆菌Bf-688菌株、罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株、唾液乳酸杆菌AP-32菌株及鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株皆具有明显较高的还原的能力。
实施例6：乳酸菌发酵物的还原力分析
本次实验是将本发明的乳酸菌菌株的发酵物粉剂0.5％水溶液、参考乳酸菌菌株：副干酪乳酸杆菌GL-156菌株、嗜酸乳酸杆菌TYCA06菌株、约氏乳酸杆菌MH-68菌株以及鼠李糖乳酸杆菌F-1菌株的发酵物粉剂0.5％水溶液、5μg/ml维生素C(阳性对照组，positivecontrol)、不具抗氧化活性效果的嗜热链球菌SY-66菌株的发酵物粉剂0.5％水溶液(阴性对照组，negative control)和Fe3+-TPTZ做反应，并检测OD593值。所测的值和所制备的已知浓度的FeSO4标准液混合FRAP试剂所得到的标准检量线做比对。利用检量线公式计算出乳酸菌发酵物的还原力(μg/ml,Fe2+)。
请参照图4，以说明本发明的乳酸菌发酵物还原力分析试验(FRAP assay)的试验结果，其中符号***表示p值<0.005；符号**表示p值<0.01，亦即统计学上具有非常显著的差异。由图4的试验结果可知，相较于嗜热链球菌SY-66菌株，本发明的长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01菌株、短双歧杆菌Bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株、动物双歧杆菌CP-9菌株、两歧双歧杆菌Bf-688菌株、罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株、唾液乳酸杆菌AP-32菌株及鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株的发酵物皆具有明显较高的还原能力。
实施例7：乳酸菌菌株诱发肠上皮细胞表达抗氧化酶活性分析
身体内对于太多的自由基(oxidative stress)会有所谓的调控机制，体细胞会产生抗氧化剂(antioxidant)来因应，如合成谷胱甘肽(glutathione)、泛醇(ubiquinol)和尿酸(uric acid)等物质来吸收游离电子，另一方面从食物中摄取抗氧化剂如维生素C、维生素E等，也能抑制自由基的产生。身体细胞的另一个抗氧化系统为抗氧化酶(antioxidantenzymes)网络。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种重要的抗氧化酶，可以将超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢，人体内有三种超氧化物歧化酶，分别存在于胞外、细胞质(cytoplasm)及粒线体(mitochondria)中。另一种酶为过氧化氢酶(catalase)是可以将超氧化物歧化酶所产生的过氧化氢转化为氧气和水。在饱和的状态下，一个过氧化氢酶分子每秒能将四千万个过氧化氢分子转化为水和氧气。
Caco-2细胞为人类结肠腺癌细胞上皮细胞，其细胞结构和功能相似于分化的小肠上皮细胞。Caco-2细胞具有微绒毛等结构并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，因而被广泛应用在模拟体内肠细胞生理活动模式。在细胞培养系统中，Caco-2细胞可以长成单一层细胞，细胞彼此排列紧密，不仅在形态学上和小肠上皮细胞相似，且具有同样的胞饮作用、Tightjunction等结构。
本实验在Caco-2细胞的培养系统中加入本发明的乳酸菌的活性菌株(实验组)、嗜热链球菌SY-66菌株(对照组)及不加入任何活性菌株只有培养液作为对照组(Control)，以比例1：100(cells：probiotics)共同培养16小时后，洗掉乳酸菌菌株，再将Caco-2细胞打破萃取蛋白质，以检测细胞内的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性(其试验结果如图5所示)及过氧化氢酶(catalase)活性(其试验结果如图6所示)。SOD活性分析是使用SODAssay Kit(Cayman Cat.706002)，而catalase活性分析是使用CatalaseAssay Kit(Cayman Cat.707002)。所有实验流程皆依照kit的说明书建议进行分析。
以下请参照图5以及图6，以说明本发明的乳酸菌菌株诱发肠上皮细胞表达抗氧化酶的效果，其中符号***表示p值<0.005；符号**表示p值<0.01，亦即统计学上具有非常显著的差异；符号*表示p值<0.05，亦即统计学上具有显著差异；符号NS表示无明显差异。由图5以及图6的试验结果可知，相较于嗜热链球菌SY-66菌株，本发明的长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01菌株、短双歧杆菌Bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株、动物双歧杆菌CP-9菌株、两歧双歧杆菌Bf-688菌株、罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株、唾液乳酸杆菌AP-32菌株及鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株可以诱发人类肠上皮细胞株Caco-2细胞增加抗氧化酶(SOD及catalase)的表达，以分解过多的体内自由基，并达到抗氧化的效果。
实施例8：乳酸菌发酵物的抗氧化酶活性分析
本实验是将本发明的乳酸菌菌株以及嗜热链球菌SY-66菌株的发酵物干燥粉末配置成10％水溶液进行超氧化物歧化酶(SOD)活性分析。另以未经乳酸菌菌株发酵的培养基作为对照组。SOD活性分析是使用SODAssay Kit(Cayman Cat.706002)。所有实验流程皆依照kit的说明书建议进行分析。
请参照图7，以说明本发明的乳酸菌发酵物的抗氧化酶的试验结果，其中符号***表示p值<0.005，即统计学上具有非常显著的差异；符号*表示p值<0.05，即统计学上具有显著的差异。由图7的试验结果可知，相较于嗜热链球菌SY-66菌株，本发明的长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01菌株、短双歧杆菌Bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株、动物双歧杆菌CP-9菌株、两歧双歧杆菌Bf-688菌株、罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株、唾液乳酸杆菌AP-32菌株及鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株的发酵物具有明显较强的SOD抗氧化酶活性，其可分解过多的体内自由基，以达到抗氧化的效果。
需注意的是，乳酸菌对身体健康的功能在于菌株(strain)的特异性，而非菌种(species)，此种对于人的身体健康有特殊功效的菌株称为功能性益生菌(Guidelines forthe evaluation of probiotics in food；Report of joint FAO/WHO working group ondrafting guidelines for the evaluation of probiotics in food；London Ontario,Canada April 30and May 1,2002：1-7)。举例而言，根据2018年发表于ScientificReports的一篇论文(PMID：30013208)提到，野生种Bifidobacterium longumsubsp.infantis在有氧的环境下，由于烟碱酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酯(nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶的作用，会在菌体内产生过多的活性氧自由基(H2O2)。因此，野生种Bifidobacterium longum subsp.infantis似乎无法有效清除自由基，并造成菌体的死亡或抑制其生长。而本发明的长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02菌株具有清除自由基的功效，相较于野生种Bifidobacterium longum subsp.infantis具有其独特性。此外，在超氧化物歧化酶(SOD)的表达上，中兴大学的一篇研究中(http://hdl.handle.net/11455/50980)发现Bifidobacterium longum B6菌株以及15708菌株，不具SOD活性。由上述2份研究可知，本发明的长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株及长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01菌株为具有抗氧化活性效果的独特性菌株。
根据Jayamanne V.S.及Adams M.R.的研究(PMID：16478503)，其实验中使用Bifidobacterium longum NCTC11818、Bifidobacterium breve NCIMB702258、Bifidobacterium longum biotype infantis NCIMB702205、Bifidobacteriumadolescentis NCIMB702204、Bifidobacterium bifidum NCIMB702203与H2O2氧化自由基相互作用。发现以上所列的乳酸菌菌株并没有抗氧化的特性。因此，相较于Jayamanne V.S.及Adams M.R.的研究，本发明的两歧双歧杆菌Bf-688菌株以及短双歧杆菌Bv-889菌株为具有抗氧化活性效果的独特性菌株。此外，于Oberg T.S.et al研究中(PMID：23772066)，发现同为Bifidobacterium animalis subsp.lactis BL-04菌株以及DSM 10140菌株表现了不同的抗氧化能力，故以此推知并非所有的Bifidobacterium animalis subsp.lactis都具有抗氧化特性。因此，本发明的动物双歧杆菌CP-9菌株为具有抗氧化活性效果的独特性菌株。
根据ChoorukA等人的研究(PMID：28474851)，SOD酶的活性及生产，在直接从口腔内所分离出来的野生型L.salivarius及L.rhamnosus并不高(约0.1-0.2U之间)。而本发明的唾液乳酸杆菌AP-32菌株以及鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株的发酵物中就有约1.5-1.75U左右的SOD活性，显示本发明的唾液乳酸杆菌AP-32菌株以及鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株为具有抗氧化活性效果的独特性菌株。又根据Narciza O等人的研究(PMID：30807829)发现，L.reuteri需要白藜芦醇(resveratrol)来诱发表达dhaT基因才能得到抗氧化的特性，而本发明的罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株直接就具有抗氧化活性效果，显示本发明的罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株为具有抗氧化活性效果的独特性菌株。
综合上述，相较于其它受测的乳酸菌菌株，本发明的长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01菌株、短双歧杆菌Bv-889菌株、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02菌株、动物双歧杆菌CP-9菌株、两歧双歧杆菌Bf-688菌株、罗伊氏乳酸杆菌GL-104菌株、唾液乳酸杆菌AP-32菌株、鼠李糖乳酸杆菌bv-77菌株以及上述乳酸菌菌株的发酵物具有较佳的自由基清除能力以及还原能力，且能诱发Caco-2细胞增加抗氧化酶的表达。因此，本发明的乳酸菌菌株以及其发酵物具有抗氧化的活性效果，且能够减少自由基浓度，以抑制或推迟器官老化。
以上所述的实施例仅是为说明本发明的技术思想及特点，其目的在使熟习此项技艺的人士能够了解本发明的内容并据以实施，当不能以的限定本发明的专利范围，即大凡依本发明所揭示的精神所作的均等变化或修饰，仍应涵盖在本发明的专利范围内。

Claims (16)

1.一种用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物，其包含：
具有抗氧化活性效果的乳酸菌菌株或其发酵物，该乳酸菌菌株选自以下至少其中之一经分离的乳酸菌菌株：长双歧杆菌长双歧亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)OLP-01菌株，保藏编号为CGMCC No.17345、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)Bv-889菌株，保藏编号为CGMCC No.16145、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)BLI-02菌株，保藏编号为CGMCC No.15212；动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CP-9菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2014588、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)Bf-688菌株，保藏编号为CGMCC No.17953、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104菌株，保藏编号为CCTCC NO：M209138、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32菌株，保藏编号为CCTCCNO：M2011127以及鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)bv-77菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2014589，上述乳酸菌菌株分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心以及中国典型培养物保藏中心；以及
赋形剂、稀释剂或载体。
2.如权利要求1所述的用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物，其中该乳酸菌菌株为具有活性的菌株。
3.如权利要求1所述的用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物，其中该发酵物为包含去活性菌株或去除菌体的发酵上清液、乳清发酵液、或以上的干燥粉末。
4.如权利要求1所述的用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物，其中该赋形剂、稀释剂或载体为生理上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
5.如权利要求1所述的用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物，其中该赋形剂、稀释剂或载体为一食品。
6.如权利要求5所述的用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物，其中该食品包含发酵乳、优格、奶酪、乳制饮品乳粉、茶、咖啡、口香糖、洁牙糖或以上的组合。
7.如权利要求1所述的用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物，其中该赋形剂、稀释剂或载体为医药上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
8.如权利要求1所述的用以抗氧化的含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物，其为一医药组合物，且为口服剂型或皮肤外用剂型。
9.一种以含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物作为抗氧化功效的用途，其中该含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物包含：
具有抗氧化活性效果的乳酸菌菌株或其发酵物，该乳酸菌菌株选自以下至少其中之一经分离的乳酸菌菌株：长双歧杆菌长双歧亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)OLP-01菌株，保藏编号为CGMCC No.17345、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)Bv-889菌株，保藏编号为CGMCC No.16145、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)BLI-02菌株，保藏编号为CGMCC No.15212；动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CP-9菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2014588、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)Bf-688菌株，保藏编号为CGMCC No.17953、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104菌株，保藏编号为CCTCC NO：M209138、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32菌株，保藏编号为CCTCCNO：M2011127以及鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)bv-77菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2014589，上述乳酸菌菌株分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心以及中国典型培养物保藏中心；以及
赋形剂、稀释剂或载体。
10.如权利要求9所述的以含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物作为抗氧化功效的用途，其中该乳酸菌菌株为具有活性的菌株。
11.如权利要求9所述的以含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物作为抗氧化功效的用途，其中该发酵物为包含去活性菌株或去除菌体的发酵上清液、乳清发酵液、或以上的干燥粉末。
12.如权利要求9所述的以含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物作为抗氧化功效的用途，其中该赋形剂、稀释剂或载体为生理上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
13.如权利要求9所述的以含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物作为抗氧化功效的用途，其中该赋形剂、稀释剂或载体为一食品。
14.如权利要求13所述的以含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物作为抗氧化功效的用途，其中该食品包含发酵乳、优格、奶酪、乳制饮品乳粉、茶、咖啡、口香糖、洁牙糖或以上的组合。
15.如权利要求9所述的以含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物作为抗氧化功效的用途，其中该赋形剂、稀释剂或载体为医药上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
16.如权利要求9所述的以含乳酸菌菌株或其发酵物的组合物作为抗氧化功效的用途，其为一医药组合物，且为口服剂型或皮肤外用剂型。
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