CN114437959A - 一种动物双歧杆菌及其在抗氧化和提升免疫中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种动物双歧杆菌及其制品，用于提高动物的抗氧化能力与免疫力，减少动物疾病的诱发。本申请动物双歧杆菌分离于动物粪便，将分离得到的菌株制成发酵液用于动物喂养，在预设时间内对被喂养动物采血并对该血清进行测定，增加了动物血清中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，提高动物抗氧化能力，增加了动物血清中的IgA、IgG值，提高动物免疫力。

Description

一种动物双歧杆菌及其在抗氧化和提升免疫中的应用
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，尤其涉及一种动物双歧杆菌及其在抗氧化和提升免疫中的应用。
背景技术
双歧杆菌是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一，双歧杆菌在体内定殖后可产生有机酸促进肠壁蠕动，吸附更多水分，促进毒素、垃圾顺畅地排出体外，因而能够治疗因大量使用抗生素而导致的伪膜性肠炎、便秘、慢性腹泻等症状；此外，双歧杆菌能够抑制腐败菌生长，减少体内腐败菌产生的胺酚、吲哚类代谢产物堆积和吸收，增强免疫力，减少肠道感染的危险。双歧杆菌的菌株作为益生菌广泛应用在食品、医药以及动物养殖等方面。
双歧杆菌在养殖动物上的应用已成为近几年的热点，双歧杆菌的来源主要是人源双歧杆菌和动物源双歧杆菌，分离于人体的双歧杆菌研究较多，制剂产品在临床应用也十分普及。动物源双歧杆菌不但可以用于养殖经济动物，还可以用于家庭宠物的饲养，对动物减少使用抗生素和维持日常健康起到积极作用。现阶段用于提高动物抗氧化能力与免疫力的养殖产品大多以人源双歧杆菌为主，动物源双歧杆菌的应用较少。
随着经济水平提高，经济动物养殖数量和种类不断增多，越来越多的家庭饲养宠物，人与动物有着密切的联系，动物的日常健康进一步引起了人们的重视，而抗氧化能力和免疫水平影响着动物的日常健康状况，动物的抗氧化能力与免疫水平下降，造成细胞和组织的功能下降，增大自由基对机体造成的损伤，容易诱发疾病。
发明内容
本申请提供了一种动物双歧杆菌及其在抗氧化和提升免疫中的应用，用于提高动物的抗氧化能力与免疫力，减少动物疾病的诱发。
本申请第一方面提供了一种动物双歧杆菌，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌乳亚种YD-AB100(Bifidobacterium animalis subsp.lactis YD-AB100)，保藏编号为：CGMCCNo.22731，保藏日期为：2021年6月17日。
可选地，所述动物双歧杆菌的细胞形态为多形态杆状。
可选地，所述动物双歧杆菌每日按动物体重补充量为1×109CFU/KG。
可选地，所述动物双歧杆菌提取于动物粪便中分离的具有抗氧化能力和提高免疫力的益生菌株。
可选地，所述动物粪便为新出生七日内的幼犬粪便。
本申请第二方面提供了一种如第一方面中所述的动物双歧杆菌在制备抗氧化和提升免疫制品中的应用。
可选地，所述制品具有提高机体抗氧化能力的功能。
可选地，所述制品具有提高机体免疫力的功能。
可选地，所述制品为菌剂或饲料。
可选地，所述应用的范围为在哺乳动物饲养中应用。
从以上技术方案可以看出，本申请具有以下有益效果：
本申请中，动物双歧杆菌乳亚种YD-AB100通过分离动物粪便，采用浓度梯度式在TYP培养基上进行预实验，选取预实验中分离状态较好的微生物菌落对应的浓度稀释液进行传代培养所获得。在体内实验中，用具有该动物双歧杆菌乳亚种YD-AB100的菌液喂养动物，被喂养的动物的抗氧化能力和免疫力水平有显著的提升，因而将使用该动物双歧杆菌乳亚种YD-AB100制备得到的菌剂和饲料用于动物的饲养，能够有效提高动物的抗氧化能力和免疫水平，进而减少动物疾病的诱发。
附图说明
图1为本申请中动物双歧杆菌的生长状态示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的阐述，显然阐述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护范围。
本申请提供了一种动物双歧杆菌及其在抗氧化和提升免疫中的应用，用于提高动物的抗氧化能力与免疫力，减少动物疾病的诱发。该动物双歧杆菌为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，菌株编号为YD-AB100，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.22731，保藏日期为：2021年6月17日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
需要说明的是，本申请中所用的“本申请动物双歧杆菌”指的是动物双歧杆菌乳亚种YD-AB100。
可选地，动物双歧杆菌的细胞形态为多形态杆状。
可选地，动物双歧杆菌每日按动物体重补充量为1×109CFU/KG。
可选地，动物双歧杆菌提取于动物粪便中分离的具有抗氧化能力和提高免疫力的益生菌株。
可选地，动物粪便为新出生七日内的幼犬粪便。
本申请分离得到的双歧杆菌为动物源双歧杆菌，增加了动物源双歧杆菌产品的数量以及功能。
本申请中动物双歧杆菌是通过将新出生的幼犬粪便进行稀释处理得到稀释液，并使用稀释液进行培养，得到微生物菌落，将该微生物菌落进行革兰氏染色和镜检，镜检结果显示该微生物菌落存在预设形态特征，则使用该微生物菌落作为母代进行传代培养，直至镜检结果显示分离出单个菌落所得。
具体的分离方法如下：
1、称取1克的幼犬粪便，放入盛有9毫升生理盐水的第一无菌试管中，配制成浓度为1:10的第一稀释液，量取第一稀释液1毫升，注入盛有9毫升生理盐水的第二无菌试管中，配制成浓度为1×10-2g/ml的第二稀释液；量取第二稀释液1毫升，注入盛有9毫升生理盐水的第三无菌试管中，配制成浓度为1×10-3g/ml的第三稀释液；量取第三稀释液1毫升，注入盛有9毫升生理盐水的第四无菌试管中，配制成浓度为1×10-4g/ml的第四稀释液；量取第四稀释液1毫升，注入盛有9毫升生理盐水的第五无菌试管中，配制成浓度为1×10-5g/ml的第五稀释液；量取第五稀释液1毫升，注入盛有9毫升生理盐水的第六无菌试管中，配制成浓度为1×10-6g/ml的第六稀释液；量取第六稀释液1毫升，注入盛有9毫升生理盐水的第七无菌试管中，配制成浓度为1×10-7g/ml的第七稀释液，分别得到浓度为1×10-1～1×10-7g/ml梯度的不同浓度的七份均匀稀释液；
2、将步骤1中的七份均匀稀释液分别在TPY培养基平板上划线分离，在温度为37℃，时间为48h的厌氧环境下进行预实验培养，以分别得到七份均匀稀释液对应的微生物菌落；
3、根据步骤2中微生物菌落的分离状态分别选取浓度为1×10-4g/ml、1×10-5g/ml、1×10-6g/ml均匀稀释液对应的微生物菌落，在TPY培养基平板上划线分离，在温度为37℃，时间为48h的厌氧环境下进行培养，并进行空白对照组实验，在实验组的TPY培养基上得到具有光滑、凸圆、边缘整齐、质地柔软、呈现白色或乳白色的特征菌落，该特征菌落的体积为8mm3；
4、从步骤3具有光滑、凸圆、边缘整齐、质地柔软、呈现白色或乳白色的体积为8mm3特征菌落中选取4mm3体积的特征菌落进行革兰氏染色，将进行革兰氏染色后的4mm3体积的特征菌落进行镜检；
5、当步骤4镜检结果显示该4mm3体积的特征菌落具有形状不规则，呈弧形、两端大小不一、V形或Y形的双歧杆菌形态特征时，则从步骤3具有光滑、凸圆、边缘整齐、质地柔软、呈现白色或乳白色的特征菌落中选取剩余4mm3体积的特征菌落在TPY培养基平板上划线分离，在温度为37℃，时间为48h的厌氧环境下进行培养，并从培养后的4mm3体积的特征菌落中选取2mm3体积的特征菌落进行革兰氏染色与镜检；
6、当步骤5中镜检结果显示2mm3体积的特征菌落具有形状不规则，呈弧形、两端大小不一、V形或Y形的双歧杆菌形态特征时，则从步骤5培养后的4mm3体积的特征菌落中选取剩余2mm3体积的特征菌落重复步骤5，直至镜检结果显示分离出纯净的双歧杆菌的单个菌落。
需要解释的是，步骤3中是通过观察七份均匀稀释液对应的微生物菌落的分离状态，选取相对而言分离状态较好的三份均匀稀释液对应的微生物菌落进行培养。
可以理解的是，本申请中菌落的培养均需在厌氧环境中进行，双歧杆菌在厌氧环境中生长，当培养基中存在需氧菌或者兼性厌氧菌时，该需氧菌或者兼性厌氧菌的生长状态相对双歧杆菌而言较差，在厌氧环境中进行培养，一方面能够去除培养基中存在需氧菌或者兼性厌氧菌，另一方面能够获得双歧杆菌。
需要说明的是，本申请中的TPY培养基主要是由水解酪蛋白、大豆胨、酵母粉、葡萄糖、L-半胱氨酸、碳酸氢二钾、氯化镁、硫酸锌、氯化钙、氯化铁、吐温80以及琼脂组成，各组成成分含量(g/L)分别为10.0、5.0、2.0、5.0、0.5、2.0、0.5、0.25、0.15、0.000001、1.0以及20.0。其原理是水解酪蛋白、大豆胨以及酵母粉提供碳源，碳酸氢二钾为缓冲剂，葡萄糖为可发酵糖类，氯化镁、硫酸镁、氯化钙以及氯化铁提供微量元素，吐温80与L-半胱氨酸为培养双歧杆菌提供生长因子，琼脂为培养基的凝固剂。
此外，本申请中使用的稀释液在配置过程中，需要充分振荡摇匀，减少稀释液浓度不均匀而影响实验结果的发生。
在分离出纯净的双歧杆菌的单个菌落之后，对该菌落进行鉴定。值得一提的是，本申请中双歧杆菌的鉴定过程可以为：根据分离纯化后得到的本申请双歧杆菌的菌落进行处理，通过对分离纯化得到的双歧杆菌的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列、tuf基因序列等进行鉴定，本申请中将分离纯化后得到的菌落送至中国科学院微生物研究所进行鉴定，鉴定数据如下：
本申请动物双歧杆菌的tuf基因序列测定结果如下：
GAGCAGCAGCGTGGTATCACCATCAACATTGCCCACATCGAGTACCAGACGGCCAAGCGTCACTACGCCCACGTCGACTGCCCGGGCCACGCCGACTTCGTGAAGAACATGATCACCGGCGCTGCCCAGATGGATGGCGCCATCCTCGTTGTGGCCGCCACCGACGGCCCGATGGCCCAGACCCGCGAGCACGTGCTGCTCGCCCGTCAGGTCGGCGTCCCGAAGATCCTCGTCGCTCTGAACAAGTGCGATATGGTCGATGACGAAGAGCTCATCGAGCTCGTCGAAGAAGAGGTCCGCGACCTCCTCGACGAGAACGGCTTCGACCGCGACTGCCCGGTCGTGCACACCTCCGCTTACGGCGCTCTGCATGACGACGCTCCGGATCACGACAAGTGGGTTGCCACCATCAAGGAGCTCATGGACGACGTCGACGAGTACATCCCGACCCCGGTCCACGACCTCGACAAGCCGTTCCTGATGCCGATCGAGGACGTCTTCACCATCTCCGGCCGTGGCACCGTCGTCACCGGTCGTGTCGAGCGCGGCAAGCTGCCGATCAACACGAACGTCGAGATCGTCGGCATCCGCCCGACCCAGACCACCACCGTCACCTCCATCGAGACCTTCCACAAGCAGATGGATGAGTGCGAGGCCGGCGACAACACCGGTCTGCTGCTCCGCGGCATCAACCGCACCGACGTCGAGCGTGGCCAGGTCGTGGCTGCTCCGGGTTCGGTCACCCCGCACACCAAGTTCGAAGGCGAAGTCTACGTCCTTACCAAGGATGAGGGCGGCCGTCACTCGCCGTTCTTCTCGAACTACCGTCCGCAGTTCTACTTCCGCACCACCGACGTCACCGGCGTCATCACGCTGCCGGAAGGCGTCGAGATGGTTCAGCCTGGCGATCACGCGACCTTCACGGGTTGAGCTGATCCAGCCGATCGCTA
本申请动物双歧杆菌的16S rRNA基因序列如下：
CTTACACATGCAGTCGAACGGGATCCCTGGCAGCTTGCTGTCGGGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCAACCTGCCCTGTGCACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATACCGGATGCTCCGCTCCATCGCATGGTGGGGTGGGAATGCTTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGCGGGGTGATGGCCCACCAAGGCGTTGACGGGTAGCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGCGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTTCAAGGGCAAGGCACGGTTTCGGCCGTGTTGAGTGGATTGTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCCTAACGGTGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCTTTCCACGGGTCCCGTGTCGGAGCCAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTGCCGGATCGCCGTGGAGACACGGTTTCCCTTCGGGGCCGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCGCATGTTGCCAGCGGGTGATGCCGGGAACTCATGTGGGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGCGGTGCGACACGGTGACGTGGGGCGGATCGCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGTAGCACCCGAAGCCGGTGGCCCGACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCT
本申请动物双歧杆菌的形态特征：多形态杆状。
本申请动物双歧杆菌的生理生化特征：革兰氏阳性，接触酶阴性，氧化酶阴性，碳水化合物产酸如表1所示。
表1、碳水化合物产酸
甘油 - 肌醇 - 菊糖 -
赤癣醇 - 甘露醇 - 松三糖 -
D-阿拉伯糖 - 山梨醇 - 棉子糖 +
L-阿拉伯糖 - α-甲基-D-甘露糖甙 - 淀粉 -
D-核糖 - α-甲基-D-葡萄糖甙 - 糖原 -
D-木糖 - N-乙酰-葡糖胺 - 木糖醇 -
L-木糖 - 苦杏仁甙 - 龙胆二糖 -
阿东醇 - 熊果甙 - D-松二糖 -
β-甲基-D-木糖甙 - 七叶灵 + D-来苏糖 -
D-半乳糖 - 水杨苷 - D-塔格糖 -
D-葡萄糖 + 纤维二糖 - D-岩藻糖 -
D-果糖 - 麦芽糖 + L-岩藻糖 -
D-甘露糖 - 乳糖 + D-阿拉伯糖醇 -
L-山梨糖 - 蜜二糖 + L-阿拉伯糖醇 -
L-鼠李糖 - 蔗糖 + 葡萄糖酸盐 -
卫茅醇 - 海藻糖 - 2-酮基-葡萄糖酸盐 -
通过对分离纯化得到的双歧杆菌的鉴定实验数据进行综合分析，可以得出鉴定结果：分离纯化得到的双歧杆菌为动物双歧杆菌乳亚种。
一种如上述分离纯化得到的动物双歧杆菌在制备抗氧化和提升免疫制品中的应用。
本申请的制品用于提高动物的抗氧化能力和免疫力，从而减少诱发动物的疾病。
可选地，制品具有提高机体抗氧化能力的功能。
可选地，制品具有提高机体免疫力的功能。
可选地，制品为菌剂或饲料。
可选地，应用的范围为在哺乳动物饲养中应用。
可以理解的是，该哺乳动物饲养应用可以是在犬类饲养中应用，也可以是在猫类饲养中应用，还可以是其他的动物饲养中应用，如在羊类饲养中应用，具体此处不做限定。
下面结合动物实验对本申请中菌株的抗氧化能力和免疫力做进一步的研究，以说明本申请中制品的有效性。
1、发酵液的制备：
培养基的制备：分别将30克葡萄糖、10.42克酵母粉、10.42克大豆蛋白胨、3.6克磷酸氢二钾、9.04克无水乙酸钠、2.4克柠檬酸钠、1克MgSO4·7H2O、54毫克MnSO4·5H2O以及1克吐温80，放入盛有1000毫升纯化水的实验器皿中，搅拌均匀，得到均匀混合溶液，用浓度为0.1M的氢氧化钠溶液将该均匀混合溶液的pH值调至6.5，将pH至为6.5的均匀混合溶液在温度为121℃、时间为15分钟的条件下进行灭菌，得到目标培养基。
扩大培养：量取1毫升目标培养基，加入1支含有0.5克本申请动物双歧杆菌的工作种子安剖瓶内，该工作种子安剖瓶内的动物双歧杆菌含量约一千亿CFU，搅拌充分溶解，得到溶解液，量取0.5毫升溶解液，加入100毫升的培养液中，搅拌均匀，得到第一菌液，将该第一菌液在温度为37℃、时间为20h的厌氧条件下培养，再将培养后的第一菌液进行二级扩培，扩培至1000毫升，从而得到目标发酵液。
需要说明的是，对目标发酵液中活菌的检测可以根据食品安全国家标准食品微生物学检验中双歧杆菌检验的方法进行检测。
2、动物实验：
选取年龄在2至6岁健康的、定期免疫、定期驱虫的60只幼犬，从60只幼犬中随机选取30只作为实验组，剩余的30只作为对照组。按照每天每只幼犬的体重添加目标发酵液，幼犬体重每一千克加入的目标发酵液含有的活菌数量为1×109CFU的比例加入实验组幼犬的日粮中进行喂养。例如：第一天幼犬A的体重为1千克，则第一天幼犬A的日粮中加入的目标发酵液的活菌含量为1×109CFU，第二天幼犬A的体重增加至2千克，则第二天幼犬A的日粮中加入的目标发酵液的活菌含量为2×109CFU。幼犬的体重增加，目标发酵液的用量也随之增加。对照组幼犬的日粮中不加入目标发酵液，直接用日粮喂养。分别在第0天、第20天、第40天以及第60天对该60只幼犬采血，并将血样送至内蒙古农业大学兽医学院测定血清中的GSH-Px、SOD、IgA以及IgG值。可以理解的是，GSH-Px、SOD是机体抗氧化能力的指标，IgA以及IgG是机体免疫水平的指标。
以上实验中的GSH-PX、SOD值是通过试剂盒采样进行检测，酶标仪直接检测读取，最后取平均值，使用IgA、IgG试剂盒进行IgA、IgG值检测，该60只幼犬血清中的GSH-Px、SOD、IgA以及IgG值的测定结果如表2所示。
表2、动物喂养实验血清测定结果
Figure BDA0003380497560000091
根据表2的血清测定结果可知，在使用目标发酵液进行喂养之前，对照组犬类血清中的GSH-Px、SOD、IgA以及IgG值与实验组犬类血清中的GSH-Px、SOD、IgA以及IgG值较为相近。对照组犬类没有使用目标发酵液进行喂养，随着时间的增加，对照组犬类血清中的GSH-Px、SOD、IgA以及IgG值无明显变化，而实验组犬类血清中的GSH-Px、SOD、IgA以及IgG值随着使用目标发酵液进行喂养时间的增加而逐渐增大，也就是说，本申请动物双歧杆菌具有提高机体抗氧化能力和提高机体免疫水平。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求及其等同限定。

Claims (10)

1.一种动物双歧杆菌，其特征在于，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌乳亚种YD-AB100(Bifidobacterium animalis subsp.lactis YD-AB100)，保藏编号为：CGMCCNo.22731,保藏日期为：2021年6月17日。
2.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于，所述动物双歧杆菌的细胞形态为多形态杆状。
3.根据权利要求1所述的动物双歧杆菌，其特征在于，所述动物双歧杆菌每日按动物体重补充量为1×109CFU/KG。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的动物双歧杆菌，其特征在于，所述动物双歧杆菌提取于动物粪便中分离的具有抗氧化能力和提高免疫力的益生菌株。
5.根据权利要求4所述的动物双歧杆菌，其特征在于，所述动物粪便为新出生七日内的幼犬粪便。
6.如权利要求1所述的动物双歧杆菌在制备抗氧化和提升免疫的制品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述制品具有提高机体抗氧化能力的功能。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述制品具有提高机体免疫力的功能。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述制品为菌剂或饲料。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用的范围为在哺乳动物饲养中应用。
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